Khoá luận tốt nghiệp Nghiên cứu thành phần hóa học dịch chiết lipid của hải sâm Holothuria scabra

TRƯỜNG ĐẠI HỌC s ư PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA HÓA HỌC
= = = S o CQ g 3 = = =

NGÔ THỊ HƯƠNG

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC
DỊCH CHIẾT LIPID CỦA HẢI SÂM
HOLOTHURIA SCABRA
KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP ĐẠI HỌC
C huyên ngành: H óa hữu cơ

HÀ NỘI - 2016


LỜ I CẢM ƠN

Khóa luận với đề tài : “Nghiên cứu thành phần hóa học dịch chiết
lipid của hải sâm Holothuria scabra” được thực hiện tại phòng Hóa sinh
hữu cơ - Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên - Viện Hàn lâm Khoa học
và Công nghệ Việt Nam.
Em xin trân trọng cảm ơn GS.TS Phạm Quốc Long và Ban lãnh đạo
Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên - Viện Hàn lâm Khoa học và Công
nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện cho em được học tập và sử dụng các thiết bị
tiên tiến của viện để hoàn thành tốt các mục tiêu đề ra trong khóa luận của
mình.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS.Trần Thị Thu Thủy, cùng các
anh - chị phòng Hóa sinh hữu cơ - Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên
đã giúp đỡ em tiong suất thời gian thực hiện khóa luận.
Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong khoa Hóa Học - Trường
ĐHSP Hà Nội 2 đã tận tình dạy dỗ và chỉ bảo cho em trong suất 4 năm học

tập tại trường.
Trong quá trình thực hiện khóa luận, mặc dù đã hết sức cố gắng nhưng
chắc chắn sẽ không tránh khỏi những thiếu sót. Vì vậy, em kính mong nhận
được sự đóng góp, chỉ bảo của các quý cô và bạn bè.
Em xin chân thành cảm ơn !
Hà nội, ngày 15 tháng 5 năm 2016
Sinh viên

Ngô Thị Hương


M ỤC LỤC

MỞ ĐÀU............................................................................................................1
CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN......................................................................... 3
1.1. Những nghiên cứu tổng quan về hải sâm Holothuria scabra..............3
1.1.1. Hệ thống phân loại......................................................................... 3
1.1.2. Đặc điểm phân bố và hình thái cấu tạ o .........................................4
1.1.3. Đặc điểm sinh trưởng, dinh dưỡng................................................ 4
1.1.4. Giá trị kinh tế ................................................................................. 4
1.1.5. Tình hình nghiên cứu......................................................................5
1.2. Các phương pháp sắc ký trong phân lập các hợp chất hữu c ơ ............9
1.2.1. Đặc điểm chung của các phương pháp sắc ký.............................. 9
1.2.2. Cơ sở của các phương pháp sắc k ý ............................................... 9
1.2.3. Phân loại các phương pháp sắc k ý ..............................................10
1.3. Các phương pháp hóa lý xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ 14
1.3.1. Phổ hồng ngoại............................................................................. 14
1.3.2. Phổ khối lượng.............................................................................. 15
1.3.3. Phổ cộng từ hạt nhân....................................................................15
CHƯƠNG 2 : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN

c ứ u .... 19

2.1. Đối tượng nghiên cứ u.......................................................................... 19
2.2. Phương pháp phân lập các chất.......................................................... 19
2.2.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC)................................................................19
2.2.2. Sắc ký cột (CC)............................................................................. 19
2.3. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất................20
2.4. Dụng cụ, thiết b ị .................................................................................. 20
2.4.1. Dụng cụ và thiết bị tách chiết...................................................... 20
2.4.2. Dụng cụ và thiết bị xác định cấu trúc..........................................20


2.5. Hóa chất................................................................................................20
CHƯƠNG 3 : THựC NGHIỆM..................................................................21
3.1. Thu mẫu, xử lý m ẫu............................................................................ 21
3.2. Phân lập các họp ch ất......................................................................... 22
3.2. Hằng số yật lý của các họp chất phân lập được................................ 23
CHƯƠNG 4 : KÉT QUẢ VÀ THẢO LUẬN............................................ 24
4.1. Xác định cấu trúc hóa học của họp chất 1..........................................24
4.2. Xác định cấu trúc hóa học của họp chất 2 ..........................................28
KÉT LUẬN..................................................................................................... 35
TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................ 36
PHỤ LỤ C ...................................................................................................... 38


D A N H M ỤC CÁC C H Ữ VIẾT TẮT

TLC

Sắc ký lớp mỏng - Thin Layer Chromatography

cc

Sắc ký cột - Column Chromatography

13C-NMR

Phổ cộng từ hạt nhân Carbon 13
Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

1 H- NMR

Phổ cộng từ hạt nhân proton
Pronton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

XH- *H COSY

1H- ’ll Chemical Shift Correlation Spectroscopy

2D- NMR

Phổ cộng từ hạt nhân hai chiều
Two - Dimensional NMR

DEPT

Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer

El- MS

Phổ khối lượng và va chạm electron
Electron Impact Mass Spectroscopy

ESI - MS

Phổ phun mù điện tử
Electron Sparyt Ionization Mass Spectroscopy

HMBC

Heteronuclear Multiple Bond Coherence

HSQC

Heteronuclear Single Quantum Coherence

IR

Phổ hồng ngoại - Infrared Spectroscopy

MS

Phổ khối - Mass Spectroscopy

NOESY

Nucler Overhauser Effect Spectroscopy

D A NH M Ụ C BẢ N G B IỂ U , H ÌN H VẼ V À s ơ ĐỒ

Hình 1.1. Hải sâm Holothurỉa scabra............................................................. 3
Sơ đồ 3.1. Sơ đồ ngâm chiết mẫu hải sâm Holothurỉa scabra......................21
Sơ đồ 3.2. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cặn CHC13 .................................. 22
Hình 4.1.a. cấu trúc hóa học của hợp chất 1 ................................................ 24
Hình 4.1.b. Phổ ^-N M R của hợp chất 1...................................................... 24
Hình 4.I.C. Phổ 13C-NMR và DEPT của hợp chất 1 .....................................25
Bảng 4.1. Dữ liệu phổ ^-N M R và 13C-NMR của hợp chất 1 ..................... 26
Hình 4.1.d. Phổ HMBC của hợp chất 1 ......................................................... 27
Hình 4.2.a. cấu trúc hóa học của hợp chất 2 .................................................28
Bảng 4.2. Dữ liệu phổ ^-N M R và 13C-NMR phần aglycol của hợp chất 2 30
Bảng 4.3. Dữ liệu phổ ’H-NMR và 13C-NMR phần đường của hợp chất 2.31
Hình 4.2.b. Phổ ^-N M R của hợp chất 2....................................................... 32
Hình 4.2.C. Phổ 13C-NMR của hợp chất 2 ...................................................... 32
Hình 4.2.d. Phổ 13C-NMR và DEPT của hợp chất 2 ......................................33
Hình 4.2.e. Phổ COSY của hợp chất 2 ........................................................... 33
Hình 4.2.g. Phổ HMBC của hợp chất 2 ......................................................... 34


M Ở ĐÀU

Nằm trên bán đảo Đông Dương, Việt Nam là một Quốc gia ven biển.
Với dải bờ biển chạy dài trên 3260 km, diện tích trên 1 triệu km2, hàng năm
đem lại nguồn lọi trên 2 triệu tấn trong số hon 90 triệu tấn hải sản của thế
giới, đồng thời cũng là hệ sinh thái rất đặc thù và được đánh giá là một trong
16 trung tâm đa dạng sinh học cao của thế giới. Đây là một điều kiện thuận
lợi để nước ta phát triển đa dạng các ngành kinh tế biển và ven biển trong
hon 50 năm qua.
Việc nghiên cứu khai thác và sử dụng các nguồn lọi từ biển luôn là chủ

đề đáng quan tâm đối với các nhà khoa học trên khắp thế giới. Trong những
năm gàn đầy Việt Nam đã và đang có các công trình khoa học nghiên cứu về
sinh vật biển, một trong các xu hướng mói mở ra là tìm kiếm các họp chất
thiên nhiên có hoạt tính sinh học cao từ sinh vật biển. Từ đó nghiên cứu
thành phàn, cấu trúc và tổng hợp nên các hợp chất có giá trị y học cao.
Trong sự đa dạng của sinh vật biển thì hải sâm là một trong những loài nhận
được sự quan tâm đặc biệt của các nhà khoa học trong và ngoài nước. Ở Việt
Nam và các quốc gia ven biển Thái Bình Dương hải sâm không những có
giá ưị ẩm thực mà con mang giá trị y học. Nhiều loại có các có hoạt tính
sinh học được dụng để chế tạo các dược phẩm trị hen suyễn, thấp khớp, chất
điều trị ung thư... Đặc biệt, các món ăn từ hải sâm có giá trị dinh dưỡng rất
lớn, đặc biệt trong việc ưị các chứng bệnh về sinh lý.
Lipid là thành phần quan trọng trong cơ thể sống, nó có chức năng là
chất dự trữ năng lượng. Một gam lipid có thể thu được 9,3 Kcal, trong khi
đó 1 gam gluxit hoặc protein chuyển hóa chỉ cho 4 Kal. Lipid cung cấp năng
lượng rất cao cho cơ thể, gấp 2,5 lần so với protein. Trong màng sinh học,
lipid ở trạng thái liên kết vói protein tạo thành hợp chất lipoproteid cấu tạo
1


nên màng tế bào. Chính nhờ các tính chất của hợp chất này đã tạo cho màng
sinh vật có được tính thẩm thẩu chọn lọc, tính cách điện. Đó là những hợp
tính hết sức quan trọng của tế bào sinh vật. Ngoài ra, lipid còn có thể liên kết
vói nhiều chất đom giản khác thành những hợp chất có tính chất sinh học
khác nhau. Những hợp phức đó có vai trò quan trọng trong các hoạt động
thần kinh và cơ bắp.
Xuất phát từ ý nghĩa thực tiễn trên nên chúng tôi đã lựa chọn đề tài:
“Nghiên cứu thành phần hóa học dịch chiết lipid của hải sâm
Holothuria scabra”
Vói mục đích nghiên cứu thành phàn hóa học dịch chiết lipid của hải

sâm Holothurỉa scabra và xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất được
phân lập. Từ đó, tạo cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo trong lĩnh vực tìm
kiếm những hoạt chất có thể ứng dụng vào tíong thực tế cuộc sống đồng thời
góp phần bảo tồn các loài quý hiếm, các loài có vai trò quan trọng đối với hệ
sinh vật biển.

2


C H Ư Ơ N G 1 : TỔ NG QUAN

1.1. Những nghiên cứu tổng quan về hải sâm Holothuria scabra
Hải sâm là loài động yật thuộc ngành Da gai, lớp hải sâm hiện nay có
khoảng 1.10 0 loài, trong đó chỉ có khoảng hơn 20 loài có giá trị thực phẩm
đang được tập trung khai thác và nuôi thương phẩm.
1.1.1. Hệ thống phân loại
Ngành : Echinodermata
Lớp

: Holothuroidea

Bộ

: Aspỉdochỉrotỉda

Họ

: Holothuriidea

Giống : Holothuria

Loài

: Holothurỉa scabra Jaeger, 1883

Tên tiếng v iệ t: Hải sâm trắng, hải sâm cát

Hình 1.1. Hải sâm Holothuria scabra

3


1.1.2. Đặc điểm phân bố và hình thái cấu tạo
Hải sâm ữắng phân bố ở hầu hết ở vùng bờ các đại dương, nhưng tập
trung phía Tây Thái Bình Dương, chủ yếu ở vùng biển Nhật Bản, Trung
Quốc, Việt Nam, Phillippine, Indonesia....Ở Việt Nam, chúng phân bố tập
trung thành những bãi lớn dọc bờ biển các tỉnh Ninh Thuận, Bình Thuận,
Khánh Hòa, Phú Yên, Quảng Ninh, Hải Phòng...
Hải sâm trắng có thân dạng hình trụ dài với lớp da mềm. Lưng có màu
xám đậm hoặc đen, bụng trắng, cơ thể giống quả dưa chuột, dài trung bình
20 cm, da sần sùi, hơi nhám và mềm. Thân hải sâm phía ngoài có nhiều u
bướu sần sùi trông như con đỉa nên thường gọi là đỉa biển. Hải sâm không
có đầu đuôi riêng biệt. Chính giữa phần đầu trước có một lỗ miệng nhỏ,
xung quanh miệng mọc 5 - 1 0 tua nhỏ. Phần đầu sau của hải sâm có lỗ hậu
môn và cơ thể không có mắt.
1.1.3. Đặc điểm sinh trưởng, dinh dưỡng
Hải sâm có tập tính sống ở đáy các vùng nước biển nông, vũng, vịnh có
nhiều đá ngầm, nhiệt độ nước thích hợp 26 - 29°c, tập trung nhiều nhất ở độ
sâu 2 - 5 m.
Thức ăn của hải sâm là xác chết động vật, thực vật phù du, chất hữu cơ
và vi sinh vật dưới đáy biển. Hải sâm còn có cách bắt mồi khác là nằm trong

sóng sử dụng các xúc tu để bắt những loài sinh vật trôi nổi. Do sử dụng thức
ăn là mùn bã hữu cơ và xác động vật chết ở nền đáy nên hải sâm cát giúp
nền đáy sạch hơn, hạn chế ô nhiễm nước.
1.1.4. Giá trị kinh tế
Hải sâm ữắng là loài có giá trị kinh tế và được nuôi ở nhiều nước trên
thể giới có điều kiện khí hậu tương tự Việt Nam như Trung Quốc,
Phillipines, Indonesia... Không chỉ là loại thức ăn cao cấp, hải sâm ưắng
còn có nhiều giá trị về y học, được xem là vị thuốc bổ thận, tráng dương, ích
4


tinh, lọi khí, nhuận táo, có tác dụng bổ dưỡng và tăng cường sinh lực như
nhân sâm. Ngoài ra hải sâm trắng được dùng để cầm máu, chữa đờm, chữa
thần kinh suy nhược, ho, viêm phế quản, mụn nhọt.
1.1.5. Tĩnh hình nghiên cứu
Thành phần hóa học của hải sâm khá đa dạng về cấu trúc cũng như hoạt
tính sinh học của chúng. Trong số các nghiên cứu về thành phần hóa học của
hải sâm Holothuria scabra cho thấy có chứa các lớp chất chủ yếu là : lipid,
sterol, triterpene...
1.1.5.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Năm 2009, Hua Han và cộng sự đã phân lập được 2 hợp chất của
triterpene glycoside đó là các Scabraside A (1) và B (2) [5].
Cấu trúc của các hợp chất này như sau :

OH

Na03S0"'Y'—2T°\ /°
H O -^ T ^ Y

ohh

5


0

Năm 2014, tiếp tục phân lập được các hợp chất mới đó là Echinoside A
(3) [10].
Cấu trúc của hợp chất này như sau :

Người ta đã chứng minh được rằng hợp chất Echinoside A có hoạt tính
mạnh, kháng tế bào gan ngưòi (Hep-G2) [10].

6


1.1.5.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam
Năm 2006, từ loài hải sâm Holothuria scabra Châu Văn Minh và các
cộng sự đã phân lập được 4 hợp chất mới là Holothuñn A (4), Holothurin
A2, Holothurin B (5) và Holothurinogeni B [8].
Cấu trúc của các hợp chất này như sau :

Năm 2007, tiếp tục phân lập thu được các hợp chất mới đó là
Holothurin A3 (6) và A4 (7) [7].
7


cấu trúc của các hợp chất này như sau :

Người ta đã chứng minh được rằng hợp chất Holothuñn A3 có hoạt tính

mạnh, kháng cả ba dòng tế bào UT người là tế bào biểu bì người (KB), tế
ung thư màng tử cung (FL) và tế bào tế bào gan người (Hep-G2).

8


1.2. Các phương pháp sắc ký trong phân lập các họp chất hữu cơ
Phương pháp sắc ký (chromatography) là một phương pháp phổ biến và
hữu hiệu nhất hiện nay được sử dụng để phân lập các chất hữu cơ nói chung
và các hợp chất thiên nhiên nói riêng.
1.2.1. Đặc điểm chung của các phương pháp sắc ký
Sắc ký là một phương pháp vật lý dùng để tách một hỗn hợp gồm nhiều
loại hợp chất ra riêng thành từng loại đơn chất, dựa vào ái lực khác nhau của
những loại họp chất đó đối vói một hệ thống (hệ thống gồm 2 pha : một pha
động và một pha tĩnh).
Các chất khác nhau sẽ có ái lực khác nhau với pha động và pha tĩnh.
Trong quá trình pha động chuyển dọc theo hệ sắc ký hết lóp pha tĩnh này
đến lóp pha tĩnh khác, sẽ lặp đi lặp lại quá trình hấp phụ và phản hấp phụ.
Kết quả là các chất có ái lực lớn hơn pha tĩnh sẽ chuyển động chậm hơn qua
hệ thống sắc ký so vói các chất tương tác yếu hơn vói pha này. Nhờ đặc
điểm này mà người ta có thể tách các chất qua quá trình sắc ký.
1.2.2. Cơ sở cửa các phương pháp sắc ký
Phương pháp sắc ký dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất giữa
pha động và pha tĩnh. Ở điều kiện nhiệt độ không đổi, định luật mô tả sự phụ
thuộc của lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh với nồng độ của dung dịch
(hoặc vói chất khí là áp suất riêng phần) gọi là định luật hấp phụ đơn phân
tử đẳng nhiệt Langmuir :
n = nco.b.C/ 1+ b .c
n

: Lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh lúc đạt cân bằng.

noo : Lượng cực đại của chất có thể bị hấp phụ lên một chất hấp phụ nào đó.
b

: Hằng số.

c : Nồng độ của chất bị hấp phụ.

9


1.2.3. Phân loại các phương pháp sắc ký
Trong phương pháp sắc ký, pha động là các lưu thể (các chất ở ữạng
thái khí hay lỏng), còn pha tĩnh là các chất ở trạng thái lỏng hoặc rắn. Dựa
vào trạng thái tập họp của pha động người ta chia sắc ký thành hai nhóm :
sắc ký khí và sắc ký lỏng.
1.2.3.1. Sắc ký lỏng
Đây là phương pháp sắc ký dùng chất lỏng làm pha động. Trong sắc ký
lỏng có các loại như sau :
a. Sắc ký giấy
Sắc ký giấy là phương pháp phân tích với pha tĩnh là một loại giấy đặc
hiệu dùng trong sắc ký. Chất thử được chấm lên giấy rồi triển khai sắc ký
bằng hệ dung môi thích hợp trong một bình triển khai kín. Sau khi đã triển
khai xong giấy được làm khô rồi làm hiện màu để xác định các vết chất có
trong hỗn họp chất thử. Các chất có màu có thể phát hiện ngay bằng mắt
thường, nhưng phần lớn các hợp chất hữu cơ không có màu nên muốn nhìn
thấy các vết cần sử dụng phương pháp hóa học hoặc vật lý.
Với phương pháp hóa học, người ta dùng các thuốc thử hiện màu đặc
trưng cho từng loại hợp chất. Thuốc thử được pha thành dung dịch có nồng

độ thích họp rồi cho tác dụng lên giấy bằng các phun lên bề mặt giấy hoặc
nhúng giấy vào thuốc thử.
Với phương pháp vật lý, hiện màu bằng cách soi vào đèn u v do nhiều
hợp chất hữu cơ hấp thụ được tia cực tím.

10


b. Sắc ký lớp mỏng (TLC)
Sắc ký lớp mỏng (SKLM) là phương pháp phân tích dung dịch chất
phân tích di chuyển trên một lớp mỏng chất hấp phụ mịn, vô cơ hay hữu cơ,
theo một chiều nhất định. Trong quá trình di chuyển, mỗi thành phần chuyển
dịch với tốc độ khác nhau tùy theo bản chất của chúng và cuối cùng dừng lại
ở các vị trí khác nhau.
Chất hấp phụ thường được sử dụng ữong SKLM là silica gel tráng trên
một nền phẳng như tấm nhôm, tấm kính. Trong quá trình hấp phụ, sẽ xảy ra
sự ưanh dành giữa dung môi và chất tan để chiếm chỗ ữên bề mặt chất hấp
phụ, và khi đạt được cân bằng, mỗi chất tan sẽ ở một vị trí khác nhau trên
bản mỏng.
Để tiến hành sắc ký, chất tan được chấm lên bản mỏng thành từng vết
chấm nhỏ, sấy cho dung môi bay hơi hết rồi triển khai với hệ dung môi thích
hợp trong một bình triển khai kín.
Để kiểm tra vết chất có thể sử dụng thuốc thử hiện màu hoặc soi bằng
đèn

uv. Thuốc thử màu có thể là hơi amoniac hoặc dung dịch axit suníuric

10%, Kmn04 , vanilin, FeCỈ3 ...
Để hiện vết người ta nhúng bản mỏng vào thuốc thử hoặc phun lên bản
mỏng sau đó hơ trên bếp điện hoặc sấy nóng để vết xuất hiện từ từ. Phương

pháp này thường được sử dụng để kiểm ữa và định hướng cho sắc ký cột.
Một hình thức SKLM cũng được sử dụng trong nghiên cứu hợp chất tự
nhiên là SKLM điều chế, dùng để điều chế, thu chất trực tiếp. Ở phương
pháp này, quá trình thực hiện tương tự như SKLM và sau khi triển khai xong
soi uv hoặc hiện hình bằng thuốc thử một vệt chuẩn để xác định rồi cạo lấy
lớp silica gel chứa chất càn điều chế và tiến hành rửa giải để thu chất.

11


c. sắc ký cột (CC)
Đây là phương pháp sắc ký phổ biến, đơn giản nhất. Chất hấp phụ là
pha tĩnh gồm có các loại silica gel (có kích thước hạt rất khác nhau) pha
thường và pha đảo (YMC, ODS, dianion). Chúng được nhồi vào cột (cột có
thể bằng thủy tinh hoặc kim loại, phổ biến nhất là cột thủy tinh). Độ mịn của
chất hấp phụ rất quan trọng, nó phản ánh số đĩa lý thuyết hay khả năng tách
của chất hấp phụ. Độ hạt của chất hấp phụ càng nhỏ thì số đĩa lý thuyết càng
lớn, khả năng tách càng cao và ngược lại. Tuy nhiên, hiện tượng tắc cộtcó
thể xảy ra nếu chất hấp phụ có kích thước hạt càng nhỏ, tốc độ chảy càng
giảm. Khi đó người ta phải sử dụng áp suất để kích thích dung môi chảy : áp
suất trung bình - MPLC, áp suất cao - HPLC.
Trong sắc ký cột, tỷ lệ đường kính (D) so với chiều cao cột (L) thể hiện
khả năng tách của cột. Tỷ lệ L/D phụ thuộc vào yêu cầu tách, tức là phụ
thuộc vào hỗn hợp chất cụ thể.
Trong sắc ký, Rf được gọi là tỷ lệ giữa quãng đường đi của chất cần
tách so với quãng đường đi của dung môi, vói mỗi chất khác nhau giá trị Rf
khác nhau. Nhờ vào sự khác nhau này mà ta có thể tách từng chất ra khỏi
hỗn hợp.
Trong sắc ký cột, việc đưa chất lên cột hết sức quan trong. Tùy thuộc
vào lượng chất và dạng chất mà người ta có thể đưa chất lên cột bằng các

phương pháp khác nhau. Nếu lượng chất nhiều và chạy thô thì phổ biến là
tẩm chất vào silica gel rồi làm khô tơi hoàn toàn sau đó đưa lên cột. Nếu
tách tinh, thì đưa trực tiếp chất lên cột bằng cách hòa tan chất vào dung môi
chạy cột với lượng tối thiểu.

12


Có 2 cách đưa chất hấp phụ lên c ộ t:
- Nhồi cột khô : theo cách này chất hấp phụ được đưa trực tiếp vào cột
khi còn khô sau đó gõ nhẹ lên thành cột để đưa chất hấp phụ xếp chặt trong
cột. Sau đó dùng dung môi chạy cột để chạy cột đến khi cột trong suốt.
- Nhồi cột ướt : chất hấp phụ được hòa tan trong dung môi chạy cột
trước với lượng dung môi tối thiểu. Sau đó đưa dần lên cột khi đủ lượng cần
thiết.
Khi chuẩn bị cột cần lưu ý không được để có bọt khí trong cột (nếu có
bọt khí sẽ gây nên hiện tương rối cột, và giảm hiệu quả tách). Và cột không
được nứt, gãy, rò.
Tốc độ chảy của dung môi có ảnh hưởng tới hiệu quả tách. Nếu tốc độ
dòng chảy quá lớn sẽ làm giảm hiệu quả tách. Nếu tốc độ chảy quá chậm thì
thòi gian sẽ kéo dài và ảnh hưởng tới tiến độ công việc.
1.23.2. sẳc ký khí
Đây là phương pháp sắc ký dùng chất khí làm pha động. Chất thử có
thể là chất khí lỏng hoặc chất rắn được chuyển thành thể bay hơi và nhờ một
luồng khí trơ làm chất tải dẫn đi qua pha tĩnh. Nếu pha tĩnh là một chất rắn
thì gọi là sắc ký khí - rắn. Nếu pha tĩnh là chất lỏng thì gọi là sắc ký khí lỏng. Ở sắc ký khí - rắn, chất rắn được dùng là những chất có hoạt tính hấp
phụ như silica gel, than hoạt tính, oxit nhôm. Ở sắc ký khí - lỏng, chất lỏng
được phân tán mỏng như một lớp phim trên bề mặt một chất rắn trơ gọi là
nền. Khi chất thử được khí tải dẫn đi qua pha tĩnh, chúng bị tách riêng ra tùy
theo hệ số phân bố của mỗi thành phần trong hỗn hợp chất thử đối với pha

tĩnh.

13


1.3. Các phương pháp hóa lý xác định cấu trúc của các họp chất hữu cơ
Cấu trúc hóa học của các họp chất hữu cơ được xác định nhờ vào
phương pháp phổ kết hợp. Tùy thuộc vào cấu trúc hóa học của từng chất mà
người ta sử dụng phương pháp phổ cụ thể. cấu trúc càng phức tạp thì yêu
cầu phối họp các phương pháp phổ càng cao. Trong một số trường hợp, để
xác định chính xác cấu trúc hóa học của các họp chất, người ta phải sử dụng
các phương pháp bổ sung khác như chuyển hóa hóa học, các phương pháp
sắc ký so sánh,...
1.3.1. Phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy, IR)
Phổ hồng ngoại được xây dựng dựa vào sự khác nhau về dao động của
các liên kết trong phân tử hợp chất dưới sự kích thích của tia hồng ngoại.
Mỗi kiểu liên kết được đặc trưng bởi một vùng bước sóng khác nhau.
Vì vậy, có thể xác định được các nhóm chức đặc trưng trong hợp chất dựa
vào phổ hồng ngoại, ví dụ như dao động hóa trị của nhóm OH tự do trong
các nhóm hydroxy là 3300 - 3450 cm'1, của nhóm cacbonyl
khoảng 1700 - 1750 cm'1, của nhóm
nhổm ete

c=0 ữong

c=c trong vùng 1630 - 1650 cm'1, của

c - o - c trong vùng 1020 - 1100 cm'1,...Đặc biệt vùng dưới 700

c m 1 được gọi là vùng vân tay, được sử dụng để nhận dạng các hợp chất hữu

cơ theo phương pháp so sánh trực tiếp.
Hiện nay, thông tin chung thu từ phổ hồng ngoại không nhiều, mà
lượng chất cần để thực hiện phép đo này lại càn đến 2 - 3 mg chất và khó thu
hồi lại. Vì vậy, đối với các họp chất thiên nhiên (lượng chất ít) thì phổ hồng
ngoại được đo sau khi hoàn chỉnh các phép đo khác như phổ cộng từ hạt
nhân hay phổ khối lượng.

14


1.3.2. Phổ khối lượng (Mass spectroscopy, MS)
Nguyên tắc của phương pháp phổ này là dựa vào sự phân mảnh ion của
phân tử chất nghiên cứu dưới sự bắn phá của chùm ion bên ngoài. Phổ MS
còn cho các pic ion mảnh khác nhau và dựa vào đó người ta có thể xác định
được cơ chế phân mảnh và từ đó dựng lại được cấu trúc hóa học của các hợp
chất. Hiện nay có rất nhiều loại phổ khối lượng, và các phương pháp chủ yếu
vẫn được thường dùng là :
- Phổ EI - MS (Electron Impact Ionization mass spectroscopy) dựa vào
sự phân mảnh ion dưới tác dụng của chùm ion bắn phá năng lượng khác
nhau, thông thường là 70Ev.
- Phổ ESI - MS (Electron Sprayt Ionization mass spectroscopy) gọi là
phổ phun mù điện tử. Phổ này được thực hiện với năng lượng bắn phá thấp
hơn nhiều so với phổ EI - MS, do đó phổ thu được chủ yếu là các pic ion
phân tử và các pic đặc trưng cho sự phá vỡ các liên kết có mức năng lượng
thấp, dễ bị phá vỡ.
Hiện nay, người ta còn sử dụng kết hợp với các phương pháp sắc ký
kết họp với khối phổ khác như : GC - MS (sắc ký khí - khối phổ) cho các
chất dễ bay hơi như tinh dầu hay LC - MS (sắc ký lỏng - khối phổ) cho các
hợp chất khác. Các phương pháp kết hợp này còn đặc biệt hữu hiệu khi phân
tích thành phần của hỗn chất (nhất là phân tích thuốc trong ngành dược ).

1.3.3. Phổ cộng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy,
NMR)
Phổ cộng từ hạt nhân là một phương pháp phổ hiện đại và hữu hiệu
nhất hiện nay. Các nhà nghiên cứu có thể xác định chính xác cấu trúc của
các họp chất, kể cả cấu trúc lập thể của phân tử vói việc sử dụng kết hợp các
kỹ thuật phổ NMR một chiều và hai chiều.

15


Nguyên lý chung của các phương pháp phổ NMR (phổ proton và phổ
cacbon) là sự cộng hưởng khác nhau của các hạt nhân từ (*H và 13C) dưới
tác dụng của tử trường ngoài. Sự cộng hưởng khác nhau này được biểu diễn
bằng độ dịch chuyển hóa học (chemical shift, S). Ngoài ra, đặc trưng của
phân tử còn được xác định dựa vào tương tác spin giữa các hạt nhân tử với
nhau (spin coupling).
1.3.3.1. P hoJH-NMR
Trong phổ *H -NMR, độ dịch chuyển hóa học (ỖH) của các proton được
xác định trong thang ppm từ 0 -14 ppm, tùy thuộc vào mức độ lai hóa của
nguyên tử cũng như đặc trưng riêng của từng phần. Dựa vào những đặc
trưng của độ dịch chyển hóa học và tương tác spin mà ta có thể xác định
được cấu trúc hóa học của hợp chất.
1.3.3.2. Phổ 13C-NMR
Phổ này cho tín hiệu vạch phổ cacbon. Mỗi nguyên tử cacbon sẽ cộng
hưởng ở một môi trường khác nhau và cho tín hiệu phổ khác nhau. Thang đo
của phổ 13C-NMR là ppm, với dài thang đo rộng là 0 - 230 ppm.
1.3.3.3. Phổ DEPT ịDistortionless Enhancement by Polarisation Transfer)
Phổ này cho ta các tín hiệu phân loại các loại cacbon khác nhau.Trên
phổ DEPT, tín hiệu của các cacbon bậc bốn biến mất. Tín hiệu của CH và
CH3 nằm về một phía và của CH2 về một phía trên phổ DEPT 135 Hz. Trên

phổ DEPT 90 Hz chỉ xuất hiện tín hiệu phổ CH.
1.3.3.4. Phổ 2D-NMR
Đây là các kỹ thuật phổ hai chiều, cho phép xác định tương tác của các
hạt nhân tử của phân tử trong không gian hai chiều. Một số kỹ thuật chủ yếu
thường được sử dụng như sau.

16


- Phổ HSQC (Heteronuclear Single Quantum Coherence) : Các tương

c được xác định nhờ vào các tương tác phổ này. Trên phổ,
một trục là phổ ^-N M R , còn trục kia là phổ 13c -NMR. Các tương tác

tác trực tiếp H -

HSQC nằm trên đỉnh các ô vuông ưên phổ.
- Phổ 1H- XH COSY i1H- ]H Chemical Shift Correlation Spectroscopy) :
Phổ này biễu diễn tương tác của H - H, chủ yếu là các proton đính với
cacbon liền kề nhau. Nhờ phổ này mà các phần của phân tử được nối ghép
lại vói nhau.
- Phổ HMBC (.Heteronuclear Multiple Bond Coherence) : Đây là phổ
biểu diễn tương tác xa của H và c trong phân tử. Nhờ vào các tương tác trên
phổ này mà từng phần của phân tử cũng như toàn bộ phân tử được xác định
về cấu trúc.
- Phổ NOESY (Nucler Overhauser Effect Spectroscopy) : Phổ này biểu
diễn các tương tác xa trong không gian của các proton không kể đến các liên
kết mà chỉ tính đến khoảng cách nhất định trong không gian. Dựa vào kết
quả phổ này có thể xác định cấu trúc không gian của phân tử.
Người ta còn sử dụng hiệu ứng NOE bằng kỹ thuật phổ NOE

differences để xác định cấu trúc không gian của phân tử. Các proton có cùng
phía cũng như gần nhau về không gian sẽ cộng hưởng mạnh hơn và cho tín
hiệu phổ với cường độ mạnh hơn bằng việc đưa vào một xung đúng bằng từ
trường cộng hưởng của một proton xác định.
Ngoài ra, người ta còn sử dụng phổ X - RAY (nhiễu xạ Rơngen) để xác
định cấu trúc không gian của toàn bộ phân tử. Tuy nhiên phạm vi sử dụng
của phổ này rất hạn chế, bởi vì yêu càu tiên quyết là cần phải có đơn tinh
thể. Đây là một điều kiện không phổ biến đối với các hợp chất hữu cơ.

17


Ngoài việc sử dụng các loại phổ, người ta còn sử dụng kết họp các
phương pháp chuyển hóa hóa học cũng như các phương pháp phân tích, so
sánh, kết hợp khác. Đặc biệt đối với các phân tử nhiều mạch nhánh dài, tín
hiệu phổ NMR bị chồng lấp nhiều, khó xác định chính xác được chiều dài
của mạch, cũng như đối với các phân tử có các đơn vị đường thì việc xác
định chính xác các loại đường cũng như cấu hình của đường phải sử dụng
phương pháp thủy phân rồi xác định bằng phương pháp so sánh LC-MS
hoặc GC-MS với các đường chuẩn dự kiến.

18


C H Ư Ơ N G 2 : Đ Ố I TƯ Ợ N G VÀ PH Ư Ơ N G PH ÁP
N G H IÊ N CỨU

2.1. Đổi tượng nghiên cứu
Mầu tươi hải sâm được thu thập tại vịnh Hạ Long, Quảng Ninh vào
tháng 8/2014 và được PGS.TS Đỗ Công Thung - Viện Tài nguyên và Môi

trường biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam xác định tên
khoa học là Holothurỉa scabra. Tiêu bản được giữ tại Viện Hóa học các Hợp
chất thiên nhiên.
2.2. Phương pháp phân lập các chất
Sử dụng các phương pháp : sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột kết hợp vói các
phương pháp phân tích hiện đại để phân tích, phân tách các phàn chiết và
phân lập các họp chất.
2.2.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC)
Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng DC - Alufolien 60 F254
(Merck). Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365
nm hoặc dùng thuốc thử KMn0 4 hoặc H2SO4 5% được phun đều trên bản
mỏng, sấy khô rồi hơ nóng từ từ cho đến khi hiện màu.
2.2.2. Sắc ký cột (CC)
Sắc ký cột được tiến hành vói chất hấp phụ là silica gel pha thường và
pha đảo. Silica gel pha thường có cỡ hạt là 0,04 - 0,063 min và 0,063 - 0,2
mm (Merck). Sử dụng các phương pháp sắc ký cột thường hoặc sắc ký cột
nhanh, sắc ký cột trung áp (nếu cần thiết).

19