Nghiên cứu đa dạng di truyền tập đoàn lúa chất lượng miền Nam bằng chỉ thị SSR

Khóa luận tốt nghiệp

Đào Thị Kim Dung

MỞ ĐẦU
1. Lí do chọn đề tài
Lúa gạo là cây lương thực lâu đời nhất được trồng ở nhiều nơi trên thế
giới. Diện tích gieo trồng của lúa gạo đứng thứ hai sau lúa mì, tổng sản lượng
lúa đứng thứ ba sau lúa mì và ngô. Lúa gạo là nguồn lượng thực quan trọng
cho khoảng 2/3 dân số trên thế giới, vì thế lúa trở thành loại lương thực được
con người tiêu thụ và ưa chuộng nhiều nhất. Hiện nay, diện tích trồng lúa
chiếm trên 1/10 diện tích đất trồng trên thế giới và có 15 nước trên thế giới
trồng lúa với diện tích hơn hơn 1 triệu ha, trong đó có tới 13 nước ở Châu Á.
Riêng Trung Quốc và Ấn Độ chiếm khoảng 50% diện tích trồng lúa và 56%
sản lượng lúa toàn cầu. Bangladesh, Indonexia, Thái Lan mỗi nước đều có
diện tích trồng lúa lớn hơn tổng diện tích trồng lúa của tất cả các nước Mĩ La
tinh.
Ở Việt Nam, lúa là một loại cây trồng quan trọng nhất, vừa là nguồn
lương thực chủ yếu vừa là nông sản có kim ngạch xuất khẩu lớn nhất hiện
nay. Tuy nhiên, do thị hiếu tiêu dùng của con người đòi hỏi ngày càng cao về
chất lượng của lúa gạo. Sự phát triển các giống lúa thơm là một trong những
mục tiêu quan trọng của các chương trình phát triển ngày nay. Tuy nhiên,
nguồn tài nguyên này đang dần dần bị thu hẹp do năng suất của các giống lúa
thơm chất lượng không cao, sự quan tâm đánh giá và khai thác chưa đúng
mức, diện tích bị thu hẹp để phát triển các giống lúa cải tiến ngắn ngày có
năng suất cao. Chính vì vậy việc thu thập và đánh giá nguồn tài nguyên lúa
chất lượng nhằm bảo tồn và khai thác nguồn gen quý của các dòng lúa chất
lượng để nâng cao năng suất và chất lượng đáp ứng nhu cầu sản xuất và tiêu
dùng là một vấn đề cần chú trọng. Xuất phát từ những lí do trên, chúng tôi
tiến hành đề tài: “Nghiên cứu đa dạng di truyền tập đoàn lúa chất lượng

Khoa Sinh – KTNN

1

Lớp K34SP - Sinh


Khóa luận tốt nghiệp

Đào Thị Kim Dung

miền Nam bằng chỉ thị SSR”.
2. Mục đích nghiên cứu
Đánh giá mức độ đa dạng và xác định mối quan hệ di truyền của các
nguồn gen lúa chất lượng ở miền Nam phục vụ công tác chọn tạo giống lúa có
năng suất, chất lượng cao cho miền Nam.
3. Ý nghiã khoa học và thực tiễn của đề tài
3.1. Ý nghĩa khoa học
Đánh giá đa dạng di truyền của các nguồn gen lúa chất lượng tạo cơ sở
lý luận cho việc chọn lọc các nguồn gen lúa chất lượng ưu tú phục vụ nghiên
cứu lai tạo giống và định hướng cho công tác thu thập bảo tồn đa dạng nguồn
gen lúa chất lượng ở mức phân tử.
3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Phát hiện sai khác di truyền của các giống lúa chất lượng có ý nghĩa
quan trọng trong việc xác định các allele hiếm, allele đặc trưng để nhận dạng
chính xác các nguồn gen ưu tú phục vụ nghiên cứu phục tráng và lai tạo giống
lúa chất lượng.

Khoa Sinh – KTNN

2

Lớp K34SP - Sinh


Khóa luận tốt nghiệp

Đào Thị Kim Dung

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU
1.1. Nguồn gốc, phân loại và giá trị kinh tế của cây lúa
1.1.1. Nguồn gốc, phân loại cây lúa
Lúa có 12 cặp nhiễm sắc thể (2n = 24) là cây tự thụ phấn. Người ta cho
rằng tổ tiên của chi lúa Oryza là một cây hoang dại cách đây ít nhất 130 triệu
năm. Hiện nay, có khoảng 21 loài cây hoang dại thuộc chi này và 2 loài lúa đã
được thuần hóa là lúa châu Á (Oryza sativa) và lúa châu Phi (Oryza
glaberrima) [15].
Lúa châu Á O. sativa tổ tiên là một loại lúa hoang (O. rufipogon) phân
bố quanh chân núi Hymalaya, có 2 thứ sau:
+ Oryza sativavar indica (ở phía Ấn Độ)
+ Oryza sativavar japonica (ở phía Trung Quốc)
Hiện nay, đây là 2 loài lúa chính được gieo trồng làm cây lương thực
trên khắp thế giới. Có nhiều giả thuyết khác nhau về nơi đầu tiên tiến hành
gieo trồng hay thuần hóa giống lúa này.
Lúa châu Phi: đã được gieo trồng trong khoảng 3500 năm trên lưu vực
châu thổ sông Niger. Tuy nhiên loài này không được phát triển rộng thậm chí
việc gieo trồng còn giảm do các giống châu Á được đem tới trong khoảng thế
kỷ 11 [34].
Theo Cadnalle (1998) cây lúa có nguồn gốc từ Ấn Độ. Còn theo
Roseleviez (1931) cây lúa có nguốn gốc từ Đông Nam Á đặc biệt là từ Ấn Độ

và Đông Dương.
Quan điểm được nhiều người công nhận nhất là cây lúa có nguồn gốc
từ Đông Nam Á. Vì đây là vùng có diện tích trồng lúa lớn nhất thế giới, có

Khoa Sinh – KTNN

3

Lớp K34SP - Sinh


Khóa luận tốt nghiệp

Đào Thị Kim Dung

khí hậu nhiệt đới nóng ẩm phù hợp với sự sinh trưởng của cây lúa. Đây cũng
là nơi trồng lúa sớm nhất.
Thông qua việc trao đổi, mua bán mà cây ngày càng được phát tán
rộng rãi trên khắp thế giới như Nhật Bản (năm 300 TCN), Triều Tiên (khoảng
năm 850 – 500 TCN), Địa Trung Hải của châu Âu (khoảng năm 800 TCN),
Nam Mỹ (đầu thế kỷ 18) [34].
Cây lúa nước được phân loại như sau:
Ngành:

Hạt kín (Angiospermae)

Lớp :

Một lá mầm (Monocotyledoneae)

Bộ

:

Lúa (Poales)

Họ

:

Lúa (Poaceae)

Chi

:

Lúa (Oryza)

1.1.2. Giá trị kinh tế của cây lúa ở Việt Nam
Lúa là cây lương thực quan trọng thứ 2 trên thế giới sau cây ngô (Bùi
Mạnh Cường, 2007) [1], được gieo trồng ở 112 nước, cung cấp lương thực
cho hơn 65% dân số thế giới. Ở Việt Nam, lúa gạo được sử dụng trong hầu
hết các bữa ăn của người dân.
Trong gần 30 năm trở lại đây sản xuất lúa gạo đã có bước tăng trưởng
mạnh (70%). Năm 2011, Việt Nam đã suất khẩu 7,35 triệu tấn gạo mang về
3,5 tỉ USD cho nền kinh tế quốc dân, đứng thứ 2 trên thế giới (sau Thái Lan)
[4]. Cây lúa đã góp phần giải quyết tình trạng thiếu đói và hiện nay là bảo
đảm an ninh lương thực trong nước.
Ngoài ra, những phụ phẩm thu được từ cây lúa như rơm, rạ, trấu
cám…đã được ứng dụng triệt để trong chăn nuôi, trồng trọt, làm phân bón,

chất đốt giúp giảm chi phí trong nông nghiệp và bảo vệ môi trường.

Khoa Sinh – KTNN

4

Lớp K34SP - Sinh


Khóa luận tốt nghiệp

Đào Thị Kim Dung

1.2. Tình hình sản xuất lúa gạo trên thế giới và Việt Nam
1.2.1. Tình hình sản xuất lúa gạo trên thế giới
Diện tích trồng lúa trên thế giới đã tăng rõ rệt từ năm 1961 đến năm
1980. Năng suất không ngừng được cải thiện, đặt biệt từ sau cuộc cách mạng
xanh của thế giới vào những năm 1965 - 1970, với sự ra đời của các giống lúa
thấp cây, ngắn ngày, mà tiêu biểu là giống lúa IR5, IR8. Các giống lúa này có
yêu cầu kỹ thuật cao hơn, tạo điều kiện cho các nước phát triển tăng nhanh
sản lượng lúa bằng con đường tăng năng suất nhờ có điều kiện phát triển hệ
thống thủy lợi hoàn chỉnh và đầu tư phân bón, kỹ thuật cao (bảng 1.1).
Đến những năm 1990, dẫn đầu năng suất lúa trên thế giới là các nước
Triều Tiên, Úc, Mỹ, Nhật Bản, Tây Ban Nha (IRRI, 1990)[16]. Trong khi các
nước có diện tích lúa lớn, điều kiện tự nhiên khắc nghiệt, thiếu điều kiện đầu
tư, cải tạo môi trường canh tác và không thể đầu tư vào nông nghiệp cao, nên
năng suất lúa vẫn còn rất thấp và tăng chậm. Điều này làm năng suất lúa bình
quân trên thế giới cho đến nay vẫn còn ở khoảng 4,0 - 4,3 tấn/ha, chỉ bằng
phân nửa năng suất lúa ở các nước phát triển (bảng 1.1).

Khoa Sinh – KTNN

5

Lớp K34SP - Sinh


Khóa luận tốt nghiệp

Đào Thị Kim Dung

Bảng 1.1. Diện tích, năng suất, và sản lượng lúa trên thế giới qua các năm

Năm

Diện tích (triệu ha)

Năng suất (tấn/ha)

Sản lượng (triệu tấn)

1965

124,98

2,03

254,08

1970

133,10

2,38

316,38

1975

141,97

2,51

357,00

1980

144,67

2,74

396,87

1985

143,90

3,25

467,95

1990

146,98

3,53

518,21

1995

149,59

3,66

547,43

2000

153,94

3,89

598,40

2005

151,71

3,94

597,32

2006

147,53

3,85

568,30

2007

147,26

3,98

585,73

2008

150,31

4,06

610,84

2009

152,90

4,12

629,30

2006

155,30

4,12

641,08

2007

155,05

4,23

656,50

2008

157,73

4,36

689,14

2009

158,30

4,32

685,24

Nguồn: FAOSTAT, 2011
1.2.2. Tình hình sản xuất lúa gạo ở Việt Nam

Khoa Sinh – KTNN

6

Lớp K34SP - Sinh


Khóa luận tốt nghiệp

Đào Thị Kim Dung

Trước năm 1975, diện tích trồng lúa cả nước dao động trong khoảng
4,42 - 4,92 triệu ha, năng suất có tăng nhưng chậm, chỉ khoảng 700kg/ha
trong vòng 20 năm. Sản lượng lúa hai miền trên dưới 10 triệu tấn (bảng 1.2 ).
Sau năm 1975, diện tích trồng lúa tăng khá nhanh và ổn định, nhưng
năng suất bình quân giảm sút khá nghiêm trọng do đất đai mới khai hoang
chưa được cải tạo, thiên tai và sâu bệnh, cơ chế quản lý nông nghiệp trì trệ
không phù hợp.
Bảng 1.2. Diện tích, năng suất và sản lượng lúa ở Việt Nam qua các năm
Năm

Diện tích (triệu ha)

Khoa Sinh – KTNN

Năng suất(tấn/ha)

7

Sản lượng (triệu tấn)

Lớp K34SP - Sinh


Khóa luận tốt nghiệp

Đào Thị Kim Dung

1955

4,42

1,44

6,36

1960

4,60

1,99

9,17

1965

4,83

1,94

9,37

1970

4,72

2,15

10,17

1975

4,94

2,16

10,54

1980

5,54

2,11

11,68

1985

5,70

2,78

15,87

1990

5,96

3,21

19,14

1995

6,77

3,69

24,96

2000

7,67

4,24

32,53

2001

7,49

4,29

32,11

2002

7,50

4,59

34,45

2003

7,45

4,64

34,57

2004

7,45

4,86

36,15

2005

7,33

4,89

35,79

2006

7,32

4,89

35,85

2007

7,21

4,99

35,94

2008

7,41

5,22

38,72

Sơ bộ

7,44

5,23

38,89

2009

Nguồn : Tổng cục Thống kê VN, 2011
Bước sang 1980, năng suất lúa tăng dần do khắc phục được những
nguyên nhân trên như: thay đổi cơ chế quản lý nông nghiệp bằng chủ trương
khoán sản phẩm trong sản xuất, cải thiện hệ thống kênh mương...Sau những
nỗ lực khắc phục khó khăn nước ta đã đạt được những thành tựu to lớn. Từ
một nước phải nhập khẩu gạo hàng năm chúng ta đã tự túc được lương thực
và dần dần tái hòa nhập vào thị trường lương thực thế giới, chiếm lĩnh ngay vị

Khoa Sinh – KTNN

8

Lớp K34SP - Sinh


Khóa luận tốt nghiệp

Đào Thị Kim Dung

trí quan trọng là nước xuất khẩu gạo đứng hàng thứ 3 rồi thứ 2 trên thế giới
sau Thái Lan.
Từ năm 1997 đến nay, hằng năm nước ta xuất khẩu trung bình trên
dưới 4 triệu tấn gạo, đem về một nguồn thu nhập ngoại tệ đáng kể. Hiện nay,
VN đứng hàng thứ 6 về diện tích gieo trồng và đứng hàng thứ 5 về sản lượng
lúa. Hạt gạo VN chẳng những đảm bảo yêu cầu về an ninh lương thực trong
nước mà còn góp phần quan trọng trong thị trường lúa gạo thế giới.
Trong những năm qua, gạo xuất khẩu VN tăng trưởng về số lượng và
chất lượng cũng như mở rộng thị trường. Đến nay, ngoài các thị trường truyền
thống của VN như là Iraq, Iran (Trung Đông), thị trường Châu Á (Indonesia,
Philippines), VN đã mở rộng và phát triển thêm một số thị trường tiềm năng ở
các nước Châu Phi, Mỹ La tinh…(bảng 1.3)

Bảng 1.3. Thị trường xuất khẩu gạo của Việt Nam năm 2010
Thị trường

Lượng(nghìn

Trị giá (nghìn USD)

tấn)

Khoa Sinh – KTNN

9

Lớp K34SP - Sinh


Khóa luận tốt nghiệp

Đào Thị Kim Dung

Philippines

1.475,82

947.378,77

Indonesia

687,21

346.017,26

Singapore

539,29

227.791,80

Cu Ba

472,27

209.216,94

Malaysia

398,01

177.688,70

Đài Loan

353,14

142.704,50

Hồng Kông

131,12

65.176,23

Trung Quốc

124,46

54.636,94

Đông Timo

116,72

51.526,93

Nga

83,69

36.059,49

Nam Phi

31,79

13.365,04

Brunei

15,14

7.658,56

Ucraina

13,15

6.149,16

Australia

7,46

4.327,17

Bỉ

5,91

2.716,95

Tiểu vương Quốc Ả Rập thống nhất

5,90

2.708,17

Ba Lan

5,02

2.058,80

Pháp

2,58

1.070,36

Hà Lan

1,42

757,90

Italia

1,39

829,32

Tây Ban Nha

0,84

392,84

6.886,17

3.247.860,36

Tổng cộng
Nguồn: Tổng cục thống kê, 2011

Về giá cả, gạo VN đã dần dần được nâng lên tương đương với gạo Thái
Lan, vào cùng một thời điểm và cấp loại gạo. Điều này cho thấy, chất lượng
gạo và quan hệ thị trường của gạo VN đã có thế cạnh tranh ngang hàng với

gạo Thái Lan trên thị trường thế giới (bảng 1.4 ).

Khoa Sinh – KTNN

10

Lớp K34SP - Sinh


Khóa luận tốt nghiệp

Đào Thị Kim Dung

Bảng 1.4. Giá gạo xuất khẩu của Việt Nam so với một số nước
(giá FOB, USD/tấn)
Loại gạo
Thái 100B ( 100% gạo nguyên )

Giá gạo (đầu 6/2011 đến cuối 7/2011)
550

Thái 5% tấm

520

Thái 25% tấm

480

Việt 5% tấm

470

Việt 25% tấm

435

Ấn Độ 5% tấm

330

Pakistan 25% tấm

315

Pakistan 15-20% tấm

460

Ấn Độ 25% tấm

510

Nguồn: Thị trường lúa gạo.com và gentraco.com.vn, 2011
Tổng sản lượng và giá trị xuất khẩu gạo của Việt Nam tăng lên rõ rệt kể
từ lúc nước ta tham gia thị trường xuất khẩu gạo thế giới năm 1989 (bảng1.5)

Khoa Sinh – KTNN

11

Lớp K34SP - Sinh


Bảng 1.5. Số lượng và giá trị gạo xuất khẩu của Việt nam
(Bộ thương mại)
Năm

Tổng lượng gạo xuất

Tổng giá trị (triệu USD)

1989

khẩu(triệu tấn)
1,37

310,29

1990

1,78

274,52

1991

1,17

230,50

1992

1,54

405,53

1993

1,65

335,06

1994

1,96

420,86

1995

2,03

538,84

1996

3,05

868,42

1997

3,86

891,34

1998

3,79

1.005,48

1999

4,56

1.008,94

2000

3,39

615,82

2001

3,53

544,11

2002

3,25

608,12

2003

3,92

693,54

2004

4,06

895,18

2005

5,20

1279,27

Nguồn: Hiệp hội lương thực VN, 2011
1.3. Chỉ thị phân tử trong nghiên cứu đa dạng di truyền
1.3.1. Chỉ thị sinh hoá
Chỉ thị sinh hóa được phát hiện nhờ phương pháp izozym, dựa trên
cơ sở gen quy định sự tổng hợp protein. Izozym là enzym cùng xúc tác cho

một phản ứng trong tế bào nhưng do các locus gel quy định. Các enzym có
bản chất là protein và là chất đa điện ly nên trong dung dịch nó ở trạng thái
phân cực. Khi chịu tác dụng của dòng điện một chiều, các phân tử protein
khác nhau về kích thước, khối lượng phân tử, lực tĩnh điện,…sẽ chuyển động
với tốc độ khác nhau và sẽ phân bố ở vị trí khác nhau trên gel sau khi điện di.
Các phân tử protein enzym là do gen quy định. Trong quá trình tiền
hóa, dưới tác dụng của điều kiện môi trường bên ngoài và bên trong cơ thể,
các gen biến đổi hình thành các alen khác nhau và nó mã hóa cho quá trình
tổng hợp các phân tử protein khac nhau (Trịnh Đình Đạt và cs.,1999) [2].
Có thể chia izozym thành 2 dạng:
- Izozym đơn gen: các izozym này chịu sự kiểm soát của 1 gen.
- Izozym đa gen: các izozym chịu sự kiểm soát của nhiều gen (đa gen)
Việc phân tích izozym giữa chúng ta phát hiện những alen đồng trội và
đây là phương pháp tương đối rẻ tiền, dễ tiến hành hơn các phương pháp sử
dụng chỉ thị ADN. Tuy nhiên, với số lượng ít ỏi izozym, chúng chỉ thể hiện ở
những giai đoạn nhất định của quá trình phát triển cá thể và thực tế nó cũng
chỉ là sản phẩm của gen nên chưa phản ánh được chính xác bản chất di truyền
của các cá thể. Do vậy, việc sử dụng chỉ thị izozym còn có những hạn chế
nhất định (Nguyễn Văn Đồng, 1998) [3].
1.3.2. Chỉ thị di truyền
Các chỉ thị phân tử được phát hiện thông qua phương pháp đánh dấu
các đoạn Oligonucleotide và đều có một số đặc điểm chung là:
+ Không bị ảnh hưởng bởi các yếu tố môi trường ;
+ Thường liên kết với các tính trạng trội hoặc siêu trội ;
+ Mang tính ổn định và được di truyền qua các thế hệ.
Chỉ thị phân tử rất đa dạng, phong phú và được chia thành các nhóm
như sau:

+ Chỉ thị dựa trên cơ sở phương pháp lai ADN hay chỉ thị RFLP
(Restriction Fragment Length Polymorphism) [8]. Dựa vào các băng ADN
trên gel điện di có thể phát hiện được các thể đồng (hoặc dị) hợp tử trội (lặn).
+ Nhóm chỉ thị phân tử dựa trên nguyên lý khuếch đại các gel mong
muốn bằng kĩ thuật PCR ( Polymerase Chain Reaction): RAPD, SSA,
AFLP…
1.3.3. Các chỉ thị dựa trên phản ứng PCR
Trong giới hạn nghiên cứu của khóa luận tốt nghiệp tôi xin được trình
bày một số chỉ thị phân tử như sau:
a. Chỉ thị RFLP (Restriction Fregment Length Polymorphism)
*Nguyên lí của phương pháp RFLP.
Phương pháp RFLP (Đa hình chiều dài các đoạn ADN cắt giới hạn) do
Botstein và cs,. phát minh 1980 [10]. Nguyên lý của phương pháp dựa trên
các đặc tính cơ bản sau:
- Tính chất cắt đặc trưng của các enzym giới hạn (Restriction enzym – RE.
- Tính chất bắt cặp tương đồng giữa các chuỗi ADN theo NTBS
Nguyên lí của phương pháp AFLP là: ADN của bộ gen sau khi sử lý
bằng enzym giới hạn sẽ bị cắt thành các đoạn có kích thước khác nhau. Sau
khi điện di, các đoạn này sẽ phân bố ở những vị trí khác nhau trên gel, qua
biến tính các đoạn này sẽ trở thành những sợi đơn và được chuyển lên màng
cellulose hoặc nylon với vị trí không thay đổi. Trong quá trình lai ADN tiếp
theo trên mẫu dò (thực chất là một đoạn ADN) sẽ bắt cặp với những đoạn có
trình tự nucleotide tương đồng với nó trên màng lai – kĩ thuật lai Southerm.
Khi phân tích đa hình di truyền, sự đa dạng của các cá thể được thực hiện qua
sự khác nhau của các băng trên màng lai.


*Ứng dụng của RFLP: RFLP là chỉ thị được dùng phổ biến nhất và
nhiều nhất, có thể kể ra các ứng dụng đó là:

- Xác định con lai F1 trong quần thể con lai có lẫn các cá thể tự phối ;
- Đánh giá sự đa dạng di truyền của các quần thể sinh vật;
- Xác định các dòng giống khác nhau. Sollor và Backman (1983) đã
phân biệt các dòng nội phối của ngô và cà chua với 20 dấu chuẩn RFLP;
- Xác định biến dị sôma. Các biến dị này là do ảnh hưởng của các đột
biến không xác định và có thể xảy ra trong quá trình nuôi cấy invitro
- Thiết lập bản đồ phân tử các gen cần quan tâm trong quá trình nghiên
cứu (Bùi Mạnh Cường, 2007) [1].
b. Chỉ thị AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)
*Nguyên lý của phương pháp
AFLP (Đa hình chiều dài các đoạn ADN được khuếch đại chọn lọc) là
phương pháp dựa trên cơ sở của kĩ thuật PCR. Nguyên lý của phương pháp
này là gắn các đoạn ADN ngắn (adapter) vào 2 đầu của mạch ADN sau khi đã
được cắt bằng enzym giới hạn. Sau đó thiết kế mồi theo các đoạn ADN ngắn
đó có gắn thêm một hoặc một số nucleotide và tiến hành phản ứng PCR.
Sản phẩm PCR được phân tích trên gel polyacrylamit, kết quả thu được
thường là 50 – 100 băng ADN/1 mẫu thí nghiệm. Số lượng các đoạn phân tử
ADN được khuếch đại phụ thuộc vào lượng C và G có trong primer. C và G
càng nhiều các đoạn ADN được khuếch đại càng ít. Tương tự, nếu kích thước
genome càng nhỏ số đoạn phân tử được khuếch đại càng ít.
*Ứng dụng: AFLP là phương pháp xác định độ đa hình cao, xây dựng
bản đồ chỉ thị ADN có hiệu quả nhất so với các chỉ thị khác tiết kiệm thời
gian, dễ dàng lặp lại và có thể sử dụng để phân tích ADN từ bất kì nguồn gốc
nào hay bất kì mức độ phức tạp nào.


Tuy nhiên, AFLP là loại chỉ thị di truyền trội, giá thành rất đắt nên
phần nào hạn chế khả năng sử dụng của nó (Nguyễn Văn Đồng, 1998) [3].
c. Chỉ thị RAPD (Random Amplified Polimorphism DNA)
*Nguyên lý của RAPD:

RAPD (đa hình các đoạn gen khuếch đại ngẫu nhiên) là một trong
những phương pháp nghiên cứu đa hình dựa trên cơ sở của kỹ thuật PCR do
William (1990), Wesh và cs. phát minh [33].
Nguyên lý của phương pháp là: sử dụng một đoạn oligonucleotide có
kích thước 8 – 12 (thông thường là 10) nucleotide không cần biết trước trình
tự làm mồi cho phản ứng PCR. Các đoạn oligonucleotide đó do vậy có thể
làm mồi xuôi, hoặc có thể là mồi ngược. Trong phản ứng, các mồi RAPD gắn
ngẫu nhiên vào ADN khuôn ở bất kì vị trí nào mà có trình tự bổ sung với nó.
Theo tính toán một mồi ngẫu nhiên gồm 10 nucleotide thì xắc suất bắt cặp của
nó là:1/410 =1/1.048.576, có nghĩa là một đoạn ADN khuôn có 1.048.576 cặp
nucleotide thì có 1 trình tự bắt cặp với mồi. Giả sử một hệ genome đơn bội
của lúa có kích thước 550.000.000 bp thì với loại mồi ngẫu nhiên trên có thể
có 524 vị trí bắt cặp với mồi, nghĩa là có thể có 262 đoạn ADN được nhân
lên. Trong thực tế số lượng các đoạn được nhân bội nhỏ hơn nhiều vì nó phụ
thuộc vào độ dài đoạn được nhân và sự sắp xếp các trình tự bắt cặp với mồi
trên ADN của bộ gen.
Khi phân tích đa hình di truyền bằng phương pháp RAPD, nếu 2 cá thể
có bộ gen hoàn toàn giống nhau thì khi tiến hành phản ứng PCR – RAPD với
bất kì mồi nào cũng cho các băng ADN giống nhau. Nếu chúng ít nhiều có sự
khác nhau về bộ gen thì với một số mồi sẽ cho những băng khác nhau giữa
chúng. Sự khác nhau này thể hiện sự đa hình di truyền của các cá thể cần
nghiên cứu. Do đó, nó được sử dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm di
truyền phân tử.


*Ứng dụng của phương pháp: ngoài ứng dụng trong phân tích đa hình
di truyền, RAPD còn được sử dụng cho các mục đích sau:
- Phân tích con lai F1giữa bố mẹ đa hình với một mồi nào đó. Khi đó
con lai F1 sẽ có tất cả các băng ADN của bố và mẹ;
- Lập bản đồ gen liên kết;

- In dấu vân tay ADN;
- Phân tích di truyền của các quần thể.
d. Chỉ thị SSR (Simple Sequence Repeat)
Trong các nghiên cứu về đa dạng di truyền, chỉ thị SSR là một trong
những chỉ thị được dùng phổ biến nhất bởi kỹ thuật đơn giản và cho độ chính
xác cao.
SSR hay còn gọi là vi vệ tinh, là những đoạn trình tự ADN đơn giản lặp
lại nối tiếp và chỉ gồm 1 - 6bp. (Litt and Luty, 1989) [20]. Tuy nhiên, tuỳ từng
loài mà số lượng các nucleotide trong mỗi đơn vị lặp lại có thể thay đổi từ
một đến hàng chục và số lượng đơn vị lặp lại có thể biến động từ hai đến hàng
chục lần hoặc nhiều hơn. Thông thường có các kiểu lặp lại:
- Lặp lại hoàn toàn: các đơn vị lặp lại sắp xếp nối tiếp nhau.
- Lặp lại không hoàn toàn: xen kẽ vào các đơn vị lặp lại là một hoặc một
số nucleotide khác.
- Lặp lại phức tạp: xen kẽ giữa các đơn vị lặp lại khác nhau.
Thông thường, các SSR có mặt chủ yếu ở các vùng dị nhiễm sắc của
nhiễm sắc thể như vùng tâm động hoặc các đầu mút, chúng giữ vai trò quan
trọng trong việc điều hoà phiên mã đối với các gen hoạt động ở vùng nguyên
nhiễm sắc, góp phần làm tăng tính ổn định cơ học của nhiễm sắc thể trong các
quá trình phân bào và có thể chứa đựng những thông tin di truyền liên quan
đến sự xác định giới tính ở cả động vật và thực vật.


Bản chất đa hình của SSR có thể được sinh ra do sự nhân bội từ
ADN tổng số của hệ gen nhờ sử dụng hai đoạn mồi bổ trợ với trình tự gần
kề hai đầu của vùng lặp lại. Sự khác nhau về độ dài ở locus SSR được phát
hiện bởi sự nhân đoạn ADN nhờ phản ứng PCR. Kích thước của sản phẩm
PCR được xác định một cách chính xác bằng điện di trên gel agarose hoặc gel
polyacrylamide với sự khác nhau về độ dài có thể rất nhỏ (2bp). Chỉ thị SSR
dùng để đánh giá đa dạng di truyền, xác lập quan hệ di truyền của cây trồng,

chọn lọc tính kháng bệnh, một số tính trạng có quan hệ chặt chẽ với năng suất
ở cây lúa, lập bản đồ, nghiên cứu locus tính trạng số lượng (QTL).
- Ưu điểm và hạn chế của chỉ thị SSR
Thuận lợi to lớn của sự phân tích SSR là phương pháp này biểu hiện
số lượng lớn sự đa hình. Hơn nữa, khả năng phân biệt các cá thể khi có sự
kết hợp các locus được kiểm tra làm cho phương pháp này rất hữu dụng
trong các thí nghiệm dòng chảy gel, xác định cây trồng và phân tích mối
quan hệ di truyền.
SSR được sử dụng rộng rãi và hiệu quả trong nghiên cứu cấu trúc di
truyền lúa trồng O. sativa, nghiên cứu quá trình tiến hóa, làm rõ độ thuần của
vật liệu lai tạo giống..., do đây là chỉ thị đồng trội cho đa hình cao và ổn định.
Hiện nay, hơn 15.000 chỉ thị SSR đã được thiết lập [35], phủ kín trên bản đồ
liên kết di truyền của lúa (Giarrocco và ctv, 2007) [16]. Trong những năm gần
đây, nhiều công trình sử dụng chỉ thị SSR nghiên cứu đa dạng di truyền và
ADN fingerprinting để nhận dạng giống ở lúa đã được công bố (Kalyan và
ctv, 2006) [19] ; Navraj và ctv, 2009 [23].
Đã có khoảng 2740 chỉ thị SSR cho toàn bộ Bộ gen lúa và như vậy
trung bình cứ 157kp của phân tử ADN có một chỉ thị SSR (Akagi và ctv,
1996 [9]; Chen và ctv, 1997 [11]; Chen và ctv, 2002 [12]; Cho và ctv, 2000


[13]; Paunaud và ctv, (1996) [27] ; Temnykh, 2000 [30]; Temnykh, 2001
[29]).
SSR là marker đồng trội, do đó dị hợp tử có thể dễ dàng được xác
định trong quá trình thực nghiệm. Tính đồng trội của SSR sẽ gia tăng sự
hiệu quả và độ chính xác của những phép tính toán di truyền quần thể dựa
trên những marker này so với những marker khác như AFLP và RAPD. Hơn
nữa, việc xác định dị hợp tử ở thế hệ F1 sẽ làm cho những phân tích phả hệ,
sự lai giống, dòng chảy gel trở nên dễ dàng hơn. SSR là công cụ hữu hiệu để
chọn lọc giống, đa dạng hoá về các vật liệu di truyền và dùng trong thiết lập

bản đồ di truyền. Chẳng hạn, tác giả Parasnis phát hiện đoạn lặp lại GATA
kích thước 5kb chỉ có ở cây đu đủ đực không có ở cây đu đủ cái bằng
marker SSR.
Hạn chế của kỹ thuật SSR là quá trình thiết kế primer quá đắt, mỗi
loại primer chỉ đặc trưng cho một loài và không thể áp dụng phân tích trên
một hệ thống lớn bao gồm nhiều loài có quan hệ di truyền xa nhau.
1.4. Tổng quan về lúa chất lượng
1.4.1. Tính trạng mùi thơm
Ahn và cs., (1992) [8] báo cáo chỉ thị RG 28 liên kết với gel điều kiển
mùi thơm cây lúa fgr nằm trên NST số 8 của giống lúa Della và Basmati 370.
Theo Lorieux và cs., (1995) [21] có 4 loại chỉ thị phân tử (RFLP,
RAPD, STS, izozym) được sử dụng lập bản đồ chỉ thị phân tử cho gel điều
khiển mùi thơm, kết quả xác định, có nhiều chỉ thị trên nhiễm sắc thể số 8 liên
kết chặt chẽ với gel điều khiển sự hiện diện của 2-AP (2 – axetyl – 1 –
pyroline), hợp chất chính tạo ra mùi thơm của lúa. Jin và cs., (1996) [18] dùng
300 RAPD điều tra đa hình tính trạng thơm của con lai từ giống bố mẹ Khao
Dawk Mali 105 (thơm) và CT 9993 (không thơm), kết quả cho thấy tính đa


hình giữa hai giống khá cao (64,1%).
Neelu Jain và cs., (2003) [26] sử dụng 15 chỉ thị SSR đã được sắp xếp
trên nhiễm sắc thể số 8. Garland và cs., (2000) [15] phân tích sự đa dạng về
chất lượng gạo của 12 giống lúa Basmati trên thị trường sử dụng các chỉ thị
SSR cho mật độ đa hình cao giữa giống Basmati thơm và không thơm.
Shu Xia Sun và cs., (2008) [28] tiến hành kiểm tra gel thơm và không
thơm trên lúa ở nhiễm sắc thể số 8 bằng kỹ thuật SSR với tám cặp mồi. Kết
quả cho thấy rằng cặp mồi Ch - 29B và R2 không đa hình mà chỉ cặp mồi
Aro7 đa hình, kích thước của cặp mồi Aro7 được xác định 302 bp. Ngoài ra,
cũng xác định được mồi RM23097 liên kết với locus hương thơm với khoảng
cách là 0,71 cM. Các gen thơm (fgr) được thể hiện giữa marker Aro7 (0,57

cM) và RM515 (0,71 cM). Dựa trên cơ sở liên kết phân tử và BAC (bacterial
artificial chromosome) trên nhiễm sắc thể số 8 được xây dựng (hình 1) [27].

Hình 1.1: Vi trí gen thơm trên nhiễm sắc thể số 8
1.4.2. Các tính trạng chất lượng
Ngoài tính trạng của mùi thơm, chất lượng của lúa phụ thuộc nhiều yếu
tố như hàm lượng amyloza, hàm lượng protein, dạng nội nhũ…


a. Tính trạng amyloza
Nhiều nghiên cứu cho thấy, hàm lượng amyloza có liên quan mật thiết
đến độ hóa hồ. He và cs., (1999), sử dụng chỉ thị CT 201 – RZ 450 để nghiên
cứu hệ di truyền độ hóa hồ trên con lai F1 ZY Q8 (O.indica) và ZX 17
(O.japodica) kết quả cho thấy cả gen chính và gel phụ của độ hóa hồ đều nằm
trên nhiễm sắc thể số 6. Thực tế về kiểu hình cho thấy, khả năng hóa hồ quyêt
định rất lớn hàm lượng amyloza (Trương Bá Thảo, 2006) [7].
b. Tính trạng hàm lượng protein
Đặc điểm di truyền về hàm lượng protein do đa gel kiểm soát phân bố
trên các nhiễm sắc thể số 1, 2, 4, 6, 9, 12, (các thành phần của glutein) nhiễm
sắc thể 7, 11, (protein dự trữ trong nội nhũ) nhiễm sắc thẻ 5, 7, 12, (các thành
phần của prolamin). Hàm lượng protein biến đổi mạnh mẽ do tác động của
môi trường từ 0,130 đến 0,372. Kết quả nghiên cứu của Shenoy và cs.,
(1991), chứng tỏ rằng hệ số di truyền hàm lượng protein đạt 71%. Một số cặp
lai nghiên cứu cho thấy hệ số di truyền hàm lượng protein rất thấp 11,1%. Từ
những biến động đó cần phải phân nhóm di truyền trên các nhóm khác của
các giống lúa địa phương, xem như là nguồn vật liệu lai phục vụ cho chương
trình chọn giống lúa tốt hơn.
1.4.3. Nghiên cứu chọn tạo lúa chất lượng
Viện Nghiên cứu lúa Quốc tế bắt đầu phát triển giống lúa thơm
Basmati năng suất cao vào đầu năm 1970. Nghiên cứu được thực hiện trên

những cặp lai đầu tiên, giữa giống lúa Basmati 370 và các dòng lúa Indica cải
tiến có hàm lượng amyloza trung bình và nhiệt độ hóa hồ trung bình. Những
dòng thấp cây từ quần thể con lai được chọn lọc, những dòng này có mức độ
hữu thụ khác nhau và dạng cây khác nhau. Sau khi tiến hành lai chéo các


dòng này thu được các dạng cây và độ hữu thụ khác nhau. Những cây có dạng
khỏe và độ hữu thụ cao được chọn ra để phân tích hàm lượng amyloza, nhiệt
độ hóa hồ và hương thơm. Những dòng có dạng cây xấu, độ hữu thụ thấp,
chất lượng hạt kém và độ thơm thấp được loại bỏ qua các thế hệ. Sau một số
chu kỳ lai và chọn lọc những dòng có dạng cây khỏe, thấp cây, đáp ứng được
các đặc điểm về chất lượng như Basmati được chọn lọc và tiến hành khảo
nghiệm tại IRRI, Ấn Độ và Pakistan [11].
Tác giả Song và cộng sự tiến hành nghiên cứu hương thơm lá lúa giữa
lúa thơm nhị bội thể và lúa không thơm tứ bội thể, kết quả cho thấy tỷ lệ giữa
các cây không có hương thơm và cây có hương thơm là 35:1 ở thế hệ F1 và
3:1 ở thế hệ F2. Ren và cộng tác viên khi lai giữa dòng lúa thơm bất dục đực
tế bào chất (dòng A) với dòng phục hồi không thơm (dòng R) thì thu được hạt
không thơm ở thế hệ F1, hạt ở F2 phân ly theo tỷ lệ không thơm và thơm là
15:1. Hạt thu được ở F1 và F2 đều có hương thơm khi lai giữa bố và mẹ là
những giống lúa thơm.
Với sự phát hiện ra cây lúa dại có hạt phấn bất thụ vào 1970, các nhà
khoa học Trung Quốc, Ấn Độ và IRRI đã tạo ra một số dòng CMS - bất dục
đực thuộc tế bào chất (A), dòng bảo tồn thích ứng (B), và dòng phục hồi (R)
thích hợp để sản xuất ra những tổ hợp lúa lai đa dạng. Những tổ hợp lai 3
dòng đầu tiên của Trung Quốc gồm có Wei-you 2, Wei-you 3, Wei-you 6,
Shan-you 2, Shan-you 3, Shan-you 6, Nam-you 2, Nam-you 3, Si-you 2, Siyou 3 và Si-you 6 [22].
Sau khi tạo ra những dòng CMS với loại WA (wild - abortive), những
dòng CMS khác cũng lần lượt được tạo ra như Zhenshan 97A, V20A, Erjiu
Ai 4A, Erjiu Nan 1A, V41A [22]. Ở Philippines, IRRI đã dùng các CMS từ

V20A, Kaliya 1. ARC, Gambiaka, v.v. để tạo ra các CMS thích hợp với khí
hậu nhiệt đới, như: IR8025A, IR68275A, IR68281A, IR68273A, IR68888A,


IR68891A, IR68893A, v.v. Tương tự, dòng CMS được tạo ra từ các nguồn tế
bào chất của O. perennis (IR66707A) và O. rufipogon (OMS1) [31], [24].
Như vậy, nền tảng di truyền của các dòng CMS đã được đa dạng hóa và gia
tăng ngày càng nhiều hơn.
Các loại lúa lai được đưa ra đồng ruộng đầu tiên của Trung Quốc có
năng suất cao, nhưng chất lượng kém. Gần đây, các tổ hợp 3 dòng như Boyou
64, Xieyou 63 và Xieyou 64 có chất lượng cao. Các tổ hợp You I63 và You
I64 có hạt gạo dài và trung bình. Các CMS có gạo thơm cũng được tạo ra,
như Xiang A và B và các tổ hợp thơm như XiangA/PH 137, Xiang A/F50 và
Xiang A/F 117 có năng suất tương tự như các tổ hợp không thơm và được đưa
ra sản xuất [32]. Các tổ hợp lai của IRRI, Ấn Độ, Philippines, Bangladesh,
Indonesia và Việt Nam đều có chất lượng tương đối cao.
Dựa trên đặc tính quang cảm và nhiệt cảm của cây lúa để tạo lúa lai 2
dòng. Những giống lúa quang cảm trở nên bất thụ đực khi được trồng trong
những ngày dài có ánh sáng từ 14 giờ trở lên, được gọi dòng PGMS
(Photoperiod-sensitive genic male sterility). Những giống lúa trở nên bất thụ
đực khi được trồng ở những nơi có nhiệt độ hơi thấp, từ 28oC trở xuống, được
gọi là dòng TGMS (Temperature-sensitive genic male sterility). Năm 1983,
dòng PGMS được tìm thấy ở tỉnh Hubei, Trung Quốc và trong 1987 gen
tương hợp lúa dại giữa lúa Japonica và lúa Indica được nghiên cứu ở Nhật
Bản. Trong thời gian qua, các nghiên cứu về kỹ thuật tạo lúa lai 2 dòng đã có
những kết quả khả quan, chủ yếu là ở Trung Quốc.
Lúa lai một dòng hay còn gọi apomixis (sinh sản vô tính) có thể giúp
nông dân sử dụng chính hạt giống của mình cho vụ mùa kế tiếp, mà không bị
ảnh hưởng phân ly của lúa lai 2 hoặc 3 dòng. Tuy nhiên, công tác nghiên cứu
lúa lai một dòng trong 3 thập niên qua chưa có triển vọng nhiều.

Một phương pháp lai tạo giống khác đã được các nhà chọn giống


Myanma và Thái Lan thực hiện đó là phương pháp chọn lọc liên kết với chỉ
thị phân tử (MAS). Để cải tiến giống lúa Manawthukha, một giống không
thơm và hàm lượng amyloza cao được trồng với một diện tích lớn ở Myanma.
Các nhà nghiên cứu đã sử dụng giống Basmati 370 là dòng bố mẹ để lai nhập
các gen mùi thơm vào giống Manawthukha bằng phương pháp Marker
Assisted Backcrossing (MAB). Bốn dòng lai nghịch và một dòng gốc được
làm vật dẫn truyền để chuyển các alen badh2 và Wx từ giống Basmati vào
giống Manawthukha. Hai mươi dòng lúa ở thế hệ BC4F2 đã chọn lọc mang
các alen đồng hợp của giống Basmati, được trồng ở các địa điểm khác nhau ở
Myanma và Thái Lan và được kiểm tra các đặc điểm nông học, chất lượng
gạo. Lúa thu hoạch được ở các dòng cải tiến đã có đặc tính mùi thơm và chất
lượng gạo tương tự như giống Basmati nhưng có đặc điểm nông học giống
như giống Manawthukha ban đầu. Các dòng lúa cải tiến có đặc điểm cây cao
trung bình, đẻ nhánh tốt, bông dày, chống đổ và có năng suất cao.
Ở Việt Nam, chương trình lúa lai được bắt đầu thực hiện vào những
năm 1980 dưới sự chỉ đạo trực tiếp của Bộ Nông nghiệp. Một số tổ hợp lai
của Trung Quốc như Sán Ưu 63 (Shanyou 63), Sán Ưu Quế (Shanyou gui 99),
Nhị Ưu 63 (Jinyou 63), Nhị Ưu 838, Bác Ưu 64 (Boyou 64), Bác Ưu 693, Bồi
Tạp Sơn Thanh (Peiai 64S/Sơn Thanh) và Bồi Tạp dòng 49 (Peiai 64S/Dòng
49), Trang Nông 15 đã được trồng đại trà trong nước. Những tổ hợp lai tạo
bản xứ như HR1, HYT56, HYT57, VN01/D212, AMS24A/Que99,
MS24A/IR9761-19, v.v. cũng được trồng rộng rãi ở miền Bắc.
Các nhà chọn giống Việt Nam đã cố gắng lai tạo giống cao sản có
hương thơm với các vật liệu bố mẹ cho gen thơm từ giống Basmati và Khao
Dawk Mali, tuy nhiên chưa thành công. Một số ứng dụng đột biến gel trên
giống Nàng thơm Chợ Đào, Tám thơm, hoặc sử dụng chúng làm bố mẹ trong
lai tạo. Có thể do khả năng kết hợp kém nên việc chọn lọc con lai rất khó

khăn. Đặc biệt trong trường hợp tổ hợp lai OM1262 = MTL61/Basmati 370,
OM1277 = OM86-9/Basmati, OM1262 = IR66/Basmati, con lai được chọn ở
thế hệ thứ 10, 11 vẫn chưa cho quần thể ổn định, mặc dù dạng hình chấp nhận
(PACP) khá tốt, hàm lượng amyloza trung bình, gạo hạt thon dài [6].
Trong năm 2002, khoảng 500.000 ha lúa lai được trồng ở miền Bắc và
miền Trung Việt Nam. Trong đó, sử dụng khoảng 80% hạt giống lai nhập nội
từ Trung Quốc, Việt Nam chỉ tự túc được 20% nhu cầu hạt giống lúa lai trong
nước. Đến nay, Việt Nam cũng chưa có chính sách và quy hoạch tích cực cho
việc tự cung đối với nguồn hạt giống lai.