Ảnh hưởng của điều kiện môi trường tới khả năng tạo màng Biocellulose từ dịch tảo xoắn Spirulina

Header Page 1 of 123.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN
----------

NGUYỄN THU NGA

ẢNH HƯỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN MÔI TRƯỜNG
TỚI KHẢ NĂNG TẠO MÀNG BIOCELLULOSE
TỪ DỊCH TẢO XOẮN SPIRULINA

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Vi sinh vật
Người hướng dẫn khoa học
PGS. TS. ĐINH THỊ KIM NHUNG

HÀ NỘI, 2016
Footer Page 1 of 123.


Header Page 2 of 123.

LỜI CẢM ƠN
Bằng tất cả tấm lòng kính trọng, em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu
sắc nhất đến PGS.TS. Đinh Thi ̣Kim Nhung đã tận tình hướng dẫn giúp đỡ em
hoàn thành luận văn này cùng toàn thể thầy cô trong tổ vi sinh vật, khoa Sinh
– KTNN, trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã nhiệt tình giảng dạy và
khuyến khích em trong thời gian học tập.
Em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại học Sư phạm
Hà Nội 2 và Ban chủ nhiệm khoa Sinh – KTNN đã tạo điều kiện thuận lợi cho

em hoàn thành đề tài nghiên cứu.
Cuối cùng em xin được cảm ơn gia đình, bạn bè và người thân đã
quan tâm giúp đỡ, động viên em trong suốt thời gian qua.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày…..tháng…..năm 2016

Sinh viên

Nguyễn Thu Nga

Footer Page 2 of 123.


Header Page 3 of 123.

LỜI CAM ĐOAN

Em xin cam đoan những gì viết trong khoa luận này đều là sự thật. Đây
là kết quả nghiên cứu của riêng em. Tất cả các số liệu đều được thu thập từ
thực nghiệm, qua xử lý thống kê, không có số liệu sao chép hay bịa đặt,
không trùng với kết quả đã công bố.
Nếu sai em xin hoàn toàn chịu trách nhiệm.
Hà Nội, ngày…..tháng….. năm 2016
Sinh viên

Nguyễn Thu Nga

Footer Page 3 of 123.

Header Page 4 of 123.

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1
1. Lí do chọn đề tài ...................................................................................................... 1
2. Mục tiêu của đề tài .................................................................................................. 2
3. Nội dung nghiên cứu ............................................................................................... 2
4. Điểm mới của đề tài ................................................................................................ 2
NỘI DUNG ................................................................................................................. 3
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................... 3
1.1.Vị trí phận loại và đặc điểm hình thái của Gluconacetobacter ............................. 3
1.2. Đặc điểm sinh lí, sinh hóa của Gluconacetobacter .............................................. 3
1.3. Biocellulose .......................................................................................................... 4
1.3.1. Cấu trúc màng Biocellulose .............................................................................. 4
1.3.2. Một số tính chất của màng Biocellulose ........................................................... 4
1.3.3. Quá trình tổng hợp Biocellulose từ vi khuẩn Gluconacetobacter .................... 5
1.3.4. Chức năng của cellulose với vi khuẩn Gluconacetobacter ............................... 7
1.3.5. Mặt nạ dưỡng da ............................................................................................... 7
1.4.Tình hình nghiên cứu và sản xuất Biocellulose hiện nay ...................................... 9
1.4.1.Tình hình nghiên cứu màng Biocellulose trên thế giới ...................................... 9
1.4.2. Tình hình nghiên cứu màng Biocellulose ở trong nước .................................... 9
1.5. Sơ lược về tảo xoắn Spirulina .............................................................................. 9
1.5.1. Phân loại tảo Spirulina .................................................................................... 10
1.5.2. Đặc điểm sinh học của tảo Spirulina .............................................................. 10
1.5.3. Cấu tạo tảo Spirulina ....................................................................................... 11
1.5.4. Sinh sản của tảo Spirulina ............................................................................... 12
1.5.5. Nghiên cứu ứng dụng ...................................................................................... 13
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................ 14
2.1. Vật liệu và thiết bị nghiên cứu ........................................................................... 14

2.1.1. Vi sinh vật ....................................................................................................... 14

Footer Page 4 of 123.


Header Page 5 of 123.

2.1.2. Hóa chất và thiết bị ......................................................................................... 14
2.1.3. Môi trường ...................................................................................................... 15
2.2. Phương pháp nghiên cứu.................................................................................... 15
2.2.1. Phương pháp vi sinh ........................................................................................ 15
2.2.3. Phương pháp hóa sinh ..................................................................................... 17
2.2.4. Phương pháp xác định trọng lượng tươi của màng ......................................... 19
2.2.4. Phương pháp thống kê và xử lí số liệu ............................................................ 19
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .................................. 20
3.1. Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn giấm từ môi trường dịch tảo xoắn................. 20
3.2. Tuyển chọn chủng vi khuẩn Gluconacetobacter tạo màng mỏng, dai, bề mặt
nhẵn .................................................................................................................... 22
3.2. Ảnh hưởng của điều kiện môi trường tới khả năng tạo màng Biocellulose từ
chủng vi khuẩn Gluconacetobacter V1 .............................................................. 27
3.2.1. Ảnh hưởng của thời gian tới quá trình lên men tạo màng Biocellulose.......... 27
3.2.2. Ảnh hưởng của pH tới hình thành màng Biocellulose .................................... 30
3.2.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hình thành màng Biocellulose .......................... 32
3.3. Ứng dụng làm mặt nạ dưỡng da ......................................................................... 35
3.3.1. Phương pháp 1. ............................................................................................... 36
3.3.2. Phương pháp 2. ............................................................................................... 37
3.3.3. Phương pháp 3. ............................................................................................... 38
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ....................................................................................... 39
1.Kết luận .................................................................................................................. 39
2.Đề nghị ................................................................................................................... 39

TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 40

Footer Page 5 of 123.


Header Page 6 of 123.

DANH MỤC VIẾT TẮT

Footer Page 6 of 123.

BBP

: Blue Bromphenol

Cs

: Cộng sự

Gx

: Gluconacetobacter

MT

: Môi trường

STT

: Số thứ tự

UV

: Ultraviolet (Tia tử ngoại)

PTN

: Phòng thí nghiệm


Header Page 7 of 123.

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1. Quá trình hình thành cellulose trong tế bào vi khuẩn Gluconacetobacter5
Hình 1.2. Con đường chuyển hóa cacbon trong vi khuẩn Gluconacetobacter ........ 6
Hình 1.3. Biocellulose mask DHC (Nhật Bản), LANCOME (Pháp) ....................... 7
Hình 1.4. Mặt nạ lên men từ nước dừa ..................................................................... 8
Hình 1.5. Hình dạng của tảo xoắn Spirulina .......................................................... 11
Hình 1.6. Hình dạng tảo Spirulina quan sát dưới kính hiển vi ............................... 11
Hình 1.7. Ảnh khuẩn lạc vi khuẩn giấm của 2 mẫu phân lập ................................. 21
Hình 1.8. Vòng phân giải CaCO3 ........................................................................... 23
Hình 1.9. Khả năng hình thành cellulose ................................................................ 24
Hình 1.10. Hình thái chủng Gluconacetobacter xylinus V1 .................................. 27
Hình 1.11. Màng sau 4 ngày nuôi cấy .................................................................... 29
Hình 1.12. Màng ở môi trường pH: 5 ..................................................................... 31
Hình 1.13. Màng nuôi cấy ở 30oC .......................................................................... 34

Footer Page 7 of 123.

Header Page 8 of 123.

DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1. Nguồn gốc, đặc điểm các chủng vi khuẩn giấm trong mẫu phân lập
được ........................................................................................................... 20
Bảng 3.2. Đặc điểm hình thành màng cellulose của 5 chủng
Gluconacetobacter ..................................................................................... 24
Bảng 3.3. Hàm lượng axit axetic hình thành của 5 chủng Gluconacetobacter ........ 25
Bảng 3.4. Một số dặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào của 2 chủng
Gluconacetobacter ..................................................................................... 26
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy tới quá trình lên men tạo màng
Biocellulose ................................................................................................ 28
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của độ pH tới quá trình lên men tạo màng Biocellulose ....... 30
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới sự hình thành màng Biocellulose ................. 33
Bảng 3.8. Màng sau khi xử lí theo phương pháp 1 ................................................... 36
Bảng 3.9. Màng sau khi xử lí theo phương pháp 2 .................................................. 37
Bảng 3.10. Màng sau khi xử lí theo phương pháp 3 ................................................. 38

Footer Page 8 of 123.


Header Page 9 of 123.

MỞ ĐẦU
1. Lí do chọn đề tài
Như chúng ta đã biết thế kỉ XX là thế kỉ của ngành công nghệ thông tin
thì thế kỉ XXI là thế kỉ của ngành công nghệ sinh học. Ngày nay công nghệ
sinh học đang dần trở thành một ngành kĩ thuật chủ đạo và chiếm giữ một vị
trí cao của nhiều quốc gia trên thế giới. Là một bộ phận của ngành công nghệ

sinh học, công nghệ vi sinh đã và đang phát triển mạnh mẽ với những thành
tựu lớn có ý nghĩa trong đời sống, trong các ngành như: công nghiệp, nông
nghiệp, y học,... Cho đến ngày nay một trong những nguồn nguyên liệu đã và
đang được quan tâm gần đây đó là cellulose vi khuẩn hay Biocellulose. Hiện
nay màng Biocellulose được xem là nguồn nguyên liệu mới có tiềm năng
được ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực khác nhau như công nghiệp thực
phẩm, công nghệ giấy, công nghệ sản xuất pin... đặc biệt trong lĩnh vực y học,
màng Biocellulose đã được một số nước trên thế giới nghiên cứu ứng dụng
làm màng trị bỏng, mặt nạ dưỡng da, mạch máu nhân tạo... Trên thế giới việc
nghiên cứu Gluconacetobacter và quá trình sinh tổng hợp Biocellulose cũng
như ứng dụng của Biocellulose bắt đầu từ rất sớm. Những nghiên cứu đầu tiên
là của Brown A.J và cộng sự năm (1886). Trải qua hơn 1 thế kỷ nhưng cho
đến nay Gluconacetobacter và màng Biocellulose vẫn đang thu hút được sự
chú ý của rất nhiều nhà khoa học trên thế giới. Ở Việt Nam, nghiên cứu về
Gluconacetobacter, màng Biocellulose và ứng dụng của nó còn là vấn đề khá
mới mẻ, chỉ mới được quan tâm gần đây. Các nghiên cứu và công bố về vấn
đề này còn rất khiêm tốn. Các nghiên cứu hiện mới dừng ở nghiên cứu quá
trình tạo màng Biocellulose ứng dụng trong sản xuất thạch dừa, làm giá thể
gắn kết tế bào vi khuẩn và làm màng trị bỏng. Nhằm ứng dụng những hiểu
biết về Gluconacetobacter và quá trình tạo màng Biocellulose vào thực tiễn,

Footer Page 9 of 123.

1


Header Page 10 of 123.

tôi lựa chọn đề tài: “Ảnh hưởng của điều kiện môi trường tới khả năng tạo
màng Biocellulose từ dịch tảo xoắn Spirulina”.

2. Mục tiêu của đề tài
Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện môi trường: nhiệt độ, pH, thời
gian lên men tạo màng tới quá trình lên men tạo màng Biocellulose từ tảo
xoắn Spirulina.
3. Nội dung nghiên cứu
3.1. Phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng tạo màng
Biocellulose trên nguồn nguyên liệu tảo xoắn Spirulina
3.2. Ảnh hưởng của điều kiện môi trường tới khả năng tạo màng của
Gluconacetobacter
3.3. Xử lí màng làm mặt nạ dưỡng da
4. Điểm mới của đề tài
Nghiên cứu tạo màng Biocellulose từ nguồn nguyên liệu mới: tảo xoắn
Spirulina dựa trên những nghiên cứu về ảnh hưởng của điều kiện môi trường:
nhiệt độ lên men tạo màng thích hợp 30oC, pH: 5, thời gian nuôi cấy 4 ngày
đồng thời ứng dụng chế tạo mặt nạ dưỡng da (Biocellulose Mask).

Footer Page 10 of 123.

2


Header Page 11 of 123.

NỘI DUNG
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Vị trí phận loại và đặc điểm hình thái của Gluconacetobacter
Theo hệ thống phân loại của nhà khoa học Bergey thì Gluconacetobacter
thuộc họ vi khuẩn Acetobacteraceae. Họ này gồm 6 chi: Acetobacter,
Acidomonas, Asaia, Gluconobacter, Gluconacetobacter và Kozakia [20].
Gluconacetobacter thuộc nhóm vi khuẩn acetic, là loài vi khuẩn tạo được

nhiều BC nhất trong tự nhiên. Mỗi tế bào Gluconacetobacter có thể chuyển
hóa 108 phân tử glucose thành cellulose trong 1 giờ.
Gluconacetobacter có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, có thể di
động hay không di động, không sinh bào tử. Chúng là vi khuẩn Gram âm,
nhưng đặc điểm nhuộm Gram có thể thay đổi do tế bào già đi hay do điều
kiện môi trường. Chúng có thể đứng riêng lẻ hay xếp thành chuỗi. Trên môi
trường thiếu thức ăn hoặc môi trường đã nuôi cấy lâu, Gluconacetobacter dễ
dàng sinh ra những tế bào có hình thái đặc biệt (tế bào có thể phình to hoặc
kéo dài, đôi khi lại có dạng phân nhánh). Tế bào thường được tìm thấy nhiều
trong dịch hoa quả, giấm, dịch rượu, trong đất…[17].
1.2. Đặc điểm sinh lí, sinh hóa của Gluconacetobacter
Vi khuẩn Gluconacetobacter sinh trưởng, phát triển ở điều kiện nhiệt
độ 25oC – 35oC; pH 4-6. Các chủng vi khuẩn Gluconacetobacter sinh trưởng
được trong điều kiện pH thấp, vì vậy có thể bổ sung thêm acid acetic vào môi
trường nuôi cấy để hạn chế sự nhiễm khuẩn lạ.
Đặc điểm sinh hóa của các chủng vi khuẩn Gluconacetobacter bao
gồm: Oxy hóa ethanol thành acetic, CO2,H2O; Phản ứng catalase dương.

Footer Page 11 of 123.

3


Header Page 12 of 123.

1.3. Biocellulose
1.3.1. Cấu trúc màng Biocellulose
Biocellulose có đường kính bằng 1/100 đường kính của cellulose thực
vật (PC – plant cellulose). Màng BC được cấu tạo bởi chuỗi polyme β-1,4
glucopynanose. Có thành phần hóa học đồng nhất với cellulose thực vật,

nhưng cấu trúc và đặc tính lại khác xa nhau [17].
Chuỗi polyme β -1,4 glucopynanose mới hình thành liên kết với nhau
tạo thành sợi nhỏ (subfibril) có kích thước 1,5nm. Những sợi nhỏ kết tinh tạo
sợi lớn hơn - sợi vĩ mô (microfibril) (Jonas and Farah, 1998) [28], những sợi
này kết hợp với nhau tạo thành bó và cuối cùng tạo dải ribbon (Yamanaka
et.al 2000) [38]. Dải ribbon có chiều dài trong khoảng từ 1 - 9nm. Những dải
ribbon được kéo ra từ tế bào này sẽ liên kết với những dải ribbon của tế bào
khác bằng liên kết hiđro hoặc lực Van Der Waals tạo thành cấu trúc mạng
lưới hay một lớp màng mỏng trên bề mặt môi trường nuôi cấy.
1.3.2. Một số tính chất của màng Biocellulose
Brown A.J (1886), đã nghiên cứu lớp màng đặc do vi khuẩn
Gluconacetobacter tạo ra trên môi trường nuôi cấy và thấy có bản chất là
hemicellulose. Hemicellulose là những polysaccharid không tan trong nước
nhưng tan trong dung dịch kiềm tính [18].
Một số tính chất của màng Biocellulose:
 Độ tinh sạch: màng BC có độ tinh sạch tốt hơn rất nhiều so với các
cellulose khác, có thể phân hủy sinh học, tái chế hay phục hồi hoàn toàn.
 Độ bền cơ học: màng BC có độ bền tinh thể cao, sức căng lớn, trọng
lượng thấp, ổn định về kích thước.
 Tính hút nước: màng BC có khả năng giữ nước đáng kể (lên đến
99%), có tính xốp, độ ẩm cao.

Footer Page 12 of 123.

4


Header Page 13 of 123.

1.3.3. Quá trình tổng hợp Biocellulose từ vi khuẩn Gluconacetobacter

Khi nuôi cấy vi khuẩn Gluconacetobacter trong môi trường có nguồn
dinh dưỡng đầy đủ (chủ yếu là carbohydrate, vitamin B1, B2, B12… và các
chất kích thích sinh trưởng), chúng sẽ thực hiện quá trình trao đổi chất của
mình bằng cách hấp thụ dinh dưỡng từ môi trường bên ngoài vào cơ thể, một
phần để cơ thể sinh trưởng và phát triển, một phần để tổng hợp cellulose và
thải ra môi trường. Ta thấy các sợi tơ nhỏ phát triển ngày càng dài hướng từ
đáy lên bề mặt trong môi trường nuôi cấy [22]. Thiaman (1962) đã giải thích
cách tạo thành cellulose như sau: các tế bào Gx khi sống trong môi trường
lỏng sẽ thực hiện quá trình trao đổi chất của mình bằng cách hấp thụ đường
glucose, kết hợp đường với acid béo để tạo thành tiền chất nằm ở màng tế
bào. Tiền chất này được tiết ra ngoài nhờ hệ thống lỗ nằm ở trên màng tế bào
cùng với một enzyme có thể polymer hóa glucose thành cellulose.

Hình 1.1. Quá trình hình thành cellulose trong tế bào vi khuẩn
Gluconacetobacter
Quá trình sinh tổng hợp BC là một tiến trình bao gồm nhiều bước được
điều hoà một cách chuyên biệt và chính xác bằng một hệ thống chứa nhiều
loại enzyme, phức hợp xúc tác và các protein điều hòa ( hình 1.2).

Footer Page 13 of 123.

5


Header Page 14 of 123.

Theo Alaban C.A và cộng sự (1967) [15] các enzyme tham gia vào quá
trình sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn gồm:
1PFK: Fructose-1-phosphate kinase

PGI: Phosphoglucoisomerase

PGM: Phosphoglucomutase

PTS: Hệ thống phosphotransferrase

UGP:UDP-glucose pyrophosphorylase

Fru-bi-P:Fructose-1,6–bi-phosphate

Fru-6-P:Fructose-6-phosphate

Glc-6-P: Glucose–6-phosphate

Glc-1-P:Glucose-1-phosphate

PGA: Phosphogluconic acid acid

UDPGlc:Uridine diphosphoglucose

CS: Cellulose synthase

GK: glucokinase

FK: fructokinase

FBP: fructose -1,6 - biphosphate phosphatase
G6PDH: glucose – 6 - phosphate dehydrogenase

Hình 1.2. Con đường chuyển hóa cacbon trong vi khuẩn Gluconacetobacter

Footer Page 14 of 123.

6


Header Page 15 of 123.

1.3.4. Chức năng của cellulose với vi khuẩn Gluconacetobacter
Màng Biocellulose nằm ở mặt thoáng của môi trường nuôi cấy có tác
dụng như một lớp bảo vệ cho các tế bào vi khuẩn Gluconacetobacter trước
các nhân tố có hại của môi trường. Có những ghi nhận rằng cellulose bao
quanh tế bào vi khuẩn bảo vệ chúng khỏi tia cực tím. Khoảng 23% số tế bào
Gluconacetobacter được bao bọc bởi Biocellulose sống sót sau 1 giờ xử lý
bằng tia cực tím. Khi tách Biocellulose ra khỏi tế bào, khả năng sống của
chúng giảm đáng kể, chỉ còn 3% [31].
Ngoài ra, màng Biocellulose còn là giá thể chống đỡ cho các tế bào vi
khuẩn đồng thời cũng giúp chúng lấy chất dinh dưỡng từ môi trường một cách
dễ dàng hơn so với khi ở trong môi trường lỏng không có mạng lưới cellulose.
1.3.5. Mặt nạ dưỡng da (Biocellulose mask)
Hiện nay trên thế giới xu hướng làm đẹp từ các sản phẩm tự nhiên
không chứa chất hóa học đang rất thịnh hành. Hàng loạt các hãng mĩ phẩm
lớn đều tập trung nghiên cứu cho ra những sản phẩm làm đẹp có nguồn gốc tự
nhiên không có hoặc rất ít tác dụng phụ trong đó có mặt nạ dưỡng da
(Biocellulose mask). Biocellulose mask được sản xuất bằng công nghệ vi sinh
và nguồn nguyên liệu chính là nước dừa. Màng thu được được xử lí thành
phẩm và bổ sung thêm các hoạt chất với các hướng ứng dụng khác nhau như:
làm trắng da, trị mụn hay làm mờ vết nám…

Hình 1.3. Biocellulose mask DHC (Nhật Bản), LANCOME (Pháp)[42]

Footer Page 15 of 123.

7


Header Page 16 of 123.

Ở Việt Nam, mặt nạ biocellulose từ nước dừa lần đầu tiên được sản
xuất tại tỉnh Bến Tre được kiểm nghiệm nhiều lần tại trung tâm kiểm nghiệm
dược và mĩ phẩm Bến Tre và được sở y tế xét duyệt chấp nhận (Số công bố
013/11 CBMP- BT do sở y tế Bến Tre cấp). Đây là lần đầu tiên mặt nạ 100%
thiên nhiên xuất hiện ở nước ta mà chưa có sản phẩm nào trên thị trường có.
Có nguồn gốc từ nước dừa, hoàn toàn không cần dùng khăn giấy hay sợi để
làm khuôn định hình như các loại mặt nạ thường thấy trên thị trường. Khác
với các mặt nạ hóa chất trên thị trường có tác dụng hóa chất ngay lập tức và
không tốt về lâu dài cho da mặt. Mặt nạ nước dừa có công dụng từ từ mang
đến làn da trắng sáng, mịn màng 1 cách tự nhiên nhiên và đẹp nhất. Mỗi tấm
mặt nạ được đóng riêng trong từng túi nhôm kín, độ dày 1mm, 2mm, 3mm,
trọng lượng 60 gram [43].

Hình 1.4. Mặt nạ lên men từ nước dừa[43]

Footer Page 16 of 123.

8


Header Page 17 of 123.

1.4. Tình hình nghiên cứu và sản xuất Biocellulose hiện nay
1.4.1. Tình hình nghiên cứu màng Biocellulose trên thế giới
Chủng vi khuẩn Gluconacetobacter và màng Biocellulose đã thu hút
được sự chú ý của nhiều nhà khoa học trên thế giới. Màng Biocellulose được
ứng dụng trong nhiều lĩnh vực, điển hình như: trong công nghệ thực phẩm sử
dụng màng Biocellulose để bảo quản thực phẩm, sản xuất thạch dừa; Trong
công nghiệp giấy, màng Biocellulose sử dụng để sản xuất giấy chất lượng cao;
Trong lĩnh vực y học, màng Biocellulose bước đầu nghiên cứu sử dụng làm
màng trị bỏng, làm da nhân tạo. Hiện nay màng Biocellulose ngày càng chiếm
ưu thế là sản phẩm thân thiện với môi trường thay thế cho túi ni lông.
1.4.2. Tình hình nghiên cứu màng Biocellulose ở trong nước
Tại Việt Nam, việc nghiên cứu và sử dụng màng Biocellulose đã thu hút
được sự chú ý của nhiều tác giả quan tâm. Điển hình như nghiên cứu đặc tính
cấu trúc màng Biocellulose làm cơ sở sản xuất thạch dừa của tác giả Nguyễn
Thúy Hương, trường đại học Bách Khoa. Tp.HCM[5]; Nghiên cứu màng trị
bỏng sinh học có tẩm dầu mủ u bằng phương pháp lên men của tác giả Nguyễn
Văn Thanh và cộng sự, đại học Y Dược TP.HCM; Bước đầu sử dụng màng
BC hấp phụ bacteriocin để bảo quản thịt tươi sơ chế tối thiểu của tác giả Trần
Thị Tưởng An, Nguyễn Thúy Hương trường đại học Quốc Gia TP.HCM;
Nghiên cứu một số đặc tính của chủng vi khuẩn Gluconacetobacter BHN2
bước đầu ứng dụng màng BC làm bao bì bảo quản thực phẩm, túi thay thế túi
ni lông của PGS.TS.Đinh Thị Kim Nhung và cộng sự [10].
1.5. Sơ lược về tảo xoắn Spirulina
Tảo Spirulina hay tảo xoắn Spirulina là tên gọi do nhà tảo học Deurben
(Đức) đặt vào năm 1827 dựa trên hình thái tảo Spirulina có dạng sợi xoắn ốc.
Cũng vào năm 1827, Turpin lần đầu tiên phân lập được tảo spirulina từ
nguồn nước tự nhiên. Năm 1963, giáo sư Clement (người Pháp) đã nghiên
cứu thành công việc nuôi spirulina ở qui mô công nghiệp. Do hình dạng “lò

Footer Page 17 of 123.

9


Header Page 18 of 123.

xo xoắn” với khoảng 5-7 vòng đều nhau không phân nhánh dưới kính hiển vi
nên được gọi là Spirulina với tên khoa học là tảo Spirulina platensis (bắt
nguồn từ chữ spire, spiral có nghĩa là “xoắn ốc”) và trước đây được coi là
thuộc chi Spirulina. Thực ra đây không phải là sinh vật thuộc tảo (algae) vì
tảo thuộc sinh vật có nhân thật (Eukaryota). Spirulina thuộc vi khuẩn lam
(Cyanobacteria) nên chúng thuộc sinh vật nhân sơ hay nhân nguyên thủy
(Prokaryote).
Năm 1973, Tổ chức Nông lương Quốc tế (FAO) và Tổ chức Y tế Thế
giới (WHO) đã chính thức công nhận tảo xoắn Spirulina là nguồn dinh dưỡng
và dược liệu quý, đặc biệt trong chống suy dinh dưỡng và chống lão hóa. Năm
1977, Viện sinh vật học là nơi tiên phong trong việc nuôi trồng Spirulina ở
Việt Nam theo mô hình ngoài trời, không mái che, có sục khí CO2[44].
1.5.1. Phân loại tảo Spirulina
Ngành: Cyanophyta
Lớp: Cyanophyceae
Bộ: Oscillatoriales
Họ: Oscillatoriaceae
Giống: Spirulina
1.5.2. Đặc điểm sinh học của tảo Spirulina
Tảo Spirulina có dạng xoắn lò xo khoảng 5-7 vòng đều nhau không
phân nhánh. Đường kính xoắn khoảng 35-50 micromet, bước xoắn 60
micromet, chiều dài thay đổi có thể đạt 0,25mm. Nhiều trường hợp tảo xoắn
Spirulina có kích thước lớn hơn. Tảo là trung gian giữa vi khuẩn và tảo nhân
thực. Người ta cho rằng tảo Spirulina giống với vi khuẩn hơn, do đó tảo

Spirulina còn có tên là vi khuẩn lam.
Tảo có khả năng vận chuyển theo hình thức trượt xung quanh trục của
chúng. Vận tốc vận chuyển của chúng có thể đạt 5 micron/giây [44].

Footer Page 18 of 123.

10


Header Page 19 of 123.

Hình 1.5. Hình dạng của tảo xoắn Spirulina

Hình 1.6. Hình dạng tảo Spirulina quan sát dưới kính hiển vi
1.5.3. Cấu tạo tảo Spirulina
Là tảo lam đa bào dạng sợi, gồm nhiều hình trụ xếp không phân nhánh.
Mỗi tế bào của sợi có chiều rộng 5 micromet, dài 2mm. Không có lục lạp mà
chỉ chứa thylacoid phân bố đều trong tế bào. Không có không bào. Không có
nhân điển hình, vùng nhân không rõ, trong đó có chứa ADN (Hedeskog và
Hifsten A.1980). Thành tế bào tảo gồm các lớp lipopolysaccharide, các sợi
nhỏ protein và các phân tử peptidoglucan. Màng tế bào nằm sát ngay dưới
thành tế bào và nối với màng quang hợp thylacoid tại một vài điểm.

Footer Page 19 of 123.

11


Header Page 20 of 123.

Bộ máy quang hợp của tảo xoắn Spirulina: Phycobilisome: chứa
phycobiliprotein và protein liên kết được gắn vào bề mặt ngoài của thylacoid.
Phycobilisome có khối lượng khoảng 7 triệu dalton và có thể tách nguyên vẹn
để nghiên cứu. Đối với phycobilisome có cả phycoerythin và phycocyanin thì
lớp ngoài cùng là phycoerythin, tiếp theo là phycocyanin và phần trong cùng
là allophycocyanin. Phycobilisome hoạt động như một anten thu nhận năng
lượng mặt trời để chuyển vào PS II. Con đường truyền năng lượng bắt đầu từ
phycoerythin sang phycocyanin và cuối cùng đến allophycocyanin trước khi
đạt tới PS II. Có khoảng 50% năng lượng ánh sáng mặt trời Spirulina nhận
được nhờ phycobilisome.
Các sắc tố quang hợp gồm chlorophylla, carotenoid, phycocyanin,
allophycocyanin và thường có carotenoid-glycoside như myxoxanthophyll,
oscillaxanthin. Spirulina có chứa 3 nhóm sắc tố chính: Chlorophyll hấp thụ
ánh sáng lam và đỏ. Carotenoid hấp thụ ánh sáng lam và lục. Phycobillin hấp
thụ ánh sáng lục, vàng và da cam[44].
1.5.4. Sinh sản của tảo Spirulina
Tảo lam là vi sinh vật xuất hiện cùng lúc với vi khuẩn trên trái đất
(Cifferi O, Tiboni O, 1985). Hiện nay, người ta biết khoảng 2500 loài. Tảo lam
phân bố rất rộng và có khả năng chịu nhiệt rất cao. Người ta phát hiện chúng
sống ở những suối nước nóng đến 690C. Tảo Spirulina có phương thức sinh sản
vô tính, từ một cơ thể mẹ trưởng thành (gọi là trichome), tự phân chia thành
nhiều mảnh, mỗi mảnh gồm một số vòng xoắn (2-4 tế bào, gọi là hormogonia).
Để tạo thành các hormogonia, sợi Spirulina sẽ hình thành các tế bào chuyên
biệt cho sự sinh sản (gọi là đoạn necridia). Các necridia hình thành các đĩa lõm
ở hai mặt và tạo ra hormogonia bởi sự chia cắt tại vị trí các đĩa. Khi đã phát
triển, dần dần phần đầu hormogonia bị tiêu giảm và trở nên tròn nhưng vách tế
bào vẫn có chiều dày không đổi. Các hormogonia phát triển, trưởng thành và
chu kì sinh sản lặp lại để đảm bảo vòng đời của Spirulina.

Footer Page 20 of 123.

12


Header Page 21 of 123.

Thông thường, Spirulina sinh sản bằng cách gãy ra từng khúc. Trong
trường hợp gặp điều kiện không thuận lợi, Spirulina cũng có khả năng tạo bào
tử giống như ở vi khuẩn. Chu kì phát triển của Spirulina rất ngắn. Chu kì này
thường diễn ra trong 24h như của tảo Chlorella [44].
1.5.5. Nghiên cứu ứng dụng
Tảo xoắn Spirulina đã được nghiên cứu sản xuất và được ứng dụng
trong nhiều lĩnh vực khác nhau ở các nước trên thế giới và được nghiên cứu
ứng dụng trong ngành thực phẩm và mỹ phẩm. Spirulina được nghiên cứu bổ
sung vào rất nhiều sản phẩm thực phẩm như: mì sợi, yaourt, kẹo, trà xanh,
bánh quy, bánh mì, bia…Các sản phẩm này được bán ở siêu thị của nhiều
nước như: Chi Lê, Đan Mạch, Hà Lan, Mỹ, Úc, New Zealand…
Nhiều giá trị dinh dưỡng và sinh học của tảo Spirulina đã được khám
phá: Tảo Spirulina rất giàu protein (60-70% trọng lượng khô của tảo) trong
khi thịt bò chỉ có 21%, thịt gà ta 20,3%... Các loại acid amin chủ yếu có tỷ lệ
vượt trội so với chuẩn của tổ chức lương nông quốc tế (F.A.O). Hệ số tiêu hóa
protein cũng rất cao với 80-85% protein được hấp thu sau 18 giờ.
Tảo Spirulina có các vitamin nhóm B, hàm lượng vitamin B12 cao gấp
2 lần trong gan bò. Caroten cao gấp 10 lần trong củ cà rốt. Ngoài ra tảo
Spirulina còn chứa các khoáng vi lượng (coban, kẽm, sắt...), 11 vitamin cần
thiết cho cơ thể và chất chống oxi hoá: betacaroten và carotenoid.Đặc biệt kẽm (Zn) và các acid amin có trong tảo giúp tăng cường khả năng hoạt động
tình dục ở nam giới. Tảo Spirulina làm cân bằng dinh dưỡng, tổng hợp các
chất nội sinh, tăng hormon và điều hòa sinh lý [44].

Footer Page 21 of 123.

13


Header Page 22 of 123.

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu và thiết bị nghiên cứu
2.1.1. Vi sinh vật
Nguồn vi sinh vật do phòng vi sinh vật học khoa Sinh- KTNN trường
Đại học Sư phạm Hà Nội 2 cung cấp.
2.1.2. Hóa chất và thiết bị
2.1.2.1 Hóa chất
Hóa chất được PTN Vi sinh vật khoa Sinh-KTNN trường ĐHSP2 cung
cấp gồm:
- Ethanol, glucose, fructose, sacrose, mannose, lactose, manitol,
sorbitol, dihyroxyaceton, acid acetic
- Cao nấm men, pepton, (NH4)2SO4, NaNO3, NaNO2
- KH2PO4, CaCO3, MgSO4.7H2O, NaCl, NaOH
- Blue Bromophenol, lugol, fucshin, tím gentian, phenolphthal
2.1.2.2 Thiết bị
- Nồi hấp Tommy (Nhật)
- Box vô trùng (Haraeus)
- Máy lắc Orbital Shakergallenkump (Anh)
- Máy li tâm Sorvall (Mỹ)
- Micropipet Jinson (Pháp) các loại từ 0.5μl – 10ml
- Cân (Precisa XT 320M - Thuỵ Sĩ)
- Máy cất nước 2 lần (Hamilton – Anh)
- Kính hiển vi quang học Carl Zeiss (Đức)
- Kính lúp soi nổi STEMI 2000

- Digital pH Meter

Footer Page 22 of 123.

14


Header Page 23 of 123.

2.1.3. Môi trường
2.1.3.1. Môi trường giữ giống (MT1)
Glucose: 20 g

(NH4)2SO4 : 3g

Pepton: 5g

Thạch agar: 20g

MgSO4.7H2O: 2g

CaCO3: 2g

KH2PO4:

2g

Nước máy : 1000ml
2.1.3.2. Môi trường nhân giống (MT2)
Glucose: 20 g

(NH4)2SO4: 3g

KH2PO4: 2 g

MgSO4.7H2O: 2g

pH: 5,0 – 6,0

Acid acetic : 2%

Nước máy: 1000 ml
2.1.3.2. Môi trường lên men
16g bột tảo xoắn Spirulina + 1000ml nước + 40g sacarose
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp vi sinh
2.2.1.1. Phân lập tuyển chọn chủng Gluconacetobacter theo phương pháp
truyền thống (Phương pháp Vinogradski và Beijerinck)
Nguồn vật liệu: Dịch tảo xoắn Spirulina bổ sung giống để ở nhiệt độ
phòng thí nghiệm sau 3 - 4 ngày xuất hiện màng trắng trong, dai.
Từ các màng thu được, dùng đũa thuỷ tinh vô trùng vớt màng, lấy một
lượng nhỏ màng, rửa qua bằng nước cất vô trùng cho vào ống nghiệm chứa
nước cất thanh trùng, vontex đều, thu được ống nghiệm chứa mẫu màng gốc.
Chuẩn bị 10 ống nghiệm có đậy nút bông, sấy vô trùng, cho vào mỗi
ống nghiệm 9ml nước cất, đậy nút bông, hấp thanh trùng trong nồi hấp giữ ở
1210C, 1atm trong thời gian 15 phút. Chuyển vào bốc cấy vô trùng, dùng
pipet vô trùng hút 1ml dịch từ ống nghiệm chứa mẫu màng gốc cho vào ống
nghiệm thứ nhất, đậy nút bông, vontex trong 5 phút, thu được ống nghiệm

Footer Page 23 of 123.

15


Header Page 24 of 123.

chứa dịch pha loãng mức 10-1. Tiếp tục hút 1ml dịch ở ống có độ pha loãng
10-1 cho vào ống nghiệm thứ hai, thu được dịch pha loãng ở mức 10-2. Tiếp
tục pha loãng ở các độ pha loãng 10-3; 10-4…; 10-7. Căn cứ vào số lượng vi
khuẩn có ở trong mẫu, chúng tôi chọn các mẫu ở độ pha loãng 10-4 - 10-7 để
tiến hành các bước tiếp theo [4].
Phương pháp phân lập trên môi trường thạch đĩa: chuẩn bị môi trường 1
đã hấp khử trùng, đổ môi trường thạch đĩa. Dùng pipet vô trùng hút 100ml
dịch màng đã chuẩn bị ở trên (với các độ pha loãng 10-4 - 10-7) nhỏ vào các
hộp lồng đã chứa môi trường thạch, dùng que trang thủy tinh trang đều trên
khắp bề mặt thạch. Đặt ngược các hộp lồng, bao gói cẩn thận, để trong tủ ấm
300C, sau 3 – 4 ngày lấy ra quan sát khuẩn lạc (hình thái, kích thước, màu sắc,
độ trơn bóng, viền mép khuẩn lạc, vòng phân giải CaCO3).
Chuẩn bị môi trường thạch nghiêng (đã loại bỏ CaCO3), tách các khuẩn
lạc riêng rẽ từ hộp lồng, cấy chuyển vào các ống nghiệm chứa môi trường
thạch nghiêng đã khử trùng, nuôi trong tủ ấm ở 300C. Sau 3 – 4 ngày, quan
sát, làm tiêu bản nhuộm tế bào bằng phương pháp nhuộm gram.
2.2.1.2. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái và cách sắp xếp tế bào
trên tiêu bản nhuộm kép
Lấy các khuẩn lạc trong các ống thạch nghiêng, làm vết bôi trên lam
kính, cố định vết bôi bằng cách hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn, nhuộm tế bào
bằng phương pháp nhuộm Gram.
Đưa lên vật kính 5 – 40 quan sát sau đó đưa tiêu bản dưới vật kính dầu
100 với độ phóng đại 1000 lần. Nếu tế bào vi khuẩn nhuộm có màu hồng là
Gram âm, đó chính là vi khuẩn Gluconacetobacter.

2.2.1.3. Phương pháp bảo quản chủng giống trên môi trường thạch nghiêng
Các chủng giống sau khi phân lập và sơ bộ xác định là Gluconacetobacter
được cấy trên môi trường thạch nghiêng (đã loại bỏ CaCO3), nuôi trong tủ ấm

Footer Page 24 of 123.

16


Header Page 25 of 123.

3 – 4 ngày ở 300C. Sau đó, giữ lạnh ở tủ 40C để bảo quản giống. Cấy truyền
giữ giống trên môi trường thạch nghiêng hai tháng một lần.
2.2.1.4. Phương pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn Gluconacetobacter cho
màng mỏng
Mục đích nghiên cứu này là tuyển chọn các chủng vi khuẩn
Gluconacetobacter cho màng mỏng, dai, nhẵn, để chế tạo màng sinh học làm
mặt nạ dưỡng da. Vì vậy cần tiến hành theo các chỉ tiêu sau [3]:
- Quan sát đặc điểm quá trình hình thành màng Biocellulose (thời gian
tạo màng, đặc điểm của màng, độ đày mỏng của màng, tính chịu lực của
màng…)
- Quan sát kích thước và hình dạng tế bào trên tiêu bản nhuộm Gram,
kiểm tra đặc tính sinh lí, sinh hóa của chủng mới phân lập.
Các chủng vi khuẩn Gluconacetobacter tuyển chọn nuôi trong môi
trường dịch thể số 1 để kiểm tra khả năng tạo màng. Chúng tôi tuyển chọn 3
lần liên tiếp để thu được chủng có khả năng tạo màng tốt nhất dùng cho các
nghiên cứu tiếp theo.
2.2.3. Phương pháp hóa sinh
2.2.3.1. Xác định khả năng tổng hợp axit bằng chuẩn độ
Cho 10ml dung dịch lên men vào bình tam giác dung tích 100ml, thêm

vào đó 1 -2 giọt dung dich phenolphthalein 0,1%, chuẩn độ bằng dung dịch
NaOH 0,1N lắc nhẹ khi dung dịch chuyển sang màu hồng nhạt. Tính số gam
axit acetic tạo thành trong 10ml dịch lên men (biết rằng 1ml NaOH 0,1N
tương ứng với 0,006g axit acetic) [2]:
Cách tính:

𝑋=

𝑉.𝐾.1000
10

(g/l)

Trong đó: X: Số gan axit acetic trong 1l dịch lên men
V: Thể tích của NaOH 0,1N đem chuẩn độ

Footer Page 25 of 123.

17