Nghiên cứu công nghệ sinh tổng hợp, thu nhận poly γ- glutamic axit (PGA) ứng dụng trong các sản phẩm thực phẩm và nông nghiệp

Header Page 1 of 89.

LỜI CAM ĐOAN

Đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, trong luận án có sử dụng một phần kết quả của
đề tài cấp Thành phố“ Nghiên cứu công nghệ sinh tổng hợp, thu nhận poly γ- glutamic axit
(PGA) ứng dụng trong các sản phẩm thực phẩm và nông nghiệp” mã số 01C-06/03-2013-2
do tôi làm chủ nhiệm.
Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận án này là trung thực và chƣa
từng đƣợc các tác giả khác công bố, các thông tin trích dẫn trong luận án đã đƣợc ghi rõ
nguồn gốc

Hà Nội, ngày 19 tháng 01 năm 2016

Ngƣời hƣớng dẫn

Ngƣời hƣớng dẫn

Khoa học

Khoa học

PGS-TS. Trần Liên Hà

GS-TS. Đặng Thị Thu

i

Footer Page 1 of 89.

Tác giả

Nguyễn Chí Dũng


Header Page 2 of 89.
LỜI CẢM ƠN
Trƣớc tiên tôi gửi lời cám ơn sâu sắc đến PGS-TS. Trần Liên Hà và GS-TS. Đặng Thị
Thu – Trƣờng Đại học Bách Khoa Hà Nội, là những ngƣời đã tận tình hƣớng dẫn, định
hƣớng, đào tạo và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành Luận án.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô ở Bộ môn Vi sinh – Hóa sinh – Sinh học phân tử Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm - Trƣờng Đại học Bách khoa
Hà Nội đã chỉ bảo, truyền đạt kinh nghiệm và tạo điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành luận
án này.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực
phẩm - ĐHBKHN đã truyền đạt kinh nghiệm, tạo điều kiện giúp đỡ tôi trau dồi kiến
thức chuyên môn.
Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới các bạn, các anh chị Viện Hóa học các Hợp
chất thiên nhiên và Viện Công nghệ Sinh học trực thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công
nghệ Việt Nam đã chia sẻ cho tôi một số kinh nghiệm trong quá trình nghiên cứu.
Tôi xin chân thành cảm ơn các bạn đồng nghiệp tại Trung tâm Công nghệ Sinh học và
Công nghệ Thực phẩm – Sở Khoa học và Công nghệ Hà Nội đã tạo điều kiện giúp đỡ về
thời gian và vật chất để tôi hoàn thành Luận án này.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng kính yêu và biết ơn tới gia đình, bạn bè đã động viên, giúp
đỡ tôi trong suốt thời gian tôi học tập tại Trƣờng Đại học Bách Khoa Hà Nội.
Hà Nội, ngày 19 tháng 01 năm 2016
Nghiên cứu sinh

Nguyễn Chí Dũng

ii

Footer Page 2 of 89.


Header Page 3 of 89.

MỤC LỤC
Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt .................................................................................. vi
Danh mục các bảng ............................................................................................................ vii
Danh mục các hình vẽ và đồ thị ............................................................................................ x
MỞ ĐẦU ............................................................................................................................... 1
CHƢƠNG 1 - TỔNG QUAN ................................................................................................. 3
1.1 Giới thiệu về axit poly gamma glutamic ..................................................................... 3
1.2 Tình hình nghiên cứu γ-PGA trên thế giới và Việt Nam ............................................. 4
1.2.1.
1.2.2.

Tình hình nghiên cứu γ-PGA trên thế giới. ..................................................... 4
Tình hình nghiên cứu γ-PGA ở Việt Nam ........................................................ 7

1.3 Cơ chế sinh tổng hợp γ-PGA....................................................................................... 8
1.4 Tính chất γ-PGA........................................................................................................ 11
1.5 Phân loại γ-PGA ....................................................................................................... 12
1.6 Hệ vi khuẩn sinh tổng hợp γ-PGA............................................................................. 13
1.7 Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình sinh tổng hợp γ-PGA ...................................... 15
1.7.1.
1.7.2.
1.7.3.

Ảnh hƣởng của nguồn dinh dƣỡng ................................................................ 15
Ảnh hƣởng của yếu tố ngoại cảnh đến quá trình lên men ............................. 21

Phƣơng pháp lên men γ-PGA ........................................................................ 23

1.8 Xác định và đánh giá chất lƣợng và γ-PGA.............................................................. 24
1.8.1.
1.8.2.
1.8.3.
1.8.4.

Định tính và định lƣợng γ-PGA ..................................................................... 24
Thu nhận và tinh sạch γ-PGA ........................................................................ 25
Đánh giá cấu trúc và khối lƣợng phân tử của γ-PGA ................................... 30
Xác định khối lƣợng phân tử γ-PGA.............................................................. 31

1.9 Ứng dụng γ-PGA ....................................................................................................... 32
1.9.1.
1.9.2.
1.9.3.
1.9.4.

Trong lĩnh vực môi trƣờng ............................................................................ 32
Trong lĩnh vực y dƣợc.................................................................................... 33
Trong lĩnh vực nông nghiệp........................................................................... 33
Trong lĩnh vực công nghiệp thực phẩm ......................................................... 34

CHƢƠNG 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ................................................................. 40
2.1.
2.1.1.
2.1.2.
2.1.3.
2.1.4.

2.2.
2.2.1.
2.2.2.
2.2.3.
nghiệm
2.2.4.
2.2.5.
2.2.6.
lụa

VẬT LIỆU ...................................................................................................... 40
Nguồn phân lập ............................................................................................. 40
Hóa chất ........................................................................................................ 40
Môi trƣờng nuôi cấy: ..................................................................................... 40
Dụng cụ và thiết bị ........................................................................................ 41
PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................................................. 41
Phƣơng pháp vi sinh và sinh học phân tử ..................................................... 41
Khảo sát, đánh giá yếu tố ảnh hƣởng đến khả sinh tổng hợp γ-PGA............ 42
Phƣơng pháp toán học - tối ƣu điều kiện nuôi cấy theo quy hoạch thực
43
Phƣơng pháp phân tích hóa lý, hóa sinh ....................................................... 46
Phƣơng pháp đánh giá cảm quan .................................................................. 49
Nghiên cứu và đánh giá mức độ ảnh hƣởng của γ-PGA đến chất lƣợng giò
49
iii

Footer Page 3 of 89.


Header Page 4 of 89.

CHƢƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................................ 51
3.1.
3.2.
3.2.1.
3.2.2.
3.3.
3.3.1.
3.3.2.
3.3.3.
3.3.4.
3.3.5.
3.3.6.
3.3.7.
3.3.8.

Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp Poly γ-glutamic
........................................................................................................................51
Định danh chủng vi khuẩn sinh γ-PGA ......................................................... 55
Định danh theo đặc điểm hình thái kết hợp với sử dụng kit API 50CHB ..........
..............................................................................................................55
Định tên bằng phƣơng pháp sinh học phân tử: ............................................. 60
Nghiên cứu các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình sinh tổng hợp γ-PGA ........ 61
Nghiên cứu tiền chất thích hợp cho sinh tổng hợp γ-PGA ............................ 61
Ảnh hƣởng của nhiệt độ ................................................................................. 62
Ảnh hƣởng của tốc độ lắc. ............................................................................. 63
Ảnh hƣởng của pH. ........................................................................................ 64
Ảnh hƣởng của nguồn carbon đến khả năng sinh tổng hợp γ-PGA. ............. 65
Ảnh hƣởng của nguồn Nitơ............................................................................ 66
Ảnh hƣởng của tỷ lệ cấp giống. ..................................................................... 67
Ảnh hƣởng của nồng độ natri-glutamat ........................................................ 68

3.4.
Tối ƣu các điều kiện ảnh hƣởng đến sinh tổng hợp γ-PGA ........................... 69
3.5.
Nghiên cứu động học của quá trình lên men ................................................. 75
3.6.
Nghiên cứu các yếu tố ngoại cảnh đến sinh tổng hợp γ-PGA của chủng B5 ở
quy mô 100 lít/mẻ ............................................................................................................ 77
3.6.1.
3.6.2.
3.7.

Ảnh hƣởng của chế độ khuấy và sục khí........................................................ 77
Sự thay đổi của hàm lƣợng oxy hòa tan trong quá trình lên men ................. 78
Tinh sạch γ-PGA ............................................................................................ 79

3.7.1. Tinh sạch dựa trên tiêu chí hàm lƣợng protein và carbonhydrat.................. 79
3.7.2. Đánh giá cảm quan sản phẩm γ-PGA sau khi tinh sạch. .............................. 80
3.7.3. Kiểm tra mức độ tinh sạch của sản phẩm bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng cao
áp (HPLC) .................................................................................................................... 81
3.7.4. Đánh giá chất lƣợng sản phẩm tinh sạch, cấu trúc γ-PGA qua kính hiển vi
điện tử quét. .................................................................................................................. 83
3.7.5. Xác định cấu trúc và độ sạch của γ-PGA thông qua phổ FT-IR và phổ H
NMR
84
3.8.
3.8.1.
3.8.2.
3.8.3.
3.8.4.

3.9.
3.9.1.
3.9.2.
phẩm.
3.10.
3.10.1.
3.10.2.
gia khác

Nghiên cứu một số đặc tính của γ-PGA ......................................................... 86
Xác định khối lƣợng phân tử ......................................................................... 86
Tỷ lệ đồng phân D – Glutamic và L – Glutamic trong γ-PGA ...................... 89
Nghiên cứu tính bền axit của γ-PGA. ............................................................ 89
Nghiên cứu tính bền nhiệt của γ-PGA ........................................................... 90
Nghiên cứu hoàn thiện chế phẩm γ-PGA....................................................... 91
Nghiên cứu các thông số cho sấy phun chế phẩm γ-PGA ............................. 91
Đánh giá mức độ an toàn của γ-PGA trong việc sử dụng làm phụ gia thực
92
Nghiên cứu ứng dụng γ-PGA trong ổn định nƣớc cam. ................................ 94
Khảo sát chất lƣợng nguyên liệu ............................................................... 94
So sánh ảnh hƣởng của γ-PGA đến độ ổn định của nƣớc cam với các phụ
95
iv

Footer Page 4 of 89.


Header Page 5 of 89.
3.10.3.
Xác định tỷ lệ bổ sung γ-PGA vào nƣớc cam........................................... 100

3.10.4.
Ảnh hƣởng của chế độ thanh trùng tới chất lƣợng cảm quan của nƣớc cam
.....................................................................................................................................101
3.11.
3.11.1.
3.11.2.
3.11.3.

Nghiên cứu ứng dụng γ-PGA trong cải thiện chất lƣợng giò ...................... 102
Ảnh hƣởng của các loại phụ gia đến độ dẻo của khối thịt xay. ............... 103
Ảnh hƣởng của các loại phụ gia đến chất lƣợng của giò. ....................... 104
Khảo sát nồng độ γ-PGA đến chất lƣợng của giò. .................................. 107

KẾT LUẬN ........................................................................................................................ 109
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN........................................ 110
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................... 111
PHỤ LỤC.......................................................................................................................... 121

v

Footer Page 5 of 89.


Header Page 6 of 89.

Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt
ADP

Adenosine diphosphate

ATP

Adenosine triphosphate

CFU/ml

Colony forming unit

CMC

Carboxyl Methyl Celullose

D,L-PGA

axit D,L- Poly γ- glutamic

DHA

Axit Docosa Hexaenoic

DNA

Axit Deoxyribonucleic

D-PGA

axit D-Poly γ- glutamic

EDTA

Axit Ethylenediaminetetraacetic

EPA

Axit Eicossa Pentaenoic

FT-IR

Quang phổ hồng ngoại chuyển đổi

GPC

Sắc ký lọc gel

H-NMR

Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân

K – γ-PGA

Kali – γ-PGA

LDL

Lipoprotein tỷ trọng thấp

L-PGA

axit L-Poly γ- glutamic

MEGA6

Phần mêm phân tích trình tự gen, phân loài

NCBI

Trung tâm thông tin công nghệ Sinh học quốc gia – Mỹ

PCR

Polymerase chain reaction

RNA

Axit Ribonucleic

SDS

Sodium dodecyl sulfate

SEM

Scanning Electron Microscope

TCA

Axit Tricarboxylic

v/p

Vòng/ phút

v/v

Thể tích/ thể tích

γ-PGA

Axit Poly γ- glutamic

vi

Footer Page 6 of 89.


Header Page 7 of 89.

Danh mục các bảng
Bảng 1.1.Tình hình nghiên cứu và sản xuất γ-PGA từ vi khuẩn trên thế giới ...................... 6
Bảng 1.2. Vi sinh vật sinh tổng hợp axit poly γ-glutamic ................................................... 13
Bảng 1.3. Thành phần môi trƣờng cho vi khuẩn sinh tổng hợp γ-PGA ............................. 15
Bảng 2.1. Khoảng biến đổi của các yếu tố ......................................................................... 44
Bảng 2.2. Bảng bố trí thí nghiệm tối ƣu các yếu tố ảnh hƣởng đến sinh tổng hợp γ-PGA. 45
Bảng 3.1. Sự phát triển, tạo màng nhày của các trực khuẩn gram dƣơng trên môi trƣờng
đặc hiệu ............................................................................................................................... 51
Bảng 3.2. Độ nhớt của canh trƣờng nuôi cấy của các chủng tuyển chọn .......................... 53
Bảng 3.3. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của chủng vi khuẩn trên môi trƣờng LB ............ 55
Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của nồng độ NaCl đến khả năng sinh trƣởng của các chủng vi khuẩn
............................................................................................................................................. 56
Bảng 3.5. Kết quả sinh tổng hợp enzym ngoại bảo của các chủng vi khuẩn ...................... 58

Bảng 3.6. Kết quả sử dụng carbon của vi khuẩn B5 và T1 bằng Kit API 50 CHB............. 59
Bảng 3.7. Kết quả thực nghiệm theo ma trận quy hoạch thực nghiệm. .............................. 70
Bảng 3.8. Kết quả phân tích phƣơng sai ANOVA của mô hình .......................................... 71
Bảng 3.9. Ảnh hƣởng của tốc độ khuấy và sục khí đến mật độ vi khuẩn (CFU/ml) .......... 77
Bảng 3.10: Hàm lƣợng protein và carbonhydrat còn lại sau khi tinh sạch γ-PGA ............ 80
Bảng 3.11. Các tiêu chí đánh giá chất lƣợng cảm quan sản phẩm γ-PGA......................... 81
Bảng 3.12. Kết quả chạy sắc ký lọc gel (GPC) mẫu γ-PGA từ chủng B. subtilis B5.......... 88
Bảng 3.13. Tỷ lệ hỗn hợp của các đồng phân quang học axit glutamic. ............................ 89
Bảng 3.14. Ảnh hƣởng của axit đến tính chất của sản phẩm γ-PGA .................................. 90
Bảng 3.15. Các thông số sấy phun cho chế phẩm γ-PGA ................................................... 92
Bảng 3.16. Bảng phân tích chỉ tiêu hóa lý, hóa sinh của γ-PGA sử dụng làm phụ gia thực
phẩm .................................................................................................................................... 93
Bảng 3.17. Một số chỉ tiêu hóa học của cam sành Hà Giang............................................. 94
Bảng 3.18. Ảnh hƣởng của tỷ lệ dịch quả đến chất lƣợng cảm quan của nƣớc cam .......... 94
Bảng 3.19. Ảnh hƣởng của các phụ gia ổn định đến sự biến đổi độ nhớt của nƣớc cam... 96
Bảng 3.20. Sự biến đổi màu sắc sản phẩm sau thời gian bảo quản ................................... 97
Bảng 3.21. Chất lƣợng cảm quan của nƣớc cam ép đục ở các tỷ lệ bổ sung γ-PGA ...... 100
Bảng 3.22. Ảnh hƣởng của chế độ thanh trùng tới chất lƣợng màu sắc và mùi vị của nƣớc
cam .................................................................................................................................... 102
Bảng PL1. Bảng thành phần các môi trƣờng lên men sinh tổng hợp γ-PGA ................... 122
vii

Footer Page 7 of 89.


Header Page 8 of 89.
Bảng PL2. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến khả năng sinh γ-PGA ........................................ 122
Bảng PL3. Ảnh hƣởng của pH đến khả năng sinh γ-PGA ................................................ 123
Bảng PL4. Hệ số trọng lƣợng đánh giá cảm quan ........................................................... 127
Bảng PL5. Thang điểm đánh giá cảm quan sản phẩm nƣớc cam .................................... 127

Bảng PL6. Thang điểm đánh giá chất lƣợng sản phẩm nƣớc cam ................................... 128
Bảng PL7. Thang điểm đánh giá thị hiếu sản phẩm ......................................................... 129
Bảng PL8. Hệ số trọng lƣợng đánh giá cảm quan sản phẩm giò lụa ............................... 129
Bảng PL9. Thang điểm đánh giá cảm quan sản phẩm giò ............................................... 129

viii

Footer Page 8 of 89.


Header Page 9 of 89.

Danh mục các hình vẽ, đồ thị
Hình 1.1. Cấu trúc của phân tử γ-PGA .............................................................................................. 3
Hình 1.2. Con đƣờng sinh tổng hợp γ-PGA ........................................................................................ 9
Hình 1.3. Phản ứng polymer hóa γ-PGA bởi ATP ........................................................................... 10
Hình 1.4. Quy trình tinh sạch γ-PGA theo phƣơng pháp của Ho và các cộng sự ............................ 27
Hình 1.5. Quy trình tinh sạch γ-PGA theo phƣơng pháp của Seong và các cộng sự ....................... 28
Hình 1.6. Quy trình tinh sạch γ-PGA theo phƣơng pháp của Goto và Kunioka................................ 29
Hình 1.7. Kỹ thuật điện di SDS-PAGE xác định khối lƣợng phân tử γ-PGA .................................... 31
Hình 1.8. Quy trình thử nghiệm chế phẩm γ-PGA trên sản phẩm giò lụa ......................................... 37
Hình 3.1. Ảnh chụp tạo màng của các chủng vi khuẩn thử nghiệm trên môi trƣờng đặc hiệu ......... 52
Hình 3.2. Sắc ký bản mỏng dịch nhớt canh trƣờng sau khi thủy phân .............................................. 54
Hình 3.3. Khả năng sinh γ-PGA của các chủng tuyển chọn .............................................................. 54
Hình 3.4. Đặc điểm hình thái tế bào của chủng B5 và T1 dƣới kính hiển vi quang học ................... 56
Hình 3.5. Ảnh hƣởng của pH đến khả năng phát triển của vi khuẩn ................................................ 57
Hình 3.6. Cây phát sinh chủng (B5) dựa trên trình tự gen mã hóa 16S rRNA .................................. 60
Hình 3.7. Cây phát sinh chủng (T1) dựa trên trình tự gen mã hóa 16S rRNA .................................. 60
Hình 3.8 Ảnh hƣởng của các tiền chất đến quá trình sinh tổng hợp γ-PGA. .................................... 61
Hình 3.9. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến quá trình sinh tổng hợp γ-PGA ............................................ 62

Hình 3.10. Ảnh hƣởng của tốc độ lắc đến quá trình sinh tổng hợp γ-PGA ....................................... 63
Hình 3.11. Ảnh hƣởng của pH đến quá trình sinh tổng hợp γ-PGA .................................................. 64
Hình 3.12. Ảnh hƣởng của nguồn carbon đến sự hình thành γ-PGA ................................................ 66
Hình 3.13. Ảnh hƣởng của nguồn nitơ đến sự hình thành γ-PGA ..................................................... 67
Hình 3.14. Ảnh hƣởng của tỷ lệ cấp giống đến quá trình sinh tổng hợp γ-PGA .............................. 68
Hình 3.15. Ảnh hƣởng của nồng độ Natriglutamat đến sự tổng hợp γ-PGA ..................................... 69
Hình 3.16. Biểu đồ bề mặt đáp ứng khi thời gian và nhiệt độ thay đổi ............................................. 73
Hình 3.17. Biểu đồ bề mặt đáp ứng khi nhiệt độ và tiền chất thay đổi .............................................. 74
Hình 3.18. Biểu đồ bề mặt đáp ứng khi pH và nhiệt độ thay đổi ....................................................... 74
Hình 3.19. Biểu đồ bề mặt đáp ứng khi pH và thời gian thay đổi ..................................................... 75
Hình 3.20. Đồ thị biểu diễn động học quá trình tổng hợp γ-PGA ..................................................... 76
Hình 3.21. Sự biến đổi của hàm lƣợng oxy hòa tan trong quá trình lên men.................................... 78
Hình 3.22. Sắc ký đồ HPLC mẫu γ-PGA thủy phân thành glutamic. ................................................ 82
Hình 3.23. Sắc ký đồ axit L-Glutamic sử dụng trong sinh tổng hợp γ-PGA. ..................................... 82
Hình 3.24. Ảnh chụp cấu trúc γ-PGA bằng kính hiển vi điện tử quét độ phóng đại 100.000 lần...... 83
Hình 3.25. Phổ FT-IR của γ-PGA tinh sạch thu đƣợc bởi chủng B. subtilis B5 ................................ 84
Hình 3.26. Phổ FT-IR của γ-PGA chuẩn của hãng Merck ................................................................ 85
Hình 3.27. Phổ H NMR của γ-PGA tinh sạch thu đƣợc bởi chủng B. subtilis B5 ............................. 85
Hình 3.28. Phổ HNMR mẫu γ-PGA chuẩn của hãng Merck ............................................................. 86
ix

Footer Page 9 of 89.


Header Page 10 of 89.
Hình 3.29. Điện di SDS PAGE xác định khối lƣợng phân tử của γ-PGA .......................................... 87
Hình 3.30. Sắc ký đồ mẫu γ-PGA tạo thành bởi chủng B. subtilis B5 bằng sắc ký lọc gel ............... 88
Hình 3.31. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến sự biến đổi độ nhớt của dịch γ-PGA .................................. 91
Hình 3.32. Biểu đồ so sánh ảnh hƣởng của γ-PGA và các phụ gia thƣờng dùng khác trong việc ổn
định cho nƣớc cam............................................................................................................................. 95

Hình 3.33. Nƣớc cam đóng chai sau 6 tháng bảo quản .................................................................... 98
Hình 3.34. Biểu đồ ảnh hƣởng của các phụ gia ổn định đến chất lƣợng cảm quan của nƣớc cam .. 99
Hình 3.35. Biểu đồ đánh giá các chỉ tiêu cảm quan của nƣớc cam ép đục ở các tỷ lệ bổ sung γ-PGA
......................................................................................................................................................... 100
Hình 3.36. Biểu đồ ảnh hƣởng của phụ gia tạo cấu trúc đến chất lƣợng khối thịt xay. .................. 103
Hình 3.37. Biểu đồ lực nén và lực cắt của giò thành phẩm ............................................................. 104
Hình 3.38. Biểu đồ đánh giá cƣờng lực gel của các mẫu sản phẩm giò ......................................... 105
Hình 3.39. Biểu đồ điểm đánh giá cảm quan các mẫu giò sử dụng phụ gia. .................................. 106
Hình 3.40. Cƣờng lực gel của các mẫu giò sử dụng γ-PGA ............................................................ 107
Hình PL1. Ảnh khuẩn lạc trên môi trƣờng LB, môi trƣờng E và ảnh chụp qua kính hiển vi nhuộm
bào tử, nhuộm gram của vi khuẩn Bacillus subtilis B5 ................................................................... 121
Hình PL2. Đƣờng chuẩn xác định hàm lƣợng γ-PGA ..................................................................... 123
Hình PL3. Ảnh các peak khi giải trình tự 2 chiều ........................................................................... 124
Hình PL4. Đƣờng chuẩn đánh giá hàm lƣợng carbonhydrat.......................................................... 126
Hình PL5. Bảng phối màu từ ba màu cơ bản .................................................................................. 126

x

Footer Page 10 of 89.


Header Page 11 of 89.

MỞ ĐẦU
Khoa học công nghệ trên thế giới nói chung hay ở Việt Nam nói riêng ngày càng đƣợc
quan tâm khai thác ứng dụng vào cuộc sống. Nhờ tiến bộ khoa học công nghệ, các sản
phẩm thực phẩm có thể giữ đƣợc lâu hơn và chất lƣợng chế biến tốt hơn. Tuy nhiên, trong
sản xuất thực phẩm, do chạy theo lợi ích, một số nhà sản xuất đã sử dụng những nguyên
liệu và phụ liệu chế biến không phù hợp với tiêu chuẩn đã đặt ra, làm cho vấn đề đảm
bảo vệ sinh an toàn thực phẩm càng trở nên báo động hơn bao giờ hết. Để góp phần giải

quyết vấn đề này, việc nghiên cứu tạo ra phụ gia thực phẩm mới thay thế những hóa chất
độc hại đang đƣợc sử dụng tràn lan trên thị trƣờng là nhiệm vụ cấp thiết đối với các nhà
khoa học.
Axit poly γ-glutamic (γ-PGA) là một polymer sinh học đƣợc tạo thành từ các phần tử axit
glutamic. Với ƣu thế là một polymer có khả năng phân hủy, không độc với con ngƣời và tự
nhiên nên γ-PGA đang đƣợc nghiên cứu và ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau, thí
dụ: Trong công nghiệp môi trƣờng γ-PGA đƣợc sử dụng làm chất kết tụ, hỗ trợ quá trình
lắng, thay thế dần các chất kết tụ có nguồn gốc hóa học [5, 59, 82, 83, 88, 95, 126]. Trong
y dƣợc γ-PGA đƣợc dùng nhƣ các chất mang, chất giữ ẩm... Trong sản xuất thực phẩm γPGA đƣợc sử dụng nhƣ một dạng phụ gia ổn định chất lƣợng sản phẩm, chất chống kết
tinh, chất ổn định… Axit poly γ-glutamic đƣợc sản xuất bằng cách trùng hợp các axit
glutamic, thông qua con đƣờng tổng hợp hóa học [1, 2], hay theo con đƣờng lên men sử
dụng các chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp axit poly γ-glutamic. Các chủng vi
sinh vật này thƣờng đƣợc tuyển chọn trong các sản phẩm lên men truyền thống nhƣ Natto
(Nhật Bản), Thua-nao (Thái Lan), Chungkookjang (Hàn Quốc), Tƣơng (Việt Nam)…[8,
53, 100].
Ở Việt Nam những nghiên cứu về γ-PGA cho đến nay chỉ đƣợc triển khai trên quy mô
phòng thí nghiệm, ở mức độ phân lập và tuyển chọn chủng giống. Một số nghiên cứu sản
xuất γ-PGA trên quy mô công nghiệp phục vụ nông nghiệp đƣợc thực hiện bởi các công ty
của Đài Loan và Nhật Bản với chủng giống độc quyền của họ Bacillus là vi khuẩn có khả
năng sinh tổng hợp γ-PGA không chỉ đƣợc tìm thấy trong các sản phẩm nƣớc ngoài mà có
thể phân lập đƣợc từ các sản phẩm thực phẩm truyền thống của Việt Nam nhƣ Tƣơng Bần,
Tƣơng Nam Đàn, Nƣớc Mắm, Chao…[3].
Thực trạng nghiên cứu về γ-PGA trong sản xuất và ứng dụng tại Việt Nam cho thấy chúng
ta cần có những nghiên cứu rộng hơn về tính chất ƣu việt của vi khuẩn Bacillus trong sinh
1

Footer Page 11 of 89.


Header Page 12 of 89.

tổng hợp γ-PGA và ứng dụng của chúng trong chế biến các sản phẩm thực phẩm. Hơn nữa
việc tạo ra những sản phẩm có nguồn gốc từ quá trình lên men hiện nay là một xu hƣớng
mới, tiến bộ bởi tính an toàn, khả năng ứng dụng cao, ít ảnh hƣởng đến môi trƣờng sống.
Trong lĩnh vực công nghiệp thực phẩm ở Việt Nam hiện nay, việc lạm dụng các phụ gia có
nguồn gốc hóa học đang diễn biến rất phức tạp, với việc nhiều loại hóa chất công nghiệp
đƣợc sử dụng trong chế biến thực phẩm. Các nhà quản lý và nhà nghiên cứu đang dần trở
nên thụ động đối với mỗi loại sản phẩm có chứa các phụ gia lạ. Từ góc độ nghiên cứu cho
thấy cần phải nghiên cứu ra những loại phụ gia thực phẩm mới, phù hợp tiêu chuẩn an
toàn, đƣợc các tổ chức trong nƣớc và quốc tế công nhận. Để đáp ứng một phần nhu cầu đó
đề tài “Nghiên cứu sinh tổng hợp và thu nhận axit poly γ-glutamic và hướng ứng dụng
trong thực phẩm” ra đời nhằm khai thác những những điểm mạnh của vi khuẩn Bacillus,
để tạo ra sản phẩm lên men an toàn cho chế biến thực phẩm ngày nay.
Mục tiêu nghiên cứu của đề tài:
 Nghiên cứu công nghệ sản xuất axit poly γ-glutamic từ vi sinh vật.
 Ứng dụng chế phẩm axit poly γ-glutamic trong sản xuất các sản phẩm thực phẩm
Nội dung nghiên cứu gồm
 Phân lập, tuyển chọn và định danh các chủng vi khuẩn có hoạt tính sinh tổng hợp γPGA từ các sản phẩm thực phẩm.
 Khảo sát và tối ƣu các điều kiện nuôi cấy thích hợp sinh tổng hợp axit poly γ-glutamic.
 Tinh sạch, thu nhận và khảo sát các đặc điểm và cấu trúc của axit poly γ-glutamic.
 Bƣớc đầu ứng dụng thử nghiệm axit poly γ-glutamic vào một số sản phẩm thực phẩm.
Những đóng góp mới của đề tài:
Luận án đã nghiên cứu một cách có hệ thống về công nghệ thu nhận axit poly γ-glutamic
từ vi khuẩn Bacillus subtilis B5 ( phân lập, tuyển chọn chủng giống vi sinh vật, tối ƣu hóa
các điều kiện nuôi vi khuẩn sinh tổng hợp γ-PGA, tách, tinh sạch, thu nhận đến việc xác
định cấu trúc, đặc tính của γ-PGA).
Bƣớc đầu thử nghiệm ứng dụng có hiệu quả γ-PGA trong quá trình chế biến để ổn định
trạng thái, màu sắc và hƣơng vị của nƣớc cam và thử nghiệm ứng dụng để cải thiện độ
giòn, dai và màu sắc trong sản xuất giò.

2

Footer Page 12 of 89.


Header Page 13 of 89.

CHƢƠNG 1 - TỔNG QUAN
1.1 Giới thiệu về axit poly gamma glutamic
Axit poly gamma glutamic (γ-PGA) là một polymer tự nhiên, mang điện tích âm có các
đơn phân là axit L-glutamic hay axit D-glutamic hoặc chứa cả hai đơn phân trên liên kết
với nhau bằng mối liên kết giữa nhóm γ-carboxyl và nhóm α-amino [50, 95]. Khả năng
tham gia phản ứng hóa học với nhóm α-NH2 của nhóm α-COOH và γ-COOH theo thứ tự
giảm dần theo mạch. Thông thƣờng, α-NH2 liên kết với α-COOH tạo nên liên kết α-peptid
(hình 1.1), tạo ra sản phẩm là α-PGA thông qua các phản ứng hóa học bằng cách trùng hợp
nucleophile. Nhƣng khi có đƣợc một hệ xúc tác thích hợp, nhóm α-NH2 sẽ liên kết với
nhóm γ-COOH để tạo nên liên kết γ-peptid, nhƣ mô tả trong hình 1.1. Sự hình thành γPGA khác với sự hình thành của protein, vì glutamate đƣợc polymer hóa bên trong tế bào
thông qua các mối liên kết γ-amide, tổng hợp một cách độc lập với ribosome. Do vậy, các
chất ức chế của protein, chẳng hạn nhƣ chloramphenicol không có ảnh hƣởng đến việc
tổng hợp γ-PGA[4]. Nhờ quá trình polymer hóa, γ-PGA có thể đƣợc hình thành từ hơn
10.000 phân tử axit glutamic. Tùy theo môi trƣờng và phụ thuộc vào chủng vi sinh vật, γPGA có thể đƣợc hình thành với 3 loại khác nhau, trong đó một loại đƣợc tạo thành từ toàn
bộ D-γ-PGA, một loại đƣợc tạo thành nhờ toàn bộ L-γ-PGA và một loại đƣợc tạo thành
nhờ polymer hóa hỗn hợp DL-γ-PGA. Sự khác biệt này có đƣợc khi vi khuẩn có khả năng
chuyển hóa trực tiếp hay gián tiếp axit L-glutamic thành axit D-glutamic và hai dạng này
sẽ đồng trùng hợp tạo ra DL-γ-PGA gọi chung là γ-PGA [95].

Hình 1.1. Cấu trúc của phân tử γ-PGA [4]

Một vài nghiên cứu về γ-PGA từ vi khuẩn đã đƣợc tiến hành thông qua việc đo độ nhớt, đo
phổ hấp thụ hồng ngoại. Các kết quả nghiên cứu cho thấy trong phần nhầy của Natto có
58% γ-PGA và 40% polysaccharide, pH khoảng 5 – 8,8 và phần nhầy này sẽ thay đổi tỷ lệ

γ-PGA và polysaccharide khi pH môi trƣờng thay đổi [42, 85, 92, 130]. Nghiên cứu về
ảnh hƣởng của nồng độ polymer tới cấu trúc cho thấy γ-PGA có cấu trúc xoắn khi ở nồng
3

Footer Page 13 of 89.


Header Page 14 of 89.
độ thấp và có dạng  khi nồng độ cao (thể hiện ở 2 dải quang phổ 1635 và 1588 cm-1) [58,
84]. Khi nồng độ polymer tăng, có sự ảnh hƣởng lẫn nhau giữa các phân tử, sự ảnh hƣởng
này lớn hơn rất nhiều so với ảnh hƣởng nội phân tử. Nhƣ vậy có thể thấy polymer ngoại
bào đƣợc sản xuất từ vi khuẩn tồn tại nhiều cấu hình khác nhau, phụ thuộc vào điều kiện
môi trƣờng nhƣ nhiệt độ, pH, nồng độ polymer và nồng độ ion những nhân tố quan trọng
ảnh hƣởng tới xu hƣớng hình thành các nhóm chức năng trong polymer. Cấu trúc thay đổi
sẽ ảnh hƣởng đến tính chất vật lý (gắn, kết dính) kim loại, theo đó sẽ thay đổi môi trƣờng
và độc tính của kim loại mà γ-PGA có thể gắn kết [50].

1.2 Tình hình nghiên cứu γ-PGA trên thế giới và Việt Nam
1.2.1. Tình hình nghiên cứu γ-PGA trên thế giới.
Các sản phẩm có nguồn gốc sinh học, các polymer sinh học, các vật liệu sinh học đang dần
thay thế các polymer dầu mỏ, các sản phẩm có nguồn gốc dầu mỏ và khoáng sản đang dần
cạn kiệt. Trong số các sản phẩm sinh học có những đặc tính nói trên phải kể đến axit poly
γ-glutamic (γ-PGA), một sản phẩm đƣợc tổng hợp từ axit glutamic, đƣợc sản xuất từ quá
trình lên men vi sinh vật với các nguồn nguyên liệu rẻ tiền nhƣ ngô, khoai, sắn hay từ sinh
khối thực vật. Hiện tại trên thế giới một số công ty đã sản xuất γ-PGA nhƣ Wako Pure
Chemical Industries, Vedan Enterprise Corp (Đài Loan), Alamanda Polymers (Canada)…
Năm 1913, axit poly γ-glutamic chỉ đƣợc biết đến trong hỗn hợp với fructan, ở lớp màng
nhầy của Natto – sản phẩm đậu tƣơng lên men của ngƣời Nhật Bản [91].
Năm 1937, axit poly γ-glutamic đƣợc tìm thấy lần đầu tiên bởi Ivanovíc và các cộng sự khi
họ nghiên cứu về lớp màng bao quanh vi khuẩn Bacillus anthrasis một loại vi khuẩn gây

nên bệnh than rất nguy hiểm cho các động vật ăn cỏ, động vật có vú và con ngƣời [54].
Năm 1942, Bovarnick đã chứng minh rằng γ-PGA là một sản phẩm tiết trực tiếp vào canh
trƣờng nuôi cấy giống nhƣ một sản phẩm lên men ngoại bào thông thƣờng [27].
Năm 1962, House và các cộng sự phân tách đƣợc một hệ enzym tổng hợp PGA cũng từ
chủng Bacillus licheniformis 9945A. Tuy nhiên, hệ enzym này xúc tác tạo ra một loại γPGA chứa 60% là axit L-glutamic [51].
Năm 1973, Troy đã tìm ra một phức hợp các enzym poly-glutamyl synthetase ở màng nhầy
bao quanh vi khuẩn B. licheniformis 9945A xúc tác cho hàng loạt phản ứng trên màng,
trong đó axit L- glutamic đƣợc hoạt hóa, đồng phân hóa và polymer hóa thành cấu trúc rất
giống PDGA nhƣ là một sản phẩm tiết vào canh trƣờng dạng hòa tan. Hệ enzym xúc tác
4

Footer Page 14 of 89.


Header Page 15 of 89.
cho các phản ứng này đòi hỏi phải sự có mặt của ion Mg2+ và không thể thay thế bằng các
ion kim loại hóa trị hai khác [113].
Năm 1982, trong một số nghiên cứu đã công bố việc phân lập đƣợc một số enzym ngoại
bào từ Bacillus natto tham gia xúc tác cho phản ứng chuyển hóa amin đặc biệt là cho
glutamine. Các đơn phân này đƣợc chuyển hóa thành đơn phân còn lại, sau đó chúng sẽ
liên kết với nhau nhờ các liên kết γ-peptid và tồn tại ở dạng đồng hình chỉ chứa một loại
đơn phân. Kết quả là có hàng loạt enzym phải tham gia vào quá trình tổng hợp này [48,
112].
Các nghiên cứu sâu hơn về γ-PGA đã đƣợc tiến hành vào năm 1995, từ đó sản phẩm này
trở thành một polymer nhận đƣợc nhiều sự quan tâm nghiên cứu từ các nhà khoa học trong
những năm gần đây. Phƣơng pháp đơn giản để phát hiện, tinh sạch, xác định γ-PGA đã
đƣợc Kanno và cộng sự đƣa ra và rất hữu ích trong nghiên cứu di truyền và sinh hóa.
Phƣơng pháp này sử dụng Cetyltrimethylammonium bromide là chất tạo độ đục cho dung
dịch chứa γ-PGA rồi đo OD ở 400 nm có thế xác định đƣợc hàm lƣợng γ-PGA [7].
Năm 2006, Masaaki và các cộng sự đã thực hiện một nghiên cứu về sự hình thành màng

sinh học từ chủng B. subtilis ATCC 14593 và chỉ ra rằng γ-PGA là thành phần chính của
màng sinh học. Nghiên cứu này đã mở ra một hƣớng ứng dụng mới đầy tiềm năng cho γPGA trong tƣơng lai đặc biệt là việc lựa chọn phƣơng thức lên men nhằm tăng hiệu suất
chuyển hóa tạo γ-PGA của chủng vi khuẩn [79, 82].
Theo số liệu thống kê trong bảng 1.1 để thu γ-PGA thời gian lên men trung bình từ 3 đến 4
ngày (72-96h) và hàm lƣợng γ-PGA sinh tổng hợp đạt đƣợc từ 20-35 g/l [95, 96].

5

Footer Page 15 of 89.


Header Page 16 of 89.
Bảng 1.1.Tình hình nghiên cứu và sản xuất γ-PGA từ vi khuẩn trên thế giới [17, 34, 45, 46, 84, 85,
87, 93, 95, 96, 128]

Chủng

Điều kiện, thời

Năng suất

Trích nguồn

30oC, 96h

17-23 g/l

Troy, F.A (1973)

B. subtilis IFO 3335

37oC, 48h

10-20 g/l

B. subtilis TAM-4

30oC, 96h

20 g/l

B. licheniformis A35

30oC, 72 – 120h

8-12 g/l

B. subtilis F-02-1

30oC, 48-72h

50 g/l

B. subtilis (Natto)

40oC, 96h

35 g/l

37oC, 96h

19–20 g/l

B. licheniformis NCIM 2324

37oC, 96h

46-47 g/l

B. subtilis ZJU-7

37oC, 48h

54 g/l

30oC, 72h

12-15 g/l

37oC, 115h

55,2 g/kg

B. licheniformis ATCC
9945

B. licheniformis CCRC
12826

B. licheniformis ATCC

9945
B. subtilis AR1

gian lên men

Goto, A và Kunioka,
M (1992)
Yoshihito, I và cộng
sự (1996)
Cheng, C và cộng sự.
(1989)
Kubota, H và cộng sự.
(1993)
Ogawa, Y. F và cộng
sự (1997)
Shih, I.L và cộng sự
(2002)
Bajaj, I. B và Singhal,
R. S (2009)
Chen, J và cộng sự
(2010)
Nuttawut, K và cộng
sự (2012)
Joseph, M và Kumar,
A (2012)

Trong các nghiên cứu khoa học gần đây, việc ứng dụng công nghệ sinh học vào các lĩnh
vực thực phẩm, nông nghiệp và xử lý môi trƣờng, chăm sóc sức khỏe ngày càng phổ biến
và đƣợc quan tâm sâu hơn. Theo tổ chức y tế thế giới, nhu cầu sử dụng các hợp chất từ
thiên nhiên trong công nghệ thức phẩm là một xu thế tất yếu, đặc biệt là các hợp chất tự

nhiên đƣợc tổng hợp từ quá trình sinh học của vi sinh vật đang là đích đến của các nhà
nghiên cứu. Các hợp chất có nguồn gốc từ vi sinh vật tổng hợp đƣợc phân tách ra làm các
sản phẩm với các mục đích khác nhau. So với các hợp chất đƣợc tổng hợp bằng phƣơng
6

Footer Page 16 of 89.


Header Page 17 of 89.
pháp hóa học, chúng có những ƣu điểm vƣợt trội nhƣ an toàn cho sức khỏe con ngƣời,
thân thiện với môi trƣờng [95].
1.2.2. Tình hình nghiên cứu γ-PGA ở Việt Nam
Ở nƣớc ta việc ứng dụng công nghệ sinh học vào đời sống không cao nhƣ các nƣớc phát
triển khác. Song việc khai thác ứng dụng các quá trình sinh học trong công nghệ thực
phẩm đã đƣợc hình thành từ lâu trong đời sống xã hội. Những sản phẩm truyền thống nhƣ
nƣớc mắm, tƣơng Bần, tƣơng Nam đàn, tôm chua Huế, Chao… là những nguồn tài nguyên
vi sinh vật tiềm năng cho phát triển công nghệ sinh học hiện đại đặc biệt là các hợp chất
polymer sinh học.
Nghiên cứu về axit poly γ-glutamic ở Việt Nam còn rất hạn chế, chủ yếu là hợp tác nghiên
cứu các phần có liên quan đến γ-PGA. Sản phẩm γ-PGA chỉ thấy xuất hiện tại Việt Nam ở
các dạng mỹ phẩm gia dụng, màng sinh học... và hầu hết các sản phẩm γ-PGA này đều có
nguồn gốc nƣớc ngoài: từ Nhật bản, Hàn Quốc, Mỹ, Đức… Các công trình nghiên cứu về
γ-PGA tại Việt Nam cho đến nay mới chủ yếu đạt đƣợc ở mức tổng quan, mô tả về quy
trình, mô tả về ứng dụng thực tiễn trong một số tài liệu giảng dạy. Việc đi sâu nghiên cứu
về cơ chế quá trình sinh tổng hợp γ-PGA và khai thác ứng dụng sản phẩm này hầu nhƣ là
chƣa có. Hiện tại cũng có một số nghiên cứu của các nhà khoa học Việt Nam tại nƣớc
ngoài có liên quan đến γ-PGA nhƣ nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa enzym γ-PGA
synthetase từ B. subtilis của Viện nghiên cứu thực phẩm Quốc gia Nhật bản và Viện Công
nghệ Sinh học [40, 66-68]. Nhìn một cách tổng thể việc nghiên cứu γ-PGA ở Việt Nam
còn rất ít và chỉ liên quan đến vi khuẩn Bacillus và các ứng dụng của vi khuẩn này trong

công nghệ sinh học hay công nghệ thực phẩm. Hiện tại ở Việt Nam tập đoàn Vedan đã sử
dụng vi khuẩn B. subtilis var natto và axit L-Glutamic qua cơ chế chuyển hóa sinh hóa
Salvage Bioconversion Pathway để tạo thành sản phẩm γ-PGA. Tuy nhiên công nghệ này
chỉ đƣợc sử dụng trong khuôn khổ của tập đoàn Vedan nên mọi thông tin công nghệ hay
chủng giống đều đƣợc bảo mật và sản phẩm tạo thành γ-PGA của Vedan là sản phẩm dạng
nƣớc sử dụng cho mục đích làm thức ăn chăn nuôi và phân bón nông nghiệp [114].
Năm

2013

đề

tài

nghiên

cứu

“Phân

lập

vi

khuẩn

có

năng

lực

sinh

tổng hợp gamma polyglutamic acid từ đồ uống Boza” của Trƣờng đại học Nông Lâm Thái
Nguyên đƣợc thực hiện nhằm mục đích phân lập đƣợc chủng vi khuẩn có năng lực sinh
tổng hợp γ-PGA và ứng dụng các sản phẩm này trong lĩnh vực nông nghiệp.

7

Footer Page 17 of 89.


Header Page 18 of 89.
Tóm lại, từ thực trạng nghiên cứu về γ-PGA trong sản xuất và ứng dụng tại Việt Nam cho
thấy cần có những nghiên cứu rộng hơn về tính chất ƣu việt của vi khuẩn Bacillus cũng
nhƣ các sản phẩm do vi khuẩn này tạo ra.

1.3 Cơ chế sinh tổng hợp γ-PGA
Nhiều nghiên cứu đã đƣợc tiến hành để làm sáng tỏ con đƣờng trao đổi chất và các enzym
có liên quan đến quá trình polymer hóa tạo γ-PGA nhằm tăng hiệu suất chuyển hóa của vi
khuẩn bằng việc tác động vào các enzym trong quá trình tạo γ-PGA. Đã có nhiều nghiên
cứu công bố cho thấy sự tham gia của enzym transglutaminase của B. subtilis NR-1 là yếu
tố chính xúc tác sinh tổng hợp γ-PGA, và cơ chế đồng phân hóa L-glutamic sang Dglutamic nhờ enzym alanine recemase. Các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng phản ứng kéo dài
chuỗi γ- peptid đƣợc xúc tác bởi hệ enzym: glutamate dehydronase, glutamine synthetase,
pyruvic acid aminotransferase, PGA synthetase [45, 92, 95]. Tuy nhiên, B. anthracis và B.
subtilis không có sự chuyển hóa này mà vẫn tạo ra γ-PGA. Điều đó chứng tỏ đây không
phải là cơ chế tạo ra γ-PGA mà thực tế chỉ là một bƣớc trong cả một quy trình chuyển hóa
tạo γ-PGA [19, 45].
Các nghiên cứu đã chỉ ra chủng B. licheniformis 9945A có hệ enzym tổng hợp γ-PGA dạng

tự do là glutamyl transamidase. Hệ enzym này xúc tác cho việc tạo ra một loại γ-PGA chứa
60% axit L-glutamic và trong quá trình tổng hợp này đòi hỏi phải có sự tham gia của Mn2+
với vai trò co-factor [53, 64, 65, 67, 125].
Axit glutamic là những đơn phân trong cấu trúc của axit poly γ-glutamic nhờ ba nhóm liên
kết hóa học α-NH2, α-COOH, γ-COOH. Phản ứng hóa học của ba nhóm này đƣợc sắp xếp
theo thứ tự α-NH2>α-COOH >γ-COOH. Trong phản ứng hóa học xúc tác polymer hóa của
axit glutamic, quá trình trùng hợp sẽ xảy ra đầu tiên giữa các nhóm α-NH2 và α-COOH
hình thành nên liên kết α-peptid và kết quả của quá trình này sẽ là axit poly α-glutamic.
Nhƣng đối với một quá trình sinh tổng hợp, phần lớn axit L- glutamic đƣợc xúc tác và
chuyển hóa thành axit D – glutamic, khi đó cả D – glutamic và L – Glutamic cùng đƣợc
polymer hóa và hình thành liên kết giữa nhóm α-NH2 và nhóm γ-COOH với kết quả tạo
nên sản phẩm cuối là D,L-γ-PGA. Liên kết α-peptid thƣờng chỉ tìm thấy trong cấu trúc của
các protein và các liên kết này có thể bị enzym protease phân cắt. Đối với liên kết γ-peptid
trong

axit

poly

γ-glutamic

chỉ

có

thể

phân

cắt

bởi

enzym

γ-GTP

(γ-

glutamyltranspeptidase) một loại enzym hiếm có trong tự nhiên. Không một protease nào

8

Footer Page 18 of 89.


Header Page 19 of 89.
có thể phân cắt đƣợc γ-PGA, tuy nhiên γ-PGA lại là đối tƣợng sử dụng trở lại của các vi
sinh vật tạo nên chúng [95].
Việc chuyển hóa tạo γ-PGA cần sử dụng các hệ enzym đa dạng tùy thuộc vào hệ vi sinh và
môi trƣờng nuôi cấy. Sơ đồ hình thành nên γ-PGA đƣợc minh họa trong hình 1.2 nhƣ sau:

Hình 1.2. Con đƣờng sinh tổng hợp γ-PGA [48]

Con đƣờng sinh tổng hợp γ-PGA đƣợc nghiên cứu và đƣa ra từ năm 1982 bởi Hara và các
cộng sự vẫn là vấn đề đang gây tranh cãi giữa các nhà khoa học, bởi mỗi chủng vi khuẩn
có những cách chuyển hóa riêng [48]. Tuy nhiên có một số điểm chung trong các nghiên
cứu về con đƣờng tổng hợp γ-PGA là: từ các hợp chất polysaccharide sau khi chuyển hóa
thành các dạng đƣờng cơ bản là glucose hoặc saccharose đƣợc vi khuẩn chuyển hóa qua
quá trình đƣờng phân thành axit pyruvic. Từ axit pyruvic nhờ sự chuyển hóa của vi khuẩn

qua chu trình TCA chuyển hóa thành axit α-ketoglutaric. Với sự tham gia xúc tác của
NH4+, phản ứng chuyển hóa axit α-ketoglutaric và L-glutamine thành axit L-glutamic. Nhờ
axit α-ketoglutaric và axit pyruvic mà axit L-glutamic có thể chuyển hóa một phần thành
D-glutamic. Giai đoạn polymer hóa nhờ sự xúc tác của enzym PGA synthetase sản sinh bởi
vi khuẩn, các phần tử L-glutamic và D-glutamic liên kết với nhau thành D,L-γ-PGA.
9

Footer Page 19 of 89.


Header Page 20 of 89.
Quá trình tổng hợp γ-PGA nhìn chung có thể tổng kết qua bốn góc độ là: racemic hóa γPGA, polymer hóa γ-PGA, phân cắt γ-PGA, và điều tiết γ-PGA, đƣợc cụ thể nhƣ sau:
- Quá trình racemic hóa γ-PGA: Do γ-PGA là một hỗn hợp chỉ gồm L hoặc D –glutamic
hoặc cả D và L glutamic, tùy thuộc vào chủng vi khuẩn tham gia. Tuy nhiên, để có đƣợc
D-glutamic cần phải có quá trình racemic hóa từ L-glutamic. Vi khuẩn B. subtilis, có đoạn
mã gen liên quan đến sự hình thành enzyme có khả năng racemic hóa là glr và yrpC. Trong
đó glr là enzym cytosolic có khả năng lựa chọn glutamic cao và đặc biệt đối với Lglutamic[30]. Quy trình racemic hóa L-glutamic thành D-glutamic đƣợc xảy ra nhƣ sau: Lglutamic đƣợc enzym pyruvic aminotransferase xúc tác chuyển hóa thành L- alanine, sau
đó L-alanine đƣợc enzym alanine racemase xúc tác racemic hóa thành D-alanine. Cũng
nhờ xúc tác của enzym pyruvic aminotransferase mà D-alanine chuyển hóa thành Dglutamic [45, 95].
- Quá trình polymer hóa γ-PGA: cơ chế polymer hóa các phân tử γ-PGA phụ thuộc vào các
phần tử ATP đƣợc chỉ ra trong hình 1.3. Đầu tiên là nhóm carboxyl ở cuối của phân tử γPGA kết hợp với nhóm phosphoryl từ gamma phosphate của ATP. Tiếp theo, nhóm amino
của axit glutamic tấn công thay thế vào các phần tử phosphorylated trên nhóm carboxyl,
kết quả hình thành liên kết amin mới làm kéo dài mạch γ-PGA [104].

Hình 1.3. Phản ứng polymer hóa γ-PGA bởi ATP [104].

- Quá trình phân cắt γ-PGA (depolymer γ-PGA): hai enzym (endo-γ-glutamyl peptidase và
exo-γ- glutamyl peptidase đƣợc chứng minh là những enzym phân cắt γ-PGA. Trong thực
tế đã chứng minh có sự phân cắt γ-PGA trong canh trƣờng do enzym ngoại bào của vi
khuẩn B. subtilis NX2, là nguyên nhân giảm khối lƣợng phân tử γ-PGA [120]. Những

enzym này đƣợc thể hiện rõ ở pha cuối của quá trình sinh tổng hợp.
- Quá trình điều tiết γ-PGA: Theo nhiều nghiên cứu quá trình sinh tổng hợp γ-PGA đƣợc
điều tiết bởi các gen ComPA, DegSU và DegQ điều khiển mức độ phiên mã để thể hiện
các đặc tính cảm ứng tối thiểu, thẩm thấu và sự biến đổi pha.

10

Footer Page 20 of 89.


Header Page 21 of 89.

1.4 Tính chất γ-PGA
Axit poly γ-glutamic có thể bị phân hủy sinh học, không độc với môi trƣờng, sinh vật và
con ngƣời. Axit poly γ-glutamic hòa tan tốt trong nƣớc và tạo đƣợc các liên kết bền vững
với nƣớc, do vậy khả năng giữ nƣớc đƣợc xem là một tính chất nổi trội của axit poly γglutamic [14, 126, 127]. Nó có thể đƣợc phân tách với các thành phần trung tính khác nhờ
sắc kí giấy [9]. Axit poly γ-glutamic khác biệt với protein cả về cấu trúc và tính chất chính
bởi liên kết γ-peptid. Thƣờng thì các liên kết α-peptid bị phân cắt bởi protease nhƣng liên
kết γ-peptid trong γ-PGA chỉ có thể bị phân cắt sinh học bởi enzym γ-GTP (γglutamyltranspeptidase) [95].
Axit poly γ-glutamic tinh khiết có độ nhớt cao ngay ở nồng độ thấp. Để xác định khả năng
tạo γ-PGA của các chủng vi khuẩn, một số nhà khoa học đã sử dụng phƣơng pháp đo độ
nhớt của canh trƣờng vi sinh vật để làm phƣơng pháp xác định γ-PGA [53, 95].
Axit poly γ-glutamic có thể kết hợp với một số ion kim loại để tạo nên các loại muối dạng
phức với các ion: Na+, K+, Mg2+, Ca2+, NH4+ có ứng dụng rộng rãi trong ngành y tế, môi
trƣờng, mỹ phẩm [61, 125].
Đối với các dạng D-PGA và L-PGA riêng rẽ, chúng có khả năng tan trong ethanol, nhƣng
khi chúng là một hỗn hợp đẳng mol thì bị kết tủa trong ethanol [50, 95].
Kích thƣớc cũng nhƣ khối lƣợng của axit poly γ-glutamic rất đa dạng, phụ thuộc vào cấu
trúc cũng nhƣ dạng liên kết của nó với các chất khác trong canh trƣờng vi sinh vật. Khối
lƣợng trung bình của các phân tử γ-PGA từ vài kilo dalton đến hàng triệu kilo dalton. Nhìn

chung, các phân tử D,L-γ-PGA thƣờng có khối lƣợng lớn hơn nhiều so với D-γ-PGA hay
L-γ-PGA và dạng neo giữ thƣờng có kích thƣớc nhỏ hơn dạng tự do [33].
Trong huyền phù cao lanh, γ-PGA đạt độ kết dính cao nhất ở nồng độ 20mg/l và độ kết
dính tăng lên khi có các cation kim loại nhƣ Ca+2,Mg+2,Fe+2... Độ kết dính cao trong môi
trƣờng pH thấp 3-5 và giảm khi nhiệt độ trên 100oC [126].
Nếu cấu trúc hình thể γ-PGA có độ tinh sạch cao sẽ đƣợc sử dụng trong dƣợc phẩm và
thực phẩm. Tuy nhiên để đạt đƣợc các sản phẩm này cần có sự tác động đến điều kiện môi
trƣờng. Với 5 dạng hình thể γ-PGA nhƣ cấu trúc xoắn anpha, phẳng beta, xoắn cuộn liên
tục ngẫu nhiên, cuộn ngẫu nhiên, bao phủ thành khối thì điều kiện môi trƣờng hình thành
khác nhau. Trạng thái hình thể của γ-PGA tinh sạch từ B. licheniformis có thể tồn tại ở các
dạng hình thể khác nhau tùy thuộc vào nồng độ γ-PGA và giá trị pH của dung dịch. Ở nồng
11

Footer Page 21 of 89.


Header Page 22 of 89.
độ thấp (0,1% w/v) và pH dƣới 7, cấu trúc γ-PGA chủ yếu là xoắn anpha, ngƣợc lại khi pH
cao, cấu trúc γ-PGA thể hiện dƣới dạng phẳng beta.

1.5 Phân loại γ-PGA
Có nhiều hình thức phân loại γ-PGA tùy thuộc vào cấu trúc, chủng vi sinh vật tổng hợp
hay phƣơng thức tồn tại của polymer này trong canh trƣờng vi sinh vật. Tuy nhiên có hai
phƣơng pháp phân loại phổ biến là:
Theo cấu trúc γ-PGA đƣợc phân làm 3 loại sau:
Axit poly γ-D-glutamic (D-γ-PGA): chỉ chứa các đơn phân là axit D-glutamic và loại
polymer này hiện nay mới đƣợc chứng minh chỉ tạo ra bởi chủng vi khuẩn B. anthracis
một chủng vi khuẩn đƣợc tìm thấy trên các vật chủ bị bệnh than [15, 32, 33].
Axit poly γ- L-glutamic (L-γ-PGA): là polymer chỉ chứa các đơn phân là axit L- glutamic
loại này đƣợc sản xuất chủ yếu từ các vi khuẩn Natrialba aegyptiacia một loài ƣa mặn, γPGA đƣợc sinh ra trong vi khuẩn này nhằm để chống lại sự mất nƣớc của vi khuẩn trong

điều kiện môi trƣờng nƣớc biển [117]. L-γ-PGA cũng đƣợc tìm thấy rất nhiều trong các
động vật có xúc tu (sứa biển, san hô) và thành phần chính trong chất dính của Hydra. L-γPGA kết hợp với các cation nhƣ Ca²+, Mg2+ và K+ giúp vi khuẩn và các sinh vật khác điều
hòa áp suất thẩm thấu bên trong tế bào [16, 69].
Axit poly γ-D,L- glutamic (DL-γ-PGA): là polymer trong phân tử chứa cả axit L-glutamic
và axit D-glutamic, DL-γ-PGA đƣợc sản xuất chủ yếu từ Bacillus đƣợc chia làm 2 nhóm:
- Cần bổ sung axit L-glutamic vào môi trƣờng nuôi cấy để tổng hợp γ-PGA
- Không cần bổ sung axit L-glutamic vào môi trƣờng nuôi cấy để tổng hợp γ-PGA.
Tỷ lệ đồng phân D/L trong DL-γ-PGA thƣờng phụ thuộc vào tỷ lệ Mn2+trong môi trƣờng
phát triển của vi khuẩn và tùy thuộc vào loài vi khuẩn [16]. Đồng phân của axit poly γglutamic đƣợc hình thành bởi D và L-Glutamic tùy thuộc vào chủng giống vi sinh vật tạo
ra nó cụ thể đƣợc chỉ ra trong bảng 1.2:

12

Footer Page 22 of 89.


Header Page 23 of 89.
Bảng 1.2. Vi sinh vật sinh tổng hợp axit poly γ-glutamic [69]

Tỷ lệ trongγ-PGA tạo thành (%)
Chủng loại

Khối lƣợng phân
tử [kDa]

D-γ-PGA

L-γ-PGA

B. subtilis (natto)

10–1000

50–80

20–50

B. subtilis (chungkookjang)

>1000

60–70

30–40

B. licheniformis

10–1000

10–100

0–90

B. anthracis

Không xác định

100

0

B. megaterium

>200

50

50

B. halodurans

10–15

0

100

Natrialba aegyptiaca

>1000

0

100

Hydra

3–25

0

100

Phân loại theo phƣơng thức tồn tại trong canh trƣờng vi sinh vật, có 2 dạng nhƣ sau:
Axit poly γ-glutamic dạng neo giữ: Chủ yếu có trong vi khuẩn B. anthracis đối với loài vi
khuẩn này γ-PGA là một hợp chất có tác dụng kháng thực khuẩn thể, ngăn cản chúng tấn
công vào bên trong tế bào. Dạng neo giữ thƣờng đƣợc tìm thấy dƣới dạng nội bào, đƣợc
tiết ra ngoài dƣới dạng các sợi liên kết giữa vi khuẩn và môi trƣờng ngoài khi gặp điều
kiện bất lợi. Do vậy việc sử dụng γ-PGA từ dạng neo giữ ít đƣợc nghiên cứu [50].
Axit poly γ-glutamic dạng tự do đƣợc tiết trực tiếp vào môi trƣờng nuôi cấy: Dạng này chủ
yếu đƣợc tìm thấy trong các loài lành tính của chi Bacillus mà điển hình là B. subtilis. Loài
vi khuẩn điển hình cho γ-PGA dạng tự do là B. subtilis, γ-PGA chủ yếu tạo độ nhầy bao
quanh tế bào vi khuẩn và có vai trò cung cấp chất dinh dƣỡng cho chúng trong trƣờng hợp
môi trƣờng thiếu dinh dƣỡng, trong giai đoạn suy vong của vi khuẩn [104].

1.6 Hệ vi khuẩn sinh tổng hợp γ-PGA
Nhiều công trình nghiên cứu đã chứng minh axit poly γ-glutamic đƣợc sản sinh bởi các
chủng vi khuẩn thuộc các loài: B. subtilis, B. licheniformis, B. thuringensis, B. cereus, B.
pumilus, B. amyloliquefaciens, B. mojavensis, B. atrophaeus, B. megaterium,
Staphylococcus epidermidis,

Natrialba aegyptiaca, Lysinibacillus sphaericus và

Fusobacterium nucleatum trong đó một số chủng vi khuẩn này đã đƣợc ứng dụng rộng rãi
trong các ngành công nghiệp và đời sống [33, 50, 95, 104, 115]. Các nghiên cứu trƣớc
13

Footer Page 23 of 89.

Header Page 24 of 89.
cũng cho thấy tất cả các vi khuẩn tạo ra γ-PGA đều là vi khuẩn Gram dƣơng và chủ yếu là
các vi khuẩn thuộc chi Bacillus, γ-PGA có chức năng đa dạng khác nhau tùy theo loài tổng
hợp và môi trƣờng của chúng [30]. Trong những chủng vi khuẩn sản sinh ra axit poly γglutamic, thuộc chi Bacillus các nghiên cứu đi sâu hơn vào các chủng của loài B. subtilis,
đây là những vi sinh vật đƣợc sử dụng rất phổ biến trong công nghiệp và các nghiên cứu
cũng chỉ ra rằng chúng có lợi cho đƣờng ruột. Trong tự nhiên, chúng đƣợc phân bố rộng rãi
và phổ biến: cỏ khô, bụi, đất nƣớc… B. subtilis là trực khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, Gram
dƣơng, thuộc họ Bacillaceae, đứng riêng rẽ hoặc kết thành chuỗi, sinh trƣởng trong điều
kiện hiếu khí hoặc kị khí không bắt buộc, pH môi trƣờng có độ biến động cao. Chúng có
khả năng hình thành bào tử khi vi khuẩn gặp điều kiện bất lợi nhƣ dinh dƣỡng trong môi
trƣờng bị cạn kiệt, hàm lƣợng kháng sinh, chất ức chế cao, nhiệt độ quá cao hoặc quá thấp
hoặc biến động mạnh… Bào tử có kích thƣớc nhỏ hơn vi khuẩn và nằm giữa tế bào. Bào tử
có thể quan sát đƣợc dƣới kính hiển vi bằng phƣơng pháp nhuộm bào tử hoặc nhuộm gram
[13]. Nhờ tính chất đặc trƣng này mà có thế phân lập đƣợc B. subtilis trong môi trƣờng.
Trong công nghệ thực phẩm ngày nay, có rất nhiều chủng của chi Bacillus có thể sử dụng
các nguồn cơ chất đa dạng, có khả năng sinh tổng hợp γ-PGA và sinh trƣởng tốt. Loài vi
khuẩn điển hình nhất, an toàn đối với ngƣời, đƣợc sử dụng rộng rãi hiện nay trong ngành
công nghiệp thực phẩm là B. subtilis. Một số chủng B. subtilis đã đƣợc phân lập và nghiên
cứu sinh tổng hợp γ-PGA trên thế giới nhƣ B. subtilis NX-2, ZJU-7, TAM 4, IFO 3335,
RKY3, chungkookjang, natto… là nhƣng vi khuẩn điển hình đƣợc phân lập từ các sản
phẩm thực phẩm. Các chủng này khi ứng dụng để sản xuất γ-PGA trên thực tế cho sản
lƣợng ổn định từ 20g/l đến 50 g/l, an toàn với ngƣời và động vật [93, 106, 116, 121, 128].
Vi khuẩn B. licheniformis thƣờng đƣợc tìm thấy trong đất, trên lông của các loài chim mặt
đất và thủy cầm. B. licheniformis là vi khuẩn Gram dƣơng và ƣa ấm, với nhiệt độ sinh
trƣởng tối ƣu của nó là khoảng 37°C, mặc dù nó có thể tồn tại ở nhiệt độ cao hơn. B.
licheniformis đƣợc phân lập và ứng dụng trong nhiều ngành công nghiệp, xử lý môi
trƣờng và xử lý các sản phẩm nông nghiệp. Các chủng B. licheniformis đƣợc nghiên cứu và
ứng dụng nhiều trên thế giới là B. licheniformis NCIM 2324, S2, ATCC 9945a, WBL-3,
CCRC 12826, với khả năng sinh tổng hợp γ-PGA đến 98 g/l [17, 33, 38, 80].
Vi khuẩn B. anthracis là vi khuẩn gây bệnh than, một căn bệnh phổ biến của gia súc và con

ngƣời là loại vi khuẩn gây bệnh. Vi khuẩn B. anthracis sinh tổng hợp chủ yếu là D – PGA
dƣới dạng neo giữ và ít đƣợc ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm bởi tính chất gây
bệnh của B. anthracis [32, 33].
14

Footer Page 24 of 89.


Header Page 25 of 89.
Chuyển gen sinh tổng hợp γ-PGA: một số gen trong vi khuẩn có chức năng polymer hóa γPGA đã đƣợc tìm ra và đã đƣợc nghiên cứu chuyển gen vào một số vi khuẩn có đặc tính
sinh trƣởng cao nhƣ Erscherichia coli và Agrobacterium trên cây thuốc lá nhằm cải thiện
năng suất và giảm giá thành γ-PGA sản phẩm. Tuy nhiên những nghiên cứu này vẫn chƣa
đạt yêu cầu khai thác công nghiệp do lƣợng γ-PGA sản sinh thấp với khoảng 0,024 g/l trên
vi khuẩn E. coli và 0,6mg/g lá thuốc lá [12, 108].

1.7 Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình sinh tổng hợp γ-PGA
1.7.1. Ảnh hƣởng của nguồn dinh dƣỡng
Nguồn dinh dƣỡng là yếu tố cốt lõi để vi sinh vật sinh trƣởng và tạo thành các sản phẩm
mong muốn. Các chủng vi sinh vật tạo ra những sản phẩm khác nhau khi đƣợc nuôi cấy
trong các môi trƣờng dinh dƣỡng khác nhau. Thông thƣờng mỗi sản phẩm đều có một môi
trƣờng đặc hiệu khác nhau, sau nhiều năm nghiên cứu về γ-PGA các nhà khoa học trên thế
giới đã đƣa ra một môi trƣờng đặc hiệu riêng, cơ bản cho các loại vi khuẩn sinh γ-PGA
(môi trƣờng E). Thành phần môi trƣờng E đƣợc trình bày trong bảng 1.3.
Bảng 1.3. Thành phần môi trƣờng cho vi khuẩn sinh tổng hợp γ-PGA [73]

Thành phần

Nồng độ (g/l)

Axit L-glutamic

20,00

Axit citric

12,00

Glycerol

80,00

NH4Cl

7,00

MgSO4.7H2O

0,50

FeCl3.6H2O

0,04

K2HPO4

0,50

CaCl2.2H2O

0,15

MnSO4.H2O

0,26.10-4 đến 0,42

Nƣớc cất đến 1000ml
Điều chỉnh pH đến 7,4 bằng NaOH
Môi trƣờng dinh dƣỡng này đƣợc gọi tắt là môi trƣờng cơ bản E. Tùy thuộc vào từng loại
vi khuẩn sinh tổng hợp γ-PGA mà sự điều chỉnh các thành phần trong môi trƣờng dinh
15

Footer Page 25 of 89.