Nghiên cứu công nghệ sinh tổng hợp Enzym glucose oxidaza (god) và ứng dụng trong công nghiệp chế biến một số sản phẩm từ quả nhằm đảm bảo ổn định chất lượng chống biến màu, hạn chế mất mùi sản phẩm

BỘ CÔNG THƯƠNG
VIỆN CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM








BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI CẤP BỘ


NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ SINH TỔNG HỢP ENZYM
GLUCOSE OXIDAZA (GOD) VÀ ỨNG DỤNG TRONG CÔNG
NGHIỆP CHẾ BIẾN MỘT SỐ SẢN PHẨM TỪ QUẢ NHẰM
ĐẢM BẢO ỔN ĐỊNH CHẤT LƯỢNG CHỐNG BIẾN MÀU,
HẠN CHẾ MẤT MÙI SẢN PHẨM

Chủ nhiệm đề tài: THS. TRẦN THỊ CHÂU

7860
08/4/2010


HÀ NỘI – 2010




1
MỞ ĐẦU

Glucooxydaza (GOD) – một trong những enzym oxy hóa khử, được sử dụng khá
rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm và chuẩn đoán trong y học. Chúng xúc tác một
cách đặc hiệu cho phản ứng giữa glucoza với oxy. Glucoza bị oxi hóa thành axit
gluconic và oxy được tiêu thụ. Vì thế, GOD có thể được ứng dụng để lọai bỏ oxy và để
định tính và định lượng glucoza.
Enzym GOD còn được gọi là β-D-glucose:oxygen 1-oxidoreductase hay EC
1.1.3.4. Trong tự nhiên enzym GOD được tìm thấy trong các mô động vật, thận, gan
trong canh trường của nấm mốc, nhất là các loài A. niger, P. amagasakiense, P.
chrysogenum, P. vitale, P. notatum và một số loài Penicillium khác [1]; [12]; [30].
Enzym GOD được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như: Công nghiệp thực phẩm,
trong y học và trong phân tích. Trong công nghiệp thực phẩm GOD được sử dụng như
một chất bảo quản không độc, có nguồn gốc tự nhiên và an toàn (để loại bỏ glucoza và
oxy khỏi thực phẩm và đồ uống) như: Bảo quản dị
ch ép các loại quả nhiệt đới, bảo
quản rượu vang. Đồng thời, enzym GOD còn được dùng để loại bỏ glucoza khỏi lòng
trắng trứng trước khi sấy khô làm nguyên liệu để sản xuất bánh ngọt [64];

[65];[66];[70]. Trong y học GOD được sử dụng để xác định hàm lượng glucoza trong
dịch của cơ thể (xác định hàm lượng glucoza trong máu hoặc nước tiểu của các bệnh
nhân tiểu đường). Ngoài ra enzym GOD còn được dùng để đánh dấu các kháng thể
và
để phát hiện các kháng thể đánh dấu của khối u và các kháng thể của virut. Trong phân
tích, enzym GOD được sử dụng rộng rãi để sản xuất các KIT thử sinh học nhằm xác
định hàm lượng glucoza có trong mẫu [9]; [88];[90].
GOD có thể được tổng hợp bằng phương pháp lên men chìm từ nguồn cacbon
là glucoza, saccaroza, tinh bột và một số chất dinh dưỡng với sự có mặt của oxy bởi
các chủng nấm mốc hoặc nấm men [1]; [11];[13].
Ở Việt nam, cho đến nay ch
ưa có công trình nghiên cứu về GOD nào được
công bố. Do vậy, việc nghiên cứu sinh tổng hợp enzym GOD ứng dụng trong bảo quản
các sản phẩm thực phẩm sẽ rất có ý nghĩa, nó mở ra một triển vọng mới trong việc
thay thế các chất bảo quản có nguồn gốc hóa học, góp phần nâng cao chất lượng thực
phẩm, đảm bảo vệ sinh an toàn cho người tiêu dùng.

Mục đích của nghiên cứu.
Quá trình sinh t
ổng hợp GOD bằng chủng A. niger sẽ được nghiên cứu ở ba mức độ
khác nhau: Nuôi lắc trong bình tam giác, trong bình lên men 5 lít và qui mô pilot.
Nghiên cứu tập trung vào những nhiệm vụ sau:

2
1. Lựa chọn chủng giống
- Lựa chọn chủng giống A. niger.
- Nghiên cứu đặc điểm hình thái.
- Kiểm tra độ an toàn của chủng giống (dựa trên kết quả kiểm tra độc tố
aflatoxin B1,B2,G1,G2).
- Định tên chủng giống chọn lựa

2. Nghiên cứu điều kiện sinh tổng hợp enzym GOD
- Xác định ảnh hưởng của các ion kim loại
đến quá trình sinh tổng hợp
enzym (Sắt, đồng, kẽm, mangan, coban v.v).
- Xác định thành phần môi trường sinh tổng hợp enzym (các bon, nitơ,
khoáng, chất có hoạt tính bề mặt tween 80, EDTA v.v.)
- Xác định điều kiện nuôi cấy để sinh tổng hợp enzym GOD (pH, nhiệt độ,
tốc độ đảo trộn môi trường v.v).
- Nghiên cứu động học của quá trình sinh tổng hợp GOD.
- Sản xuất thử nghiệm enzim GOD quy mô xưởng thực nghi
ệm
3. Thu nhận, tinh sạch enzym và xác định đặc tính của chế phẩm
- Lựa chọn phương pháp phá vỡ tế bào
- Thu nhận và tinh sạch enzym.
- Nghiên cứu đặc tính của enzym GOD sinh tổng hợp được
4. Nghiên cứu đặc tính sinh hóa và độ an toàn của chế phẩm enzym
5. Nghiên cứu xác định các điều kiện thích hợp trong quá trình sử dụng enzym
GOD trong chế biến quả quy mô phòng thí nghiệm và xưởng thực nghi
ệm
(nước quả và rượu vang)
6. Nghiên cứu áp dụng thử nghiệm GOD trong công nghiệp chế biến nước quả và
rượu vang

3
CHƯƠNG I
TỔNG QUAN

I. GIỚI THIỆU VỀ ENZYM GOD

I.1 Lịch sử phát hiện enzym GOD

Enzym GOD (GOD) là một enzym chống oxi hóa được sinh tổng hợp từ những
năm 1950. Năm 1904, Maximow đã phát hiện ra một hệ thống enzym tiêu thụ oxy
trong dịch chiết nấm mốc. Năm 1926, D.Mueller đã xác định lại hệ thống này và ông
ta đặt tên cho enzym này là glonga oxidaza. GOD được chiết tách lần đầu tiên từ hệ
sợi nấm mốc Aspergillus niger và Penicillium glaucum do nhà khoa h
ọc Muller (năm
1928). Kể từ sau lần đầu được phát hiện và tách chiết nhiều nhà khoa học đã tập trung
nghiên cứu enzym GOD. Năm 1946, Keilin và Haitree chứng minh rằng GOD là một
flavinprotein với một nhóm ngoại (prosthetic) FAD và có đặc tính kháng khuẩn
“antibiotic" (do tạo thành hydro peroxit H
2
O
2
) [9].
Tiếp theo là báo cáo của Keston năm 1956 về cặp phản ứng giữa GOD,
peroxidaza và một chất tạo mầu. Trên nguyên tắc này “que nhúng” định lượng glucoza
đã xuất hiện để xác định hàm lượng glucoza trong nước tiểu. Cũng trong năm 1956,
dựa trên bài báo của Teller, Worthington lần đầu tiên đã đưa ra hệ thống enzym định
lượng để xác định hàm lượng glucoza bằng phương pháp so mầu.
Các chủng nấm mốc Aspergillus niger, Penicillium glaucum và nấm men
Saccharomyces cerevisiae
là nguồn vi sinh vật có khả năng sản xuất ra GOD tốt nhất.
Enzym GOD thu được dưới dạng enzym nội bào (Aspergillus niger, Saccharomyces
cerevisiae) hay ngoại bào (Penicillium glaucum) được làm sạch với các mức độ khác
nhau, tùy theo mục đích sử dụng. Enzym GOD tinh sạch đã loại bỏ các polysaccharit
tạp này đã được giới thiệu cho mục đích bảo quản thực phẩm, y học chuẩn đoán và
phân tích.

I. 2. Cấu tạo của enzym GOD
Cũng gi

ống như mọi enzym khác GOD có bản chất là protein GOD là một
protein có cấu trúc đối xứng, gồm hai monomer giống nhau có trọng lượng phân tử
vào khoảng 80,000 daltons, liên kết đồng hóa trị với nhau nhờ các cầu nối disulfit.

4
Trọng lượng phân tử của enzym GOD khoảng 160.000 dalton. Kích thước phân tử của
GOD thu nhận từ các nguồn khác nhau là khác nhau (khối lượng phân tử GOD thu
được từ Aspergillus niger là 186.000 Da. từ Penicillium notatum là 152.000 Da) [39].
Để có thể làm việc như một chất xúc tác, mỗi một monomer của GOD cần một
nhân tố phụ trợ là FAD (flavin adenine dinucleotide). Trong phản ứng oxy hóa khử do
enzym GOD xúc tác, FAD đóng vai trò như chất nhận điện tử ban đầu và khử thành
FADH
2
sau đó FADH
2
được oxy hóa bởi chất nhận điện tử cuối cùng là một phân tử
oxy (O
2
) vì oxy có thế oxy hóa khử cao hơn. Sau đó oxy được khử thành hydro peroxit
(H
2
O
2
). FAD được gắn với protein bởi liên kết không đồng hóa trị và có thể bị giải
phóng khỏi cấu trúc protein khi bị biến tính.
Enzym GOD được gắn với 16% (w/w) hydratcacbon. 80% (w/w) hydratcacbon
là mannoza. Đường mannoza có thành phần nitơ và oxy liên kết với các axit amin:
Arginin, threonin và serin. Mạch hydratcacbon trong phân tử GOD không tham gia vai
trò xúc tác của phản ứng enzym và cấu tạo của nó cho tới nay vẫn chưa được xác định
rõ ràng [23].

Enzym GOD được sinh tổng hợp từ A. niger có cấu tạo bởi 583 axit amin.
Enzym GOD có tính đặc hiệu rất cao. M
ột thay đổi nhỏ trong cấu trúc đã có tác động
lớn tới hoạt lực oxy hoá của enzym. Gốc glucoza trong phân tử của enzym ở dạng β-
D- glucoza có hoạt tính oxy hoá mạnh hơn α- D- glucoza 157 lần [39].










Hình 1.1. Cấu trúc không
gian ba chiều của GOD









Hình 1.2. Cấu trúc tiểu đơn
vị của GOD (mầu đỏ là
FAD)

5
I.3. Tính chất của enzym GOD [8];[39];[92]

¾ Tính chất vật lý
- Phân tử protein tan dễ dàng trong dung dịch potassium phosphate 0.1M, pH
7.0 cho dung dịch mầu vàng, trong suốt. Hệ số phân li của dung dịch GOD
1% (w/v) ở bước sóng 280 nm là 13.8.
- Enzym thể hiện mức độ chuyên hóa rất cao đối với β-D glucoza mặc dầu 2-
deoxy-D-glucoza, D-mannoza và D-fructoza cũng bị oxy hóa.
- Protein của bản thân enzym là có tính axit và có điểm đẳng điện (pI) là 4.2.
¾ pH tối ưu
- pH của môi trường
ảnh hưởng rõ rệt đến phản ứng enzym vì nó ảnh hưởng
đến mức độ ion hoá cơ chất, enzym và độ bền của protein enzym. Đa số các
enzym đều bền trong giới hạn pH từ 5- 9. Độ bền của enzym đối với môi
trường cũng có thể tăng lên khi có cơ chất coenzym và ion Ca
++
.
- pH tối thích (pH
opt
) cho hoạt động của GOD thu được từ các nguồn khác
nhau là khác nhau. Giá trị pH không cố định mà phụ thuộc vào nhiều yếu tố
như cơ chất, tính chất dung dịch đệm, nhiệt độ v.v. pH thích hợp cho hoạt
động của GOD vi sinh vật trong khoảng 4 –7, tối ưu nhất là 5.6.
¾ Tính đặc hiệu
Enzym có đặc tính chuyên hóa cao đối với β-D-glucoza. Với đồng phân α -D-
glucoza enzym không có tác dụng. Với các cơ chất như 2-deoxy-D-glucoza, D-
mannoza và D-galactoza enzym GOD thể
hiện hoạt tính rất thấp.

¾ Các chất ức chế
- Ức chế bởi: D- arabinoza và 2- deoxy-D-glucoza.
- Ức chế hoàn toàn bởi: ρ- cloromercuribenzoat.
- Ức chế một phần bởi: 8- hydroxycholin, semicarbazit
- Bị mất hoạt lực bởi: H
2
O
2

- CO, HCN, NaF không ảnh hưởng đến hoạt tính của enzym.
¾ Các chất kìm hãm
Các ion kim loại Ag
+
, Hg
2+
, Cu
2+
có ảnh hưởng kìm hãm đến hoạt tính enzym
GOD. Sự gắn kết của FAD bị kìm hãm bởi một vài nucleotit.

6
¾ Điều kiện bảo quản
Enzym GOD dạng khô là ổn định trong nhiều năm khi bảo quản ở chỗ mát. Các
dạng dung dịch tính ổn định phụ thuộc nhiều vào các điều kiện bảo quản.

I.4. Cơ chế hoạt động cña enzym GOD [77]
Enzym GOD (còn gọi là β-D-glucose:oxygen 1-oxidoreductase, EC 1.1.3.4) là
một enzym oxi hóa khử β-D glucoza bị oxi hóa thành axit gluconic và oxi bị tiêu thụ.
GOD
Phản ứng tổng quát: C

6
H
12
O
6
+ ½ O
2
C
6
H
12
O
7






Trước tiên, β-D-glucoza bị loại nước thành D-glucono-1,5-lacton và FAD bị
khử thành dạng FAD khử. Sau đó D-glucono-1,5-lacton bị kết hợp với nước tạo thành
axit gluconic và FAD khử phản ứng với oxy tạo thành hydro peroxit (H
2
O
2
). Nếu có
mặt enzym catalaza hydro peroxit (H
2
O
2

) sẽ bị phân hủy thành nước và oxy.
Phương trình phản ứng như sau:
GOD
C
6
H
12
O
6
+ FAD C
6
H
10
O
6
+ FAD~H
2

gluconolacton +O
2
+H
2
O

C
6
H
12
O
7

H
2
O
2
H
2
O + ½ O
2
+
FAD
Sự tạo thành axit gluconic làm giảm pH môi trường nên trong quá trình phản
ứng đồng thời phải bổ sung kiềm để điều chỉnh pH.
Theo cơ chế hoạt động xúc tác của của enzym GOD, quá trình oxy hoá glucoza luôn
có sự hình thành H
2
O
2
chính sản phẩm phụ này lại ức chế ngược hoạt động của enzym
GOD. Hoạt lực của enzym GOD luôn biểu hiện giảm mạnh sau 5 giờ phản ứng. Các
kết quả đều cho thấy hoạt lực của GOD giảm tỷ lệ nghịch với sự tăng của nồng độ
H
2
O
2
[45].

7
I. 5. Chỉ tiêu chất lượng của một số chế phẩm GOD [8].
¾ Hoạt tính riêng
Dựa vào hoạt tính riêng của GOD mà chia enzym này thành 4 loại:

- Loại I khoảng 210 U/mg
- Loại II khoảng 70 U/mg
- Loại III khoảng 20 U/mg
- Loại IV khoảng 1.5 U/mg
¾ Mức độ tinh sạch
- Loại I: amylaza, sacaroza – mỗi loại < 0.01%, catalaza <10U/mg
- Loại II: amylaza, sacaroza – mỗi loại < 0.1%, catalaza < 250 U/mg
- Loại III: amylaza, sacaroza – mỗi loại < 0.1%, catalaza < 260 U/mg
¾ Dạng chế phẩm GOD có sẵn
- Loại I và II dạng dung dịch.
- Lo
ại III và IV dạng bột khô.
¾ Độ bền
GOD được bảo quản ở 4
0
C, không bị giảm hoạt tính trong vòng 12 tháng.

II. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÀ SẢN XUẤT GOD TRONG NƯỚC VÀ
TRÊN THẾ GIỚI
GOD được tìm thấy trong các mô động vật, thận, gan trong canh trường nuôi
cấy nấm mốc, nhất là các loài Aspergillus niger, P. amagasakiens, P. chrysogenum, P.
vitale. P. notatum, P. glaucum, P. purpurogennum và P. variabile [1]; [12]; [30].
GOD sinh tổng hợp từ các vi sinh vật nói trên đã được nghiên cứu kỹ ở các
nước như: Liên Xô, Tiệp Khắc, Mỹ và Nhật. Trên thị trường đã có một số chế phẩm
enzym GOD được lư
u hành với những tên thương phẩm như Oxidoredutaza 1.1.3.4
(Liên Xô). Gluzyme
TM
BG của hãng Ecozym (Hungary), Glucose oxidase của hãng
Calzyme (Mỹ) hay Novarom của hãng Novozyme (Đan Mạch) [9]; [70] .

Kreston (1956) đã sản xuất que thử glucoza để xác định glucoza niệu.
Worthington (1956) lần đầu tiên đã đưa ra phương pháp định lượng glucoza dựa trên
phản ứng màu của enzym. Ông đã sử dụng enzym GOD dạng thô tách chiết từ
Aspergillus niger. Tuy nhiên. phương pháp này có độ sai số cao do enzym GOD có lẫn

8
các enzym khác như amylaza, maltaza, saccharaza. Williams và cộng sự (1976), Auses
và cộng sự (1975) đã tiến hành xác định hàm lượng glucoza bằng enzym GOD đã
được tinh sạch với sự có mặt H
2
O
2
và chất chỉ thị màu luminol. Greenfeld và cộng sự
(1975), Lahoda và cộng sự (1975) đã sử dụng enzym GOD cố định trong chuẩn đoán
bệnh tiểu đường. Năm 1997, enzym GOD đã được Janser sử dụng để bảo quản dịch ép
các loại quả nhiệt đới. Pickering (2000) đã sử dụng GOD trong bảo quản rượu vang
[64]; [65];[66];[70].
Chính vì tính chất ưu việt của GOD mà các công trình nghiên cứu về enzym
này vẫn được tiếp tục công bố. Akulova và c
ộng sự (1978) đã nghiên cứu động học
của quá trình sinh tổng hợp và tính ổn định của enzym GOD từ chủng Penicillium
vitale. Li (1996) đã nghiên cứu nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp GOD từ chủng
Streptomyces sp. Năm 2001, các tác giả Kapat, A., Jung, J.K., Park, Y.H đã nghiên
cứu nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp GOD từ chủng Saccharomyces cerevisiae tái tổ
hợp. Cùng thời gian này Rinas và cộng sự đã sản xuất GOD từ chủng Aspergillus niger
tái tổ hợp và s
ử dụng các nguồn cacbon không phải glucoza. Gần đây có nhiều công
trình công bố điều kiện nuôi cấy tối ưu cho sinh tổng hợp GOD, sinh tổng hợp catalaza
(CAT) và kích thích sinh tổng hợp cả hai enzym.[34], [39], [69];[71]. Năm 2003,
Hafiz và cộng sự đã tiến hành tối ưu hoá các thông số khác nhau của quá trình sản xuất

GOD trên môi trường tinh bột sử dụng chủng Aspergillus niger [36]. Rhinas và cộng
sự (2001) đã nghiên cứu ảnh hưởng của sự thông khí đến hình thái sợ
i nấm, sự tạo
thành viên và sự sản xuất enzym GOD của chủng tái tổ hợp Aspergillus niger. Theo
tác giả này, trong nuôi cấy chìm khi tốc độ thông khí tăng từ 200 – 800 v/p, hình thái
sinh trưởng của A. niger thay đổi từ hạt kích thước lớn (đường kính trung bình 1500
µm) đến hạt kích thước nhỏ. Có một sự tương quan giữa cường độ thông khí với hình
thái sinh trưởng và sinh tổng hợp enzym GOD. Khả năng tổng hợp enzym tăng lên khi
thay đổi hình thái sinh trưởng t
ừ dạng viên đến dạng sợi mảnh. Tuy nhiên, dạng sợi
mảnh có sức căng bề mặt lớn hơn, cần thông khí mạnh hơn và lượng sinh khối thu
được ít hơn [63];[69].
Cho đến nay, ở Việt Nam chưa có công trình nghiên cứu nào về GOD được
công bố.


9
II.1. Chủng vi sinh vật trong sản xuất enzym GOD
Chủng giống là điều kiện tiên quyết quan trọng nhất trong sản xuất enzym công
nghiệp bằng kỹ thuật lên men. Việc lựa chọn chủng giống đang ngày càng đóng vai trò
quan trọng trong sản xuất enzym. Một chủng giống tốt không chỉ giúp tăng sản lượng
của sản xuất enzym, tăng tốc độ sử dụng nguyên liệu thô mà còn liên quan đến tính đa
dạng của các enzym, rút ngắn quá trình sản xuất, cải thiện quá trình lên men và tách
chiết.
Nấm sợi là vi sinh vật hoại sinh điển hình, chúng tiết ra một loạt các enzym tham
gia vào việc phân hủy các polyme sinh học của các mô động vật và thực vật. Đại bộ
phận các enzym này là enzym thủy phân và đóng vai trò quan trọng trong dinh dưỡng
của nấm mốc, giải phóng cacbon và nitơ liên kết trong các đại phân tử để cung cấp
dinh dưỡng cho nấm mốc. Điều này làm cho n
ấm sợi như là vật chủ để sản xuất các

enzym [12].
Khả năng của nấm sợi trong việc bài tiết protein ở mức cao là một trong những đặc
điểm then chốt trong việc xem xét chúng như là vật chủ giàu tiềm năng để sản xuất các
protein tái tổ hợp có giá trị cao dùng trong y học [23].
Khả năng sinh tổng hợp GOD được phát hiện ở nhiều chủng nấm mốc như
Penicilium
(P. notatum, P. chrysogenum, P. .vitale), Aspergillus (A. niger), nấm men
(Saccharomyces sp) và vi khuẩn (Streptomyces sp) [71]. Tuy nhiên, enzym GOD được
sản xuất chủ yếu từ các chủng A. niger, P. notatum, P. glaucum, P. amagasakiense, P.
purpurogenum, P. variablile và Alternaria alternate [30].
Trong một vài năm gần đây, nhiều công trình nghiên cứu về khả năng sinh hợp
GOD của chủng nấm mốc A.niger đã được công bố. Trong số các chủng nấm mốc
được sử dụng để sản xuất enzym qui mô công nghiệp thì chủng Aspergillus niger
là
được sử dụng nhiều hơn cả nhờ sự đa dạng về trao đổi chất của chủng này. Việc sử
dụng chủng A. niger để sinh tổng hợp enzym GOD có những ưu điểm sau [30]:
• A. niger có thể tạo ra các enzym nhất định với với số lượng vài kg/1 m
3
ở điều
kiện thích hợp.
• A. niger có lịch sử lâu đời về ứng dụng trong công nghiệp lên men và nhìn
chung chúng được coi là an toàn.

10
• Các ngành công nghiệp lên men là tương tự nhau về các điều kiện cần thiết để
cực đại hóa việc sản xuất các protein đồng hình của Aspergillus. Vì vậy, nó cung cấp
điểm khởi đầu tốt nhất để nhận biết các ảnh hưởng hóa lý đối với việc sản xuất và bài
tiết các protein dị hình khi dùng một chủng tương tự.
• Các loài Aspergillus là các nhà máy bài tiết protein hiệu quả, vớ
i số lượng cao

gấp nhiều lần so với trong tự nhiên. Chúng không có khuynh hướng tích lũy một số
lượng lớn protein nội bào dưới dạng cấu trúc cơ thể như vi khuẩn và nấm men.
• Aspergillus là một hệ thống sản xuất hữu ích các protein dị hình nhận được từ
các nấm sợi khác.
• Tính ổn định của các biến đổi di truyền là khá cao vì vậy, mối đe dọa của s
ự lại
giống hầu như không được nhắc tới.

II. 2. Định tên chủng nấm mốc
Aspergillus niger là một trong những loài nấm mốc được nghiên cứu nhiều nhất.
Tuy nhiên, các cơ sở để phân loại chúng là chưa thật chắc chắn. Thông thường tên A.
niger có thể được sử dụng cho bất kỳ thành viên nào thuộc nhóm này bởi vì chúng rất
khó phân biệt. Các đặc điểm về hình thái của chúng là rất giố
ng nhau và rất khó phân
biệt các loài trong cùng một nhóm A. niger [16]. Theo Al-Musallam (1981) và Samson
(2004) thuộc nhóm A. niger gồm có 8 loài: A. niger, A. tubingensis, A. foedidus, A.
piperis, A. brasiliensis, A. vadensis, A. costaricensis và A. lacticoffeatus.
Cho đến năm 1991 bằng kỹ thuật gen dựa trên kết quả đọc trình tự các đoạn gen ITS,
β-tubilin, calmodulin, IGS và cox1 đã cho phép phân biệt chính xác hơn các loài trong
nhóm A. niger [46].
Theo Varga và cộng sự, 1993; 1994; Accensi và cộng sự, 1999; 2001, nếu chỉ
dựa trên phương pháp phân loại nấm mốc cổ điển, không thể phân biệt được đã phân
biệt được
A. tubingensis và A. niger. Hai loài này có độ tương đồng về hình thái rất
cao và A. tubingensis được xem như là loài phụ của A. niger. Việc sử dụng các phương
pháp phân tử cho phép phân biệt chính xác hơn các loài trong nhóm A. niger và đã
phân loại được A. niger và A. tubingensis là hai loài riêng biệt [16]; [83]; [84]. Sự phân
biệt chính xác A. niger và A. tubingensis là rất có ý nghĩa bởi vì A. niger được công bố

11

là có sinh độc tố ochratoxin A (OA) trên hạt cafe, trong khi A. tubingensis là loài
không sinh độc tố vi nấm này [16].

II.3. Độc tố nấm mốc [3];[4]; [7]; [14];[17]
Một số chủng nấm mốc thuộc nhóm Aspergillus trong quá trình sinh trưởng ở
điều kiện nuôi cấy nhất định có sinh ra độc tố vi nấm. Trong số các độc tố do nấm mốc
sinh ra thì aflatoxin là độc tố gây nguy hiểm nhất, nó ảnh hưởng xấu tới gan và là
nguyên nhân gây xơ gan và ung thư gan. Chỉ với một hàm l
ượng rất nhỏ (10 mg) mà
con người ăn phải cũng có thể gây tử vong.
Bảng 1. 1. Các loài thuộc chi nấm cúc Aspergillus và các độc tố nấm
TT Loài nấm Độc tố nâm mốc
1
A. amstelodami catenarin, entocroxin
2
A. avenaceus x
3
A. elavatus aflatoxin (k), patulin (k), ascladiol
4
A. candidus x
5
A. carneus x
6
A. claviforme x
7 A. flavus aflatoxin (k), axit koji, axit nitro-propionic,
tremorgen, aspertoxin, metylstergmatocystin, axit
aspergillic
8
A fumigatus aflatoxin (k), fumigacillin, gliotoxin
9

A flacipes aflatoxin (k)
10
A. giganteus patulin (k)
11
A. glaucus axit koji
12
A. mangnini aflatoxin (k)
13
A. nidulans sterigmatocystin (k), axit koji, nitulin, nitulotoxin
14
A. niger aflatoxin (k)
15
A. niveus citrinin
16
A. ochraceus ochratoxin A, B, C, aflatoxxin (k)
17
A. oryzae oryzacillin, axit koji
19
A. parasitieus aflatoxin (k)
20
A. ruber aflatoxin (k), parietin
21
A. sydowii x
22
A. terreus patulin (k), citrin, axit terreic
23
A. ustus axit ustinic
24
A. varsicolor sterogmatocystin (k), aversin, versicolorin A, B, C
25

A. wentii aflatoxxin (k), x
Chú thích: x: độc tố nấm mốc chưa biết; k: độc tố nấm mốc gây ung thư gan;

12
Cho đến nay, người ta đã phát hiện được tất cả 16 aflatoxin. Trong 16 aflatoxin
đã được phát hiện, cần đặc biệt chú ý đến các aflatoxin B
1
, G
1
, B
2
, G
2
vì các aflatoxin
này có độc tính cao nhất, đồng thời cũng là các aflatoxin được tạo thành với số lượng
nhiều nhất, cả trong các cơ chất tự nhiên, trong các sản phẩm cũng như trong môi
trường lên men.

II. 4. Một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và sinh tổng hợp enzym
II. 4. 1. Ảnh hưởng của các ion kim loại và khoáng chất
Các ion kim loại và khoáng chất trong môi trường có ảnh hưởng đáng kể đến sự
sinh trưởng và sinh t
ổng hợp các chất chuyển hóa của tế bào. Tùy theo nhu cầu của vi
sinh vật đối với các ion kim loại và khoáng chất mà chúng được chia thành các nguyên
tố đại lượng (như P, K, S, Ca, Mg, Fe.v.v) hay nguyên tố vi lượng (như Mn, Mo, Zn,
Cu, Co, Ni.v.v).
Nhu cầu về các nguyên tố đại lượng hay vi lượng thay đổi tuỳ thuộc vào từng
loại nấm và vào điều kiện nuôi cấy, thành phần môi trường và thời gian nuôi cấy [2].
Nồng độ cần thiết của các muối khoáng đố
i với vi khuẩn, nấm và xạ khuẩn thường

thay đổi theo các phạm vi sau đây:

Bảng 1. 2. Nhu cầu của vi sinh vật về các loại muối khoáng [2]
Nồng độ cần thiết (g/l)
Muối khoáng
Vi khuẩn Nấm men, nấm mốc, xạ khuẩn
K
2
HPO
4
0.2 – 0.5 1 - 2
KH
2
PO
4
0.2 – 0.5 1 - 2
MgSO
4
.7H
2
O 0.1 – 0.2 0.2 - 0.5
MnSO
4
.4H
2
O 0.005 – 0.01 0.02 – 0.1
FeSO
4
.7H
2

O 0.005 – 0.01 0.05 – 0.2
Na
2
Mo.O
4
0.001 – 0.003 0.01 – 0.02
ZnSO
4
.7H
2
O - 0.02 – 0.1
CoCl
2
tới 0.03 tới 0.06
CaCl
2
0.01 - 0.03 0.02 – 0.1
CaSO
4
.5H
2
O 0.001 – 0.005 0.01 – 0.05

Các ion kim loại có mặt trong môi trường với hàm lượng rất nhỏ, dưới dạng các
nguyên tố vi lượng nhưng chúng có vai trò quan trọng đối với các quá trình xúc tác

13
sinh học trong tế bào nấm. Một số nguyên tố tham gia vào cấu trúc của các enzym kim
loại. Một số nguyên tố kim loại khác tuy không tham gia vào cấu trúc của enzym
nhưng cũng có ảnh hưởng rất quan trọng đối với hoạt động của nhiều enzym [2].

Lưu huỳnh cũng là một nguyên tố khoáng quan trọng trong tế bào vi sinh vật.
Lưu huỳnh có mặt trong thành phần một số axit amin (systin, systein và một tripeptide
là glutathion). Ngoài ra, lưu huỳnh còn có vai trò quan trọng trong các quá trình oxi
hóa khử. Việc chuy
ển nhóm sulphidrin thành nhóm disulphit có vai trò rất lớn trong
quá trình chuyển điện tử từ nguyên liệu hô hấp đến oxi phân tử. Các hợp chất hữu cơ
có chứa lưu huỳnh ở dạng oxy hóa thường có tác dụng độc đối với tế bào vi sinh vật,
trong khi các muối sulphat vô cơ lại được vi sinh vật đồng hóa rất tốt [2].
Sắt là nguyên tố rất cần thiết để giúp vi sinh vật có thể tổng hợp một số enzym
chứa sắt như: xitocrom, xitocrommoxidaza, peroxidaza, catalaza v.v. Trong sinh tổng
hợp enzym GOD và peroxidaza từ A. niger nguồn Fe thích hợp nhất là FeSO
4
.7H
2
O
[2],[35],[48].
Magiê là nguyên tố được vi sinh vật đòi hỏi với hàm lượng khá cao (10
-3
– 10
-
4
M). Magiê đóng vai trò một cofacto, chúng tham gia vào nhiều phản ứng enzym có
liên quan đến các quá trình photphoril hóa (chuyển H
3
PO
4
từ

một hợp chất hữu cơ này
sang một hợp chất hữu cơ khác). Mg

2+
có thể làm hoạt hóa các enzym hexokinaza,
ATP-aza, pirophotphataza, phophopheraza, transaxetilaza, photphoglucomutaza,
cacboxylaza, enolaza, các enzym trao đổi protein, các enzym oxi hóa khử của chu
trình Crep. Mg
2+
còn có vai trò quan trọng trong việc làm iên kết các tiểu phần
riboxom với nhau. Nguồn Mg, S được dùng phổ biến là MgSO
4
[2], [36].
Canxi có vai trò trong việc xây dựng các cấu trúc tinh vi của tế bào. Canxi đóng
vai trò cầu nối trung gian giữa nhiều thành phần quan trọng của tế bào sống (như giữa
ADN và protein trong nhân, giữa các nucleotit với nhau, giữa ARN và protein trong
ribôxom). Canxi rất cần thiết đối với việc hình thành các cấu trúc không gian ổn định
của nhiều bào quan như riboxom, ti thể, nhân v.v. Trong quá trình tổng hợp GOD từ
nấm mốc A. niger, muối canxi cacbonat có tác dụng kích thích quá trình sinh tổng hợp
cả enzym GOD và catalaza trong khi canxiclorua lại có tác dụng kìm hãm chúng [36],
[54].


14
Kẽm cũng là một cofacto tham gia vào nhiều hoạt động của enzym. Zn có vai trò
đáng kể trong việc hoạt hóa các enzym như cacboanhydraza, enolaza, photphataza
kiềm, pirophotphataza, lơxitinaza v.v [2].
Mangan tham gia vào cấu trúc của một số enzym hô hấp. Mangan có vai trò quan
trọng trong việc làm hoạt hóa một số enzym như phophomonoesteraza, cacboxylaza,
ATP-aza, hydroxylamin reductaza, acginaza, aminopeptidaza, enolaza,
photphoglucomutaza v.v [54].
Kali là nguyên tố chiếm tỷ lệ khá cao trong thành phần khoáng của tế bào vi sinh
vật. Kali thường tồn tại dưới dạng ion K

+
ở mặt ngoài của màng tế bào. Một lượng
đáng kể ion K
+
tồn tại ở trạng thái liên kết hóa lý không bền với protein và các thành
phần khác của nguyên sinh chất. Kali làm tăng độ ngậm nước của các hệ thống keo do
đó ảnh hưởng đến các quá trình trao đổi chất, nhất là các quá trình tổng hợp. Nguồn
kali thường dùng dưới dạng muối KH
2
PO
4
, K
2
HPO
4
hoặc K
2
SO
4
[36].
Trong tế bào vi sinh vật, các ion kim loại có sự tương tác với nhau, một enzym
có thể bị hoạt hóa bởi nhiều ion kim loại khác nhau, cũng có trường hợp một ion kim
loại này lại có tác dụng đối kháng đối với một ion kim loại khác [2]. Bình thường
trong nuôi cấy vi sinh vật, người ta không cần bổ sung các nguyên tố vi lượng, các
nguyên tố này thường có sẵn trong nước máy hoặc trong các hóa chất dùng làm môi
trường. Tuy nhiên, trong một số trường hợp cụ thể phải b
ổ sung một số nguyên tó vi
lượng vào môi trường nuôi cấy như bổ sung Zn vào môi trường nuôi cấy nấm mốc, bổ
sung Co vào môi trường nuôi cấy vi khuẩn sinh tổng hợp B12, bổ sung B và Mo vào
môi trường nuôi cấy các vi sinh vật cố định đạm v.v [2]. Sự tồn tại dư thừa các ion kim

loại và các nguyên tố khoáng là không cần thiết và có thể dẫn đến những ảnh hưởng
xấu đến sinh trưởng và sinh tổng hợp enzym.

II.4.2. Ảnh hưởng c
ủa dinh dưỡng cacbon, nitơ, photpho và các chất có hoạt tính bề
mặt
Sinh trưởng và sinh tổng hợp enzym của nấm mốc không chỉ bị ảnh hưởng bởi
các ion kim loại và muối khoáng mà còn bị ảnh hưởng rất lớn bới thành phần dinh
dưỡng cacbon và nitơ.

15
9 Nguồn dinh dưỡng cacbon [10];[36],[68]; [69]
Để sản xuất enzym GOD qui mô thương mại bằng chủng A. niger và phương
pháp lên men chìm, có thể sử dụng những nguồn thức ăn cacbon rất khác nhau. Các
nguồn hydratcacbon được A. niger sử dụng làm nguồn năng lượng để sinh tổng hợp
GOD có thể kể đến: Glucoza, sacaroza, maltoza, fructoza, rỉ đường, dịch chiết khoai
tây và một vài loại tinh bột. Khi phát triển trên môi trường có nguồn cacbon là glucoza,
thời kỳ tiề
n phát thường rút lại rất ngắn và hệ sợi nấm rất nhanh chóng được tích lũy
trong môi trường nuôi cấy.
Đối với các nguồn cacbon cao năng khó phân huỷ như tinh bột, thì trước hết nấm
mốc phải sinh ra các enzym để phân huỷ các hợp chất này thành các chất đơn phân tử
sau đó mới đồng hoá được chúng [2]. Theo Fiedurek. J (1997) trên môi trường có 6%
bột mì được sử dụng như nguồn cacbon duy nhất, chủng A. niger GIV 10 có thể sinh
tổ
ng hợp enzym GOD nội bào và ngoại bào với hoạt tính enzym đạt cao nhất [29].
Theo J. Mirón và cộng sự (2002), khi nghiên cứu sản xuất GOD từ chủng A. niger, họ
đã phát hiện ra rằng axit gluconic được sinh ra từ glucoza nhờ hoạt động của enzym
cũng có thể được coi như nguồn cacbon dùng cho sinh trưởng, mà không hề cản trở
quá trình sinh tổng hợp GOD mặc dầu axit gluconic được sinh ra do hoạt động của

enzym GOD [51],[59],[66]. Ngoài ra, enzym GOD cũng có thể được tổng hợ
p từ
chủng A. niger trên môi trường có nguồn cacbon là glycerol, đường riboza, arabinoza,
xyloza, rhamnoza, mannoza, galactoza và hỗn hợp của xyloza/xilan [69].
9 Nguồn dinh dưỡng nitơ
Ảnh hưởng của nguồn nitơ lên quá trình sinh tổng hợp GOD từ A. niger bằng
phương pháp lên men chìm đã được nghiên cứu sâu. Nguồn nitơ dùng cho sinh tổng
hợp GOD từ chủng A. niger bao gồm các nguồn nitơ vô cơ khác nhau như muối nitrat
của canxi, natri, amoni, kali và nguồn nitơ hữu cơ như d
ịch chiết nấm men, nước chiết
malt, peptone, dịch chiết ngô, nước chiết đậu tương [47]. Natri nitrat và cao nấm men
là nguồn nitơ phổ biến nhất được dùng để sinh tổng hợp GOD. Tuy nhiên, theo Kona.
R.P và cộng sự (2000) để sản xuất GOD từ A. niger, trong số các nguồn nitơ như canxi
nitrat, natri nitrat, amoni nitrat, kali nitrat, dịch chiết nấm men và pepton thì natri nitrat
cho hoạt lực enzym GOD cao nhất (đạt 595 ± 30 Unit/ml) trong khi sử dụng dịch chiết

16
ngô như nguồn nitơ duy nhất với hàm lượng 20ml/l hoạt lực enzym cao hơn hẳn (đạt
640 ± 36 Unit/ml) [47].
9 Nguồn dinh dưỡng photpho
Photpho luôn luôn chiếm tỷ lệ cao nhất trong số các nguyên tố khoáng của tế bào
vi sinh vật. Photpho có mặt trong cấu tạo của nhiều thành phần quan trọng của tế bào
(như axit nucleic, photphoprotein, photpholipit, trong nhiều coenzym quan trọng như
ATP, ADP, UDP, UTP, XDP, XTP, NAD, NADP, flavin v.v.), trong một số vi tamin
như thiamin, biotin v.v. Để đảm bảo nguồn dinh dưỡng photpho người ta thườ
ng sử
dụng các loại photphat vô cơ. Việc bổ sung photphat vào môi trường dinh dưỡng ngoài
việc cung cấp photpho còn có tác dụng tạo ra tính đệm của môi trường. Với các tỷ lệ
thích hợp, hỗn hợp muối KH
2

PO
4
và K
2
HPO
4
có thể tạo ra những mức pH ổn định
trong khoảng pH 4.5 – 8.0. Trong môi trường axit K
2
HPO
4

tạo ra ion OH
-
còn trong
môi trường kiềm KH
2
PO
4
sẽ tạo ra ion H
+
. Trong quá trình sinh tổng hợp GOD từ A.
niger, nguồn photpho có thể dùng dưới dạng muối KH
2
PO
4
, K
2
HPO
4

hoặc
(NH
4
)
2
HPO
4,
NH
4
H
2
PO
4
, trong đó KH
2
PO
4
và K
2
HPO
4
là thích hợp hơn cả [36]; [40],
[41].
9 Ảnh hưởng của các chất có hoạt tính bề mặt [2]; [37]; [40]
Khi sinh trưởng trong môi trường dịch thể vi sinh vật chịu ảnh hưởng của sức
căng bề mặt của môi trường. Đa số các môi trường dịch thể dùng trong phòng thí
nghiệm có sức căng bề mặt khoảng 0,57 – 0,63mN/cm. Những thay đổi mạnh mẽ sức
căng bề mặt có thể làm ngừ
ng sinh trưởng và làm tế bào chết. Khi sức căng bề mặt
thấp, các thành phần của tế bào chất bị tách khỏi tế bào. Điều này chứng tỏ màng tế

bào chất bị tổn thương. Các chất làm tăng sức căng bề mặt đa số là các muối vô cơ.
Các chất làm giảm sức căng bề mặt chủ yếu là các axit béo, alcohol, saponat và
các chất có chuỗi cacbon dài, thẳng và thơm. Các chất nói trên được g
ọi là các chất có
hoạt tính bề mặt. Tác dụng của chúng thể hiện trong việc làm thay đổi các đặc tính bề
mặt của vi sinh vật, trước hết là nâng cao tính thấm của tế bào. Trong thực tế người ta
sử dụng hiện tượng này trong việc nuôi cấy các vi khuẩn kháng axit. Khác với các vi
khuẩn khác, vi khuẩn kháng axit có bề mặt kỵ nước và việc giảm sức căng bề mặt của
môi trường sẽ kích thích sự sinh tr
ưởng của chúng. Sức căng bề mặt thấp còn ngăn cản
vi khuẩn gắn vào bề mặt cứng, tránh cho chúng khổi cạnh tranh sinh trưởng. Việc

17
thêm một lượng nhỏ chất có hoạt tính bề mặt như Tween 80 vào môi trường nuôi cấy
giúp cho vi khuẩn sinh trưởng khuyếch tán đồng đều trong dung dịch [2]. Các chất có
hoạt tính bề mặt cũng được dùng để sát trùng, tẩy uế. R.P Kona (2001), khi nghiên
cứu sinh tổng hợp enzym GOD từ chủng nấm mốc Aspergillus niger đã sử dụng dung
dịch 0,5g/l tween 80 để thu bào tử [47]. Hao Peng (2004), khi nghiên cứu ảnh hưởng
của EDTA đến quá trình tổng hợp enzym GOD của ch
ủng Penicillium sp. JW 8312
cho thấy, nồng độ EDTA bổ sung thích hợp nhất là 290ppm, trong khi nồng độ
580ppm kìm hãm sinh trưởng và làm giảm hoạt tính enzym [40].

II. 4.3 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy
Việc sản xuất enzym GOD từ chủng A. niger chịu ảnh hưởng của một số yếu tố
môi trường như nhiệt độ, pH, thời gian, chế độ thông khí v.v. Để đạt được sản lượng
GOD cao ngườ
i ta cần phải nghiên cứu lựa chọn nhiệt độ, pH, thời gian nuôi cấy, chế
độ thông khí thích hợp cho sinh trưởng của chủng vi sinh vật sử dụng. Tuy nhiên, điều
kiện tối ưu cho sự sinh trưởng, phát triển từng loài có thể không trùng với điều kiện tối

ưu cho quá trình sinh tổng hợp enzym.
9 pH
Hoạt động chuyển hóa của nấm mốc rất nhậy cảm với pH của môi trườ
ng. Hầu
hết nấm mốc phát triển tốt trong môi trường hơi axit, giá trị pH từ 3 đến 6, nhưng một
số loài có thể sinh trưởng ở giá trị pH dưới 2, có tác dụng rất tốt để ức chế sự phát triển
của vi khuẩn. Tác dụng của pH có ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình trao đổi chất của
tế bào. pH cần cho hoạt động của nhiều enzym. Nồng độ ion H
+
còn ảnh hưởng trực
tiếp đến độ hoà tan của một số khoáng K, Na, Mg pH môi trường còn ảnh hưởng
đến khả năng hấp thụ các nguồn hydrat cacbon, nitơ của sinh vật [2]. Để sản xuất
enzym GOD từ A. niger khoảng pH ban đầu của môi trường trong khoảng từ 5-7
[ 42];[47];[73].
9 Nhiệt độ [42]
Nhiệt độ lên men thích hợp cần phải được duy trì mặc dầu vi sinh vật trong quá
trình hoạt động trao đổi ch
ất cũng sinh nhiệt. Nhiệt độ có vai trò quan trọng trong sự
sinh trưởng của sợi nấm, việc sản sinh bào tử và sự nảy mầm của chúng. Khi nuôi cấy
ở nhiệt độ dưới nhiệt độ tối thích, sự sinh trưởng và sản xuất các chất chuyển hóa bị

18
chậm lại. Khi nuôi cấy nấm mốc ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ tối thích, kết quả là làm
ức chế và biến tính enzym và sự sinh trưởng bị dừng lại. Mặc dầu hầu hết nấm sợi là
có nhiệt độ tối thích giữa 25
0
C và 35
0
C, một số loài có thể phát triển mạnh ở 50
0

C. Ở
nhiệt độ 40
0
C được coi là nhiệt độ tối thích cho việc sản xuất các chất trao đổi và tiêu
thụ đường của chủng A. niger ACTT 10577.
9 Chế độ thông khí
Trong quá trình sinh tổng hợp GOD từ A. niger nấm mốc đều cần oxy để sinh
trưởng và tổng hợp enzym. Nhu cầu oxy sẽ khác nhau tuỳ theo giai đoạn. Nồng độ oxy
hòa tan tới hạn (DO) xác định khả năng thích hợp nhất của vi sinh vật tùy thuộc vào
sản ph
ẩm mong muốn cuối cùng. Việc sinh tổng hợp enzym GOD bị ảnh hưởng đáng
kể bởi hàm lượng oxy hòa tan. Nồng độ DO 100% thể hiện là nồng độ ngưỡng để tăng
sản lượng enzym lên vài lần [61]. Sự giao động của DO trong quá trình lên men theo
chu kỳ hình sin cho thấy đường DO thổi vào bình lên men qui mô công nghiệp qua
ống dẫn khí là rất thuận lợi cho việc sản xuất GOD. Ngoài ra, Michael Trager đã
chứng minh rằng, ở nồng độ DO kém tối ư
u và ở giai đoạn nhất định A. niger đã tiết
enzym vào môi trường [61];[63]. Tốc độ sinh trưởng và sinh tổng hợp enzym GOD
của chủng A. niger ở tốc độ khuấy 700v/p là cao hơn ở tốc độ khuấy 460v/p [55]. Hơn
nữa, việc tăng tốc độ khuấy không chỉ làm tăng tốc độ sinh trưởng của A. niger mà còn
nâng cao hoạt tính GOD. Hoạt tính enzym GOD đạt cao nhất ở nồng độ đường của
môi trường là 5% (tốc độ khuấy 700v/p) và hoạt tính enzym không cao hơn khi nồng
độ đường trong môi trường tăng lên 7%. Khi cung cấp oxy tinh khiết vào bình lên men,
tốc độ sinh trưởng của A. niger (ở pha ổn định) là 95mg sợi nấm khô/100ml/giờ và
sinh khối chỉ đạt 61 mg khi oxy tinh khiết được thay bằng không khí [63]. Hoạt tính
glucooxidaza trong nuôi cấy cấp oxy cao gấp đôi trong nuôi cấy thông khí. Độ nhớt
của dịch nuôi cấy sẽ cao hơn khi nồng độ sợi nấm tăng lên.
Độ nhớt của dịch nuôi cấy
cung cấp oxy là thấp hơn độ nhớt của dịch nuôi cấy thổi không khí.

II.5. Thu hồi và tinh sạch enzym
Sản xuất enzym GOD (GOD) bằng chủng A. niger được biết đến từ lâu. Tuy
nhiên, các nghiên cứu sự phân bố enzym trong các chủng nấm mốc còn ít được quan
tâm. Clarke và cộng sự đã nghiên cứu định lượng enzym GOD ngoại bào, trong màng

19
tế bào, tế bào chất và trong các thành phần khác của nấm mốc A. niger NRRL-3 nuôi
cấy trên môi trường thạch nước chiết malt (MEA). Các tác giả đã tách được các thành
phần riêng rẽ và xác định được hoạt tính enzym GOD, trong đó GOD ngoại bào chiếm
38% hoạt động tổng thể, 60% còn lại ở trạng thái liên kết trong sợi khuẩn ty bao gồm:
màng tế bào, tế bào chất và chất dịch khác chiếm tỷ lệ tương ứng 34, 12 và 16% [59].
Witteveen và cộng sự đ
ã nghiên cứu định vị hoạt động của GOD và catalaza
của A. niger N 400 (CBS 120.49) theo phương pháp hoá học miễn dịch và cũng xác
định GOD tập trung ở màng tế bào [59]. Đối với trường hợp enzym tiết ra môi trường,
để thu dịch enzym người ta thường tách sinh khối và các chất cặn bã ra khỏi canh
trường bằng ly tâm hoặc lọc ép với việc sử dụng thêm các chất trợ lọc hoặc các chất
tạo kết tủa.
Đối vớ
i enzym còn nằm trong tế bào thì việc phá vỡ tế bào là rất cần thiết.

II.5.1. Cơ chế của việc giải phóng enzym nội bào [27]; [52]
Việc giải phóng các enzym nội bào ra khỏi tế bào thực chất là quá trình làm tổn
thương tế bào. Có hai cách để có thể làm thay đổi màng tế bào dẫn đến việc giải phóng
enzym là làm cạn kiệt năng lượng hoặc làm tổn thương màng tế bào.

II. 5.1.1 Cơ chế làm cạn kiệt năng lượng
Sự ức chế quá trình chuyển hóa năng lượng là làm cạn kiệt năng lượng ATP
dẫn đến sự giải phóng liên tục các các ion Na
+

, K
+
và Cl
-
trên màng và dẫn đến làm
phồng màng tế bào. Hậu quả của sự thâm nhập các ion Ca
2+
vào bên trong tế bào là
kích hoạt các enzym phospholipaza, kết quả của những phản ứng do enzym
phospholipaza xúc tác đã gây ra những tổn thương cho màng tế bào. Khi các lỗ thủng
nhỏ trên màng được khắc phục nhờ sự hàn gắn lại trong pha thuận nghịch thì chỉ một
phần rất nhỏ enzym được giải phóng ra, nhưng khi năng lượng ATP đã giảm đến mức
thấp, tính toàn vẹn của màng bị phá vỡ nghiêm trọng, sự tổn thươ
ng của tế bào là
không thể khắc phục thì một lượng lớn enzym được giải phóng.


20
II.5.1.2 Cơ chế tổn thương màng tế bào bằng cơ học và phi cơ học
Có rất nhiều cách để phá vỡ các tế bào vi sinh vật. Việc lựa chọn phương pháp
phá vỡ tế bào tùy thuộc vào chủng vi sinh vật và sản phẩm cần thu nhận. Các phương
pháp phá vỡ tế bào dựa trên hai nguyên lý là phá vỡ bằng tác nhân cơ học và phá vỡ
bằng tác nhân phi cơ học. Hiệu quả của từng phương pháp được đánh giá d
ựa trên mức
độ tế bào bị phá vỡ và mức độ hoạt động của enzym được giải phóng ra.

a) Các phương pháp phá vỡ tế bào bằng tác nhân cơ học [93]
 Phương pháp đồng hóa (Homogenizers)
Máy đồng hóa bơm sinh khối qua một van có lỗ đã được giới hạn liều lượng.
Máy sử dụng áp suất cao (trên 1500 bar) tiếp sau là sự giãn nở ngay lập tức thông qua

một vòi đặc biệt. Sự phá vỡ tế bào đượ
c gắn với ba cơ chế: Sự đẩy lên van, sự xé chất
lỏng rất mạnh ở trong van và sự giảm áp suất đột ngột ở đầu ra, cuối cùng gây ra sự nổ
vỡ tế bào. Phương pháp này được ứng dụng chủ yếu để giải phóng các phần tử bên
trong tế bào. Theo Hetherington và cộng sự, đây là phương pháp phá vỡ tế bào (hay tỷ
lệ protein được giải phóng) tốt nhất.

Phương pháp nghiền bi (Ball Mills)
Sử dụng các bi gốm hoặc bi thủy tinh và được khuấy ở tốc độ cao. Các tế bào
trong dịch huyền phù bị vỡ do các lực cắt, nghiền, va đập và cọ sát giữa các hạt và giải
phóng các phân tử sinh học. Ở mức công nghệ đơn giản nhất, các bi thủy tinh được bổ
sung vào dịch huyền phù và mẫu được trộn bằng máy trộn vortex của phòng thí
nghiệm. Bằng cách này, các tế bào
được phá vỡ dễ dàng, không đắt và có thể thực hiện
với nhiều mẫu khác nhau. Khi phá vỡ một lượng mẫu lớn bằng phương pháp này, cần
trang bị bộ phận làm mát (thường dùng CO
2
lỏng) bởi vì khi khuấy mạnh, một lượng
lớn nhiệt được tỏa ra.
 Phá vỡ bằng siêu âm (Ultrasonic disruption)
Một phương pháp được ứng dụng khá rộng rãi là phá vỡ tế bằng sóng siêu âm
tần số cao (thường là 20-50 kHz). Về nguyên tắc, tần số cao do dòng điện sinh ra và
năng lượng cơ học được chuyển đến mẫu qua một đầu kim loại giao động với tần số
r
ất cao. Đầu kim loại được đặt trong ống đựng tế bào (mẫu) và sự rung tần số cao gây
ra áp suất cao ở tại vùng đó và kết quả là tác động mạnh và tạo ra lỗ hổng và kết cục là
phá vỡ hoàn toàn tế bào.

21
Nhược điểm của phương pháp phá vỡ tễ bào bằng tác nhân cơ học.

- Phương pháp phá vỡ tế bào bằng cơ học có một số nhược điểm sau:
- Các tế bào bị phá vỡ hoàn toàn, tất cả các vật chất bên trong tế bào được giải
phóng. Vì vậy, sản phẩm cần phải được tách khỏi hỗn hợp các protein, các
axit nucleic và các mảnh vỡ của thành tế bào.
- Các mả
nh vụn của tế bào sinh ra thường là những mảnh nhỏ vì thế làm cho
dung dịch khó lọc trong.
- Hầu hết các phương pháp phá vỡ tế bào bằng cơ học đều sinh nhiệt, vì vậy
các protein dễ bị biến tính trừ khi các thiết bị được làm mát một cách đầy
đủ.

b) Các phương pháp phá vỡ tế bào bằng tác nhân phi cơ học [83]
 Cải thiện tính thấm nhờ hóa chất (Chemical Permeabilization)
Nhiều phương pháp hóa h
ọc đã được sử dụng để cải thiện tính thấm của thành
tế bào nhằm chiết rút các thành phần bên trong các tế bào vi sinh vật. Các dung môi
hữu cơ như toluen, ete, phenylethyl alcohol DMSO, benzen, methanol, chloroform có
thể dễ dàng tạo ra các kênh dẫn qua màng tế bào.
Việc cải thiện tính thấm bằng hóa chất cũng có thể đạt được kết quả khi sử
dụng các chất kháng sinh, các thionin, các chất hoạt động bề mặt, các tác nhân làm nứt
nẻ và làm đứt gẫ
y. Một chất rất quan trọng đó là EDTA (tác nhân bẻ gẫy) được sử
dụng rộng rãi để cải thiện tính thấm của các vi sinh vật Gram âm. Hiệu lực của nó thể
hiện ở kết quả của việc gắn các cation hóa trị hai Ca
2+
, Mg
2+
. Cuối cùng là ổn định cấu
trúc của các màng bên ngoài bằng cách gắn các lipopolysaccharit với nhau. Ngay khi
các cation này bị EDTA tách ra các lipopolysaccharit cũng bị tách ra, kết quả là các

vùng có khả năng thấm của lớp thành bên ngoài tế bào tăng lên.
 Cải thiện tính thấm bằng gây sốc thẩm thấu
Trong khi các tế bào chịu được sự thay đổi từ từ của áp suất thẩm thấu bên
ngoài môi trường do có sự thích ứng với những thay đổi, thì những tế bào ch
ịu sự thay
đổi áp suất thẩm thấu nhanh đột ngột, có thể bị tổn thương về mặt cơ học. Quá trình
này diễn ra đặc trưng khi môi trường có nồng độ đường sacaroza cao. Người ta cho
rằng, các enzym được giải phóng bằng phương pháp này là các enzym định vị ở gần bề

22
mặt tế bào [30]. Theo Fiedurek, J (1992) để giải phóng enzym GOD khỏi chất bao, sợi
nấm A. niger 72 giờ tuổi được hòa vào dung dịch NaCl có nồng độ từ 0,4- 2.8 M/l [31].
 Thủy phân (Lysis)
Phương pháp phá vỡ tế bào bằng thủy phân thường được sử dụng cho những tế
bào dễ bị phá vỡ. Thông thường, nồng độ các chất ion hóa trong môi trường bị giảm
xuống làm cho các tế bào bị phồng lên và vỡ ra. Trong một số trường h
ợp, một số chất
hoạt động bề mặt có thể được bổ sung vào và kết hợp với khuấy nhẹ hoặc siêu âm để
tách rời hoàn toàn các thành phần của tế bào.
Sự phá vỡ tế bào bằng phương pháp thủy phân có nhược điểm là không kiểm
soát được mức độ phá vỡ tế bào, kết quả là giải phóng tất cả các sản phẩm nội bào (các
protein, các axit nucleic, các mảnh vỡ của t
ế bào) cũng như làm biến tính các sản
phẩm.
 Cải thiện tính thấm bằng enzym (Enzymatic Permeabiization)
Các enzym cũng có thể được dùng để cải thiện tính thấm của tế bào, nhưng
phương pháp này thường bị giới hạn trong việc dùng để giải phóng các chất bao hoặc
các enzym bề mặt. Các enzym dùng trong cải thiện tính thấm là những enzym thương
phẩm có sẵn trên thị trường: β (1-6) và β (1-3) glycanaza, proteaza và mannaza.
Trở ngại chính của vi

ệc ứng dụng phương pháp enzym là tính ổn định hoạt lực
của enzym, tính nhậy cảm của tế bào đối với các enzym còn tùy thuộc vào trạng thái
của tế bào. Ngoài ra, phương pháp thủy phân enzym qui mô lớn thường đắt và sau
thủy phân cần loại bỏ hoặc làm bất hoạt enzym để cho tế bào sinh trưởng hoặc để tách
các sản phẩm mong muốn.

23
Bảng 1.3. So sánh các phương pháp phá vỡ tế bào [93]

Nguyên tắc Ưu điểm Nhược điểm
Áp suất cao (Các hệ
thống phá vỡ tế bào liên
tục)
Nhanh, được lưu giữ
trong quá trình hoạt động
với các sản phẩm phụ có
trang bị hệ thống làm
mát, CIP, SIP, các mẫu
có thể là dịch lỏng, nhớt
hoặc đặc,dễ sử dụng và
dễ vệ sinh, được bảo
hành, dễ nâng công suất,
có chọn lọc, và có thể sử
dụng lại
Khó có thiết bị như v
ậy,
Cần có các thuyết trình
để nkhách hàng quan
tâm.
Áp suất cao khác Lưu giữ lại trong quá

trình hoạt động, có thể
lập lại với một số lượng
lớn
Chậm bởi vì cần phải đi
qua nhiều lần, không có
biện pháp giữ lại các sản
phẩm phụ, không có bộ
phận làm mát,không có
hệ thống CIP & SIP, chỉ
dùng cho các chất lỏng,
không dễ sử dụng và vệ
sinh nnhư nhiều thiết bị
khác.

Sốc nhiệt Đơn giản, rẻ tiền Sản phẩm bị biến tính
Các loại enzym / các loại
hóa chất
Đặc hiệu Khó khăn khi nâng công
suất
Các loại siêu âm Thiết bị gọn nhẹ Sinh nhiệt, chậm
Làm đứt gẫy bằng cơ học Có thể lập lại Khó làm vệ sinh, chậm


II.5.2. Tinh sạch enzym [8], [27], [39],[52],[68].
Tùy theo yêu cầu sử dụng enzym mà ta cần enzym tinh sạch hay không tinh
sạch. Rất ít khi enzym thu được sau khi phá vỡ tế bào được sử dụng ngay, trong hầu
hết các trường hợp đòi hỏi phải qua bước tinh sạch enzym. Để tách và tinh chế enzym
người ta thường dựa vào tính chất cơ bản của enzym để đưa ra các phương pháp thích
hợp.
- Các phương pháp dựa vào sự thay đổi tính hoà tan bao gồm: thay đổi pH (kết

tủa ở đ
iểm đẳng điện), thay đổi lực ion (kết tủa enzym bằng muối trung tính), làm
giảm hằng số điện môi (kết tủa enzym bằng dung môi hữu cơ) v.v

24
- Các phương pháp phụ thuộc vào điện tích như: điện di, điểm đẳng điện, sắc ký
trao đổi ion.
- Các phương pháp phụ thuộc vào khối lượng phân tử: Ly tâm, lọc gel, thẩm
tích, siêu lọc v.v
Khi tế bào bị phá vỡ, điều quan trọng là phải xác định những thành phần nào có
mặt trong dịch phá vỡ tế bào để quá trình tinh sạch có hiệu quả và không bị cản trở.
Các phương pháp tinh sạch enzym bao g
ồm: Tủa muối và các phương pháp sắc
ký.
Trước khi tinh sạch enzym GOD được tách từ A. niger ở nhiệt độ từ 0-5
0
C. 50 g
dịch chiết của A. niger được hòa vào 300ml dung dịch đệm natri axetat 0.1M (pH 4,5)
và được thẩm tách ngược trong 5 lít dung dịch đệm nói trên. Bước ban đầu này là để
loại bỏ số lượng lớn các chất điện phân có thể phân tách có mặt trong dịch chiết của
Asp. niger. Tủa protein mầu nâu tạo thành trong khi thẩm tách được loại bỏ bằng ly
tâm. Dịch phái trên có chứa toàn bộ hoạt tính enzym GOD được sử dụng để đưa vào
cột Amberlite CG-50 (kích thước c
ột 50 x 6cm), sử dụng dung dịch đệm natri axetat
0.1M (pH 4,5). Cột được rửa với 4 lít dung dịch đệm natri axetat 0.1M (pH 4,5) để
loại bỏ với số lượng đáng kể các chất bẩn. Tiếp theo enzym được tách rửa tới một
dung dịch mầu vàng bằng dung dịch đệm natri axetat 0.1M (pH 5.0). Protein được kết
tủa từ dung dịch mầu vàng bằng việc thêm amon sulphat bão hòa 90%. Tủa được tách
bằng ly tâm và được hòa tan trở lại trong 50ml đệm natri photphat 0.1M (pH 6.0).
Dung dịch này

được thẩm tích ngược bằng cùng dung dịch đệm.
Dung dịch đã thẩm tích được dùng để chạy qua cột DEAE-cellulose (kích thước
50 x 4 cm) với dung dịch đệm là natri photphat 0.1M (pH 6.0). Cột trao đổi ion được
rửa bằng 5 lít dung dịch đệm là natri photphat 0.1M (pH 6.0). Protein mầu nâu với
hoạt tính catalaza cao được tách rửa. Cuối cùng, DEAE-cellulose được rửa với đệm
photphat 0.2M (pH 6.0), theo cách tách rửa này, thu được protein mầu vàng với hoạt
tính GOD. Dịch mầu vàng được thêm vào một lượng amon sulphat đến độ bão hòa
90%. Tủ
a tạo thành được ly tâm và hòa tan trở lại trong nước, cuối cùng thẩm tách
ngược bằng nước.