Nghiên cứu xây dựng quy trình tổng hợp levothyroxin mononatri và liothyronin mononatri từ L-tyrosin

Header Page 1 of 148.
B GIÁO D C VÀ ĐÀO T O

B YT

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ N I

NGUYỄN THỊ NGỌC HÀ
NGHIÊN C U XÂY D NG QUY TRÌNH TỔNG HỢP
LEVOTHYROXIN MONONATRI VÀ LIOTHYRONIN
MONONATRI TỪ L-TYROSIN

Chuyên ngành: Công nghệ dư c phẩm và bào ch thuốc
Mã số: 62720402
TÓM T T LUẬN ÁN TI N Sƾ DƯỢC HỌC

Hà N i, năm 2016

Footer Page 1 of 148.


Header Page 2 of 148.
Công trình này đư c hoàn thành t i:
-

B môn Công nghiệp Dư c, trường Đ i học Dư c Hà N i

-

B môn Bào ch , trường Đ i học Dư c Hà N i

-

Viện Kiểm nghiệm thuốc trung ương

-

Viện Hóa học, viện Hàn lâm khoa học Việt Nam

Người hướng dẫn khoa học:
PGS. TS. Nguyễn Đình Luyện
TS. Nguyễn Văn Hân
Phản biện 1:
Phản biện 2:
Phản biện 3:

Luận án s đư c bảo vệ trước H i đồng chấm luận án cấp trường
họp t i:
Vào hồi:

giờ ngày

tháng năm

Có thể tìm hiểu luận án t i: Thư viện quốc gia Việt Nam
Thư viện trường Đ i học Dư c Hà N i

Footer Page 2 of 148.


Header Page 3 of 148.

CÁC KÝ HI U, CH

VI T T T

Ch vi t t t

Ch đầy đ hoặc nghƿa ti ng Vi t

13

Phổ c ng hưởng từ h t nhân carbon-13

C-NMR

(Carbon13- Nuclear Magnetic Resonance)
1

H-NMR

Phổ c ng hưởng từ h t nhân proton
(Proton- Nuclear Magnetic Resonance)

Ac

Acetyl (CH3CO-)

Acac

Acetyl acetonat

ACN

Acetonitril

DMF

Dimethylformamid [HCON(CH3)2]

eq

Đương lư ng (equivalent)

EI

Ion hóa va ch m điện tử (electron impact)

ESI

Ion hóa phun mù điện tử (electrospray
ionization)

Et

Ethyl (C2H5-)

HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (Highperformance liquid chromatography)

IR

Phổ hồng ngo i (Infrared
Spectrophotometer)

LD50

Liều ch t trung bình

Me

Methyl (CH3-)

MS

Phổ khối lư ng (Mass Spectrometry)

OECD

Tổ chức H p tác và Phát triển Kinh t
(Organization for Economic Co-operation
and Development)

Rf

Footer Page 3 of 148.

Hệ số lưu giữ (retention factor)


Header Page 4 of 148.

T2

Diiodothyronin (3,5-diiodo-thyronin)

T3

Triiodothyronin, liothyronin (3,5,3’-triiodothyronin)

T3 Na

Liothyronin natri

T3 diNa

Liothyronin dinatri

T4

Tetraiodothyronin, levothyroxin (3,5,3’,5’tetraiodo-thyronin)

T4 Na

Levothyroxin natri

T4 diNa

Levothyroxin dinatri

tonc

Nhiệt đ nóng chảy

Ts

Tosyl (p-CH3-C6H4-SO2-)

TsOH

Acid p-toluensulfonic

Footer Page 4 of 148.


Header Page 5 of 148.
MỞ Đ U
Tính c p thi t c a lu n án
Kho ng 3 - 5% dân s Vi t Nam bị suy tuyến giáp. B nh gặp ở nhiều
lứa tuổi và nhiều đ i tượng. Trẻ em bị suy giáp sẽ chậm lớn và kém
phát triển trí tu . B nh cũng hay gặp ở phụ nữ có thai, gây hậu qu
nghiêm trọng đến thai nhi. Ngoài s ít trường hợp suy giáp do dùng
thu c kháng giáp có thể hồi phục khi ngưng thu c, còn đa s các
trường hợp khác đều ph i điều trị bằng hormon giáp tr ng c đời.
Hi n nay, nhu cầu s dụng levothyroxin và liothyronin ở nước ta
trong điều trị b nh là khá lớn mà vi c s n xuất nguyên li u trong
nước chưa thực hi n được. Con đường tổng hợp levothyroxin
mononatri và liothyronin mononatri chủ yếu đi t L-tyrosin, nguyên
li u này có thể điều chế bằng phương pháp thủy phân các nguồn
keratin khác nhau như s ng, tóc… Nếu chúng ta tiến hành nghiên
cứu, s n xuất thành công levothyroxin mononatri và liothyronin
mononatri thì sẽ chủ động được nguồn nguyên li u.

Quyết định s

61/2007/QĐ-TTg của Thủ tướng Chính phủ ngày

07/05/2007 về vi c phê duy t “Chương trình nghiên cứu khoa học
công ngh trọng điểm qu c gia phát triển công nghi p hóa dược đến
năm 2020” đã đặt ra cho ngành dược Vi t Nam một mục tiêu quan
trọng là tăng cường tự s n xuất nguyên li u làm thu c, tiến tới chủ
động s n xuất thu c trong nước.
Mục tiêu c a lu n án
1. Xây dựng được quy trình tổng hợp levothyroxin mononatri và
liothyronin mononatri từ L-tyrosin ở quy mô phòng thí nghiệm.
2. Đánh giá được độ ổn định và độc tính cấp của sản phẩm.
1

Footer Page 5 of 148.


Header Page 6 of 148.
Nội dung c a lu n án
1. Kh o sát các phương pháp tổng hợp levothyroxin mononatri và
liothyronin mononatri t L-tyrosin.
2. Chọn ra phương pháp phù hợp để triển khai tổng hợp
levothyroxin mononatri và liothyronin mononatri đ t tiêu chuẩn dược
dụng.
3. Đánh giá độ ổn định của 2 s n phẩm ở 2 điều ki n: lão hóa cấp t c
và điều ki n thường.
4. Đánh giá độc tính cấp của 2 s n phẩm.
Nh ng đóng góp mới c a lu n án
1. Đã xây dựng được quy trình tổng hợp levothyroxin mononatri và

liothyronin mononatri t L-tyrosin s n xuất trong nước theo phương
pháp của J. R. Chalmers và P. Bracco với c i tiến sau:
 Đã thực hi n thành công ph n ứng kh hóa hợp chất 3,5-dinitro4-p-methoxyphenoxy-N-acetyl-L-phenylalanin ethyl ester ở điều ki n
áp suất thường.
 Đã c i tiến phương pháp t o mu i mononatri của levothyroxin
và liothyronin bằng cách dùng natri bicarbonat bão hòa thay cho natri
carbonat bão hòa.
2. Lần đầu tiên thực hi n thành công phương pháp t o ether Ullmann
trong tổng hợp O-methyl-N-acetyl-3,5-diiodo-L-thyronin ethyl ester
t ph n ứng giữa dẫn chất L-tyrosin và 4-bromoanisol với xúc tác là
mu i đồng (I) iodid và ph i t

sắt (III) acetylacetonat trong môi

trường kali carbonat và dung môi dimethyl formamid.
C u trúc c a lu n án

2

Footer Page 6 of 148.


Header Page 7 of 148.
Luận án gồm 135 trang, 50 hình, 38 b ng, 148 tài li u tham kh o. B
cục gồm: Đặt vấn đề (2 trang), Tổng quan (32 trang), Nguyên li u,
trang thiết bị và phương pháp nghiên cứu (9 trang), Thực nghi m và
kết qu nghiên cứu (65 trang), Bàn luận (25 trang), Kết luận và đề
xuất (2 trang), Tài li u tham kh o (17 trang), Danh mục các công
trình khoa học đã công b liên quan đến đề tài luận án (1 trang),
Danh mục phụ lục (4 trang), Phụ lục (79 trang).

Ch

ng 1: T NG QUAN

1.1. T ng quan v levothyroxin và liothyronin
1.1.1. Levothyroxin mononatri hydrat
I
HO
I

O
I

ONa
NH

O

. x H O
2

2

I

Hình 1.2. Công thức cấu t o của levothyroxin mononatri hydrat
1.1.2.

Liothyronin mononatri hydrat
O

HO

I

I

O

NH

O N a . x H 2O
2

I

Hình 1.4. Công thức cấu t o của liothyronin mononatri hydrat
1.1.3.

Tác dụng dược lý của hormon tuyến giáp

Kích thích các ph n ứng trao đổi làm tăng chuyển hoá cơ b n, tăng
hấp thu glucose ở ruột và tăng phân huỷ glycogen, nên gây tăng
đường huyết, tăng phân huỷ triglycerid, phospholipid và cholesterol,
tăng tổng hợp protein. Không đủ hormon tuyến giáp sẽ gây ra b nh
3

Footer Page 7 of 148.


Header Page 8 of 148.

suy giáp, trẻ chậm lớn và không phát triển trí tu , người lớn bị chứng
m ch chậm, gi m thân nhi t, gi m trao đổi chất cơ b n, gi m ho t
động trí não, bướu cổ.
1.2. Các ph

ng pháp t ng hợp levothyroxin mononatri và

liothyronin mononatri
Có 2 phương pháp:
Phương pháp chính tổng hợp qua chất trung gian 3,5-diiodo-Lthyronin:
I
1 . I2/KI/base
1e q

O
HO

I

OH

O
I

2 . N a2CO 3

2 . N a2CO 3

1 eq

7

I
1 . I2/KI/base
2e q

I

ONa
N H2

O

NH 2

O
6

HO

I
HO
I

O
I

ON a
NH2

O

8

I

Hình 1.5. Sơ đồ tổng hợp levothyroxin mononatri (8) và liothyronin
mononatri (7) t 3,5-diiodo-L-thyronin (6)
Trong đó giới thi u các phương pháp tổng hợp 6: Phương pháp của
các tác gi như: C. R. Harington và cộng sự, A. David và cộng sự, W.
Siedel và cộng sự, G. Hillmann, J. R. Chalmers và cộng sự (sau này
có c i tiến của P. Bracco trong 1 s bước quan trọng), P. Z. Anthony
và R. I. Meltzer.
Các phương pháp khác: Phương pháp của Salamonczyk, Phương
pháp oxy hóa của L. G. Ginger.
1.3. Các ph

ng pháp t o hợp ch t diaryl ether

Có 4 phương pháp: Phương pháp ghép đôi nhờ xúc tác Cu: Ph n ứng
Ullmann cổ điển; Ph n ứng ghép đôi Ullmann các dẫn chất có nhóm
4

Footer Page 8 of 148.


Header Page 9 of 148.
thế ortho; Ph n ứng ghép đôi của các acid arylboronic nhờ xúc tác
Cu(OAc)2. Phản ứng thế ái nhân trong nhân thơm: Ph n ứng thế ái
nhân chuẩn; Ph n ứng thế ái nhân để t o phức kim lo i-aren; Với

mu i diaryl iodo. Phản ứng oxy hóa: Oxy hóa các phenol. Các
phương pháp khác.
1.4. Phân tích, l a chọn h ớng nghiên c u
Qua tổng quan tài li u và dựa vào xu hướng nghiên cứu trên thế giới
đã tổng kết được có 4 phương pháp tổng hợp 2 nguyên li u t Ltyrosin: Phương pháp 1: Oxy hóa dẫn chất 3,5-diiodo-L-tyrosin theo
phương pháp của L. G. Ginger t o levothyroxin; Phương pháp 2:
Ngưng tụ với dẫn chất iodoni iodid của G. Hillmann t o levothyroxin
và liothyronin; Phương pháp 3: Tổng hợp qua dẫn chất nitro của J.
R. Chalmers t o levothyroxin và liothyronin; Phương pháp 4: T o
cầu n i diaryl ether t

dẫn chất của L-tyrosin với acid 4-

methoxyphenylboronic, xúc tác là Cu(OAc)2 theo tác gi A. David
t o levothyroxin và liothyronin.
T các phương pháp trên chúng tôi dự định tiến hành kh o sát để tìm
ra phương pháp phù hợp nhất với điều ki n thiết bị hi n có và có thể
triển khai tổng hợp ở quy mô lớn hơn. Đồng thời nghiên cứu phương
pháp t o ether Ullmann giữa một aryl halogenid và L-tyrosin để t o
liên kết ether của hormon giáp tr ng với hy vọng sẽ có đóng góp mới
về mặt khoa học, sau đó tiến hành nghiên cứu tiếp kh năng ứng
dụng vào thực tế s n xuất.
Ch

ng 2: NGUYÊN LI U, TRANG THI T B VÀ PH
PHÁP NGHIÊN C U

2.1. Nguyên li u
5

Footer Page 9 of 148.

NG


Header Page 10 of 148.
Nguyên li u, hóa chất, dung môi s dụng trong nghiên cứu đều là
lo i đ t tiêu chuẩn tổng hợp. Các dung môi sắc ký đ t tiêu chuẩn
dùng cho HPLC.
2.2. Thi t b nghiên c u
S dụng các thiết bị tổng hợp hóa dược chuyên dụng, các thiết bị
dùng để định tính, định lượng tin cậy của trường Đ i học Dược Hà
Nội, vi n Hóa học các hợp chất thiên nhiên - Vi n Hàn lâm Khoa học
Vi t Nam, vi n Kiểm nghi m thu c trung ương.
2.3. Ph

ng pháp nghiên c u

2.3.1. Phương pháp tổng hợp hóa học
Bằng các ph n ứng hữu cơ cơ b n: iodo hóa, acetyl hóa, ester hóa,
oxy hóa, thủy phân, nitro hóa, ngưng tụ, kh hóa, diazo hóa và ph n
ứng t o mu i natri t phenol, t acid carboxylic.
2.3.2. Phương pháp kiểm tra độ tinh khiết
Theo 2 phương pháp: Nhi t độ nóng ch y và Sắc ký lớp m ng.
2.3.3. Phương pháp phân tích cấu trúc
Để phân tích, khẳng định cấu trúc của các chất tổng hợp, đề tài đã s
dụng phương pháp phổ: IR, MS, 1H-NMR 13C-NMR.
2.3.4. Phương pháp kiểm nghiệm
Theo USP 34 đ i với T3Na và BP 2010 đ i với T4Na.
2.3.5. Phương pháp đánh giá độ ổn định

- Đ i tượng th : 3 lô đóng lọ PE, tránh ánh sáng.
- Điều ki n th nghi m: Điều ki n lão hóa cấp t c: Nhi t độ 40 
2°C; độ ẩm: 75  5%. Điều ki n thường: Nhi t độ thường 30  2°C;
độ ẩm: 75  5%

6

Footer Page 10 of 148.


Header Page 11 of 148.
- Các chỉ tiêu kh o sát: tính chất, góc quay cực riêng, mất kh i lượng
do làm khô, giới h n t p chất liên quan và hàm lượng (theo USP 34
đ i với liothyronin mononatri và theo BP 2010 đ i với levothyroxin
mononatri).
2.3.6. Phương pháp đánh giá độc tính cấp
Mô hình liều c định theo hướng dẫn của OECD.
2.3.7. Xử lý và biểu thị các kết quả nghiên c u
Các kết qu nghiên cứu được x lý bằng công cụ th ng kê thích hợp.
Ch

ng 3: TH C NGHI M VÀ K T QU NGHIÊN C U

3.1. T ng hợp O-methyl-N-acetyl-3,5-diiodo-L-thyronin ethyl
ester
Đây là bước t o cấu trúc diaryl ether, là ph n ứng “chìa khóa” của
quy trình. Tổng hợp theo 3 phương pháp sau:
3.1.1. Phương pháp mới tổng hợp O-methyl-N-acetyl-3,5-diiodo-Lthyronin ethyl ester (5)-

ng dụng phương pháp tạo ether Ullmann

O

O

4 - br o m oa n is o l

I

M eO

I

OE t

OEt
N H Ac

HO

C u I, F e (a c ac ) 3, K 2C O 3 , DM F

I

8 7, 0 %

I

N H Ac

O

5

4

Hình 3.2. Ph n ứng t o 5 theo phương pháp Ullmann
3.1.2. Phương pháp c a J. R. Chalmers và P. Bracco

7

Footer Page 11 of 148.


Header Page 12 of 148.
O
O
OH
NH

HO

H N O /H SO
3 2 4

2

NH

HO

0 -2 0oC

O H A c O/ N a O H
2

O 2N

2

OH

7 7, 9 %

N O2
34

25
O

O
E t OH , S O C l2
8 9, 6 %

O 2N

N H Ac
NO

O N
2

M eO

1 . T s Cl / p y r id i n

OEt

HO

N H Ac

HO

N O2

8 9, 1 %

3

O

O 2N

OE t

9 2, 5 %

N O2

7 7, 1 %

2

H /P d - C
2

N H Ac

O

2 . p - m e th o x y p h e n o l

27

26
O
M eO

H N
2

O
OE t

N H Ac

O
NH

2 . I /K I

2
2

I

M eO

1 . N aN O / H S O , Ac OH
2 2 4

OE t
N H Ac

O
8 9, 1 %

I

28

5

Hình 3.3. Sơ đồ tổng hợp 5 theo phương pháp J. R. Chalmers và P. Bracco

3.1.3. Phương pháp c a G. Hillmann
O

O
OH

a . I2 / KI

I

9 1, 1 %

NH2

HO
3

b . N aI O 3/ N aI

NH 2

HO

OH
N H Ac

HO

8 5,2 %

31

I

9 0, 1 %

O
I

A c 2O / N aO H

OH

I

32

E tO H , Ts O H
8 8, 0 %
N a I O 3, A c 2O , A c O H
H 2S O 4, K I
M eO

O
I
M eO

I

I

OMe

OE t

+

1 2, 3 %

N H Ac

HO
33

I
4

4 9, 3 %
O
M eO

I

OEt
N H Ac

O
5

I

Hình 3.4. Sơ đồ tổng hợp 5 theo phương pháp của G. Hillmann

8

Footer Page 12 of 148.

Header Page 13 of 148.
3.2. T ng hợp 3,5-diiodo-L-thyronin
Dùng 2 tác nhân: HBr 47% hoặc HI 57%:
OEt
NHAc

O
5

O

a. HBr 47% / AcOH
87,1 %

O
I

MeO

I

HO

b. HI 57% / AcOH
92,4 %

I

OH

O
6

NH2
I

Hình 3.5. Sơ đồ tổng hợp 3,5-diiodo-L-thyronin (6)

3.3. T ng hợp và tinh ch levothyroxin mononatri
3.3.1. Tổng hợp levothyroxin (1)
Tổng hợp 1 t 6 theo phương pháp của J. R. Chalmers và P. Bracco.
O
HO

I
O
6

I
OH

O

I2 / KI, EtNH2

HO

I

86,4 %

I

O
1

NH2
I

OH
NH2
I

3.3.2. Tinh chế levothyroxin
Kết tinh qua d ng mu i dinatri.
K t qu : tonc: 235-236oC; Rf = 0,22 [NH4OH-2-C3H7OHCH3COOC2H5 (20:35:55)]; HPLC: không có pic l , thời gian lưu
mẫu th và mẫu chuẩn bằng nhau (tR = 5,8 phút). Điều ki n sắc ký:
Pha động: hỗn hợp (ACN : H2O) = (60 : 40); thêm 0,5 mL acid
H3PO4 trong 1000,0 mL. T c độ dòng: 1,5 mL/phút. Cột C18 Phenomenex 4,6 mm x 25 cm, 5μm; bước sóng 225 nm; Kết quả
phân tích phổ: IR (KBr), υmax (cm-1): 3243 (OHphenol); 3080 (CHthơm); 1638 (C=Ocarboxylic); 2974 và 2885 (C-Hno); 2599 (N+-Hmu
phân t
ether);

); 1638 (C=Ocarboxylat mu

i nội phân t

i nội

);1559 (C=Cthơm); 1178 (C-Odiaryl

526 (C-I). ESI-MS (m/z): 777,5 [M+H]+ (CTPT C15H11I4NO4,

M = 776,87). 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6), δ (ppm): 2,8 (1H, dd,
9

Footer Page 13 of 148.


Header Page 14 of 148.
2

JH3a-H3b = 14,0 Hz, 3JH3a-H2 = 8,0 Hz, H-3a); 3,1 (1H, dd, 2JH3b-H3a =

14,0 Hz, 3JH3b-H2 = 4,0 Hz, H-3b); 3,5 (1H, dd, 3JH2-H3a = 7,5 Hz, 3JH2H3b
13

= 4,5 Hz, H-2); 7,1 (2H, s, H-2’’, H-6’’); 7,8 (2H, s, H-2’, H-6’).

C-NMR (125 MHz, DMSO-d6), δ (ppm): 34,8 (C-3); 54,7 (C-2);

87,8 (C-3’’, C-5’’); 91,8 (C-3’, C-5’); 125,0 (C-2’’, C-6’’); 139,0 (C1’); 140,9 (C-2’, C-6’); 150,1 (C-4’’); 151,0 (C-1’’); 151,4 (C-4’);
169,4 (C=Ocarboxylic).
3.3.3. So sánh và lựa chọn phương pháp tổng hợp levothyroxin
B ng 3.6. So sánh các phương pháp tổng hợp levothyroxin
Ph
Đặc điểm

ng

Ph

ng pháp J.

Ph

ng pháp

pháp G.

R. Chalmers và

t o ether

Hillmann

P. Bracco

Ullmann

7

8

5

33,3

40,9

58,8

33,3

82,4

58,8

Số phản ứng
HS 5 từ Ltyrosin (%)
HS 5 từ phản
ứng có dùng
Iod (%)

Các ph n ứng
Hợp chất

không quá phức

iodoni 33 d

t p, trang thiết bị

Các đặc điểm

gây nổ, khó

phù hợp với điều

khác

tinh chế, hi u

ki n hi n có. Quy

suất thấp

trình khá ổn định.

(12,2%)

Không dùng iod
t đầu.
10

Footer Page 14 of 148.

Phương pháp
mới, khó tinh
chế s n phẩm
của ph n ứng
ether hóa, dùng
iod ngay t
ph n ứng đầu.


Header Page 15 of 148.
3.3.4. Tạo levothyroxin mononatri (8)

Kh o sát 2 phương pháp t o mu i với 2 tác nhân là Na2CO3 bão hòa
và NaHCO3 bão hòa. Hi u suất t o mu i của 2 phương pháp tương
đương nhau (78,0 %).
Tạo muối với natri carbonat bão hòa:
I
HO
I

I

O
I

OH

O

HO

I

I

O

N H2

O
1

Na2C O3 bh

I

8

ONa
NH2
I

K t qu : tonc: 206,5-208,9 (phân hủy); Rf [CHCl3-MeOH-HCOOH
(70:15:15)] = 0,42; Góc quay cực riêng: +18,5o (C = 2 trong HCl
0,2M / EtOH 96%); Hàm lượng: 97,9 %; Kết quả phân tích phổ: IR
(KBr), υmax (cm-1): 3458 (NH2); 3060 (C-Hthơm); 2910 (C-Hno); 1591
(C=Ocarboxylat); 1534 (C=C

thơm);

1242 và 1137 (C-Odiaryl ether); 543 và

436 (C-I). ESI-MS (m/z): 799,4 [M+H]+ (CTPT C15H10I4NNaO4, M =
798,85). 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6), δ (ppm): 2,8 (1H, dd,
2

JH3a-H3b = 14,0 Hz, 3JH3a-H2 = 8,0 Hz, H-3a); 3,1 (1H, dd, 2JH3b-H3a =

14,0 Hz, 3JH3b-H2 = 4,0 Hz, H-3b); 3,5 (1H, dd, 3JH2-H3a = 7,5 Hz, 3JH2H3b
13

= 4,5 Hz, H-2); 7,0 (2H, s, H-2’’, H-6’’); 7,8 (2H, s, H-2’, H-6’).

C-NMR (125 MHz, DMSO-d6), δ (ppm): 35,1 (C-3); 55,0 (C-2);

87,9 (C-3’’, C-5’’); 91,8 (C-3’, C-5’); 124,91 (C-2’’, C-6’’); 139,2
(C-1’); 140,9 (C-2’, C-6’); 148,2 (C-4’’); 151,6 (C-1’’); 153,4 (C-4’);
169,6 (C=Ocarboxylat).
Tạo muối với natri bicarbonat bão hòa:
H
HO
I

H

O
I

OH
N H2

O
1

N aH C O3 bh

I

I

O
8

I

11

Footer Page 15 of 148.

O

HO

ON a
NH2
I


Header Page 16 of 148.
K t qu : tonc: 207-209oC; Rf [CHCl3-MeOH-HCOOH (70:15:15)] =
0,42; Góc quay cực riêng: +18,5o (C=2 trong HCl 0,2M/ EtOH 96%).
3.4. T ng hợp và tinh ch liothyronin mononatri
Gồm 2 giai đo n: Tổng hợp liothyronin t

3,5-diiodo-L-thyronin

(tinh chế qua mu i dinatri); và T o mu i mononatri (kh o sát với 2
tác nhân t o mu i là Na2CO3 bão hòa và NaHCO3 bão hòa).
O
HO

I

O
OH I2 /KI , ethyla min

NH2

O

HO

I

I

O

I

6

OH
NH2

2

I
NaOH 50 %
O

O

HO

I

I

O

HCl 1 N

OH
NH2

2

I

NaO

I

I

O
37

ONa
NH2
I

Na2 CO3 bh
O
HO

I

I

O
7

ONa
NH2
I

Hình 3.9. Sơ đồ ph n ứng t o liothyronin natri (7)
K t qu :
Liothyronin: tonc: 236-237oC; Rf = 0,32 [NH4OH-2-C3H7OHCH3COOC2H5 (20:35:55)]; HPLC: không có pic l , thời gian lưu
mẫu th và mẫu chuẩn bằng nhau (tR = 4,3 phút). Điều ki n sắc ký:
Pha động: hỗn hợp (ACN : H2O) = (60 : 40); thêm 0,5 mL acid
H3PO4 trong 1000,0 mL. T c độ dòng: 1,5 mL/phút. Cột C18 Phenomenex 4,6 mm x 25 cm, 5μm; bước sóng 225 nm; Kết quả
phân tích phổ: IR (KBr), υmax (cm-1): 3178 (OHphenol); 3035 (CHthơm); 2762 (N+-Hmu

i nội phân t

); 1599 (C=Ocarboxylat mu

i nội phân t

); 1570

và 1496 (C=Cthơm); 1246 và 1175 (C-Odiaryl ether); 534 (C-I). ESI-MS
(m/z): 651,6 [M+H]+ (CTPT C15H12I3NO4, M = 650,97). 1H-NMR
12

Footer Page 16 of 148.


Header Page 17 of 148.
(500 MHz, DMSO-d6), δ (ppm): 2,8 (1H, dd, 2JH3a-H3b = 14,0 Hz,
3

JH3a-H2 = 8,0 Hz, H-3a); 3,1 (1H, dd, 2JH3b-H3a = 14,0 Hz, 3JH3b-H2 =

4,0 Hz, H-3b); 3,5 (1H, dd, 3JH2-H3a = 7,5 Hz, 3JH2-H3b = 4,5 Hz, H-2);
6,6 (1H, dd, 3JH5’’-H6’’ = 9,0 Hz, 4JH5’’-H3’’ = 3,0 Hz, H-5’’); 6,8 (1H, d,
JH6’’-H5’’ = 9,0 Hz, H-6’’); 7,0 (1H, d, 4JH2’’-H6’’ = 3,0 Hz, H-2’’); 7,8

3

(2H, s, H-2’, H-6’). 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6), δ (ppm): 34,9
(C-3); 54,9 (C-2); 84,5 (C-3’’); 91,9 (C-3’, C-5’); 115,1 (C-5’’);
116,2 (C-6’’); 124,4 (C-2’’); 138,8 (C-2’, C-6’); 140,8 (C-1’); 148,9
(C-4’); 151,9 (C-1’’); 152,1 (C-4’’); 169,1 (C=Ocarboxylic).
Liothyronin mononatri:
Kh o sát 2 phương pháp t o mu i mononatri với 2 tác nhân t o mu i
là Na2CO3 bão hòa và NaHCO3 bão hòa. Hi u suất t o mu i của 2
phương pháp tương đương nhau (71,1 %).
K t qu : tonc: 205-206°C (phân hủy); Rf = 0,31 [CHCl3 - MeOH HCOOH (70:15:15)]; Hàm lượng: 98,2%; Kết quả phân tích phổ:
IR (KBr), υmax (cm-1): 3389 (NH2); 2963 (C-Hthơm); 1618

(C=Ocarboxylat); 1498,08 (C=Cthơm); 1246,27 (C-Odiaryl ether); 498,87 và
456,01 (C-I). ESI-MS (m/z): 673,64 [M+H]+ (CTPT C15H11I3NNaO4,
M = 672,96). 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6), δ (ppm): 2,8 (1H, dd,
2

JH3a-H3b = 14,0 Hz, 3JH3a-H2 = 8,0 Hz, H-3a); 3,1 (1H, dd, 2JH3b-H3a =

14,0 Hz, 3JH3b-H2 = 4,0 Hz, H-3b); 3,4 (1H, dd, 3JH2-H3a = 7,5 Hz, 3JH2H3b

= 4,5 Hz, H-2); 6,6 (1H, dd, 3JH6’’-H5’’ = 9,0 Hz, 4JH6’’-H3’’ = 3,0

Hz, H-6’’); 6,8 (1H, d, 3JH5’’-H6’’ = 9,0 Hz, H-5’’); 7,0 (1H, d, 4JH2’’H6’’

= 3,0 Hz, H-2’’); 7,8 (2H, s, H-2’, H-6’). 13C-NMR (125 MHz,

DMSO-d6), δ (ppm): 35,3 (C-3); 55,1 (C-2); 84,5 (C-3’’); 92,0 (C-3’,
C-5’); 115,1 (C-5’’); 116,1 (C-6’’); 124,4 (C-2’’); 139,1 (C-2’, C-6’);
13

Footer Page 17 of 148.


Header Page 18 of 148.
140,8 (C-1’); 148,9 (C-4’); 151,8 (C-1’’); 152,1 (C-4’’); 170,0
(C=Ocarboxylat).
3.5. Triển khai quy trình t ng hợp levothyroxin mononatri và
liothyronin mononatri
L - ty ro s i n
N IT R O H Ó A

H N O 36 8 % /H 2S O 4 9 8 %

N -A C E T Y L H Ó A

A c 2O / N a O H 2 N

E ST ER H ÓA

E t O H / S O C l2

E TH ER H ÓA

p -m e t h o x y p h e n o l/p y r i d in

T s C l / p y ri d i n

K H HÓ A
á p s u ấ t t h ườ n g

H 2/ P d -C

D IA Z O H Ó A
IO D O H Ó A
(o n e p o t)

N a N O 2/ H 2S O 4 9 8 % , A c O H
I 2/K I

H B r 4 7 % /A c O H

L O I N HÓ M B O V

IO D O H Ó A
T O T3

I OD O HÓ A
T O T4

I 2/ K I 1 e q , E tN H 2

T O M U I NA T R I

T O MU I NA TR I

N a H C O 3 bh

L io thy ro n in
m o n o n a tr i

I2/ K I 2 e q , E t N H 2

N a HC O3 bh

L e v o t h y ro x i n
m o n o n a tr i

Hình 3.11. Sơ đồ quy trình tổng hợp levothyroxin mononatri và
liothyronin mononatri
14

Footer Page 18 of 148.


Header Page 19 of 148.
Kh i lượng L-tyrosin: 525,0 g. Hi u suất toàn chặng: levothyroxin
mononatri đ t 27,4 %, liothyronin mononatri đ t 23,0 %. Các ph n
ứng cho hi u suất tương đ i ổn định.
3.6. Kiểm tra ch t l ợng s n phẩm theo tiêu chuẩn d ợc điển
Nguyên li u liothyronin mononatri tổng hợp được đ t các tiêu chuẩn
theo USP 34 và levothyroxin mononatri tổng hợp được đ t các tiêu
chuẩn theo BP 2010.
3.7. Đánh giá độ n đ nh c a s n phẩm
S li u độ ổn định ở điều ki n lão hóa cấp t c cho thấy 2 s n phẩm
không có biến đổi đáng kể về các chỉ tiêu chất lượng đã theo dõi. Dữ
li u độ ổn định dài h n cho thấy hàm lượng trong giới h n qui định.
Tuổi thọ của levothyroxin mononatri và liothyronin mononatri được
dự đoán lần lượt là 26 tháng và 30 tháng.
3.8. Đánh giá độc tính c p
C hai nguyên li u không độc, không xác định được LD50.
Ch

ng 4: BÀN LU N

4.1. V t ng hợp hóa học
4.1.1. Các phương pháp tổng hợp 3,5-diiodo-L-thyronin
Qua tổng quan tài li u chúng tôi tìm được 5 phương pháp tổng hợp
levothyroxin mononatri và liothyronin mononatri t L-tyrosin. Trong
đó có 2 phương pháp chúng tôi không kh o sát: Phương pháp oxy
hóa dẫn chất 3,5-diiodo-L-tyrosin theo phương pháp của L. G.
Ginger; và Phương pháp t o cầu n i diaryl ether t dẫn chất của Ltyrosin với acid 4-methoxyphenylboronic, xúc tác là Cu(OAc)2 theo

tác gi A. David.

.

Đã kh o sát 3 phương pháp sau đây:
15

Footer Page 19 of 148.


Header Page 20 of 148.
Ph

ng pháp mới sử dụng ph n

ng t o diaryl ether c a

Ullmann: Cách đây hơn 100 năm, Ullmann đã đưa ra phương pháp
t o ether giữa phenol và aryl halogenid. Xúc tác cho ph n ứng là bột
đồng nguyên t hay các mu i đồng với lượng lớn, nhi t độ ph n ứng
thường cao. Trong su t hơn 100 năm qua đã có hàng trăm công trình
tổng hợp ether theo phương pháp t o ether Ullmann cổ điển được
công b , nhưng đặc bi t chưa có công trình nào áp dụng trong tổng
hợp hormon giáp tr ng. Trường hợp các aryl halogenid có nhóm thế
ortho t o phức với Cu như triazen hoặc trifluoroacetamid thì ph n
ứng có thể x y ra ở nhi t độ thấp hơn các ph n ứng Ullmann cổ điển.
Trường hợp trong ph n ứng thay thế các aryl halogenid bằng các acid
arylboronic thì ph n ứng có thể x y ra ở nhi t độ phòng với các xúc
tác như Cu (II) acetat, triethylamin hoặc pyridin. Phương pháp này đã
được áp dụng trong tổng hợp levothyroxin với hi u suất t o ether là

81 %. Không chỉ d ng ở đó, đến năm 2010, hai tác gi người Trung
Qu c là Xiaoyan Liu và Songlin Zhang cùng cộng sự đã tiếp tục c i
tiến phương pháp t o ether Ullmann kết hợp xúc tác Cu/Fe đã làm
gi m đáng kể lượng chất xúc tác. Các tác gi này đã tổng hợp thành
công cấu trúc diaryl ether của hàng chục chất với quy mô lớn và hi u
suất tương đ i t t. Nghiên cứu của Xiaoyan Liu và Songlin Zhang
cùng cộng sự t o ý tưởng cho chúng tôi trong quá trình tìm kiếm
phương pháp mới tổng hợp cấu trúc diaryl ether của hormon giáp
tr ng. Chúng tôi th nghi m ph n ứng t o cấu trúc diaryl ether giữa
3,5-diiodo-N-acetyl-L-tyrosin ethyl ester và 4-bromoanisol với xúc
tác là các nguồn đồng và ph i t là các nguồn sắt. Nghiên cứu bước
đầu cho thấy, ph n ứng có nhiều ưu điểm như: d tiến hành, thích
16

Footer Page 20 of 148.


Header Page 21 of 148.
hợp để nâng cấp quy trình. Tuy nhiên cũng có một s vấn đề cần
khắc phục như khi tiến hành ph n ứng ph i đặc bi t tránh nước, tất c
các chất tham gia ph n ứng cũng như dung môi ph i đ m b o khan
để hợp chất 4-brommoanisol không bị thủy phân t o ra hợp chất
phenol. Đồng thời khi kết thúc ph i tiến hành x lý ngay để tránh
ph n ứng thủy phân s n phẩm trong môi trường kiềm.
Về cơ chế của ph n ứng, theo Ying-Peng Zhang và cộng sự, có thể
gi i thích như sau:
PhOH

Fe(acac)3 HO-Cu-OPh
Fe(acac)3

(a)
Ar-X

n+

Cu

O-Cu-O-Ph
Ar
HX

HX

(b)
Ar

O

Fe(acac)3

Ph
(c)

Hình 4.1. Sơ đồ cơ chế ph n ứng t o cấu trúc diaryl ether giữa
phenol và aryl halogenid
Kết quả khảo sát ảnh hưởng của xúc tác tới hiệu suất phản ứng: xúc
tác CuI cho hi u suất ph n ứng cao nhất, điều đó có thể gi i thích
như sau: Trong hỗn hợp ph n ứng, đồng tồn t i dưới 2 d ng phức (d)
và (a):

O
O
Cu
O
O

d

HO→Cu←OPh
a

17

Footer Page 21 of 148.


Header Page 22 of 148.
Cu (I) thường t o phức với s ph i trí 2, do đó nếu dùng xúc tác Cu
(I) thì ưu tiên phức (a). Cu (II) thường t o phức với s ph i trí 4, do
đó nếu dùng xúc tác Cu (II) thì ưu tiên phức (d). Phức (a) tham gia
vào chu trình ph n ứng theo cơ chế ph n ứng đã đề cập ở trên nên
hi u suất ph n ứng cao nhất khi dùng xúc tác CuI.
Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của phối tử: ph i t Fe(acac)3 cho
hi u suất ph n ứng cao nhất, có thể gi i thích do có cấu trúc phức
chất khác hẳn cấu trúc thông thường của các ph i t khác nên kh
năng tham gia ph n ứng của ph i t sắt (III) acetylacetonat cao nhất.
Mặc dù hi u suất của ph n ứng t o ether theo phương pháp Ullmann
tương đ i cao nhưng do thời gian nghiên cứu h n hẹp và nguyên li u
đắt tiền là iod l i được dùng ngay t ph n ứng đầu tiên của quy trình
nên vi c áp dụng để triển khai s n xuất trong thời điểm này là chưa

thích hợp.
Ph

ng pháp qua hợp ch t nitro c a tác gi J. R. Chalmers và P.

Bracco: Chúng tôi thực hi n các ph n ứng trên cơ sở kết hợp phương
pháp của J. R. Chalmers và P. Bracco. Tuy quy trình có s bước ph n
ứng nhiều nhất nhưng các ph n ứng không quá khó thực hi n, đặc
bi t đến ph n ứng cu i mới dùng iod là nguyên li u đắt tiền và hi u
suất tính t ph n ứng có dùng iod cao nhất. Phương pháp được lựa
chọn để triển khai tổng hợp levothyroxin mononatri và liothyronin
mononatri.
Về phản ứng “chìa khóa”- tạo ether của quy trình: Ph n ứng được
kh o sát với 2 phương pháp: phương pháp của J. R. Chalmers và
phương pháp của P. Bracco. Phương pháp của P. Bracco cho hi u
suất cao hơn phương pháp của J. R. Chalmers, vi c thu s n phẩm
18

Footer Page 22 of 148.


Header Page 23 of 148.
không ph i qua giai đo n chiết với dung môi dicloromethan, thích
hợp khi triển khai ở quy mô lớn hơn. Tuy nhiên, c hai quy trình đều
ph i lưu ý giai đo n cất lo i pyridin.
Cơ chế ph n ứng:
OH
O2 N

N O2

O Ts
T sC l

O2 N

N O2

O CH 3

+
N
H

R
N

26

Cl
R
tosylat ester

N
H3 C O

N
H

27

O-

+ H3 C O

4 -me thoxyphe nol

- OT s

N O2

R

OH

+

O
O2 N

N u-

R = - CH 2- CH (N HAc)C OO E t

Hình 4.3. Cơ chế ph n ứng t o cấu trúc diaryl ether trong phương
pháp của J. R. Chalmers và P. Bracco
Cơ chế ph n ứng cho thấy điểm mấu ch t nh hưởng đến hi u suất
ph n ứng này là tỉ l mol giữa 4-methoxyphenol và hợp chất dinitro
26, cách thêm 4-methoxyphenol và dung môi. Vi c hòa tan 4methoxyphenol trong pyridin t o nucleophile 4-MeO-C6H4O- sau đó
nh t t vào kh i ph n ứng, thúc đẩy ph n ứng x y ra nhanh hơn,

tăng đáng kể hi u suất, gi m lượng 4-methoxyphenol s dụng.
Phương pháp của P. Bracco không chỉ làm tăng hi u suất của ph n
ứng mà vi c tách và tinh chế chế s n phẩm của ph n ứng cũng được
đơn gi n hóa so với phương pháp của J. R. Chalmers. Vi c tiến hành
ph n ứng một giai đo n trong pyridin cho thấy quy trình thích hợp để
triển khai quy trình ở quy mô lớn hơn.

19

Footer Page 23 of 148.


Header Page 24 of 148.
Ph

ng pháp qua muối iodoni c a G. Hillmann: Tổng hợp 6 theo

con đường qua mu i iodoni qua 5 giai đo n. Hi u suất 3 ph n ứng
đầu tiên tương đ i cao, hi u suất toàn chặng 33,3% (không tính hi u
suất ph n ứng tổng hợp mu i iodoni). Riêng ph n ứng tổng hợp mu i
iodoni, dùng đến các nguyên li u natri iodat và kali iodid đắt tiền,
nhưng cho hi u suất rất thấp (12,3%). Hơn nữa, s n phẩm khó tinh
chế và d gây nổ. Do vậy khó làm ph n ứng với cỡ mẻ lớn hơn. Một
s kh o sát thay đổi tỉ l natri iodat và anhydrid acetic nhưng không
tăng được hi u suất ph n ứng.
4.1.2. Về quá trình tổng hợp levothyroxin và liothyronin từ 3,5diiodo-L-thyronin
Vi c định hướng s n phẩm của ph n ứng iodo hóa 3,5-diiodo-Lthyronin (6 hoặc T2) để được levothyroxin hay liothyronin khác nhau
ở tỷ l mol I2/3,5-diiodo-L-thyronin, t c độ tiến hành ph n ứng iodo
hóa và nhi t độ của ph n ứng. Với tỷ l mol I2/3,5-diiodo-L-thyronin
= 1/1 thì quá trình iodo hóa chủ yếu x y ra ở 1 vị trí ortho- so với

nhóm OH phenol của 3,5-diiodo-L-thyronin. Với tỷ l mol I2/3,5diiodo-L-thyronin ≥ 2 sẽ t o levothyroxin. Để h n chế sự t o thành
levothyroxin trong ph n ứng tổng hợp liothyronin, cần lưu ý dùng
đúng tỉ l mol I2/3,5-diiodo-L-thyronin và h n chế t c độ ph n.
4.1.3. Phương pháp tạo muối mononatri c a levothyroxin và
liothyronin
Phương pháp t o mu i mononatri của levothyroxin (T4) và
liothyronin (T3) thông qua mu i dinatri về b n chất là để tinh chế T4
và T3. Qua tổng quan tài li u, chúng tôi nhận thấy để t o mu i
mononatri tất c các tác gi đều dùng Na2CO3 bão hòa.
20

Footer Page 24 of 148.


Header Page 25 of 148.
Trước tiên chúng tôi cũng áp dụng phương pháp t o mu i mononatri
bằng cách cho d ng acid của T4 và T3 ph n ứng với Na2CO3 bão hòa
theo các tài li u tham kh o được. Xét theo lý thuyết các giá trị pKa
thì Na2CO3 ph n ứng được với c hai nhóm COOH và OH của T4 và
T3. Có thể gi i thích quá trình t o mu i mononatri đã x y ra theo thứ
tự như sau: Khi cho Na2CO3 bão hòa ph n ứng với T4 và T3 thì nhóm
có COOH có tính acid m nh hơn nhóm OH phenol sẽ ph n ứng trước
và sinh ra NaHCO3. Khi đó trong dung dịch tồn t i c 2 d ng mu i là
NaHCO3 (mới được t o ra) và Na2CO3 (còn dư). NaHCO3 chỉ ph n
ứng với nhóm COOH của T4 và T3 t o ra d ng mu i mononatri còn
Na2CO3 có kh năng ph n ứng tiếp với nhóm OH phenol để t o ra
mu i dinatri. Vì vậy, s n phẩm của ph n ứng có thể có c mu i
mononatri và mu i dinatri của T4 và T3. Nhưng khi chỉnh pH của
kh i ph n ứng về 9-10 ~ pKa2(acid carbonic) (= 10) thì d ng mu i dinatri
chuyển hết về mu i mononatri:

X

O

HO

I

I

O

OH

pH < 8
X

O

NaO

I

I

O

N H2
I

ON a
N H2
I

X

O

HO

I

I

O

ON a

p H 9 -1 1

pH > 1 1

N H2
I

M u ối d i n a tr i

M u ối m o no n a tr i
X = I : L e v ot h y ro x in
X = H : L io th y ro n in

T phân tích trên, về mặt lý thuyết cho thấy có thể dùng NaHCO3
thay cho Na2CO3 để t o mu i mononatri mà không cần dùng acid
điều chỉnh về pH của hỗn hợp ph n ứng về 9-10. Do đó, chúng tôi đã
21

Footer Page 25 of 148.