Nghiên cứu xây dựng quy trình tổng hợp cyclophosphamide làm thuốc điều trị ung thư

viện hoá học
viện khoa học và công nghệ việt nam
18 Đờng Hoàng Quốc Việt - Cầu Giấy - Hà Nội



Báo cáo tổng kết khoa học kỹ thuật
đề tài:
"nghiên cứu xây dựng quy trình
tổng hợp cyclophosphamide làm
thuốc điều trị ung th"

GS. TSKH. Trần Văn Sung









6500
10/9/2007

Hà Nội, 4 - 2006

Bản quyền 2006 thuộc VHH - VAST
Đơn xin sao chép toàn bộ hoặc từng phần tài liệu này phải gửi đến Viện
trởng VHH - VAST trừ trờng hợp sử dụng cho mục đích nghiên cứu

.

viện hoá học
viện khoa học và công nghệ việt nam
18 Đờng Hoàng Quốc Việt - Cầu Giấy - Hà Nội



Báo cáo tổng kết khoa học kỹ thuật
đề tài:
"nghiên cứu xây dựng quy trình
tổng hợp cyclophosphamide làm
thuốc điều trị ung th"

GS. TSKH. Trần Văn Sung











Hà Nội, 4 - 2006


Bản thảo viết xong 1/ 2006.

Tài liệu này đợc chuẩn bị trên cơ sở kết quả thực hiện Đề tài cấp Nhà nớc,
mã số KC 10. 25



Danh sách cán bộ tham giathực hiện đề tài




Họ và tên Cơ quan công tác
Chủ nhiệm đề tài
1. GS.TSKH. Trần Văn Sung Viện Hoá học, Viện KH và CNVN
Cán bộ tham gia nghiên cứu
1. PGS. TS. Nguyễn Hữu Định Khoa Hoá
Trờng ĐHKHTN, ĐHQG Hà Nội
2. ThS. Nguyễn Việt Thắng nt
3. ThS. Trần Văn Lộc Viện Hoá học, Viện KH và CNVN
4. ThS. Trần Văn Chiến nt
5. ThS. Trần Đức Quân nt
6. CN. Phạm Thị Ninh nt
7. TS. Trịnh Thị Thuỷ nt
8. TS. Nguyễn Thị Hoàng Anh nt
9. TS. Nguyễn Thanh Đạm Bệnh Viện K Hà Nội
10. ThS. Nguyễn Tuyết Mai nt
11. DS. Lê Tiến Dũng XN Dợc phẩm TW I
12. TS. Phùng Thị Vinh Viện Kiểm nghiệm
Mục lục

Tr

1.
Bài tóm tắt
1
2. Phần chính báo cáo
3
2.1. Phần tổng quan
3
2.1.1. Cyclophosphamide
3
2.1.1.1. Cơ chế tác dụng của cyclophosphamide
3
2.1.1.2. Tổng hợp cyclophosphamide
5
2.1.1.3.
Tiêu chuẩn của cyclophosphamide đợc mô tả trong các Dợc
điển
9
2.1.1.4.
Tình hình nghiên cứu, sử dụng cyclophosphamide tại Việt
Nam
11
2.1.1.5.
Các dạng sản phẩm chính của cyclophosphamide và nhu cầu
về thuốc cyclophosphamide
13
2.1.2. Trích dẫn nội dung thuyết minh của Đề tài
14
2.2. Các kết quả nghiên cứu của Đề tài
19
2.2.1. Nghiên cứu quy trình tổng hợp cyclophosphamide

19
Quy trình tinh chế sản phẩm cyclophosphamide
28
2.2.2.
Nghiên cứu khẳng định cấu trúc hoá học của sản phẩm
cyclophosphamide tổng hợp đợc
29
2.2.3.
Kiểm nghiệm sản phẩm cyclophosphamide theo tiêu chuẩn
Dợc điển Anh, BP 2001
32
2.2.4.
Nghiên cứu độc tính cấp và bán cấp của sản phẩm
cyclophosphamide
33
2.2.5. Nghiên cứu bào chế thuốc cyclophosphamide pha tiêm
36
2.2.6.
Nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng thuốc cyclophosphamide pha
tiêm
39
2.2.6.1. Đề cơng nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng
39
2.2.6.2. Kết quả nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng
42
2.2.7. Nghiên cứu độ bền của cyclophosphamide
48
2.2.7.1. Nghiên cứu độ bền của nguyên liệu cyclophosphamide
48
2.2.7.2.

Nghiên cứu độ bền của cyclophosphamide ở trong dung dịch
nớc
49
2.2.8. Các kết quả khác
50
3. Kết luận và kiến nghị
51
Báo cáo quyết toán tài chính

Lời cảm ơn

Tài liệu tham khảo
55



1
1. Bài tóm tắt
1.1. Đặt vấn đề
Hiện nay Việt Nam vẫn phải nhập khẩu một lợng lớn thuốc
cyclophosphamide để điều trị ung th và một số bệnh khác có nguyên nhân
tự miễn. Theo dự tính, hàng năm số tiền để nhập khẩu cyclophosphamide
riêng cho nhu cầu chữa bệnh ung th là khoảng 26 tỉ đồng. Đề tài "Nghiên
cứu xây dựng quy trình tổng hợp cyclophosphamide làm thuốc điều trị ung
th" có mã số KC 10.25 đặt ra các mục đích sau đây:
Nghiên cứu xây dựng quy trình tổng hợp cyclophosphamide có tính khả thi,
và tính kinh tế cao.
Nghiên cứu độc tính cấp và bán cấp của cyclophosphamide; Kiểm nghiệm
cyclophosphamide theo tiêu chuẩn Dợc điển Anh BP 2001.
Nghiên cứu bào chế thuốc cyclophosphamide pha tiêm trên dây chuyền

GMP. Thuốc bào chế xong phải đạt tiêu chuẩn thuốc tiêm của Dợc điển Anh
BP 2001.
Nghiên cứu đánh giá lâm sàng giai đoạn I thuốc cyclophosphamide tổng hợp
đợc trên bệnh nhân ung th.
1.2. Nguyên liệu và phơng pháp nghiên cứu:
1.2.1. Nguyên liệu:
Các hoá chất đợc sử dụng có độ tinh khiết P. A. của hãng Merck, CHLB
Đức.
1.2.2. Phơng pháp nghiên cứu:
Các phơng pháp dùng để phân tích cấu trúc của cyclophosphamide tổng hợp
đợc là hiện đại và phù hợp nh phổ MS, LC/MS, IR và NMR (
1
H -,
13
C -
NMR) đợc thực hiện tại Viện Hoá học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt
Nam.
Các phơng pháp tổng hợp đợc dựa theo patent của Đức, Liên minh Châu
Âu, Mỹ có kết hợp với các tài liệu tham khảo khác, đợc thực hiện tại trờng
ĐHKHTN - ĐHQG Hà Nội và Viện Hoá học, Viện KH và CNVN.
2
Các phơng pháp nghiên cứu về y dợc đợc sử dụng là những phơng pháp
quy chuẩn của Bộ Y tế, đợc thực hiện tại các cơ quan khoa học do Bộ Y tế
chỉ định nh Viện Kiểm nghiệm, xí nghiệp Dợc phẩm TW I và bệnh viện K
Hà Nội.
1.3. Các kết quả đã đạt đợc:
Đã tiến hành nghiên cứu và đề ra đợc quy trình khả thi có hiệu quả kinh tế
và ứng dụng quy trình này để tổng hợp 4250 gam cyclophosphamide.
Đã đa ra đợc bộ phổ chuẩn của cyclophosphamide tổng hợp đợc gồm: IR,
MS, LC/ MS,

1
H -,
13
C - NMR.
Sản phẩm cyclophosphamide tổng hợp ra đã đợc nghiên cứu độc tính cấp và
độc tính bán cấp, đợc phân tích, kiểm nghiệm theo tiêu chuẩn Dợc điển
Anh BP 2001. Tất cả các tiêu chí đều đạt.
Cyclophosphamide đã đợc bào chế thành thuốc bột pha tiêm trên dây
chuyền GMP của xí nghiệp Dợc phẩm TW I. Thuốc và nớc cất pha tiêm
đạt tiêu chuẩn BP 2001.
Thuốc cyclophosphamide đã đợc nghiên cứu lâm sàng giai đoạn I đối với
bệnh nhân ung th tình nguyện tại bệnh viện K Hà Nội.
Kết quả: Với liều 750 mg/ m
2
da cơ thể các bệnh nhân đều có đáp ứng một
phần. Liều 750 mg/ m
2
da cơ thể là liều sử dụng an toàn.
1.4. Kết luận và kiến nghị
Đề tài đã hoàn thành tốt các mục tiêu đã đề ra và theo đúng tiến độ.
Thanh quyết toán tài chính theo đúng dự toán và quy định của nhà nớc.
Đề nghị Bộ Khoa học và Công nghệ xem xét phê duyệt giai đoạn tiếp theo
của Đề tài để nghiên cứu lâm sàng giai đoạn II và III nhằm đánh giá hiệu
quả chống ung th của thuốc và đa ra sản xuất, đáp ứng nhu cầu trong nớc,
thay thế thuốc nhập khẩu.
3
2. Phần chính báo cáo
2.1. Phần tổng quan
2.1.1. Cyclophosphamide
Cyclophosphamide có tên khoa học là (RS)-2-[bis(2-chloroethyl) amino]

tetrahydro-2H-1,3,2-oxazo phosphorine 2-oxide hoặc N,N-bis-[2-chloroethyl] N,O-
trimethylendiamidophosphat (I); công thức tổng là C
7
H
15
Cl
2
N
2
O
2
P. H
2
O, khối lợng
phân tử là 279,1.
Công thức cấu tạo là:
HN
P
O
O
N
H
2
C
H
2
C
Cl
Cl
. H

2
O

I
Tinh thể cyclophosphamide có màu trắng hoặc gần trắng, tan trong nớc, rất
dễ tan trong cồn, tan vừa phải trong ete.
2.1.1.1. Cơ chế tác dụng của cyclophosphamide
Cyclophosphamide đợc sử dụng nhiều trong lâm sàng với một phổ tác dụng
rộng và hiệu quả đối với các bệnh ung th ở ngời. Ngoài lý do về tác dụng điều trị,
cyclophosphamide còn có cơ chế tác dụng rất độc đáo và tính chọn lọc trong điều
trị.
Hiện nay cyclophosphamide là loại thuốc chống ung th đợc sử dụng nhiều
nhất trong điều trị hoá chất liều cao với tổng liều lợng dùng là 500 -700mg/m
2
da
ngời trong 1 đến 4 ngày. Là một loại hoạt chất dễ mất nitơ, cyclophosphamide
đóng vai trò ankyl hoá ADN làm cho ADN không tháo rời đợc, do vậy không tạo
thành ARN do đó dẫn tới việc tái sản xuất tế bào bị kìm hãm, trớc hết là đối với
4
các hệ tế bào phát triển nhanh nh các tuyến tiết, da, tuỷ xơng và đặc biệt là các u
ác tính [1,2].
Các hợp chất có tính ankyl hoá sẽ tấn công vào quá trình trao đổi chất của a
xít nucleic và kìm hãm sự phát triển hoặc tiêu diệt những tế bào bị bệnh. Tuy nhiên,
chúng cũng tấn công cả tế bào lành và ở liều hiệu dụng chúng cũng có độc tính đáng
kể.
Theo tác giả Charlotte le Roux và cộng sự thì cơ chế alkyl hoá của
cyclophosphamide đợc lý giải nh sau [6]:
NH
P
O

O
N
CH
2
CH
2
Cl
Cl
-H
+
+H
+
H
2
N
P
O
O
N
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
Cl
Cl
- Cl

-
H
2
N
P
O
O
N
CH
2
CH
2
Cl
H
2
N
P
HO
O
N
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
Cl
Cl

H
2
N
P
O
O
N
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
Nu
Nu
H
2
N
P
O
O
N
CH
2
CH
2
Nu
+ Nu

-
+ Nu
-
H
2
N
P
O
O
N
CH
2
CH
2
Cl
CH
2
CH
2
Nu
- Cl
-
Cyclophosphamide (I)
(A)
(B)

Trong cơ thể cyclophosphamide giải phóng ra chất phosphoramidat
(A) một
tác nhân alkyl hoá có hoạt tính sinh học. Hoạt tính sinh học của chất
(

A
) đợc giải
thích qua dãy phản ứng bao gồm: đóng vòng nội phân tử; mở vòng nucleophil. Quá
trình này lặp lại hai lần dẫn đến sản phẩm cuối cùng đợc alkyl hoá hai lần
(
B
).
Tuy nhiên, cơ chế chính xác của quá trình alkyl hoá của chất
(
A
) vẫn là vấn
đề còn ít đợc biết. Các bớc theo trình tự trên bao gồm các chất azinidin trung gian
đã đợc minh chứng bằng các thí nghiệm đơtêrô hoá. Nhng liệu chất
(
A
) sẽ tham
gia phản ứng alkyl hoá nguyên vẹn hay liên kết P-N sẽ bị cắt trớc khi alkyl hoá thì
hiện vẫn còn tranh cãi [6].
Theo nguyên lý về ''dạng vận chuyển" (transport) và '' dạng hoạt tính '' (active
form) của một biệt dợc đối với các chất có tác dụng ankyl hoá thì một hoạt chất
cần đợc đa vào cơ thể ở ''dạng vận chuyển'' tức là ở dạng cha có hoạt tính. Dạng
này sẽ chuyển thành ''dạng hoạt tính'' trong cơ thể và nếu có thể thì ngay tại vị trí
5
cần điều trị có nghĩa là làm tăng độ chọn lọc của thuốc. Ví dụ: Đối với các chất dễ
bị loại nitơ thì hợp chất chứa nhóm oxit nitơ (NO) là một '' dạng vận chuyển''
thực thụ. Nguyên lý này đã đợc áp dụng với loại thuốc chữa ung th tiền liệt tuyến
là stilbeoestroldiphosphate.
Nh đã biết thì trong cơ thể ngời bệnh, tại bộ phận bị ung th có tồn tại một
enzym dạng phosphamidasa và phosphatasa có thể thuỷ phân đợc liên kết
phosphamide và este của axit phosphoric.

Với ý tởng là: độ chọn lọc của thuốc sẽ tăng đáng kể, nếu ''dạng hoạt tính''
đợc tạo thành trực tiếp tại vị trí cần điều trị, ngời ta đã tổng hợp ra chất
phosphamide este II để nghiên cứu động dợc học của cyclophosphamide.
NP
NH
O
O
R
2
R
1
H
2
C
H
2
CCl
Cl

II
2.1.1.2. Tổng hợp cyclophosphamide
Cyclophosphamide đã đợc Arnold, Bourseaux và Hirsch [3,4] tìm ra lần đầu
tiên năm 1956 trong phòng nghiên cứu của nhà máy Asta với ký hiệu là B518. Việc
tổng hợp ra chất này là kết quả của sự mong muốn áp dụng nguyên lý ''dạng vận
chuyển" và '' dạng hoạt tính ''. Cyclophosphamide đợc sử dụng trong điều trị ung
th từ năm 1958 hoặc 1970 [1]. Ngoài ra, cyclophosphamide còn đợc sử dụng nh
một chất ức chế miễn dịch để điều trị các bệnh tự miễn nh nhợc cơ, thấp khớp,
lupút ban đỏ và đặc biệt để chống thải ghép trong các ca ghép tạng [19, 24, 25].
Arnold, Bourseaux và Brock [7] đã nghiên cứu mối quan hệ giữa cấu trúc và
hoạt tính kháng ung th của hợp chất này. Kết quả thu đợc ở chất

cyclophosphamide là rất khả quan về mặt dợc lý và lâm sàng [4].
Cơ chế biến đổi của cyclophosphamide trong cơ thể đã đợc C.L. Roux và
cộng sự tiếp tục nghiên cứu [6].
6
Một dẫn xuất khác của cyclophosphamide có nhóm thế ở mạch vòng cũng đã
đợc tổng hợp để nghiên cứu hoạt tính chống ung th [7, 8, 25].
Cyclophosphamide còn đợc sử dụng làm độc tố cho sơn chống hà dùng cho
các tàu biển [9].
Trong những năm gần đây, tính chất dợc lý của cyclophosphamide vẫn còn
đợc tiếp tục nghiên cứu [10,11,12].
Kể từ khi tìm ra cyclophosphamide vào năm 1956 và bản quyền sáng chế
(patent) đầu tiên đợc chấp nhận vào năm 1957 [26] cho đến nay vẫn luôn có các
bản quyền sáng chế mới về tổng hợp cyclophosphamide đợc đăng ký. Bản quyền
sáng chế gần đây nhất mà chúng tôi có đợc là của Ulf Niemeyer và cộng sự vào
cuối năm 2001 [28]. Nhìn chung các patent về tổng hợp cyclophosphamide đều dựa
theo sơ đồ nh sau:
Y
+
N
OH
R
4
R
3
Y
+
POCl
3
Triethylamin

dung môi
N
P
O
R
3
O
N
R
1
R
2
HN
R
1
R
2
12
3

với R
1
và R
2
là chloroethyl, R
3
và R
4
là H. Ngời ta thờng áp dụng giải pháp kỹ
thuật tiên tiến đợc gọi là "phản ứng hai bớc trong cùng một nồi phản ứng" (two-

stage one-pot reaction). Lợi thế của giải pháp kỹ thuật này là:
Hiệu suất tổng của phản ứng cao
Không phải tách sản phẩm trung gian
Chi phí cho thiết bị phản ứng thấp
Giảm thời gian sản xuất
Tiêu thụ ít nguyên liệu đầu
Không phải chạy sắc ký hoặc các bớc tinh chế khác
Giảm lợng chất thải gây độc hại tới môi trờng
Để thực hiện kỹ thuật này, ngời ta cho phosphoryl halogenid và hai chất
amin là bis 2- chloroethyl amin và n- propylamin- 3- ol tác dụng với nhau trong một
dung môi hữu cơ trơ với một chất kiềm hỗ trợ, tránh sự có mặt của nớc và alcol,
7
không cần tách các sản phẩm trung gian. Các tác nhân đợc cho lần lợt vào bình
phản ứng.
Điều đặc biệt quan trọng ở đây là hạn chế tối đa ảnh hởng của nớc hoặc
hơi ẩm đối với các tác nhân, đặc biệt là POCl
3
. Nếu có mặt nớc trong môi trờng
phản ứng thì sẽ có nhiều sản phẩm phụ và hiệu suất thu đợc cyclophosphamide bị
giảm nhanh chóng. Và nh vậy sản phẩm chỉ kết tinh đợc sau khi phải có thêm
bớc tinh chế ví dụ chạy sắc ký cột. Những quy trình tổng hợp cyclophosphamide
trớc năm 2001 cha đánh giá đợc hết mức độ ảnh hởng của nớc đối với phản
ứng này.
Ngoài nớc ra, thì các alcol cũng không đợc có mặt trong môi trờng phản
ứng. Ngời ta đã chứng minh đợc rằng: sự có mặt lợng vết methanol hoặc ethanol
trong dung môi sẽ tạo ra nhiều phản ứng phụ và làm giảm hiệu suất.
Phản ứng đợc thực hiện trong một dung môi hoặc một hỗn hợp dung môi
hữu cơ trơ. Có thể sử dụng các dung môi nh: dichlorometan, 1,2- dichloroetan,
chloroform, dioxan, acetonitril, tetrahydrofuran và toluen.
Nồng độ của hỗn hợp phản ứng, tức là tỷ lệ giữa các chất 1, 2, 3, với thể tích

dung môi có thể dao động từ 0,1 đến 6 mol/ lit.
Các amin 1 và 2 đợc sử dụng theo tỷ lệ mol tơng đơng nhau. Nếu amin 2
ít hơn amin 1 5% hoặc nhiều hơn 20% cũng không có vấn đề gì.
Chất kiềm hỗ trợ (để kéo axit ra khỏi hỗn hợp phản ứng) có thể là
triethylamin, pyridin, hoặc natri cacbonat. Nhìn chung, tỷ lệ mol giữa các amin với
chất kiềm là tơng đơng nhau.
Ví dụ: Nếu amin 2 (n- propylamin- 3- ol) tham gia phản ứng ở dạng muối thì
cần hai đơng lợng chất kiềm hỗ trợ, còn nếu nó ở dạng kiềm tự do thì chỉ cần một
đơng lợng chất kiềm hỗ trợ là đủ.
Phản ứng ngng tụ của POCl
3
với amin là phản ứng toả nhiệt. Để kiểm soát
đợc nhiệt độ phản ứng ta phải cho các tác nhân vào từ từ và phải làm lạnh hỗn hợp
8
phản ứng. Có nhiều cách khác nhau khi cho các tác nhân vào bình phản ứng đợc
mô tả trong các bản quyền sáng chế.
Ví dụ: Có thể nhỏ giọt từ từ POCl
3
vào một amin ở dạng kiềm tự do; hoặc
chất kiềm hỗ trợ nh triethylamin đợc cho từ từ vào hỗn hợp gồm POCl
3
và một
amin ở dạng muối. ở giai đoạn đầu của phản ứng nhiệt độ nhìn chung đợc giữ
trong khoảng từ - 40
o
C đến 20
o
C, trong nhiều trờng hợp ngời ta giữ phản ứng ở
nhiệt độ giữa - 20
o

C đến 10
o
C. Nhiệt độ có thể tăng tới 100
o
C sau khi đã phản
ứng đợc một nửa, hoặc tăng đến nhiệt độ sôi của dung môi nếu cần thiết bằng cách
đun nóng.
Trong một trờng hợp khác ngời ta cũng có thể tiến hành nh sau:
Bớc một: Cho chất bis- 2- chloroethylamin vào bình, sau đó cho từ từ
n- propylamin- 3- ol cùng với chất kiềm hỗ trợ (ví dụ: triethylamin) vào bình.
Chất n- propylamin- 3- ol có thể đa vào bình phản ứng ở dạng muối và trong
dung môi; chất bis- 2- chloroethylamin và kiềm hỗ trợ sẽ lần lợt đợc đa từ
từ vào bình, hoặc cũng có thể đợc cho chảy cùng một lúc vào bình từ hai
ngả sao cho chất kiềm hỗ trợ luôn luôn d so với bis- 2- chloroethylamin.
Bớc hai: POCl
3
có thể đợc cho từ từ cùng với chất kiềm hỗ trợ vào
hỗn hợp phản ứng của bớc một, hoặc ngợc lại, hỗn hợp của bớc một đợc
cho từ từ vào dung dịch POCl
3
và chất kiềm hỗ trợ.
Nhằm giảm thiểu tối đa lợng nớc trong hỗn hợp phản ứng thì tất cả các hoá
chất và thiết bị phản ứng đều phải khô tuyệt đối.
Ví dụ: phải sấy nóng thiết bị phản ứng để loại hơi nớc, làm khan dung môi
và các tác nhân trớc lúc phản ứng. POCl
3
phải cất lại trong điều kiện khô trớc khi
dùng. Hàm lợng nớc trớc lúc phản ứng không đợc vợt quá 0,5%, tốt hơn cả là
trong khoảng từ 0,001% đến 0,1%.
Các sản phẩm phụ sẽ đợc hạn chế nếu hỗn hợp phản ứng đợc xử lý với các

chất phụ gia trớc khi phản ứng. Các chất phụ gia này có thể là: Rây phân tử; oxit
nhôm ở các dạng khác nhau, chlorua canxi (dạng khan hoặc ngậm nớc), P
2
O
5
và
9
MgCl
2
. Lợng chất phụ gia nhìn chung dao động trong khoảng 5 đến 150 gam/ mol
chất bis- 2- chlor ethylamin. Hỗn hợp phản ứng có thể ở dạng dung dịch hoặc huyền
phù và thờng đợc khuấy từ
2
1
cho đến 3 giờ trớc lúc phản ứng ngng tụ đợc
bắt đầu bằng việc cho thêm chất kiềm hỗ trợ hoặc POCl
3
vào bình.
Sau khi phân tử chlor thứ nhất hoặc thứ hai của POCl
3
đã phản ứng, ngời ta
có thể lọc tách muối tạo thành hoặc rửa hỗn hợp phản ứng, sau đó cho phản ứng tiếp
tục bằng cách bổ sung thêm amin và chất kiềm hỗ trợ.
Xử lý hỗn hợp phản ứng sau khi phản ứng kết thúc đợc bắt đầu bằng việc
lọc tách muối, hoặc/ và rửa với nớc ở các độ pH khác nhau. Cần chú ý tránh sự
thuỷ phân hoặc tan vào nớc của sản phẩm bằng cách cho thời gian tiếp xúc với pha
nớc ngắn và làm lạnh hỗn hợp.
Có thể xử lý hỗn hợp phản ứng theo phơng pháp khan, nghĩa là trung hoà
hỗn hợp phản ứng bằng khí HCl cho tới pH = 4 - 6. Ngoài ra, sử dụng các axit yếu
nh axit acetic, axit oxalic cũng đem lại kết quả.

2.1.1.3. Tiêu chuẩn của cyclophosphamide đợc mô tả trong các Dợc điển
Trong Dợc điển Việt Nam, lần xuất bản thứ 3, Nhà xuất bản Y học,
năm 2002 chúng tôi không thấy có cyclophosphamide.
Trong Dợc điển Anh BP 2001 trang 510, những tiêu chuẩn chính của
cyclophosphamide đợc mô tả nh sau:
Cyclophosphamide có hàm lợng không dới 98,0% và không quá
đơng lợng của 102,0% (RS)- 2- [bis (2- chloroethyl) amino]
tetrahydro- 2H- 1, 3, 2- oxaphosphorin- 2- oxit tính theo chất khan.
Là bột tinh thể màu trắng hoặc gần trắng, tan trong nớc, tan hoàn
toàn trong cồn, tan ít trong ete.
Điểm nóng chảy 51
o
C. Chênh lệch điểm nóng chảy không đợc quá 2
o
C.
10
pH: Dung dịch của 0,50 gam cyclophosphamide trong 25 ml nớc đã
khử CO
2
sẽ có pH từ 4,0 đến 6,0, đo ngay sau khi pha.
Cl
-
(chlorid): Hoà tan 0,15 gam cyclophosphamide trong 15 ml nớc
đã khử CO
2
. Hàm lợng ion Cl
-
của dung dịch vừa pha chế không đợc
vợt quá 330 ppm.
PO

4
3-
(phosphat): Hoà tan 0,10 gam cyclophosphamide trong 100 ml
nớc đã khử CO
2
. Hàm lợng ion phosphat của dung dịch không đợc
vợt quá 100 ppm.
Kim loại nặng: Không đợc quá 20 ppm tính theo chì.
Nớc: Từ 6,0 đến 7,0% xác định với lợng 0,300 gam
cyclophosphamide theo phơng pháp bán vi lợng.
Dợc điển châu Âu (EP 1997) trang 697: cũng đa ra các phơng
pháp xác định và các tiêu chuẩn của cyclophosphamide tơng tự nh
Dợc điển Anh BP 2001.
Dợc điển Mỹ (USP 25) trang 491 năm 2002:
Cyclophosphamide có hàm lợng không dới 97,0% và không nhiều
quá 103,0% tính theo sản phẩm khan.
Lu ý: Rất thận trọng khi làm việc với cyclophosphamide vì đó là chất
gây độc tế bào mạnh.
Đóng gói và bảo quản: Bảo quản trong thùng kín, ở nhiệt độ trong
khoảng từ 2
o
C đến 30
o
C.
pH: nằm giữa 3,9 và 7,1 trong một dung dịch (1 trong 100), đo 30' sau
khi pha.
Nớc: Từ 5,7 đến 6,8%.
11
Kim loại nặng: Hoà tan 1,0 gam cyclophosphamide trong 25 ml nớc,
nếu cần thiết thì lọc lại dung dịch. Hàm lợng kim loại nặng không

đợc vợt quá 0,002%.
Dợc điển Nhật Bản JP XIII trang 314:
Cyclophosphamide có hàm lợng không dới 97,0%
Tinh thể trắng hoặc bột tinh thể.
Tan rất tốt trong axit acetic băng, tan hoàn toàn trong cồn, trong
anhydrit acetic và trong CHCl
3
, tan trong nớc và ete.
Điểm nóng chảy 45
o
C - 53
o
C.
Màu sắc dung dịch: Hoà tan 0,20 gam cyclophosphamide trong 10 ml
nớc, dung dịch phải trong suốt và không màu.
Cl
-
: Kiểm tra với dung dịch của 0,40 gam cyclophosphamide ở nhiệt
độ không quá 20
o
C. Dung dịch chuẩn là: 0,40 ml 0,01 mol/ lit axit
HCl. Hàm lợng ion Cl
-
không quá 0,036%.
Kim loại nặng: Kiểm tra với 1,0 gam cyclophosphamide. Dung dịch so
sánh đợc pha với 2,0 ml dung dịch chì tiêu chuẩn. Hàm lợng kim
loại nặng không quá 20 ppm.
Nớc: Từ 5,7 đến 7,0% (0,5 gam, chuẩn độ trực tiếp).
Đóng thùng và bảo quản: Thùng kín, bảo quản ở dới 30
o

C.
2.1.1.4. Tình hình nghiên cứu, sử dụng cyclophosphamide tại Việt Nam
Khoa Hoá học trờng Đại học Tổng hợp Hà Nội đã tiến hành nghiên cứu các
phơng pháp điều chế và cơ chế tác dụng của các hợp chất cơ phốt pho nhằm phục
vụ nông nghiệp và y tế [13-15].
Cyclophosphamide đã qua bớc nghiên cứu cơ bản trong đề tài ''Tổng hợp
một số hợp chất cơ kim có hoạt tính sinh lý mạnh'' cấp Bộ Đại học, Trung học
12
chuyên nghiệp, mã số 149/QĐ ngày 01/3/1972, nghiệm thu ngày 30/10/1975 và đề
tài cấp nhà nớc '' Tổng hợp các chất chống virus'' mã số 510801, Hà Nội 2002.
Hiện nay cyclophosphamide đã và đang đợc sử dụng trong chơng trình đa
hoặc đơn hoá trị liệu để chữa các chứng bệnh sau:
Các bệnh bạch cầu: Bệnh bạch cầu dạng lymphô bào và dòng tuỷ bào cấp
hay mãn.
U hạch ác tính: Bệnh Hodgkin, ung th hạch không Hodgkin, u tơng bào.
U tạng đặc ác tính có di căn và không di căn: Ung th buồng trứng, ung th
cổ tử cung, nội mạc tử cung, ung th tinh hoàn, ung th vú, ung th phổi tế
bào nhỏ, u nguyên bào thần kinh, u nguyên bào võng mạc, sarcoma Ewing.
Các bệnh tự miễn tiến triển: Viêm khớp dạng thấp, bệnh khớp do vẩy nến,
lupus ban đỏ hệ thống, sơ cứng bì, viêm mạch máu hệ thống (kèm hội
chứng thận h), một số thể viêm cầu thận (kèm hội chứng thận h), bệnh
nhợc cơ nặng, thiếu máu tán huyết tự miễn, bệnh ngng kết tố lạnh.
Điều trị ức chế miễn dịch trong ghép tạng.
Cyclophosphamide có thể dùng đợc cả hai đờng uống hoặc tiêm. Sau khi
uống, thuốc đợc hấp thụ tới 75% qua đờng tiêu hoá, nó phân bố rộng rãi ở khắp
các mô và đi qua hàng rào máu não. Cyclophosphamide còn đi qua cả rau thai và
sữa mẹ.
Thời gian bán huỷ của cyclophosphamide là từ 4 đến 8 giờ. Thuốc đạt nồng
độ đỉnh trong huyết thanh trong vòng 1 giờ sau khi uống. Nó đợc thải trừ qua nớc
tiểu ở dạng không biến đổi dới 10% và dạng chuyển hoá từ 85- 90%.

Cyclophosphamide có thể gây ra các tác dụng phụ. Tuy nhiên các tác dụng
ngoại ý thờng phụ thuộc vào liều dùng và hầu hết các trờng hợp bị tác dụng phụ
đều có thể hồi phục đợc.
Các tác dụng phụ có thể có của cyclophosphamide:
+ Về huyết học: Giảm bạch cầu kèm theo nguy cơ bị nhiễm trùng; giảm tiểu
cầu kèm tăng nguy cơ xuất huyết; thiếu máu kèm giảm Hemoglobine (trên
2g/ 100ml so với giá trị ban đầu).
13
+ Về tiêu hoá: Buồn nôn và ói mửa
+ Đờng niệu sinh dục: Viêm bàng quang
+ Đối với gan: ít gặp
+ Rụng tóc
2.1.1.5. Các dạng sản phẩm chính của cyclophosphamide và nhu cầu về
thuốc cyclophosphamide
Trên thị trờng trong nớc và quốc tế hiện nay có các thơng phẩm chính
chứa hoạt chất cyclophosphamide nh sau:
Endoxan dạng viên bao và dạng bột pha tiêm của hãng Asta Medica [17],
Cytoxan dạng viên nén và bột pha tiêm của hãng Bristol - Myers Squibb.
Neosar dạng bột pha tiêm của hãng Pharmacia & Upjohn.
Theo thống kê của Bộ Y tế, hàng năm nớc ta có khoảng 150.000 ngời mới
mắc bệnh ung th cần đợc điều trị [16]. Số lợng bệnh nhân ngày càng tăng
do tỷ lệ sống kéo dài của những bệnh nhân ung th đã mắc từ 3 đến 5 năm.
Trong số đó khoảng 30% cần đợc điều trị tiếp ở giai đoạn cuối và giai đoạn
di căn.
Nh vậy, trong 1 năm có khoảng 50.000 bệnh nhân cần dùng
cyclophosphamide đơn độc hay phối hợp với các loại thuốc khác. Mỗi đợt điều trị
cần sử dụng 500mg/ m
2
da; trung bình cần 6 đợt điều trị cho một bệnh nhân. Diện
tích bề mặt da trung bình của ngời Việt Nam là 1,6m

2
.
Nh vậy:
+ Một đợt điều trị cần : 500mg/m
2
da x 1,6 m
2
= 800mg
+ Sáu đợt điều trị cần: 800mg/m
2
da x 6 = 4800mg
+ Số thuốc cần dùng cho Việt Nam trong 1 năm sẽ là: 4800mg x 50.000 ngời
= 240.000.000mg (240kg).
14
Giá thuốc hiện nay của Đức là: 45.000đ/ 200mg; của Hàn Quốc là:
22.000đ/ 200mg. Nh vậy nếu chỉ tính theo giá thuốc của Hàn Quốc thì số tiền Việt
Nam cần phải chi để mua thuốc đã là: 22.000đ x 240.000.000 : 200 =
26.400.000.000đ (hai mơi sáu tỷ bốn trăm triệu đồng).
Số liệu trên cho thấy, cần gấp rút tổ chức nghiên cứu sản xuất
cyclophosphamide trong nớc để điều trị ung th và các bệnh khác. Ngoài việc sử
dụng để điều trị ung th thì cyclophosphamide còn đợc dùng nhiều để điều trị các
bệnh khác nh chống thải ghép (dùng cho các ca ghép gan, thận, da, v.v ), các bệnh
thuộc về ức chế miễn dịch nh lupút ban đỏ, vẩy nến, viêm khớp thể nhẹ
Điều đặc biệt quan trọng nữa là: cyclophosphamide có thể đợc bào chế bằng
cách đóng viên nén dùng đờng uống giá rẻ, dễ bảo quản và vận chuyển để phục vụ
đồng bào vùng sâu, vùng xa, ngời nghèo bị mắc bệnh ung th và một số bệnh khác.
2.1.2. Trích dẫn nội dung thuyết minh của đề tài
Giới thiệu về chủ nhiệm đề tài và cơ quan quản lý đề tài:
Tên đề tài: "Nghiên cứu xây dựng quy trình tổng hợp
cyclophosphamide làm thuốc điều trị ung th"

M số: KC.10. 25
Thời gian thực hiện: 24 tháng (Từ 1/ 1/ 2004 đến 31/ 12 / 2005)
Cấp quản lý: Nhà nớc
Kinh phí: Tổng số: 2.900 triệu đồng
Trong đó, từ Ngân sách SNKH: 1.900 triệu đồng
Thuộc chơng trình: Khoa học và Công nghệ trọng điểm cấp nhà n
ớc giai đoạn
2001-2005: "Khoa học và Công nghệ phục vụ bảo vệ và
chăm sóc sức khỏe cộng đồng".
Chủ nhiệm đề tài: Họ và tên: Trần Văn Sung
Học hàm/học vị: GS. TSKH.
Chức danh khoa học: Nghiên cứu viên cao cấp (NCVCC)
Điện thoại: (CQ)/ 04-7564794; (NR) 04-8570894;
Fax: 04-8361283; Mobile: 0913210527
15
E-mail:
Địa chỉ cơ quan: Viện Hoá học, Viện KH & CNVN
18 Đờng Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội
Địa chỉ nhà riêng: Số nhà 35, Ngõ 198, phố Thái Hà, Hà Nội
Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Hoá học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam
Điện thoại: 04-7564312; Fax: 04- 8361283
E-mail:
Địa chỉ: 18 Đờng Hoàng Quốc Việt, Quận Cầu Giấy, Hà Nội
Mục tiêu của đề tài: Xây dựng đợc quy trình công nghệ tổng hợp và tinh chế
thuốc cyclophosphamide đạt tiêu chuẩn Dợc điển Anh
(BP- 2001).
Nội dung nghiên cứu:
+ Nghiên cứu quy trình tổng hợp và tinh chế cyclophosphamide
+ Kiểm tra độ tinh khiết của các hoá chất, dung môi sử dụng
+ Tinh chế các hoá chất, dung môi sử dụng

+ Nghiên cứu quy trình tổng hợp và tinh chế sản phẩm trung gian I
+ Nghiên cứu quy trình tổng hợp và tinh chế sản phẩm trung gian II
+ Nghiên cứu quy trình điều chế cyclophosphamide trong các điều kiện phản
ứng khác nhau (dung môi, tác nhân)
+ Nghiên cứu tinh chế cyclophosphamide trong các điều kiện khác nhau.
+ Xác định cấu trúc và kiểm tra độ tinh khiết của cyclophosphamide: Kiểm
tra độ tinh khiết bằng các phơng pháp sắc ký nh sắc ký lớp mỏng, sắc ký
khí, sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), sắc ký lỏng gắn khối phổ (LC/ MS)
và phân tích nguyên tố.
+ Xác định cấu trúc của cyclophosphamide bằng các phơng pháp phổ nh
IR, MS, NMR, so sánh với phổ của chất chuẩn.
16
+ Kiểm nghiệm cyclophosphamide: Theo tiêu chuẩn Dợc điển Anh BP-
2001.
+ Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn cơ sở của cyclophosphamide.
+ Xác định độc tính của cyclophosphamide: Xác định độc tính cấp trên chuột
nhắt trắng và chó; LD
50
trên chuột nhắt trắng, độc tính bán trờng diễn.
+ Báo cáo sơ kết
Bào chế đóng lọ bột thuốc cyclophosphamide và ống nớc cất pha tiêm:
+ Đóng 15.000 lọ thuốc bột pha tiêm đạt tiêu chuẩn trên dây chuyền GMP tại
xí nghiệp dợc phẩm TW1.
+ Đóng 15.000 ống nớc cất để pha thuốc tiêm đạt tiêu chuẩn tại xí nghiệp
dợc phẩm TW1.
Nghiên cứu tác dụng lâm sàng của cyclophosphamide:
+ Xây dựng đề cơng trình Hội đồng đạo đức của Bộ Y tế cho phép thử
nghiệm lâm sàng.
+ Lựa chọn bệnh nhân đạt tiêu chuẩn để thử nghiệm nh sau.
- Khám lâm sàng

- Các xét nghiệm cận lâm sàng ( phải có xét nghiệm mô bệnh học)
- Chẩn đoán xác định bệnh
- Chẩn đoán giai đoạn bệnh
- Các tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân
+ Tiến hành thử nghiệm lâm sàng giai đoạn I sau khi đã đợc sự cho phép của
Bộ Y tế.
- Tiến hành điều trị bệnh nhân theo phác đồ
- Đánh giá kết quả đáp ứng của bệnh
- Theo dõi các tác dụng phụ và độc tính của thuốc
- Báo cáo kết quả thử lâm sàng.
17
Tiến độ thực hiện
TT
Các bớc/công đoạn thực hiện Sản phẩm phải đạt Thời gian
1 2 3 4
1
Xây dựng thuyết minh chi
tiết của đề tài
Bản thuyết minh chi tiết
1/ 1/ 2004 -
15/ 1/ 2004
2
Nghiên cứu quy trình tổng
hợp giai đoạn I (chất VIII)
Quy trình tổng hợp giai đoạn I
1/ 2004 -
6/ 2004
3
Nghiên cứu quy trình tổng
hợp giai đoạn II (chất IX)

Quy trình tổng hợp giai đoạn II
6/ 2004 -
12/ 2004
4
Nghiên cứu quy trình tổng
hợp cyclophosphamide
cyclophosphamide thô
6/ 2004 -
12/ 2004
5
Nghiên cứu quy trình tinh
chế cyclophosphamide
4250g cyclophosphamide
1/ 2004 -
12/ 2004
6

Kiểm tra độ tinh khiết, xác
định cấu trúc các sản phẩm
Bộ phổ chuẩn
6/ 2004 -
12/ 2004
7
Kiểm nghiệm
cyclophosphamide
Theo tiêu chuẩn của BP2001
6/ 2004 -
1/ 2005
8
Thử độc tính của

cyclophosphamide
Báo cáo kết quả
6/ 2004 -
1/ 2005
9
Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở
của cyclophosphamide
TCCS
8/ 2004 -
12/2004
10 Báo cáo sơ kết 12/ 2004
11
Đóng lọ thuốc bột và ống
nớc pha tiêm để thử lâm
sàng
Tiêu chuẩn GMP
12/ 2004 -
1/ 2005
12
Xây dựng đề cơng thử lâm
sàng
Hồ sơ
1/2005 -
3/2005
13
Thử lâm sàng giai đoạn I
Báo cáo kết quả
3/2005 -
11/2005
14

Viết báo cáo tổng kết đề tài,
nghiệm thu
Báo cáo tổng kết đề tài
11/2005 -
12/2005


18
Yêu cầu kỹ thuật, chỉ tiêu chất lợng đối với sản phẩm tạo ra
Mức chất lợng
TT
Tên sản phẩm và chỉ tiêu chất
lợng chủ yếu
Đơn vị
đo
Cần đạt
Trong
nớc
Thế
giới
Dự kiến số
lợng sản
phẩm tạo
ra
1 2 3 4 5 6 7
1
Cyclophosphamide


C

7
H
15
Cl
2
N
2
O
2
P. H
2
O
CAS [6055 - 19 - 2]

gram 4250g
-
Trọng lợng phân tử
C 30,12 % H 6,14 %
Cl 25,40 % N 10,04 %
O 17,20 % P 11,10 %
đơn vị
khối
279,10 279,10
- Điểm chảy
0
C 40-45 41-45
-
Độ tan
Trong nớc
g/l 40 40

-
LD
50
chuột nhắt
chuột cống
mg/kg
350
94-95

350
94

2
Thuốc tiêm cyclophosphamide
-
Dạng bột trắng

Bột
trắng

Bột
trắng

-
Hàm lợng cyclophosphamide
khan
mg 200 200 15.000 lọ
-
Nớc cất pha thuốc. Khi soi dới
bóng điện 40W trên nền đen phải

trong suốt. Mối hàn ống không
đợc có vệt đen
ml 10 10
15.000
ống

NH
P
O
N
O
CH
2
CH
2
Cl
H
2
O
.
Cl
CH
2
CH
2
19
Kinh phí thực hiện đề tài phân theo các khoản chi
Đơn vị tính: Triệu đồng
Trong đó
TT Nguồn kinh phí Tổng số

Thuê
khoán
chuyên
môn
Nguyên,
vật liệu,
năng
lợng
Thiết bị
máy
móc
Xây
dựng,
sửa
chữa
nhỏ
Chi
khác
Hợp tác
quốc tế
1 2 3 4 5 6 7 8 9
A Tổng kinh phí 2.900 720 767,614 698,386 500 214
B Nguồn kinh phí
1 Ngân sách SNKH 1.900 650 650 350 50 200
2
Các nguồn vốn
khác + Tự có
1.000 70 117,614 348,386 450 14

2.2. Các kết quả nghiên cứu của Đề tài:

2.2.1. Nghiên cứu quy trình tổng hợp cyclophosphamide:
Qua công tác su tầm và tham khảo tài liệu về các phơng pháp tổng hợp
cyclophosphamide của các nhà khoa học trên thế giới [18 - 24], thì việc tổng hợp
cyclophosphamide dựa theo bản quyền sáng chế của các nhà khoa học Đức [22 - 24]
là tơng đối thuận lợi và có tính khả thi cao.
Các cán bộ khoa học của Viện Hoá học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt
Nam và của trờng Đại học Khoa học Tự nhiên thuộc Đại học Quốc gia Hà Nội đã
tiến hành nghiên cứu tổng hợp cyclophosphamide ở quy mô phòng thí nghiệm theo
một số quy trình tổng hợp sau:
Các quy trình tổng hợp cyclophosphamide đã đợc nghiên cứu:
Quy trình I
:
a/ Tổng hợp bis - (2 - chloroethyl) amine hydrochloride
NH
HOCH
2
CH
2
HOCH
2
CH
2
SOCl
2
+
CHCl
3
NH . HCl
ClCH
2

CH
2
ClCH
2
CH
2

100 ml SOCl
2
trong 100 ml CHCl
3
đợc nhỏ từ từ (khoảng 30 phút) vào hỗn
hợp gồm 50 ml diethanol amine trong 100 ml CHCl
3
. Hỗn hợp phản ứng tự sôi lên,
20
sau đó chuyển dần về dạng trong suốt. Đun hồi lu nhẹ cho bay hết khí SO
2
và HCl
(khoảng 30 phút); giữ hỗn hợp phản ứng ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ; hạ lạnh
xuống 10
o
C; sản phẩm phản ứng tự kết tinh, lọc, rửa sản phẩm bằng ete làm khô ở
áp suất thấp. Kết tinh lại sản phẩm trong dung môi là aceton thu đợc 50g sản phẩm
tinh: Đnc = 216 - 217
o
C, hiệu suất 59%.
b/ Tổng hợp cyclophosphamide
POCl
3

+
HO CH
2
CH
2
CH
2
NH
2
2 Et
3
N
CH
2
Cl
2
NH
P
O
O
Cl
+2 Et
3
N . HCl
(Sản phẩm trung gian I)

NH
P
O
O

Cl
HCl . HN
CH
2
CH
2
Cl
CH
2
CH
2
Cl
+
2 Et
3
N
CH
2
Cl
2
NH
P
O
O
CH
2
CH
2
Cl
CH

2
CH
2
Cl
N
+
2 Et
3
N . HCl
(Cyclophosphamide)

+ Tổng hợp "Sản phẩm trung gian I"
Dung dịch gồm 76g (1 mol) 3-amino-1-propanol và 222g (2,2 mol) triethyl
amine trong 1000 ml CH
2
Cl
2
đợc làm lạnh tới -10
o
C bằng hỗn hợp đá muối. Sau
đó vừa khuấy vừa nhỏ vào dung dịch trên từng giọt dung dịch gồm 153g (1 mol)
POCl
3
trong 500 ml CH
2
Cl
2
đã

đợc làm lạnh trớc. Quá trình nhỏ giọt diễn ra trong

khoảng 2 giờ, sao cho phản ứng đợc duy trì ở nhiệt độ không vợt quá -10
o
C. Tiếp
tục khuấy thêm 3 giờ nữa, ngừng khuấy, để qua đêm.
+ Tổng hợp cyclophosphamide từ "Sản phẩm trung gian I"
Vừa khuấy vừa cho từ từ dung dịch đã đợc làm lạnh tới -5
o
C bằng hỗn hợp
đá muối của 178,5g bis-(2-chloroethyl) amine hydrochloride hoà tan trong 1000 ml
CH
2
Cl
2
vào hỗn hợp phản ứng trên. Sau đó tiếp tục nhỏ thêm từng giọt của 222 g
Et
3
N. Quá trình nhỏ giọt diễn ra trong khoảng 2 giờ, sao cho phản ứng đợc duy trì
ở nhiệt độ không vợt quá -5
o
C. Tiếp tục khuấy ở nhiệt độ phòng thêm 3 giờ nữa,
ngừng khuấy, làm lạnh. Lọc bỏ kết tủa Et
3
N.HCl, rửa lại với 500 ml CH
2
Cl
2
, thu lấy
phần nớc lọc, cô quay dới áp suất thấp. Phần cặn thu đợc đợc hoà tan trong 600
ml H
2

O, để qua đêm ở + 5
o
C. Lọc, rửa kết tủa bằng nớc lạnh, thu đợc 218 g
(78%) cyclophosphamide sạch: Đnc = 41 - 45
o
C.