Ứng dụng bộ kít nhuộm hóa học tế bào để phân loại bệnh bạch cầu cấp theo tiêu chuẩn FAB

Header Page 1 of 258.

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU..................................................................3
1.1. Quá trình sinh máu ..........................................................................................3
1.1.1. Cơ quan sinh máu.....................................................................................3
1.1.2. Quá trình sinh máu...................................................................................3
1.2. Bệnh bạch cầu cấp ...........................................................................................3
1.2.1. Khái niệm chung.......................................................................................3
1.2.2. Dịch tễ học ...............................................................................................3
1.2.3. Các nguyên nhân gây bệnh ......................................................................4
1.2.4. Cơ chế bệnh sinh ......................................................................................4
1.2.5. Phân loại ..................................................................................................5
1.2.6. Đặc điểm lâm sàng...................................................................................6
1.2.7. Đặc điểm xét nghiệm ................................................................................7
1.3. Tình hình nghiên cứu trên thế giới về nhuộm hóa học tế bào .........................8
1.3.1. Kỹ thuật nhuộm Periodic-Axit Schiff (PAS) .............................................9
1.3.2. Kỹ thuật nhuộm peroxidaza (PER) ........................................................10
1.3.3. Kỹ thuật nhuộm sudan B ........................................................................11
1.3.4. Kỹ thuật nhuộm esteraza ........................................................................11
1.3.5. Kỹ thuật nhuộm photphataza .................................................................13
1.4. Ứng dụng phương pháp nhuộm hóa học tế bào trong y học .........................14
1.5. Nghiên cứu trong nước về nhuộm hóa học tế bào.........................................23
CHƯƠNG 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................................................28
2.1. Đối tượng nghiên cứu ....................................................................................28
2.1.1. Tiêu chuẩn lựa chọn ...............................................................................28
2.1.2. Tiêu chuẩn loại trừ .................................................................................28
2.2. Phương pháp nghiên cứu ...............................................................................28
2.2.1. Thiết kế nghiên cứu ................................................................................28
2.2.2. Phương pháp thu thập mẫu và số liệu....................................................28

2.2.3. Kỹ thuật nghiên cứu ...............................................................................29
2.2.4. Xử lý số liệu............................................................................................30

Footer Page 1 of 258.


Header Page 2 of 258.

2.2.5. Biện pháp hạn chế sai số........................................................................30
2.2.6. Thời gian và địa điểm nghiên cứu..........................................................30
2.3. Thực nghiệm..................................................................................................30
2.3.1. Bệnh phẩm, dụng cụ, máy móc và hóa chất nghiên cứu ........................30
2.3.2. Quy trình nhuộm hóa học tế bào............................................................32
2.3.3. Đánh giá kết quả ....................................................................................35
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ............................................................37
3.1. Đặc điểm chung của nhóm bệnh nhân được nghiên cứu...............................37
3.2. Nhóm bạch cầu cấp dòng lympho .................................................................39
3.2.1. Đặc điểm chung về nhóm bệnh bạch cầu cấp dòng Lympho .................39
3.2.2. Phân loại thể bệnh bạch cầu cấp dòng lympho sử dụng bộ kit nhuộm
HICYTEC .........................................................................................................41
3.2.3. Kết quả nhuộm photphataza axit bạch cầu xác định loại lympho T trên
bệnh nhân bạch cầu cấp dòng lympho .............................................................47
3.3. Nhóm bạch cầu cấp dòng tủy ........................................................................48
3.3.1. Phân nhóm bạch cầu cấp dòng tủy theo giới tính và tuổi......................48
3.3.2. Kết quả phân loại thể bệnh bạch cầu cấp dòng tủy theo kết quả
chẩn đoán tại Viện Huyết học-Truyền máu trung ương...................................50
3.3.3. Kết quả phân loại thể bệnh bạch cầu cấp dòng tuỷ bằng kit nhuộm
HICYTEC .........................................................................................................51
3.3.4. Mức độ phù hợp về chẩn đoán thể bệnh bạch cầu cấp dòng tủy bằng
bộ kít HICYTEC và kết luận của viện Huyết học-Truyền máu TW..................53

3.4. Phân loại dòng tế bào bạch cầu cấp thể lai lympho - tủy (Lai L-T)..............62
3.5. Kết quả nhuộm photphataza kiềm bạch cầu ..................................................67
3.6. Kết quả nhuộm sắt trên mẫu tủy của bệnh nhân bạch cầu cấp tại Viện HHTM trung ương ...............................................................................................69
KẾT LUẬN..............................................................................................................69
KIẾN NGHỊ.............................................................................................................70
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN
ĐẾN LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP..........................................................................71
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................72

Footer Page 2 of 258.


Header Page 3 of 258.

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
TT

Tên
viết tắt

1

ALL

2

Tên Tiếng Việt

Tên Tiếng Anh

Bệnh bạch cầu cấp dòng

Acute lymphoblastic

lympho

leukemia

AML

Bệnh bạch cầu cấp dòng tủy

Acute myeloid leukemia

3

BCC

Bạch cầu cấp

Leukemia

4

CE

Cacboxyl esteraza

Carboxyl esterase

5

CS

Cộng sự

et al

6

CD

Dấu ấn miễn dịch

Cluster of Differenciation

7

FAB

8

HHTB

9

HLA - DR

10

LA

11

L1

12

L2

13

L3

14

M0

15

M1

16

M2

Footer Page 3 of 258.

Hội các nhà huyết học Pháp Mỹ - Anh

French - American - British

Nhuộm Hóa học tế bào

Cytochemistry

Kháng nguyên bạch cầu người

Human Leukocyte antigen

Bệnh bạch cầu cấp

Acute leukemia

Bệnh bạch cầu cấp dòng
lympho đã biệt hóa
Bệnh bạch cầu cấp dòng
lympho chưa biệt hóa
Bệnh bạch cầu cấp dòng
lympho loại Burkitt

Homogenous small blast type

Heterogenous blast type

Homogenous lager blast type

Bệnh bạch cầu cấp dòng tủy

Minimally differentiated

biệt hóa tối thiếu

acute myeloid

Bệnh bạch cầu cấp dòng tủy

Acute myeloblastic leukemia,

không có tế bào trưởng thành

without maturation

Bệnh bạch cầu cấp dòng tủy có

Acute myeloblastic leukemia,

tế bào trưởng thành

with granulocytic maturation


Header Page 4 of 258.

17

M3

18

M4

19

M5

20

M6

21

M7

22

NE

23

NE - NaF

24

Bệnh bạch cầu cấp dòng tiền tủy

Acute promyelocytic
leukemia

Bệnh bạch cầu cấp dòng tủy -

Acute myelomonocytic

mono

leukemia

Bệnh bạch cầu cấp dòng mono

Acute mono

Bệnh bạch cầu cấp dòng
hồng cầu

Acute erythroid leukemia

Bệnh bạch cầu cấp dòng

Acute megakaryoblastic

tiểu cầu

leukemia

Esteraza không đặc hiệu

Non-specific esterase

Esteraza không đặc hiệu ức chế

Non-specific esteraza - NaF

bằng NaF

inhibitor

PA

Photphataza axit

Acid photphatase

25

PAL

Photphataza kiềm

Alkaline photphatase

26

PAS

Periodic Axit Schiff

Periodic -Acid - Schiff

27

PER

Peroxydaza

Peroxidase

28

SD

Sudan đen

Sudan black

29

SLTBT

Số lượng tế bào tủy

The number of myeloid cells

30

WHO

Tổ chức Y tế thế giới

World Heath Organization

Footer Page 4 of 258.


Header Page 5 of 258.

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Glycogen bị oxi hóa bởi axit periodic thành diandehit...............................9
Hình 1.2. Diandehit tác dụng với thuốc thử Schiff tạo phẩm màu Quinoit................9
Hình 1.3. H2O2 bị khử do xúc tác của peroxidaza tạo oxi nguyên tử .......................10
Hình 1.4. Oxi nguyên tử ôxi hóa benzidin thành di-imin diphenyl. .........................10
Hình 1.5. Thủy phân cơ chất este thành naphtol.......................................................11
Hình 1.6. Naphtol tác dụng với muối điazo thành phẩm màu azo ...........................12
Hình 1.7. Thủy phân naphtyl photphat thành naphtol. .............................................14
Hinh 1.8. Quy trình thường quy nhuộm hóa học tế bào chẩn đoán thể
bệnh bạch cầu cấp theo FAB ....................................................................................27
Hình 3.1. Biểu đồ phân loại bạch cầu cấp theo độ tuổi và giới tính.........................38
Hình 3.2. Biểu đồ phân loại bệnh bạch cầu cấp........................................................39
Hình 3.3. Biểu đồ phân loại bệnh bạch cầu cấp dòng lympho theo độ tuổi .............40
Hình 3.4. Ảnh nhuộm giemsa mẫu tủy của bệnh nhân Doãn Hữu T- thể L1 ...........42
Hình 3.5. Ảnh nhuộm giemsa mẫu tủy của bệnh nhân Nguyễn Hữu T - thể L2 ......42
Hình 3.6. Ảnh nhuộm PAS mẫu tủy của bệnh nhân Doãn Hữu T - Thể L1.............43
Hình 3.7. Ảnh nhuộm PAS mẫu tủy của bệnh nhân Nguyễn Hiền A- Thể L2 .......43
Hình 3.8. Ảnh nhuộm PER mẫu tủy của bệnh nhân Doãn Hữu T - Thể L1.............44
Hình 3.9. Ảnh nhuộm PER mẫu tủy của bệnh nhân Nguyễn Hữu T- Thể L2..........44
Hình 3.10. Ảnh nhuộm SD mẫu tủy của bệnh nhân Doãn Hữu T - Thể L1 .............44
Hình 3.11. Ảnh nhuộm SD mẫu tủy của bệnh nhân Nguyễn Hữu T - Thể L2 .........44
Hình 3.12. Ảnh nhuộm photphataza axit ..................................................................48
Hình 3.13. Tỷ lệ bệnh nhân bạch cầu cấp dòng tủy theo độ tuổi và giới .................50
Hình 3.14. Tỷ lệ bệnh nhân bạch cầu cấp theo kết quả chẩn đoán của
Viện Huyết học - Truyền máu trung ương................................................................51

Hình 3.15. Ảnh nhuộm giemsa mẫu tủy của Vũ Thị Ng-thể M1 .............................55
Hình 3.16. Ảnh nhuộm peroxidaza mẫu tủy của Vũ Thị Ng-thể M1 .......................55
Hình 3.17. Ảnh nhuộm sudan B mẫu tủy của Vũ Thị Ng-thể M1............................55
Hình 3.18. Ảnh nhuộm esteraza đặc hiệu mẫu tủy của Vũ Thị Ng-thể M1 .............55

Footer Page 5 of 258.


Header Page 6 of 258.

Hình 3.19. Ảnh nhuộm giemsa mẫu tủy của Bùi Thị T - thể M2 .............................56
Hình 3.20. Ảnh nhuộm giemsa mẫu tủy của Hồ Ngọc A - thể M2 ..........................56
Hình 3.21. Ảnh nhuộm peroxidaza mẫu tủy của Đào Minh H-thể M2 ....................56
Hình 3.22. Ảnh nhuộm sudan B mẫu tủy của Đào Minh H-thể M2.........................56
Hình 3.23. Ảnh nhuộm giemsa mẫu tủy của Nguyễn Văn T-thể M3.......................57
Hình 3.24. Ảnh nhuộm giemsa mẫu tủy của Hà Thị Thu H-thể M4 ........................57
Hình 3.25. Ảnh nhuộm peroxidaza mẫu tủy của Hà Thị Thu H-thể M4..................57
Hình 3.26. Ảnh nhuộm sudan B mẫu tủy của Hà Thị Thu H-thể M4 ......................58
Hình 3.27. Ảnh nhuộm esteraza đặc hiệu mẫu tủy của Hà Thị Thu H-thể M4 ........58
Hình 3.28. Ảnh nhuộm giemsa mẫu tủy của Trần Thị T-thể M5a ...........................58
Hình 3.29. Ảnh nhuộm giemsa mẫu tủy của Đặng Thị Thu M-thể M5b .................58
Hình 3.30. Ảnh nhuộm giemsa mẫu tủy của Dương Quang T-thể M6 ....................59
Hình 3.31. Ảnh nhuộm PAS mẫu tủy của Dương Quang T-thể M6 ........................59
Hình 3.32. Ảnh nhuộm giemsa mẫu tủy của Nguyễn Thanh T- Thể M0 .................60
Hình 3.33. Ảnh nhuộm giemsa mẫu tủy của Nguyễn Thanh T- Thể M0 .................60
Hình 3.34. Ảnh nhuộm peroxidaza mẫu tủy của Nguyễn Thanh T ..........................60
Hình 3.35. Ảnh nhuộm PAS mẫu tủy của Nguyễn Thanh T ....................................60
Hình 3.36. Ảnh nhuộm sudan B mẫu tủy của Nguyễn Thanh T ..............................60
Hình 3.37. Ảnh nhuộm esteraza đặc mẫu tủy hiệu của Nguyễn Thanh T ................60
Hình 3.38. Ảnh nhuộm PAS mẫu tủy của bệnh nhân Đỗ Thị P ...............................61

Hình 3.39. Ảnh nhuộm peroxidaza mẫu tủy của bệnh nhân Đỗ Thị P .....................61
Hình 3.40. Ảnh nhuộm sudan B mẫu tủy của bệnh nhân Đỗ Thị P..........................62
Hình 3.41. Ảnh nhuộm esteraza đặc hiệu mẫu tủy của bệnh nhân Đỗ Thị P ...........62
Hình 3.42. Ảnh nhuộm esteraza không đặc hiệu mẫu tủy của bệnh nhân
Đỗ Thị P ....................................................................................................................62
Hình 3.43. Ảnh nhuộm esteraza không đặc hiệu ức chế bằng NaF mẫu tủy của
bệnh nhân Đỗ Thị P ..................................................................................................62
Hình 3.44. Ảnh nhuộm Giemsa mẫu tủy của bệnh nhân Lý Trọng Đ......................64
Hình 3.45. Ảnh nhuộm Giemsa mẫu tủy của bệnh nhân Trần Văn C. .....................64

Footer Page 6 of 258.


Header Page 7 of 258.

Hình 3.46. Ảnh nhuộm PAS mẫu tủy của bệnh nhân Trương Thị T........................64
Hình 3.47. Ảnh nhuộm PAS mẫu tủy của bệnh nhân Trần Văn C ...........................64
Hình 3.48. Ảnh nhuộm peroxidaza mẫu tủy của bệnh nhân Trương Thị T.............65
Hình 3.49. Ảnh nhuộm peroxidaza mẫu tủy của bệnh nhân Trần Văn C.................65
Hình 3.50. Ảnh nhuộm Sudan B mẫu tủy của bệnh nhân Trương Thị T. ................65
Hình 3.51. Ảnh nhuộm Sudan B mẫu tủy của bệnh nhân Trần Văn C.....................65
Hình 3.52. Ảnh nhuộm esteraza đặc hiệu mẫu tủy của bệnh nhân Trương Thị T....66
Hình 3.53. Ảnh nhuộm esteraza đặc hiệu mẫu tủy của bệnh nhân Trần Văn C .......66
Hình 3.54. Ảnh nhuộm esteraza không đặc hiệu ức chế NaF mẫu tủy của
Trương Thị T.............................................................................................................66
Hình 3.55. Ảnh nhuộm esteraza không đặc hiệu mẫu tủy của bệnh nhân
Trần Văn C................................................................................................................66
Hình 3.56. Ảnh nhuộm photphataza kiềm mẫu tủy của bệnh nhân Trần Văn C ......68
Hình 3.57. Ảnh nhuộm Perls tế bào lưới nội mô sắt mẫu tủy của bệnh nhân
Trương Thị T.............................................................................................................68

Footer Page 7 of 258.


Header Page 8 of 258.

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Biến đổi di truyền và tiên lượng trong bạch cầu cấp dòng lympho....................... 5
Bảng 1.2. Xếp loại bạch cầu cấp cấp dòng lympho theo FAB............................................... 6
Bảng 1.3. Phân loại tế bào lympho và thể bệnh theo FAB có bổ sung thêm Marker
và di truyền ..............................................................................................................................16
Bảng 1.4. Bảng phân loại dòng tế bào theo FAB có bổ sung thêm marker và di truyền.... 19
Bảng 1.5. Quy trình kỹ thuật của các bước nhuộm đơn........................................................24
Bảng 2.1. Thành phần bộ kít nhuộm hóa học tế bào .............................................................31
Bảng 2.2. Pha chế dung dịch nhuộm ......................................................................................32
Bảng 2.3. Nhuộm glycogen và biệt hóa .................................................................................33
Bảng 2.4. Nhuộm nhân và nền................................................................................................34
Bảng 2.5. Nhuộm tăng màu .................................................................................................... 34
Bảng 2.6. Đánh giá kết quả định tính .....................................................................................35
Bảng 2.7. Đánh giá kết quả bán định lượng........................................................................... 36
Bảng 3.1. Tỷ lệ mắc bệnh bạch cầu cấp .................................................................................37
Bảng 3.2. Phân loại bạch cầu cấp theo giới tính .................................................................... 38
Bảng 3.3. Bảng phân loại bạch cầu cấp dòng lympho theo giới tính ................................... 39
Bảng 3.4. Kết quả phân loại thể bệnh bạch cầu cấp dòng lympho....................................... 41
Bảng 3.5. Kết quả phân loại thể bệnh bạch cầu cấp dòng tuỷ bằng bộ kít HICYTEC
và kết chẩn đoán xác định của Viện Huyết học-Truyền máu trung ương trên từng
bệnh nhân ....................................................................................................................................................................46
Bảng 3.6. Kết quả phân loại thể bệnh bạch cầu cấp dòng lympho....................................... 46
Bảng 3.7. Kết quả nhuộm photphataza axit phân loại dòng lympho T................................47
Bảng 3.8. Bảng phân bố bệnh bạch cầu cấp dòng tủy theo giới tính.................................... 49

Bảng 3.9. Kết quả phân loại thể bệnh bạch cầu cấp dòng tủy theo giới tính .......................49
Bảng 3.10. Kết quả phân loại thể bệnh bằng bộ kit nhuộm HICYTEC...............................51
Bảng 3.11. Kết quả chẩn đoán thể bệnh bạch cầu cấp dòng tủy bằng bộ kít HICYTEC
và kết luận của viện Huyết học-Truyền máu TW từng đôi một........................................... 53
Bảng 3.12. Kết quả phân loại thể bệnh bạch cầu cấp lai lympho-tủy ................................. 63
Bảng 3.13. Kết quả nhuộm photphataza kiềm trên bệnh nhân bạch cầu cấp ......................67
Bảng 3.14. Kết quả nhuộm Perls trên các mẫu tủy bị bệnh bạch cầu cấp............................68

Footer Page 8 of 258.


Header Page 9 of 258.

MỞ ĐẦU
Bệnh bạch cầu cấp là nhóm bệnh máu ác tính của hệ thống tạo máu với đặc
trưng bởi sự tăng sinh và tích tụ tế bào non trong máu và tủy xương. Bạch cầu cấp
được chia thành 2 nhóm là bạch cầu cấp dòng tủy và bạch cầu cấp dòng lympho.
Bạch cầu cấp dòng tủy là kết quả của sự tích lũy tế bào non bất thường trong tủy
xương. Bạch cầu cấp dòng lympho là bệnh tăng sinh ác tính trong quá trình tạo máu
dòng lympho. Những tế bào này lấn át sự sinh máu bình thường trong tủy xương,
chúng có thể thoát ra ngoài máu ngoại vi và thâm nhiễm vào các cơ quan nội tạng
[23]. Bệnh có các hội chứng: Thiếu máu, xuất huyết, nhiễm trùng và dẫn tới tử vong
nếu không được phát hiện và điều trị kịp thời. Vì vậy, việc xác định chính xác thể
bệnh cũng như dòng tế bào bị ung thư có vai trò quyết định trong điều trị. Hiện nay,
việc phân loại dòng tế bào và thể bệnh bạch cầu cấp dựa trên một trong hai tiêu
chuẩn là FAB và WHO. Tiêu chuẩn FAB do các nhà Huyết học Pháp-Anh-Mỹ đưa
ra năm 1976 là tổng hợp kết quả hình thái học và hóa học tế bào, năm 1986 tiêu
chuẩn này đã bổ sung thêm kết quả miễn dịch và di truyền [15, 17].
Nhuộm hóa học tế bào gồm 8 kỹ thuật: Periodic-Acid Schiff (PAS), sudan
black (SD), peroxidaza (PER), esteraza đặc hiệu, esteraza không đặc hiệu ức chế

bằng NaF và không ức chế, photphataza kiềm và axit. Ưu điểm của phương pháp
nhuộm hóa học tế bào: Rẻ tiền, giá thành chỉ bằng 1/4 so với phương pháp miễn
dịch và bằng 1/10 so với phương pháp di truyền, không cần máy móc hiện đại, dễ
triển khai. Hiện nay, các bộ kít nhuộm có bán trên thị trường là các kít đơn, giá
thành cao và có những nhược điểm: kỹ thuật nhuộm nằm nên có nhiều cặn, quy
trình nhuộm khác nhau về thời gian, số bước nhuộm, hóa chất cố định khác nhau,
bước tẩy màu của kỹ thuật nhuộm Sudan và Periodic - Acid Schiff khó đồng nhất,
nhuộm nền thiếu tương phản, chất màu dễ hòa tan trong dầu soi kính nên khó hội
chẩn tiêu bản nhiều lần. Tại Việt Nam, các thuốc thử hầu hết là tự pha kết hợp với
các yếu điểm trên nên độ nhạy, độ đặc hiệu còn thấp. Theo Trần Ngọc Vũ và cộng
sự (2014) tỷ lệ phù hợp chẩn đoán giữa hình thái học-hóa học tế bào và miễn dịch là
89,1%, giá trị dự báo đối với bệnh bạch cầu cấp dòng lympho là 88,88% và độ đặc
1
Footer Page 9 of 258.


Header Page 10 of 258.

hiệu là 73,77% [25]. Theo tác giả Nguyễn Hữu Toàn thì việc phân loại dòng tế bào
theo tiêu chuẩn FAB dựa trên phương pháp nhuộm hóa học vẫn cần phải có sự điều
chỉnh tới 29,7% nhờ vào kỹ thuật miễn dịch và di truyền [19]. Hiện nay, tác giả
Trần Văn Tính, Trung tâm Huyết học- Truyền máu, Bộ Công an đã nghiên cứu và
chế tạo thành công kít nhuộm hóa học tế bào đồng bộ HICYTEC gồm 10 kỹ thuật:
Giemsa, Periodic-Axit Schiff (PAS), Peroxidaza, Sudan B, Esteraza đặc hiệu,
Esteraza không đặc hiệu, Esteraza không đặc hiệu ức chế bằng NaF, Photphataza
kiềm, Photphataza axit, Perls. Bộ kít đã cơ bản khắc phục được các yếu điểm ở trên.
Nhằm đánh giá giá trị sử dụng của bộ kít, tiến tới có thể thay thế hàng nhập ngoại,
đề tài “Ứng dụng bộ kít nhuộm hóa học tế bào để phân loại bệnh bạch cầu cấp theo
tiêu chuẩn FAB” là đề tài có ý nghĩa khoa học, thực tiễn, kinh tế - xã hội cấp thiết.
Mục tiêu của đề tài là: Đánh giá sự phù hợp của bộ kít nhuộm hóa học tế bào

trong phân loại dòng tế bào so với phương pháp hình thái học, miễn dịch học và di
truyền trên những bệnh nhân bạch cầu cấp đã được chẩn đoán thể bệnh theo tiêu
chuẩn FAB (1986).
Nội dung nghiên cứu:
 Thống kê đặc điểm bệnh bạch cầu cấp trên các bệnh nhân được chọc tủy lần
đầu tại Viện Huyết học-Truyền máu trung ương.
 Đánh giá tính phù hợp của phương pháp nhuộm hóa học tế bào đồng bộ
HICYTEC 10 kỹ thuật so với phương pháp hình thái học, miễn dịch và di
truyền trên các bệnh nhân đã được chẩn đoán thể bệnh theo tiêu chuẩn FAB.
 Đánh giá giá trị của kít nhuộm hóa học tế bào đồng bộ HICYTEC, khi
nhuộm photphataza kiềm, nhuộm photphataza axit bạch cầu, nhuộm Perls
trên bệnh nhân bạch cầu cấp.

2
Footer Page 10 of 258.


Header Page 11 of 258.

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Quá trình sinh máu
1.1.1. Cơ quan sinh máu
Cơ quan tạo máu bao gồm: tủy xương, tổ chức lympho (lách, hạch, tuyến ức)
và tổ chức võng mô. Thời kì phôi thai, cơ quan tạo máu gồm có gan, lách, hạch. Sau
khi sinh, quá trình tạo máu (hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu) chỉ xảy ra ở tủy đỏ của
các xương. Đến tuổi trưởng thành, quá trình sinh máu chỉ còn diễn ra tại đầu các
xương dẹt, đầu xương đùi, xương cánh tay và một vài khu vực sinh máu ngoài tủy
biệt hóa các dòng lympho T và B [6].
1.1.2. Quá trình sinh máu
Hiện nay nhiều công trình đã chứng minh, các dòng tế bào máu được sinh ra

từ tế bào gốc vạn năng. Quá trình biệt hóa qua nhiều giai đoạn và tùy theo sự kích
thích đặc hiệu mà tế bào gốc vạn năng biệt hóa để tạo thành những tế bào có chức
năng cần thiết [11]. Ba kích thích tố chính tạo máu gồm: Erythropoietin tạo hồng
cầu, thrombopoietin tạo tiểu cầu và colony-stimulating factors cùng với interleukin
(IL) kích thích tạo bạch cầu. Quá trình sinh máu được điều hòa bởi yếu tố di truyền
đặc biệt là các tế bào bị chết theo chương trình [13].
1.2. Bệnh bạch cầu cấp
1.2.1. Khái niệm chung
Bệnh bạch cầu cấp là tình trạng bệnh lý cấp tính của tế bào sinh máu với đặc
điểm chính là tăng số lượng bạch cầu bất thường ở cả trong tủy xương và ở ngoài
máu ngoại vi, tủy xương có trên 30% tế bào non (blast) trong tổng số tế bào có
nhân, phá hủy quá trình sinh máu bình thường trong tủy và xâm nhiễm vào các cơ
quan [12].
1.2.2. Dịch tễ học
 Theo công bố của Rebecca Siegel MPH và cộng sự (2015) trong năm 2014,
ở Mỹ ghi nhận 6.250 ca mắc mới bệnh bạch cầu cấp dòng lympho. Tỷ lệ nam
(3.100) và nữ (3.150) gần bằng nhau, số tử vong gây ra bởi bệnh này là 1.450
người [52];
3
Footer Page 11 of 258.


Header Page 12 of 258.

 Tại Mỹ, hàng năm xuất hiện mới khoảng 2,2 trường hợp bạch cầu cấp dòng
tủy trên 100.000 dân và có khoảng 3.000 trường hợp bạch cầu cấp dòng
lympho mới trên toàn quốc [44];
 Tại Việt Nam, tuy chưa có nghiên cứu nào tiến hành đầy đủ về dịch tễ học
của bệnh bạch cầu cấp trên toàn quốc nhưng theo tổng kết tại Viện Huyết
học-Truyền máu, Bệnh viện Bạch Mai thì thấy bệnh bạch cầu cấp gặp tỷ lệ

cao nhất (32.1%) trong số các bệnh máu đến khám và điều trị tại Bệnh viện
Bạch Mai [7].
1.2.3.Các nguyên nhân gây bệnh
Cho tới nay nguyên nhân gây bệnh chưa được sáng tỏ. Tuy nhiên qua nhiều
nghiên cứu cho thấy có nhiều yếu tố liên quan tới phát sinh bệnh:
 Tia xạ: Những người tiếp xúc nhiều với tia ion hóa hay tia xạ thường có
nguy cơ bị bạch cầu cấp;
 Hóa chất: Những người nhiễm mạn tính benzen hay sử dụng hóa chất để
chữa bệnh ác tính dễ mắc bệnh bạch cầu cấp;
 Virus: Human T-cell lymphotropic virus gây bạch cầu cấp dòng lympho,
Epstein-Barr virus (EBV) gây ung thư vòm...
 Yếu tố di truyền: Những bệnh nhân bị một số bệnh di truyền như hội chứng
Down, hội chứng Bloom, thiếu máu Fanconi có nguy cơ cao bị bạch cầu cấp [12].
1.2.4. Cơ chế bệnh sinh
 Sự hoạt động của các gen ung thư (oncogene): Các gen bình thường do
yếu tố nào đó tác động trở thành các gen bất thường gây ung thư gọi là gen
ung thư. Sản phẩm của các gen ung thư là các protein bất thường, có hoạt
tính mạnh, gây rối loạn quá trình sinh sản và biệt hóa của tế bào;
 Gen ức chế ung thư: Các công trình nghiên cứu gần đây đã chứng minh
được trong tế bào bình thường có những gen kiểm soát sự tăng sinh, nếu mất
các gen này sẽ dẫn đến mất kiểm soát phân chia tế bào, gây ra u;
 Hoạt hóa các oncogen trong bệnh bạch cầu cấp: Một số gen hoạt hóa và
kích thích tăng sinh tế bào. Khi các gen này được giải phóng và kết hợp với
4
Footer Page 12 of 258.


Header Page 13 of 258.

gen ức chế bị kìm hãm sẽ làm tăng trưởng mạnh sự phát triển khối u và làm

các tế bào bình thường trở thành ác tính [2, 21, 37].
 Một số biến đổi gen thường gặp trong bạch cầu cấp dòng lympho được thể
hiện trên Bảng 1.1 [10].
Bảng 1.1. Biến đổi di truyền và tiên lượng trong bạch cầu cấp dòng lympho.
Tiên lượng
Tốt

Loại bất thường
Trên lưỡng bội: >50 NST; Chuyển đoạn t(12;21)

Trung bình

Trên lưỡng bội từ 47-50 NST; 46XX/XY (bộ NST bình
thường); Chuyển đoạn t(1;19)

Xấu

Thiểu bội, mất NST; Chuyển đoạn t(9;22); Chuyển đoạn
t(11q23), t(4;11); Chuyển đoạn t(5;14).

1.2.5. Phân loại
 Xếp loại bạch cầu cấp dòng tủy: Trong Bảng xếp loại bạch cầu cấp dòng tủy
theo FAB 1976. Bạch cầu cấp dòng tủy được chia làm các thể từ M1 đến M7:


Thể M1: lơ xê mi cấp nguyên tủy bào kém biệt hóa;



Thể M2: lơ xê mi cấp nguyên tủy bào biệt hóa;



Thể M3: lơ xê mi cấp tiền tủy bào tăng hạt đặc hiệu và chia làm 2 nhóm:
 M3h: chứa các hạt đặc hiệu lớn;
 M3v: chứa các hạt đặc hiệu nhỏ.



Thể M4: lơ xê mi cấp hỗn hợp chia làm 2 nhóm:
 M4: lơ xê mi cấp tủy - mono;
 M4eo: lơ xê mi cấp tủy - mono có tăng bạch cầu ái toan.



Thể M5: lơ xê mi cấp dòng mono:
 M5a: ≥80% tế bào mono là monoblast;
 M5b:<80% tế bào mono là monoblast.



Thể M6: Thể bạch cầu cấp dòng tủy với hội chứng loạn sản hồng cầu;



Thể M7: lơ xê mi cấp nguyên mẫu tiểu cầu.

 Xếp loại bạch cầu cấp dòng lympho: Theo xếp loại FAB, bạch cầu cấp dòng
lympho được chia làm 3 thể từ L1 đến L3 thể hiện trên bảng 1.2.
5

Footer Page 13 of 258.


Header Page 14 of 258.

Bảng 1.2. Xếp loại bạch cầu cấp cấp dòng lympho theo FAB.
Hình thái tế bào

L1

L2

L3

Kích thước tế bào

Nhỏ, đều

Lớn, không đều

Lớn, đều

Chất nhiễm sắc

Đồng nhất, mịn

Không đồng nhất

Mịn và đồng nhất

Hình dạng nhân

Đều đặn, đôi khi có
rãnh, khía

Không đều,
thường có rãnh,
khía

Đều đặn, hình bầu
dục hoặc tròn

Không thấy hoặc

Một hay nhiều hạt

Một hay nhiều hạt

nhỏ

nhân to

nhân hình túi

Nhân/ Bào tương

Thấp

Khá cao, thay đổi

Cao

Bào tương ưa base

Nhẹ, vừa hoặc đậm Vừa hoặc đậm

Rất đậm

Thường không có

Hốc to và nhiều

Hạt nhân

Không bào trong
bào tương

Thường không có

1.2.6. Đặc điểm lâm sàng
Biểu hiện lâm sàng của bệnh là hậu quả của quá trình sản sinh quá nhiều tế
bào non, ác tính lấn át các tế bào máu sinh máu bình thường. Bệnh có nhiều thể,
mỗi thể có những đặc điểm riêng, các biểu hiện lâm sàng chung nhất gồm:
 Hội chứng thiếu máu: xảy ra nhanh, nặng dần với các biểu hiện da xanh, mệt
mỏi, hoa mắt chóng mặt, nhịp tim nhanh. Thường không cân xứng với tình
trạng xuất huyết;
 Hội chứng xuất huyết: xuất huyết tự nhiên, hay ở da - niêm mạc (chấm nột
đám mảng xuất huyết, chảy máu mũi, chảy máu chân răng...) có thể ở các
tạng (xuất huyết đường tiêu hoá, tiết niệu, tử cung, não - màng não...);
 Hội chứng nhiễm trùng: Sốt, viêm loét miệng họng, viêm phổi, nhiễm trùng da;

 Hội chứng thâm nhiễm: Gan to, lách to, hạch to, phì đại lợi , thâm nhiễm da,
đau xương, cơ khớp...
 Toàn trạng chung: mệt mỏi gầy sút, suy sụp nhanh.
6
Footer Page 14 of 258.


Header Page 15 of 258.

1.2.7. Đặc điểm xét nghiệm
Huyết đồ:





Thiếu máu bình sắc, hồng cầu bình thường, hồng cầu lưới giảm;



Bạch cầu: số lượng bạch cầu thường tăng, nhưng có thể bình thường hoặc
giảm. Công thức bạch cầu thường gặp một tỷ lệ tế bào blast. Tuy nhiên
một số trường hợp số lượng bạch cầu giảm nặng có thể không gặp tế bào
blast ở máu ngoại vi;



Tiểu cầu: số lượng giảm.

Tuỷ đồ:





Số lượng tế bào tuỷ: thường tăng, tủy giàu tế bào. Trong một số trường
hợp tủy nghèo hoặc có mật độ bình thường;



Tăng sinh tế bào blast trên 30% tế bào có nhân trong tuỷ xương;



Các dòng hồng cầu, bạch cầu hạt và mẫu tiểu cầu bị lấn át.

Sinh thiết tuỷ xương: Chỉ định khi chọc hút tuỷ nghèo tế bào. Các khoang



sinh máu có nhiều tế bào ác tính, có thể có tình trạng xơ.
Nhuộm hoá học tế bào: Sử dụng hóa chất nhuộm một số enzym và các chất



có trong tế bào, qua đó xác định được dòng tế bào, kết hợp với kết quả hình
thái học trên tiêu bản nhuộm giemsa có thể phân loại thể bệnh bạch cầu cấp
theo tiêu chuẩn FAB.
Xét nghiệm miễn dịch:



Bằng kỹ thuật miễn dịch phát hiện các kháng nguyên dấu ấn trên màng các tế
bào blast (CD-Cluster of Differentiation) và đối chiếu với sự xuất hiện các CD này
trong quá trình biệt hóa và trưởng thành tế bào máu bình thường để biết bản chất
dòng và giai đoạn biệt hóa của tế bào trong bệnh bạch cầu cấp.


Nhóm dấu ấn CD thay đổi trong quá trình biệt hóa bạch cầu dòng tủy: Các
tế bào non thuộc dòng tủy sẽ phản ứng dương tính với các kháng nguyên
CD33 hoặc CD14.
7

Footer Page 15 of 258.


Header Page 16 of 258.



Nhóm dấu ấn CD thay đổi trong quá trình biệt hóa bạch cầu lympho B:
 Tế bào nguồn đầu dòng B: CD10, CD19;
 Tế bào tiền lympho B: CD10, CD19, CD20;
 Lympho B trưởng thành: CD19, CD20, CD21, CD22, CD23;
 Tương bào: CD38.



Nhóm dấu ấn CD thay đổi trong quá trình biệt hóa bạch cầu lympho T:
 Tế bào nguồn đầu dòng T: TdT, HLA;

 Tế bào tiền lympho T: TdT, CD7, CD2, CD3;
 Tế bào lympho T4: CD2, CD3, CD4;
 Tế bào lympho T8: CD2, CD3, CD8.



Xét nghiệm về di truyền NST:
Xét nghiệm di truyền thường được dùng để chẩn đoán và tiên lượng bệnh.

Có một số bất thường nhiễm sắc thể phổ biến trong một số thể bạch cầu cấp
(chuyển đoạn, đảo đoạn,…), cụ thể như sau:


t(8;12) trong bạch cầu cấp M2;



t(15;17) trong bạch cầu cấp M3;



Inversion (inv) 16 trong bạch cầu cấp M4Eo;



t(9;22) trong bạch cầu cấp dòng lympho.

1.3. Tình hình nghiên cứu trên thế giới về nhuộm hóa học tế bào
Nhuộm hóa học tế bào từ lâu đã trở thành đối tượng được các nhà khoa học
tập trung nghiên cứu phát triển các kỹ thuật nhằm phát hiện các enzym cũng như

các chất chuyển hóa có trong nội bào tế bào. Năm 1885, Ehrlich là người đầu tiên
nhuộm enzym cytochrom oxidaza trong các mô tươi bằng phản ứng "Nadi" giữa
-naphtol và dimethyl-p-phenylethylendiamine và có thể quan sát được trên kính
hiển vi. Neukirch (1910) giới thiệu kỹ thuật nhuộm phát hiện các glycogen trong
các bạch cầu trung tính bằng phẩm màu carmin theo phương pháp Best [31, 40].
Năm 1947, Bailllif và Kimbrough ứng dụng dùng Sudan B nhuộm hạt mỡ bạch cầu
để phân biệt dòng tuỷ và các dòng khác [31, 40]. Đầu những năm 50 của thế kỷ XX,
sự phát triển mạnh mẽ của các loại phẩm màu azo đã giúp các nhà nghiên cứu đưa
các tiến bộ trong ngành hóa màu vào ứng dụng nhuộm hóa học tế bào [30, 32, 51].
8
Footer Page 16 of 258.


Header Page 17 of 258.

Năm 1953, Gomori là người đầu tiên phát triển kỹ thuật nhuộm esteraza đặc hiệu
bạch cầu người sử dụng naphtol AS-D cloaxetat làm cơ chất [55]. Việc phối hợp với
các công nghệ khác như kỹ thuật kháng thể đơn dòng và các phương pháp phân tích
dòng chảy đã cho phép tự động hóa đạt kết quả tin cậy cao [45]. Phương pháp hình
thái học-nhuộm hóa học tế bào cùng với miễn dịch và di truyền được ứng dụng rộng
rãi trong chuyên ngành Huyết học để phân loại thể bệnh bạch cầu cấp theo tiêu
chuẩn FAB và tiêu chuẩn WHO [28, 32, 34, 49]. Hiện nay, trên thế giới thường sử
dụng phổ biến 8 kỹ thuật nhuộm hóa học tế bào như sau:
1.3.1. Kỹ thuật nhuộm Periodic-Axit Schiff (PAS)
Phương pháp dựa trên nguyên lý của phản ứng hóa học gồm hai giai đoạn:
Giai đoạn 1: Axit periodic oxi hóa glycogen trong tế bào thành diandehit
theo hình 1.1:
HO

R1

+
R2

R 1 CHO

HIO 4

+

R 2 CHO

OH

1-2 Glycol

Diandehit

Hình 1.1. Glycogen bị oxi hóa bởi axit periodic thành diandehit
Ghi chú: R1, R2 là các gốc: amin (-RNH2) hoặc alkyl amino thế (-RNHR')
Giai đoạn 2: Diandehit tạo thành tham gia vào phản ứng nhuộm hoàn nguyên
bằng thuốc thử Schiff thể hiện trên hình 1.2:
NH2

HO2SN

NH

SO3H

+

NSO2(OH)HCR

2R - CHO

NSO2(OH)HCR
NSO2H

Thuốc thử Schiff

Phẩm màu quinoit

Hình 1.2. Diandehit tác dụng với thuốc thử Schiff tạo phẩm màu Quinoit
9
Footer Page 17 of 258.


Header Page 18 of 258.

Như vậy, về mặt bản chất đây là một phản ứng nhuộm hoàn nguyên nhằm
bộc lộ glycogen có trong nguyên sinh chất của tế bào. Kết quả dương tính khi có
màu đỏ trên nguyên sinh chất của tế bào nghĩa là có glycogen và ngược lại.
Phản ứng PAS thường dương tính đối với bạch cầu ung thư dòng lympho, tế
bào càng trưởng thành thì mức độ dương tính càng mạnh. Các tế bào monoxit và
lymphoxít bình thường có độ dương tính rất thấp. Các dòng tế bào khác như dòng
tủy, mẫu tiểu cầu, tiểu cầu, tương bào dương tính dạng lan tỏa, còn tế bào bạch cầu
ưa axit, bazơ và dòng hồng cầu thì gần như âm tính. Những tính chất khác nhau đó
là cơ sở của kỹ thuật nhuộm hóa học bạch cầu để phân biệt các dòng tế bào và xếp
loại thể bệnh bạch cầu cấp theo tiêu chuẩn FAB [27, 28].

1.3.2. Kỹ thuật nhuộm peroxidaza (PER)
Cơ chế của phản ứng nhuộm peroxidaza đi qua hai giai đoạn thể hiện trên
hình 1.3 và 1.4 [29, 46]:

H2 O2

Peroxydaza

H2O + O:

Hình 1.3. H2O2 bị khử do xúc tác của peroxidaza tạo oxi nguyên tử
H2N

NH2

O

NH

HN

Benzidin

Di-imin diphenyl

Hình 1.4. Oxi nguyên tử ôxi hóa benzidin thành di-imin diphenyl.
Dưới xúc tác của peroxidaza là một enzym oxi hóa khử, nước ôxi già bị khử
thành nước và oxi nguyên tử, oxi nguyên tử có tính oxi hóa mạnh đã oxi hóa
benzidin thành 2-diimin diphenyl có màu vàng nâu. Nếu trên nguyên sinh chất của
tế bào có màu vàng nâu chứng tỏ có mặt của peroxidaza.

Peroxidaza dương tính đối với các tế bào dòng tủy, dương tính nhẹ với dòng
mono; âm tính với dòng lymphoxít, dòng hồng cầu và tiểu cầu.

10
Footer Page 18 of 258.


Header Page 19 of 258.

1.3.3. Kỹ thuật nhuộm sudan B
Cơ chế của các phản ứng nhuộm rất khác nhau gồm khuếch tán vật lí đơn
thuần hoặc liên kết hóa học trực tiếp. Trong các loại thuốc nhuộm, sudan là một
nhóm phẩm nhuộm được ưa chuộng nhuộm lipit từ vàng (Sudan III) đến đen
(Sudan B).
Đối với máu ngoại vi, phản ứng nhuộm sudan B cho kết quả bạch cầu hạt
dương tính mạnh, monoxit dương tính yếu, lymphoxit và hồng cầu âm tính. Trong
tủy xương bình thường, các tế bào dòng tủy dương tính từ tiền tủy bào đến tế bào
trưởng thành, dòng mono chỉ dương tính ở các tế bào trưởng thành; mẫu tiểu cầu và
tiểu cầu âm tính. Trong nhiều trường hợp của bệnh bạch cầu cấp có thể phân biệt
tương đối rõ dòng tủy và các dòng tế bào khác bằng kết quả nhuộm Sudan B. Kết
quả dương tính Sudan B của mẫu bệnh phẩm thường cũng cho kết quả dương tính
với kỹ thuật nhuộm Peroxidaza. Chính vì vậy kết quả nhuộm Sudan B là một trong
những tiêu chuẩn được ứng dụng phân loại thể bệnh trong bệnh bạch cầu cấp theo
tiêu chuẩn FAB [28].
1.3.4. Kỹ thuật nhuộm esteraza
a) Nhuộm esteraza đặc hiệu [54]
Cơ chế phản ứng nhuộm esteraza đặc hiệu gồm hai giai đoạn:
Giai đoạn 1: Esteraza bạch cầu người thủy phân cơ chất là các este tạo thành
dẫn xuất của naphtol như hình 1.5:

CONH
OCOCH2Cl

esteraza
CH3

CONH
OH

Naphtol AS-D Cloaxetat

Naphtol AS-D

Hình 1.5. Thủy phân cơ chất este thành naphtol

11
Footer Page 19 of 258.

CH3


Header Page 20 of 258.

Giai đoạn 2: dẫn xuất naphtol tác dụng với muối điazo tạo thành chất màu
azo theo hình 1.6

CONH

CONH
CH3

OH
OCH3

N
N

N N Cl

O

CH3

OH
OCH3
O
C

C
N

N
H

OCH3 H

OCH3

Hình 1.6. Naphtol tác dụng với muối điazo thành phẩm màu azo
Cơ chất nhuộm esteraza đặc hiệu gồm nhiều loại: naphtol AS-D cloaxetat,

Naphtol AS-OL 2-clopropionat... Trong giai đoạn 1, phân tử cơ chất dưới xúc tác
của enzym tạo thành napthol theo cơ chế của hình 1.5 và 1.6. Giai đoạn 2 là giai
đoạn ghép đôi giữa naphtol và muối điazo. Về mặt bản chất đây là phản ứng thế
electrophin của nhóm azo cho nguyên tử proton ở nguyên tử cacbon C4 trên vòng
naphtol. Tùy theo loại muối điazo mà phẩm màu azo có màu đỏ hoặc màu đen. Nếu
xuất hiện màu trên nguyên sinh chất của tế bào có nghĩa là có esteraza. Tốc độ của
quá trình nhuộm màu phụ thuộc vào nhiều yếu tố như nồng độ cơ chất, muối điazo,
thành phần dung môi, nhiệt độ và pH môi trường... các hóa chất sử dụng luôn đòi
hỏi độ tinh khiết cao, giá thành đắt [3, 14, 40, 47, 55].

12
Footer Page 20 of 258.


Header Page 21 of 258.

b) Kỹ thuật nhuộm esteraza không đặc hiệu ức chế và không ức chế bằng NaF
Nhuộm phát hiện esteraza không đặc hiệu bạch cầu người lần đầu tiên được
công bố vào năm 1959 bởi Braunstein. Esteraza không đặc hiệu dương tính trong tất
cả các dòng tế bào máu vì thế nên được gọi là không đặc hiệu. Cơ chế phản ứng
thủy phân dựa trên cơ chế hình thành phẩm màu azo giống như nhuộm esteraza đặc
hiệu (hình 1.4, 1.5 và 1.6). Cơ chất thường sử dụng là naphtol AS axetat, -naphtyl
axetat, -naphtyl butyrat và naphtol AS-D axetat. Chất ghép đôi thường sử dụng là
muối điazo và tùy theo loại muối điazo mà phẩm màu azo có phổ màu khác nhau từ
đen đến đỏ. Các cơ chất của -naphtyl axetat, -naphtyl butyrat thường cho phản
ứng dương tính mạnh đối với dòng mono, dòng tiểu cầu; các dòng khác lên màu
dưới dạng hạt và yếu. Riêng tế bào lymphoxít B cho kết quả âm tính. Đối với cơ
chất naphtol AS-D axetat và naphtol AS Axetat thì dương tính mạnh ở tất cả các
dòng trừ dòng tế bào lymphoxit B. Tuy có mức độ dương tính khác nhau nhưng chỉ
có dòng mono bị ức chế bởi NaF với nồng độ 1,5 mg/1 ml. Chính nhờ tính chất này

mà kỹ thuật nhuộm với chất ức chế NaF thường dùng để phân biệt dòng mono với
các dòng tế bào khác trong bệnh bạch cầu cấp và là tiêu chuẩn để phân loại dòng tế
bào theo tiêu chuẩn FAB [27, 28].
1.3.5. Kỹ thuật nhuộm photphataza
Photphataza bạch cầu thuộc nhóm Hidrolaza (EC 3.1.3.2) là một enzym xúc
tác cho phản ứng thủy phân nhóm photphat từ nhiều loại phân tử, bao gồm các
nucleotide, protein, và ancaloit [3, 30].
Photphataza có mặt chủ yếu trong lysosom và được giải phóng qua hệ thống
lưới nội nguyên sinh chất. Photphataza là một hệ enzym không đồng nhất gồm
nhiều iso enzym có thể hoạt động ở pH tối ưu khác nhau và được gọi tên gắn liền
với điều kiện pH hoạt động tối ưu như: photphataza kiềm (pH=8-9), photphataza
axit (pH=5-6,5) [35, 38]. Trong các phương pháp nhuộm hóa học tế bào có hai kỹ
thuật nhuộm photphataza là: Kỹ thuật nhuộm photphataza kiềm và photphataza axit
Với sự phát triển mạnh của kỹ thuật hóa màu đặc biệt là phát hiện phẩm màu azo đã
được ứng dụng vào để nhuộm photphataza kiềm và axit.
13
Footer Page 21 of 258.


Header Page 22 of 258.

Nguyên lý của kỹ thuật đi qua hai giai đoạn [40, 43].
Giai đoạn 1: Thủy phân cơ chất naphtyl photphat thành các naphtol tương
ứng dưới sự xúc tác của photphataza kiềm (ALP) hoặc axít (AP) theo hình 1.7:
OH

OPO3HNa

+

ALP/AP
H2O

+

PA

Natri -naphtyl photphate

NaH2PO4

-Naphtyl

Hình 1.7. Thủy phân naphtyl photphat thành naphtol.
Giai đoạn 2: Naphtol tác dụng với muối điazo tạo thành chất màu azo theo
hình 1.6 như ở phần nhuộm esteraza.
Photphataza kiềm bạch cầu dương tính đối với dòng tủy từ hậu tủy bào đến
bạch cầu hạt. Tế bào càng trưởng thành thì mức độ dương tính càng mạnh. Ngoài ra
các tế bào tạo cốt bào cũng cho phản ứng dương tính trong kỹ thuật nhuộm này.
Trong bệnh bạch cầu kinh, hoạt tính của photphataza kiềm bạch cầu giảm trong
bệnh thiếu máu do tan máu; hoạt tính của photphataza kiềm bạch cầu tăng trong các
bệnh nhiễm khuẩn cấp, lách to sinh tủy, phản ứng giả bạch cầu [3, 25, 30, 40, 43].
Photphataza axit dương tính mạnh trong bệnh bạch cầu cấp dòng lympho loại
tế bào B, tế bào liên võng, hủy cốt bào và các nguyên mẫu tiểu cầu. Dòng hồng cầu,
mono, lympho (trừ bệnh bạch cầu tế bào tóc-tế bào B hay còn gọi là Hairy cell) và
dòng tủy từ nguyên tủy bào đến tiền tủy bào cho kết quả âm tính [40, 56].
1.4. Ứng dụng phương pháp nhuộm hóa học tế bào trong y học
Nhuộm hóa học tế bào được ứng dụng rộng rãi trong y học, nghiên cứu sinh
học và đặc biệt trong chuyên ngành Huyết học-Truyền máu. Trong bệnh bạch cầu
cấp, kết quả của phương pháp hình thái học-nhuộm hóa học tế bào, phương pháp

marker và di truyền là tiêu chuẩn để phân loại dòng tế bào bệnh bạch cầu cấp cũng
như thể bệnh. Việc xác định chính xác thể bệnh quyết định việc dùng thuốc điều trị
đặc biệt là các thuốc nhắm đích. Trong bệnh bạch cầu kinh, nhuộm photphataza
kiềm thường bị giảm điểm nhuộm và có giá trị phân biệt với các bệnh nhiễm trùng,
14
Footer Page 22 of 258.


Header Page 23 of 258.

tăng bạch cầu đơn nhân... Năm 1976, Hội các nhà huyết học Pháp-Anh-Mỹ đã sử
dụng kết quả của các phương pháp: hình thái học-nhuộm hoá học tế bào làm cơ sở
để phân loại thể bệnh trong bệnh bạch cầu cấp. Trong đó nhuộm hóa học tế bào dựa
trên các kỹ thuật: periodic -axit schiff, peroxidaza, esteraza đặc hiệu và không đặc
hiệu (ức chế và không ức chế), Sudan B, photphataza kiềm, axit. Năm 1986, đã bổ
sung thêm các tiêu chuẩn dấu ấn miễn dịch và di truyền để nâng cao độ chính xác
trong phân loại dòng tế bào và thể bệnh. Bảng 1.3 là một ví dụ của Asa Barnes [26]
về tổ hợp các kết quả của ba phương pháp: Hình thái học-hóa học tế bào, marker
CD, di truyền để phân loại dòng tế bào lympho và thể bệnh theo tiêu chuẩn FAB
(1986).

15
Footer Page 23 of 258.


Header Page 24 of 258.

Bảng 1.3. Phân loại tế bào lympho và thể bệnh theo FAB có bổ sung thêm Marker và di truyền [26]
Thể
L1

Hình thái học-số lượng tế bào tủy
1) <50% SLTBT là nguyên hồng cầu;
2) ≥30% tế bào có nhân trong tủy là
tế bào blast loại I:
 Hầu hết là tế bào nhỏ;
 Nhân mịn, đồng nhất, hình thoi
dẹt;
 Hạt nhân nhỏ hoặc không rõ;
 Nguyên sinh chất không có hạt ưa

Hóa học tế bào

Marker CD

1) Early Pre B: t(4; 11)
PAS dương tính 1) 1CD (+): TdT; CD (-): Smlg;
(q21:q23).
hạt to trên một số 2) Early Pre B: (+): CD10, HLADR; (-/+): CD19; (-): CD3,5, 2) Pre B: t(1; 19)(q23:p13).
lymphoblast trong 80%

1)

Cylg.

trường hợp;

2)
Peroxidaza, Sudan 3) Pre B: (+): CD19, Cylg, HLADR; (-/+): CD10; (-): CD3,5.
B, CE âm tính;

3) NE âm tính trừ tế bào 4) Pre T: (+): CD5; (-):
non dòng lymphoxít T
có thể dương tính hạt

bazơ.

16
Footer Page 24 of 258.

Di truyền

CD3,10,19, Cylg, HLA-DR.
5) 5) Lympho T: (+): CD3,5; (-):
CD10, 19, Cylg, HLA-DR.

3) Pre T và T: t(1; 14)
(p32:q11); t(7;v)(q32-q36;
v),
t(8;14)
(q24;q11),
t(10;14)(q24;q11),
t(11;14)(p13;q11-q13),
inv(14)(q11;q32).


Header Page 25 of 258.

Thể
L2

Hình thái học-số lượng tế bào tủy

Hóa học tế bào

Marker CD

1) <50% SLTBT là nguyên hồng cầu; 1)PAS dương tính hạt to

1) CD (+): TdT; CD (-): Smlg;

Di truyền
1) Early Pre B: t(4; 11)

2) ≥30% tế bào có nhân trong tủy là

trên một số lymphoblast

2) Early Pre B: (+): CD10, HLA-

tế bào blast loại I:

trong 80% trường hợp;

DR; (-/+): CD19; (-): CD3,5, 2) Pre B: t(1; 19)(q23:p13).
Cylg.
3) Pre T và T: t(1; 14)
3) Pre B: (+): CD19, Cylg, HLA(p32:q11); t(7;v)(q32-q36;
DR; (-/+): CD10; (-): CD3,5.
v), t(8;14) (q24;q11),
4) Pre T: (+): CD5; (-):

t(10;14)(q24;q11),
CD3,10,19, Cylg, HLA-DR.
t(11;14)(p13;q11-q13),
5) Lympho T: (+): CD3,5; (-):
inv(14)(q11;q32).
CD10, 19, Cylg, HLA-DR.

 Tế bào to, nhỏ không đều;
 Nhân không đồng nhất;
 Có 1 hoặc nhiều hạt nhân và
thường lớn;

2)Peroxidaza, Sudan B,
CE âm tính;
3)NE âm tính trừ tế bào
non dòng lymphoxit T
có thể dương tính hạt

 Nguyên sinh chất rộng, ưa bazơ.

17
Footer Page 25 of 258.

(q21:q23).