Nghiên cứu tạo cây đậu xanh chuyển gen có khả năng kháng mọt (LA tiến sĩ)

1

1

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn
của GS.TS. Chu Hoàng Mậu và PGS.TS. Nguyễn Vũ Thanh Thanh. Các số liệu,
kết quả trong luận án là trung thực, một phần đã được công bố trong các tạp chí
khoa học công nghệ, phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình
nào khác. Mọi trích dẫn đều ghi rõ nguồn gốc.

Thái Nguyên, tháng 03 năm 2017
Tác giả luận án
Hoàng Thị Thao


2

2

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến GS.TS. Chu Hoàng Mậu,
PGS.TS. Nguyễn Vũ Thanh Thanh đã tận tình hướng dẫn và chỉ bảo trong suốt
quá trình tôi nghiên cứu và hoàn thành đề tài luận án.
Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Lê Văn Sơn và các cán bộ nghiên cứu
Phòng Công nghệ ADN ứng dụng, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa
học và Công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất để tôi có thể hoàn
thành các thí nghiệm nghiên cứu thuộc đề tài này.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô Bộ môn Sinh học hiện đại & Giáo

dục sinh học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên đã tạo mọi điều
kiện thuận lợi và có những góp ý sâu sắc cho tôi trong thời gian học tập, thực hiện
luận án. Tôi xin cảm ơn các thầy cô và cán bộ Khoa Sinh học, các cán bộ Bộ phận
đào tạo Sau đại học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên đã giúp đỡ
và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành khoá học này.
Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Trường Đại học Nông - Lâm Bắc
Giang, chân thành cảm ơn các đồng nghiệp Khoa Nông học - Trường Đại học
Nông Lâm Bắc Giang đã tạo điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi trong quá trình học
tập và công tác.
Tôi rất biết ơn những người thân trong gia đình, các bạn bè đã luôn động
viên, khích lệ và chia sẻ những khó khăn cùng tôi trong suốt quá trình học tập và
nghiên cứu.
Thái Nguyên, ngày

tháng 03 năm 2017

TÁC GIẢ
Hoàng Thị Thao


3

3

MỤC LỤC
Trang


4

DANH MỤC KÝ HIỆU, CÁC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT
µg
AS
BAP
bp
cs
CCM
cDNA

Microgam
Acetylseringone
Benzylaminopurine
Base pair

Kb
kDa
LB

Cocultivation medium
Complementary DNA
Hexadecyltrimethyl ammonium
bromide
Cysteine
Diethyl pyrocarbonate
Deoxyribonucleic acid
Deoxyribonucleoside triphosphate
Escherichia coli
Ethylene diamine tetraacetic acid
Enzyme-linked immunosorbent
assay

Germination Medium
β-Glucuronidase
Horseradish Peroxidase
Indole Acetic acid
Isopropyl β-D-1thiogalactopyranoside
Kilo base
Kilo Dalton
Luria Bertani

MS

Murashige và Skoog, 1962

mRNA
NAA
NptII
OD
PCR

Messenger ribonucleic acid
Naphthaleneacetic acid
Neomycyn phosphatranferaseII
Optical density
Polymerase chain reaction

CTAB
Cys
DEPC
DNA
dNTP

E. coli
EDTA
ELISA
GM
Gus
HRP
IAA
IPTG

Cặp bazơ nitơ
Cộng sự
Môi trường đồng nuôi cấy
DNA bổ sung

Xét nghiệm ELISA
Môi trường nảy mầm

Môi trường dinh dưỡng cơ bản
nuôi cấy vi khuẩn
Môi trường dinh dưỡng cơ bản
nuôi cấy mô thực vật

Gen kháng kanamycine
Mật độ quang
Phản ứng chuỗi polymerase


5
PDF1
RNA

RM
RT-PCR
rVrPDF1
ScFv
SDS
SEM
SIM
TAE
Taq DNA
polymerase

Plant defensin type 1
Ribonucleic acid
Rooting medium
Reverse transcription polymerase
chain reaction
Recombinant VrPDF1 protein
Single-chain variable fragment
Sodium dodecyl sulfate
Shoot Elongation Medium
Shoot Induction Medium
Tris Acetate EDTA
Thermus aquaticus DNA
polymerase

T-DNA

Transfer DNA

Ti-plasmid

T0, T1

Tumor inducing – plasmid

T0
T1
TMB
v/p
WT
X-gal

Gen defensin 1 ở đậu xanh
Môi trường tạo rễ
Phản ứng chuỗi polymerase phiên
mã ngược
Protein defensin tái tổ hợp VrPDF1

Môi trường kéo dài chồi
Môi trường tạo đa chồi

Đoạn DNA được chuyển vào thực
vật
Plasmid gây khối u
Các thế hệ cây chuyển gen
Cây chuyển gen tái sinh từ chồi
trong ống nghiệm
Hạt của cây chuyển gen T0 nảy
mầm thành cây T1

3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine

Wild type
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-Dgalacto-pyranoside

Vòng /phút
Kiểu dại

DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang


6

MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Đậu xanh là một trong ba cây đậu đỗ chính trong nhóm các cây đậu ăn hạt,
đứng sau đậu tương và lạc. Hạt đậu xanh là nguồn thực phẩm giàu đạm. Hạt đậu
xanh vừa cung cấp protein cho con người, vừa có giá trị trong y học, và cũng là
cây có giá trị trong cải tạo đất bởi rễ cây đậu xanh có các nốt sần chứa vi khuẩn cố
định đạm sống cộng sinh. Việt Nam nằm trong khu vực nhiệt đới, khí hậu thường
nóng ẩm. Đây là điều kiện tốt để phát triển sản xuất nông nghiệp, tuy nhiên cũng
là yếu tố thuận lợi cho sâu hại phát sinh, phát triển gây tổn thất nghiêm trọng tới
năng suất và phẩm chất nông sản. Theo ước tính, tổn thất sau thu hoạch khoảng từ
10% - 30% sản lượng cây trồng nông nghiệp. Điều này có nghĩa là khoảng 10% 30% lượng lương thực không bao giờ được sử dụng và cũng là tỷ lệ tổn thất của
công sức và tài chính đầu tư trong sản xuất nông nghiệp. Lượng nông sản bị hao
hụt này có thể ảnh hưởng đến an ninh lương thực của một phần dân số thế giới.
Do đó, việc đánh giá và hạn chế tổn thất sau thu hoạch là công tác rất có ý nghĩa

trong việc đảm bảo lương thực, thực phẩm trong điều kiện hạn chế diện tích trồng
trọt và dân số đang gia tăng hiện nay.
Đối với nhóm nông sản là hạt thì một trong những nguyên nhân chính gây
tổn thất đến số lượng và chất lượng hạt là côn trùng mà chủ yếu là một số thuộc
Bộ cánh cứng (thường gọi là mọt). Các loài mọt gây hại chủ yếu cho đậu đỗ là:
mọt đậu xanh (Callosobruchus chinensis (L.)), mọt đậu đỏ (Callosobruchus
maculatus F.), mọt đậu nành (Ancanthoscelides obtectus)…Trong đó, mọt đậu
xanh Callosobruchus chinensis (L.) thuộc họ Bruchid, bộ Coleoptera là loài gây
hại chủ yếu cho hạt đậu xanh. Ngoài ra, mọt đậu xanh còn gây hại trên các loại
đậu khác như: đậu đũa, đậu Hà Lan, đậu đen … Mọt có thể gây thành dịch từ
một số lượng nhỏ cá thể do khả năng sinh sản lớn và thời gian phát triển cá thể
ngắn. Sự tổn hại do mọt gây ra là rất lớn, do đó công tác phòng trừ mọt đậu nói
chung và mọt đậu xanh nói riêng đang là một vấn đề cần được quan tâm nghiên
cứu. Trong công tác chọn tạo giống thì bên cạnh yếu tố năng suất cao và chất


7

lượng tốt thì khả năng chống chịu với điều kiện ngoại cảnh trong đó có khả năng
kháng mọt ở hạt là vấn đề cần thiết trong lĩnh vực chọn giống đậu đỗ nói chung
và chọn giống đậu xanh nói riêng.
Hiện nay, đã có một số nghiên cứu bước đầu đánh giá về khả năng kháng
mọt, kháng nấm, kháng virus trên một số loại cây trồng trong đó có đậu xanh. Tuy
nhiên, những nghiên cứu ở đậu xanh mới tập trung đánh giá về mức độ thiệt hại mà
còn ít nghiên cứu về cơ chế phân tử của tính chống chịu sinh vật hại nói chung và
tính kháng mọt nói riêng. Theo các nghiên cứu đã công bố, đặc tính kháng mọt hại
hạt của cây trồng rất phức tạp và liên quan đến hoạt động của protein defensin.
Defensin thực vật là nhóm chuỗi peptide nhỏ đặc trưng bởi cấu trúc gấp cuộn ba
chiều qua 8 cầu nối disulfide của các cystein. Defensin thực vật hoạt động mạnh sẽ
tổng hợp protein ức chế, ảnh hưởng đến kênh trao đổi ion, tác động đến hoạt động

của α-amylase và trypsin, làm suy yếu vi sinh vật… Cơ chế gây độc của defensin
đối với mọt đậu xanh là sự cản trở hoạt động phân giải tinh bột của α-amylase trong
ruột mọt và ngăn chặn sự tiêu hoá tinh bột của mọt, ức chế sự sinh trưởng phát triển
của mọt. Ngoài ra, defensin thực vật còn ức chế sự phát triển của một loạt các loại
nấm và một số loại virus gây hại cây lương thực.
Defensin trong hạt đậu xanh có hàm lượng thấp và khác nhau giữa các giống, vì
thế để tăng hiệu quả ức chế α-amylase của ruột ấu trùng mọt, việc ứng dụng công nghệ
gen nhằm tăng cường biểu hiện, nâng cao hàm lượng defensin trong hạt được quan tâm
nghiên cứu. Xuất phát từ những cơ sở trên, chúng tôi lựa chọn và tiến hành đề tài luận
án là: “Nghiên cứu tạo cây đậu xanh chuyển gen có khả năng kháng mọt”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
(i) Phân tích được đặc điểm của gen defensin 1 (VrPDF1) phân lập từ các giống đậu
xanh Việt Nam có khả năng kháng mọt khác nhau.
(ii) Biểu hiện được gen VrPDF1 trên cây thuốc lá chuyển gen.
(iii) Tạo được cây đậu xanh chuyển gen chứa gen VrPDF1 liên quan đến tính kháng
mọt Callosobruchus chinensis (L.).


8

3. Nội dung nghiên cứu
i) Nghiên cứu đánh giá khả năng kháng mọt của một số giống đậu xanh trồng phổ
biến ở miền Bắc Việt Nam.
ii) Nghiên cứu thông tin, tách dòng và xác định trình tự gen VrPDF1 phân lập từ cây
đậu xanh. Phân tích đặc điểm trình tự nucleotide, trình tự amino acid suy diễn của
gen VrPDF1 phân lập từ giống đậu xanh có khả năng kháng mọt tốt nhất và giống
đậu xanh kháng mọt kém nhất.
iii) Thiết kế vector chuyển gen thực vật mang gen VrPDF1 và phân tích hoạt động
của vector chuyển gen trên cây thuốc lá chuyển gen ở thế hệ T0 và T1.
iv) Nghiên cứu chuyển cấu trúc chứa gen VrPDF1 và tạo cây đậu xanh chuyển gen.

Phân tích biểu hiện protein tái tổ hợp rVrPDF1 trong cây đậu xanh chuyển gen ở thế hệ
T1.
4. Những đóng góp mới của luận án
Luận án là công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu có hệ thống từ đánh
giá và phân nhóm các giống đậu xanh có khả năng kháng mọt khác nhau; phân lập,
tách dòng gen VrPDF1 đến thiết kế vector chuyển gen thực vật, tạo cây chuyển gen
và phân tích sự biểu hiện gen chuyển VrPDF1, cụ thể là:
1) Đã phân lập được gen VrPDF1 từ DNA hệ gen của hai giống đậu xanh có khả năng
kháng mọt khác biệt nhau. Gen VrPDF1 có kích thước 356 bp gồm 1 intron (128 bp)
xen giữa 2 exon (228 bp); cDNA VrPDF1 có 228 bp, mã hóa 75 amino acid.
2) Protein tái tổ hợp rVrPDF1 được biểu hiện trên cây thuốc lá chuyển gen và dịch
chiết chứa protein rVrPDF1 từ dòng thuốc lá chuyển gen T1 có khả năng ức chế αamylase của ruột ấu trùng mọt.
3) Tạo được cây đậu xanh của giống ĐX22 mang gen chuyển VrPDF1 ở thế hệ T1
và biểu hiện thành công protein tái tổ hợp rVrPDF1. Chứng minh được dịch chiết
chứa protein tái tổ hợp rVrPDF1 biểu hiện ức chế α-amylase của ấu trùng mọt, hiệu
suất ức chế α-amylase ở hai dòng chuyển gen DX1-3 và DX1-7 tăng 166,40 % và
178,19% so với cây không chuyển gen.


9

5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
5.1. Về mặt khoa học
Kết quả nghiên cứu góp phần làm sáng tỏ đặc điểm cấu trúc của gen
VrPDF1 phân lập từ các giống đậu xanh Việt Nam có khả năng kháng mọt khác
nhau. Sự tăng cường biểu hiện protein tái tổ hợp rVrPDF và biểu hiện khả năng ức
chế α-amylase của ruột ấu trùng mọt của protein này từ cây chuyển gen là những cơ
sở khoa học để khẳng định hiệu quả của việc ứng dụng công nghệ gen nhằm nâng
cao khả năng kháng mọt của đậu xanh nói riêng và cây trồng thu hạt nói chung.
5.2. Về mặt thực tiễn

Các trình tự gen VrPDF1 phân lập được, cấu trúc vector chuyển gen thực vật
mang gen VrPDF1, các dòng cây chuyển gen ở T1, dịch chiết chứa rVrPDF1 có khả
năng ức chế α-amylase của ruột ấu trùng mọt đã góp phần giải quyết những vấn đề
cụ thể về việc ứng dụng kỹ thuật chuyển gen trong cải thiện khả năng kháng mọt
của cây đậu xanh, mở ra triển vọng ứng dụng công nghệ sinh học hiện đại vào thực
tiễn chọn giống cây trồng thu hạt ở Việt Nam.

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU


10
1.1. ĐẶC ĐIỂM CỦA MỌT HẠI ĐẬU XANH VÀ SỰ THIỆT HẠI DO MỌT
GÂY RA CHO ĐẬU XANH

1.1.1. Cây đậu xanh
Cây đậu xanh [Vigna radiata (L.) Wilczeck] thuộc ngành Magnoliophyta, lớp
Magnoliopsida, bộ Fabales, họ Fabaceae, chi Vigna. Chi Vigna là một trong những
chi lớn trong họ Đậu, bao gồm 7 chi phụ: Vigna, Haydonia, Plactropic,
Macrhyncha, Ceratotropic, Lasiospron, Sigmaidotrotopis. Đậu xanh bao gồm các
loài thuộc hai chi phụ là Ceratotropic, còn được gọi là nhóm đậu châu Á, bao gồm
16 loài hoang dại và 5 loài trồng trọt là V. radiata, V. mungo, V. aconitifolia, V.
angularis, V. umbellata [11], [16]. Đậu xanh có bộ nhiễm sắc thể 2n = 22, là loại
cây ăn hạt, thân thảo. Đậu xanh có nguồn gốc từ Ấn Độ, được phân bố rộng rãi ở
các nước Đông và Nam Á, khu vực Đông Dương. Dạng dại của V. radiata cũng
được tìm thấy ở Madagasca, bên bờ Ấn Độ Dương, Đông Phi [11].
Bên cạnh những cây lương thực như lúa, ngô, lạc…thì đậu xanh cũng là loài
cây trồng có giá trị kinh tế cao. Hạt đậu xanh là nguồn thực phẩm giàu đạm (khoảng
23 - 28%), ngoài ra còn có lipid khoảng 1,3%, glucid 56 - 60,2%, nước và các chất
khoáng cùng nhiều loại vitamin. Các sản phẩm chế biến từ đậu xanh không chỉ phù
hợp với nhu cầu tiêu dùng trong nước mà còn là mặt hàng xuất khẩu. Lá non và

ngọn của cây đậu xanh có thể được dùng để làm rau, muối dưa. Thân, lá xanh có thể
dùng làm thức ăn cho vật nuôi [1], [2]. Ngoài ra đậu xanh còn có giá trị trong y học,
vỏ hạt đậu xanh có vị ngọt, tính mát, không độc nên có tác dụng giải nhiệt, giải
bách độc [17]. Trồng cây đậu xanh còn có tác dụng cải tạo và bồi dưỡng đất. Nhờ
hệ rễ đậu xanh có các nốt sần chứa các vi khuẩn cộng sinh thuộc chi Rhizobium có
khả năng cố định nitơ từ khí trời, cung cấp một phần đạm cho cây và để lại lượng
đạm đáng kể trong đất sau khi thu hoạch. Vì vậy, đất sau khi trồng đậu xanh sẽ trở
nên tơi xốp và giàu dinh dưỡng hơn [15].
Cây đậu xanh gồm các bộ phận rễ, thân, lá, hoa, quả và hạt. Hệ rễ đậu xanh
thuộc loại rễ cọc bao gồm rễ chính và các rễ phụ. Rễ chính thường ăn sâu khoảng
20 - 30 cm, trong điều kiện thuận lợi có thể ăn sâu tới 70 - 100 cm. Rễ phụ thường


11

gồm 30 - 40 cái, dài khoảng 20 - 25 cm. Trên rễ cây họ Đậu có nhiều nốt sần chứa
vi khuẩn cổ định đạm Rhizobium. Trung bình mỗi vụ, 1 ha đậu xanh có thể bù lại
cho đất tương ứng 85 - 107 kg nitơ làm cho đất tơi xốp hơn [12], [13].
Thân cây đậu xanh thuộc loại thân thảo hình trụ, phân đốt, cao khoảng 40 70 cm mọc thẳng đứng, có khi hơi nghiêng. Thân đậu xanh nhỏ, tròn, có màu xanh
hoặc màu tím tùy thuộc vào kiểu gen, có một lớp lông màu nâu sáng bao bọc [15]. Lá
cây đậu xanh thuộc loại lá kép, có ba lá chét, mọc cách. Trên mỗi thân chính có 7 - 8
lá thật, chúng xuất hiện sau khi xuất hiện lá mầm và lá đơn. Lá thật hoàn chỉnh gồm
có: lá kèm, cuống lá và phiến lá. Cả hai mặt trên và dưới của lá đều có lông bao phủ
[15]. Hoa đậu xanh là loại hoa lưỡng tính, tự thụ phấn, mọc thành chùm to, xếp xen
kẽ nhau ở trên cuống. Hoa đậu xanh thường nở rải rác nên người ta chia hoa đậu
xanh thành 3 nhóm: Nhóm ra hoa không tập trung hoa nở liên tiếp trên 30 ngày,
nhóm ra hoa tập trung hoa nở kéo dài trong khoảng 16 ngày trở lại, nhóm 3 là nhóm
ra hoa trung gian hoa nở trong khoảng 16 - 30 ngày [15]. Quả đậu xanh thuộc loại
quả giáp, có dạng hình trụ, dạng tròn hoặc dạng dẹt với đường kính 4 - 6 mm, dài 8 14 cm, dài khoảng 8 - 10 cm, có 2 gân nổi rõ dọc hai bên quả, đa số là quả thẳng, có
một số hơi cong, khi còn non quả có màu xanh, khi chín vỏ quả có màu nâu vàng hoặc

xám đen, đen. Mỗi cây có từ 8 - 35 quả, mỗi quả có từ 8 - 15 hạt [1], [12]. Hạt không
nội nhũ, phôi cong, hai lá mầm dày, lớn và chứa nhiều chất dinh dưỡng. Hạt gồm vỏ
hạt, rốn hạt 2 lá mầm và 1 mầm non. Mầm non là nơi thu nhỏ của mầm rễ, 2 lá đơn,
thân chính và lá kép đầu tiên. Hạt có hình tròn, hình trụ, hình ô van, hình thoi... và
có nhiều màu sắc khác nhau như: màu xanh mốc, xanh bóng, xanh nâu, vàng mốc,
vàng bóng nằm ngăn cách nhau bằng những vách xốp của quả [1].
Hạt đậu xanh có giá trị dinh dưỡng cao, trong hạt đậu xanh có chứa tương
đối đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết cho con người và gia súc. Thành phần
hóa học của hạt đậu xanh thay đổi phụ thuộc vào giống, điều kiện khí hậu, điều
kiện canh tác, và vị trí của hạt ở trong quả. Các chất hữu cơ trong hạt đậu xanh
bao gồm protein, glucid, lipid, vitamin, enzyme, và một số chất màu. Trong 100
gam hạt đậu xanh có khoảng 23,4g protein, 53,1g glucid, 2,4g lipid. Các chất vô
cơ gồm nước, muối khoáng [15], [17].


12

Protein chiếm hơn 90% các hợp chất chứa nitơ của hạt còn các chất phi
protein có hàm lượng không đáng kể. Protein đậu xanh có: protein hòa tan trong
nước (chiếm 71 - 79 % protein tổng sô); protein hòa tan trong dung dịch muối (chiếm
5 - 10% protein tổng số); protein hòa tan trong dung dịch kiềm (chiếm 4 - 8% protein
tổng sô). Protein hạt đậu xanh chứa đầy đủ các amino acid không thay thế như
leucine, isoleucine, lysine, methionine, phenylalanine, valine nhưng hàm lượng
cysteine và methionine lại thấp [15], [17].
Glucid đậu xanh chứa chủ yếu là tinh bột và các thành phần khác với hàm
lượng rất thấp không đáng kể. Tinh bột đậu xanh bao gồm 2 cấu tử là amylose và
amylopectin. Trong đó amylose có hàm lượng tương đối cao, chiếm khoảng 45 50%. Tinh bột đậu xanh được ứng dụng nhiều trong công nghệ thực phẩm như chế
biến các sản phẩm miến đậu xanh, bột đậu xanh, cháo đậu xanh ăn liền...[15], [17].
Hàm lượng lipid trong đậu xanh rất thấp nhưng có ảnh hưởng rất lớn đến
chất lượng của hạt, bột và sản phẩm chế biến. Chất béo của hạt có giá trị tương đối

cao vì trong thành phần của nó có 20 axit béo trong đó chứa nhiều axit béo chưa no
không thay thế như axit linoleic [15].
Hạt đậu xanh chứa nhiều vitamin như vitamin A, B1, B2, B6, C, D, PP…
Hàm lượng vitamin trong các sản phẩm được chế biến từ đậu xanh phụ thuộc nhiều
vào kỹ thuật và phương tiện chế biến. Nghiên cứu cho thấy có sự mất mát vitamin
từ 20 - 35% trong quá trình chế biến và 10 - 15% trong quá trình bảo quản [15],
[17].
Chất khoáng tập trung chủ yếu ở phần vỏ hạt gồm có Na, ca, Mg, P, Cu, Zn,
Fe, Mn…Ngoài ra, trong hạt đậu xanh còn chứa các enzyme như lipase, transferase,
hydrolase, lypoxygenase…[15], [17].


13

1.1.2. Mọt đậu xanh và ảnh hưởng của mọt đến bảo quản hạt đậu xanh
1.1.2.1. Đặc điểm của mọt gây hại đậu xanh
Mọt đậu xanh có tên khoa học là Callosobruchus chinensis Linne thuộc họ
mọt đậu (Bruchidae), bộ cánh cứng (Coleoptera). Mọt đậu xanh là loài đa thực, ăn
hại các loại đậu và các sản phẩm dược liệu có nguồn gốc thực vật như: đậu xanh,
đậu tằm, đậu đũa, đậu hà lan, đậu đen, hạt sen, đậu tương.... Trong đó, đậu xanh và
hạt sen là bị thiệt hại nặng nhất. Loài mọt này có mặt khắp nơi trên thế giới, các
vùng trồng đậu xanh ở nước ta đều có loại mọt này. Mọt đậu xanh thường có mặt
ngoài đồng ruộng vào thời gian đậu xanh sắp thu hoạch [5], [39], [154], [157].
Về đặc điểm hình thái, mọt đậu xanh thuộc nhóm biến thái hoàn toàn, chu kỳ
sống của chúng gồm 4 pha phát dục là trứng, sâu non, nhộng và trưởng thành [5], [39].
Mọt trưởng thành: con đực dài trung bình 2,5 mm, rộng 1,64 mm, con cái dài
trung bình 3 mm, rộng 1,8 mm. Thân hình bầu dục ngắn, toàn thân màu đen nâu,
màu nâu đỏ hay trà nâu, có nhiều lông nhỏ màu đen nâu, màu vàng nâu hay màu
trắng xám. Ðầu nhỏ, quặp về phía trước. Râu đầu có 11 đốt, râu con cái hình răng
cưa, râu con đực hình răng lược. Gốc râu, thân râu màu hồng nâu. Ðầu màu nâu tối,

phủ đầy chấm lõm và lông nhung màu vàng kim. Mép sau ngực trước ở giữa có 2
khóm lông hình bầu dục dài màu xám trắng. Mắt lồi, ngực trước có hình chóp cụt,
mặt lưng lồi tròn, cánh không che hết phần bụng. Trên hai rãnh của đốt đùi chân sau
có 2 răng, răng ngoài tù, răng trong dài và thẳng [5], [39], [154].
Trứng có hình bầu dục, một đầu to, một đầu nhỏ, chiều dài từ 0,4 - 0,6 mm
và chiều rộng 0,28 - 0,4 mm, màu vàng nhạt [5], [39].
Sâu non có 4 tuổi, màu sắc thay đổi tùy theo độ tuổi. Sâu non tuổi một có
chân rất nhỏ, tạm thời không phân đốt. Khi đẫy sức sâu non có chiều dài khoảng 3,5
mm, có màu trắng sữa, mập, có hình chữ C [5], [154].
Nhộng trần dài 3 - 3,5 mm, hình bầu dục to và mập, có nhiều lông nhỏ màu
vàng nhạt, đầu cong xuống [5], [39], [157].
Về đặc tính sinh vật học, trưởng thành mọt đậu xanh đẻ trứng vào các hạt mà
quả đã bị khô nứt vỏ hoặc vỏ bị côn trùng ăn hại bỏ sót lại. Sau một thời gian ngắn
thì trứng nở thành sâu non, sâu non ăn phần thịt của hạt và làm cho hạt rỗng, phân
thải ra trong quá trình này làm cho hạt bị biến đổi thành màu vàng nâu hoặc nâu


14

đen. Sâu non khi đẫy sức hóa nhộng, vũ hóa ngay trong hạt, trưởng thành sau vũ hóa
một ngày chui ra từ một lỗ tròn ở vỏ hạt. Con đực chui ra được hơn nửa giờ bắt đầu
giao phối, sau giao phối khoảng hơn 5 giờ con cái bắt đầu đẻ trứng. Mọt có thể đẻ
trứng trên quả ở ngoài đồng hay trên hạt ở trong kho, có thể đẻ liên tục 2 - 3 quả trên
cùng 1 hạt. Thời gian các pha phát dục của mọt là: giai đoạn trứng từ 4 - 15 ngày,
trung bình 6 ngày. Giai đoạn sâu non từ 13 - 34 ngày. Giai đoạn nhộng từ 3 - 18 ngày.
Thời gian sống của mọt trưởng thành phụ thuộc vào các yếu tố sinh thái, đặc biệt là
yếu tố nhiệt độ và độ ẩm. Trung bình trưởng thành sống được từ 36 đến 39 ngày
trong điều kiện mùa đông và 6 đến 7 ngày trong điều kiện mùa hè. Mọt phát dục thích
hợp nhất ở 22oC - 29,5oC và độ ẩm 88 - 100 % [150] . Mọt không có khả năng đẻ
trứng khi nhiệt độ dưới 10oC, và trên 37oC [150]. Vòng đời của mọt đậu xanh phụ

thuộc vào các yếu tố như độ nhiệt, độ ẩm và thức ăn, thời gian từ 18 - 60 ngày.
Trong điều kiện hoàn toàn thích hợp, một con cái có thể đẻ từ 80 - 100 trứng. Nếu
điều kiện không thích hợp, thì vòng đời của mọt có thể kéo dài đến 196 ngày. Tập
tính của mọt đậu xanh đã được nghiên cứu chi tiết về tập tính giao phối của con đực
[79], nghiên cứu về vai trò của con đực đối với khả năng sinh sản của con cái [39].
Mỗi năm mọt đậu xanh thường có từ 4 - 5 lứa, có thể có từ 8 - 11 lứa (nếu trong điều
kiện thích hợp).
Về đặc điểm sinh thái học
Theo Chavan và cs (1997), mọt trưởng thành có đời sống ngắn, khoảng 12
ngày trong điều kiện thích hợp. [42]. Vòng đời khoảng 22 đến 25 ngày trong điều
kiện thích hợp. Nhiệt độ thích hợp cho mọt đậu xanh đẻ trứng là ở 23 oC. Trứng dính
chặt vào vỏ của hạt ký chủ, những giống có vỏ hạt nhẵn phù hợp cho sự đẻ trứng
hơn những giống có vỏ hạt ráp [42], [103]. Sau khi đẻ 5 - 6 ngày thì trứng bắt đầu
nở [63]. Theo Borikar và cs (1996), Yongxue và cs (1998b) mọt đậu xanh được nuôi
dễ dàng trong phòng thí nghiệm và sự phát triển của nó bị ảnh hưởng lớn bởi nhiệt
độ và độ ẩm [34], [150].
Ấu trùng phát triển hoàn toàn trong một hạt, tạo thành hang khi phát triển.
Nhiệt độ tối thích cho mọt đậu xanh phát triển là 37 oC và độ ẩm 90%. Thời gian
phát triển tối thiểu là 22 - 23 ngày. Sự xâm nhiễm thường xảy ra trên đồng


15

ruộng, trứng được đẻ trên vỏ quả khi chín [95], [117]. Khi quả khô khả năng xâm
nhiễm của mọt giảm [39].
Nghiên cứu về sự cạnh tranh giữa loài C. chinensis và C. maculatus, Koichi
fujii (1967) cho thấy, trong điều kiện nhiệt độ 30 oC và độ ẩm 70% bổ sung thêm
thức ăn ở các khoảng thời gian khác nhau thì không thấy có kết quả về của sự cạnh
tranh giữa hai loài [73]. Cũng ở điều kiện trên, khi sử dụng hai nguồn thức ăn khác
nhau là đậu khô (hàm lượng nước là 11%) và đậu thường (hàm lượng nước khoảng

15%) thì cũng không thấy có sự khác nhau về kết quả cạnh tranh thức ăn. Nhưng ở
điều kiện nhiệt độ 32oC và độ ẩm 64% thì thấy có kết quả của sự cạnh tranh, do sự
khác nhau về tỷ lệ phát triển và số lượng trứng giữa hai loài.
1.1.2.2. Tác hại của mọt trong quá trình bảo quản đậu xanh
Sau khi thu hoạch, hạt đậu xanh cần được bảo quản để sử dụng làm lương
thực, thực phẩm, thức ăn chăn nuôi và nhiều mục đích khác nhau, mà thiệt hại do
côn trùng gây ra trong qúa trình bảo quản hạt có thể lên tới 5 - 10% (ở khu vực ôn
đới) và 20 - 30% (ở khu vực nhiệt đới) [5], [96]. Đặc biệt, với đặc điểm khí hậu
nước ta nóng ẩm quanh năm, có nhiều loại mọt hại đậu xanh trong kho bảo quản
nhưng mọt đậu xanh loài C. Chinensis là đối tượng gây hại nghiêm trọng nhất,
chúng có khả năng thích ứng rộng với điều kiện ngoại cảnh và có sức sinh sản
nhanh. Sự xâm nhiễm có thể bắt đầu từ ngoài đồng trước khi thu hoạch, sau đó theo
vào trong kho bảo quản. Sự lây nhiễm có thể làm giảm đáng kể về khối lượng, chất
lượng và hàm lượng protein của hạt [154]. Ngoài ra nó còn gây hại nghiêm trọng
đối với các loại đậu đỗ khác, như: đậu tương, đậu hà lan, đậu đũa và đậu năng, đậu
đỏ, đậu đen... Ngoài ra, mọt đậu xanh còn gây hại trên hạt bông, lúa miến và ngô
[29]. Cả mọt trưởng thành và sâu non đều gây hại. Khối lượng hạt bị hao hụt do mọt
có thể lên đến 55 - 60% [52] và hao hụt về hàm lượng protein là 45,50 - 66,30%
[73]. Một sâu non có thể gây hại vài hạt đậu [63]. Trong trường hợp bị nhiễm mọt,
hạt bị mất khả năng nảy mầm và không sử dụng được. Khi bị xâm nhiễm nặng, thiệt
hại có thể lên đến 100% và chỉ còn lại phần vỏ hạt. Nghiên cứu sự thiệt hại về chất
lượng của hạt đậu xanh kết quả cho thấy sự thiệt hại có thể lên tới 90%. Tỷ lệ thiệt


16

hại hạt đậu xanh trong quá trình bảo quản do C. chinensis ở Pakistan gây ra là
12,18% [56].
1.1.2.3. Một số biện pháp phòng trừ mọt hại đậu xanh
Sau khi thu hoạch hạt đậu xanh được bảo quản chủ yếu ở dạng hạt khô và

hạt khô dễ bị tấn công bởi mọt, gây ra thiệt hại lớn. Hiện nay người ta có thể sử
dụng nhiều biện pháp khác nhau để phòng trừ mọt đậu xanh. Nhưng có hai
phương pháp được sử dụng phổ biến nhất đó là phương pháp hóa học và phương
pháp vật lý [33].
Phòng trừ bằng hóa học
Có thể xử lý hạt bằng xông hơi methyl bromide hoặc phosphine, mặc dù sự
đăng ký sử dụng sản phẩm này ở nhiều khu vực có thể bị hạn chế hoặc bị cấm
[118]. Philips (1994) cho rằng, biện pháp hóa học có hiệu quả rất cao đối với mọt
đậu, có thể đạt 90 - 99% với các loại thuốc hóa học thuộc nhóm lân hữu cơ và
pyrethroid. Các hoá chất pyrethrin là những hợp chất hữu cơ thiên nhiên mà có chứa
hoạt tính diệt côn trùng mạnh [109].
Việc sử dụng bừa bãi thuốc hóa học trừ côn trùng dẫn đến một số vấn đề như
tăng tính kháng thuốc của côn trùng, các tàn dư độc hại trên hạt, gây ô nhiễm môi
trường và tăng chi phí. Do đó, hiện nay người ta quan tâm nhiều đến việc sử dụng
các chất có hoạt chất sinh học được chiết xuất từ thực vật. Việc trộn hạt với dầu
thực vật, tro hoặc lá có mùi thơm cũng có hiệu quả trong việc hạn chế tác hại của
mọt đậu xanh [73]. Một số các loài cây, sản phẩm chiết xuất từ cây có tác dụng hạn
chế tác hại của mọt đậu xanh và các loài dịch hại thuộc họ Bruchidea khác như: cây
keo Ả Rập (Acacia nilotica), cây thủy xương bồ (Acorus calamus), Cây cỏ xước
(Achyranthus aspera), cây gội nước (Amoora rohituka), Cây cốt khí muồng (Cassia
occidentalis), cây bạch đàn trắng lá nhỏ (Eucalyptus tereticornis), cây hoa ngũ sắc
(Lantana camara), cây lanh (Linum usitatissinum),...[39].
Hóa chất có nguồn gốc thực vật được biết đến phổ biến nhất là azadirachtin,
chất này được dùng riêng ở dạng thuốc thảo mộc hoặc ở dạng hỗn hợp như một
thành phần của lá hoặc dạng chiết xuất của cây xoan ấn độ (Azadirachta indica).
Azadirachtin có tác dụng hạn chế sự đẻ trứng và tiêu diệt sâu non và mọt trưởng


17

thành. Dầu của cây xoan Ấn độ và chất chiết xuất khác có thể sử dụng trực tiếp để
bảo quản hạt đậu xanh [155].
Trong bảo quản hạt đậu xanh, Farid Asif Shaheem (2006) đã nghiên cứu hiệu
quả sử dụng bột ớt, bột oliu và bột lá chè xanh trong phòng chống sự xâm nhiễm và
phá hủy hạt của mọt Callosobruchus chinensis. Kết quả cho thấy bột ớt, bột oliu,
bột lá chè có tác dụng chống mọt và trong cùng một khối lượng hạt đậu xanh bảo
quản, cùng thời gian và cùng liều lượng bột xử lý thì hiệu quả chống mọt có sự khác
nhau giữa bột ớt, bột liu và bột đậu xanh [56].
Phòng trừ bằng biện pháp vật lý
Nhiệt độ là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự phát triển của mọt. Việc xử lý
nhiệt đã được quan tâm nhiều trong những năm gần đây trong việc làm sạch hàng
hóa bảo quản và xu hướng này đang tiếp tục được áp dụng rộng rãi để diệt trừ dịch
hại [85], [86]. Việc sử dụng nhiệt độ cao là một biện pháp được sử dụng phổ biến để
phòng trừ dịch hại trong bảo quản hạt. Hầu hết các dịch hại trong bảo quản bị chết ở
nhiệt độ trên 40oC [61]. Tuy nhiên, nhiệt độ thấp cũng được sử dụng trong phòng trừ
mọt hại. Evans (1987) công bố rằng xử lý nhiệt độ thấp, kết hợp với làm khô bảo vệ
hạt khỏi sự tấn công và gây hại của dịch hại hơn là việc xử lý diệt trừ [55]. Việc tăng
nhiệt độ làm tăng tỷ lệ trao đổi chất, theo đó làm giảm trọng lượng sản phẩm bảo
quản nhanh hơn. Ở nhiệt độ thấp khả năng đẻ trứng giảm và khả năng phát triển của
côn trùng chậm điều này kéo dài thời gian trước khi quần thể tăng đến ngưỡng gây
hại kinh tế [73].
Sử dụng năng lượng điện tử ở mức nhẹ để phòng trừ mọt, thí nghiệm này được
tiến hành ở phòng thí nghiệm đối với mọt ở các giai đoạn khác nhau. Mọt ở 0, 2, 4,
6, 8, 10, 12, 14, 16 và 18 ngày tuổi xử lý ở mức 170 kv trong vòng 20 phút, kết quả
cho thấy sự mẫn cảm đối với bức xạ điện tử giảm khi tuổi của mọt tăng, giai đoạn
trứng dễ nhiễm bức xạ điện tử cao nhưng ngược lại giai đoạn 18 ngày tuổi thì mọt
trưởng thành vẫn hoàn toàn phát triển được. Do vậy, để đạt được tỷ lệ chết ở giai
đoạn trưởng thành 80% phải xử lý ở mức năng lượng cao hơn (200 kv). Đối với mọt
trưởng thành sống sót còn lại thì ảnh hưởng tới sức đẻ trứng, thời gian sống. Đây là
một biện pháp rất hiệu quả và an toàn vì nó không ảnh hưởng tới khả năng nảy mầm

của hạt đậu [157].


18

Đối với bất kỳ một loại sâu bệnh nào việc nghiên cứu để tìm ra giống có khả
năng chống chịu là khâu không thể thiếu trong công tác quản lý dịch hại tổng hợp,
vì vậy các nhà khoa học đã tiến hành thử nghiệm 5 giống đậu xanh: Parbat, Paidar91, Pb-2000, CM-2000, bittler-98 thì thấy khả năng kháng mọt của các giống là rất
khác nhau thể hiện ở số lượng trứng, tỷ lệ hao hụt khối lượng, số lượng mọt trưởng
thành, số lượng lỗ đục. Kết quả thí nghiệm cho thấy giống Parbat là giống bị nhiễm
nặng, còn giống Bittle-98 có khả năng kháng mọt cao [158].
1.1.3. Đánh giá khả năng kháng mọt của đậu xanh
Có rất nhiều phương pháp để đánh giá khả năng kháng mọt đục hạt đậu xanh.
Liu và cs năm 2016 đã nghiên cứu về khả năng kháng mọt đục hạt ở đậu xanh bằng
phương pháp so sánh hệ gen của các giống đậu xanh (Vigna radiata L. Wilczeck).
Kết quả so sánh hệ gen của các dòng bố mẹ kháng và nhạy cảm với mọt thế hệ con
cháu của chúng đã xác định được 91 gen biểu hiện khác nhau và phân loại thành 17
gen chính và 74 gen khác liên quan tính kháng mọt; một số lượng lớn gen này nằm
trên một vùng của nhiễm sắc thể số 5 [82]. Sibakwe và cs (2015) đã đánh giá các
mức độ kháng mọt Acanthoscelides obtectus và mọt Zabrotes subfasciatus của một
vài giống đậu ở quy mô phòng thí nghiệm. Kết quả nghiên cứu đã chỉ ra rằng mức
độ kháng của 7 giống đậu xanh với hai loài mọt Acanthoscelides obtectus và
Zabrotes subfasciatus có sự khác nhau rõ rệt trong thời gian lưu trữ từ 15 ngày đến
120 ngày [116].
Năm 2014, Duraimunrugan và cs đã sử dụng phương pháp sàng lọc khả năng
kháng mọt đậu xanh của các kiểu gen đậu xanh và đậu đen nhằm tìm hiểu sự ảnh
hưởng của đặc điểm hình thái, sinh lý của hạt tới khả năng kháng mọt. Sử dụng 335
giống đậu xanh và 140 giống đậu đen thuộc chi Vigna đem kiểm tra ngẫu nhiên, kết
quả thu được 8 giống đậu xanh và 9 giống đậu đen được xác nhận có tính kháng
mọt trong điều kiện phòng thí nghiệm. Tám giống đậu xanh và chín giống đậu đen

có chỉ số mẫn cảm thấp với mọt trong sàng lọc ở phép kiểm tra “lựa chọn tự do”
được chọn để xác nhận thêm tính kháng trong phép kiểm tra “không lựa chọn” [51].


19

Theo Hà Quang Hùng (2005) và Tomooka và cs (1992) khả năng kháng mọt
của các giống đậu xanh được đánh giá bằng phương pháp lây nhiễm mọt nhân tạo.
Sử dụng 3 cặp mọt đậu xanh ban đầu thả vào hộp nhựa có nắp gắn lưới ngăn côn
trùng đựng 100g hạt đậu xanh và theo dõi các chỉ tiêu như khối lượng hạt hao hụt,
hệ số gia tăng quần thể, tỷ lệ nhiễm mọt ở các thời điểm sau 15 ngày, sau 30 ngày,
sau 45 ngày và sau 60 ngày nhiễm mọt và xác định chỉ số mẫm cảm với mọt của các
giống đậu xanh. Thí nghiệm chia làm 2 lô theo dõi, lô thí nghiệm (thả mọt) nhắc lại
3 lần và lô đối chứng (không thả mọt) [8], [138].
Như vậy, mọt đậu xanh có thể gây thành dịch từ một số lượng nhỏ cá thể do
mọt có khả năng sinh sản nhanh và thời gian phát triển cá thể ngắn. Cả mọt trưởng
thành và sâu non đều gây hại. Hiện nay người ta đã sử dụng nhiều biện pháp khác
nhau để bảo quản hạt đậu xanh nhưng không mang lại hiệu quả, mà lại tốn nhiều
thời gian công sức. Vì thế, hướng giải quyết hiệu quả là chọn tạo những giống đậu
xanh chuyển gen có khả năng kháng mọt.
1.2. DEFENSIN THỰC VẬT

1.2.1. Các nhóm defensin thực vật
Defensin là những phân tử protein nhỏ, giàu cystein được tìm thấy ở cả động
vật có xương sống, động vật không xương sống và thực vật [58]. Về mặt chức năng,
chúng là những peptide bảo vệ. Defensin có hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm và
kháng nhiều loại virus.
Defensin thực vật đầu tiên được phân lập từ lúa mỳ (Triticum aestivum) [44],
[74], và lúa mạch (Hordeum vulgare) [89]. Cho tới nay, người ta đã xác định được
có hơn 80 loại defensin thực vật. Nhóm defensin thực vật khá đa dạng tương ứng

với vị trí khác nhau của các amino acid cũng như nhóm 8 gốc cystein trong tất cả
các loại defensin thực vật [131], [136]. Sự khác biệt trong cấu trúc bậc một dẫn đến
sự khác nhau về hoạt tính sinh học đối với các loại defensin này.
Sự phân nhóm defensin được đề xuất dựa trên nguồn gốc phát sinh và phân
tích 139 trình tự gen mã hóa defensin được chia thành 18 nhóm có chức năng khác
nhau, như tính kháng nấm, kháng khuẩn, ức chế α- amylase, ức chế trypsin, ức chế
tổng hợp protein, chặn kênh trao đổi ion Na+, chịu kẽm,…[92], [99].


20

Defensin nhóm 1 là các chất ức chế tổng hợp protein, ức chế hoạt động của
α-amylase và chặn kênh natri, có độ tương đồng trên 90% và tạo thành một nhóm
riêng biệt. Các thành viên khác của nhóm 1 thể hiện hoạt tính kháng nấm và kháng
khuẩn [120], [130]. Tuy nhiên, tồn tại hay không tồn tại sự ức chế tổng hợp protein,
ức chế các enzyme có hoạt tính kháng nấm và kháng khuẩn còn chưa được biết đến
Chỉ một thành viên trong nhóm này được nghiên cứu hoạt tính kháng nấm là
MtDef4. Defesin này ức chế sự sinh trưởng của Fusarium graminearum mà không
làm tăng sự phân nhánh sợi nấm.
Defensin thuộc nhóm 2 gồm hai loại defensin phân lập từ cây ớt (Capsium)
và một trong số này được xác nhận là có mặt trong suốt quá trình chín của quả.
Nhóm 3 gồm các defensin tách từ cây vân sam (Spruce) và cây bạch quả (Gingko
biloba), một trong số đó có hoạt tính kháng nấm in vitro [53]. Defensin thuộc nhóm
4 có hoạt tính ức chế α-amylase và chặn kênh trao đổi ion Na+. Hai loại defensin
của củ cải đường là thành viên của nhóm 5, có khả năng ức chế sự sinh trưởng của
nấm sợi nhưng không có tác dụng với vi khuẩn và được biểu hiện ở lá. Một
defensin từ cây Arabidopsis là thành viên duy nhất của nhóm 6 đến nay còn chưa
được nghiên cứu kỹ. Defensin thực vật nhóm 7 chỉ gồm các defensin từ cây họ cà
(Solanaceous), đều có hoạt tính kháng nấm và chỉ biểu hiện ở hoa. Defensin thực
vật nhóm 8 bao gồm một peptide kháng nấm biểu hiện ở nhị hoa của cây cải bắp

Brassica campestri (BsD1). Hầu hết các defensin được nghiên cứu kĩ đến nay là các
defensin kháng nấm của nhóm 9, nhóm này có thể được chia thành 3 nhánh, trong
đó có defensin liên quan đến tính trạng hình thái, gây ra sự tăng phân nhánh sợi
nấm và sự phồng ở những sợi nấm; trong khi defensin của nhánh còn lại không liên
quan đến hình thái. defensin thuộc nhánh 9.3 có nguồn gốc từ họ cải (Brassicaceae)
với đại diện điển hình là RsAFP2 của cây cải củ. RsAFP2 tác động kháng nấm bằng
cách liên kết với glucosylceramide (GlCer) trên thành của nấm [41]. Nhóm 10 gồm
hầu hết các defensin kháng nấm, được phân lập từ các cây họ đậu (Fabaceae). Một
loại defensin tách từ cây đậu thuộc nhóm 10 di chuyển vào trong nhân của nấm,
được dự đoán làm dừng chu kỳ tế bào thông qua tương tác với protein điều khiển
chu kỳ tế bào [147]. Một thành viên khác của nhóm này có khả năng chặn các kênh


21

canxi ở động vật có vú và được dự đoán là can thiệp vào sự cân bằng nội môi trong
tế bào nấm, dẫn đến làm cản trở sự sinh trưởng [127]. Tất cả defensin của nhóm 12
và 13 được nghiên cứu chức năng đều thể hiện hoạt tính kháng khuẩn. Hai defensin
của nhóm 13 cũng có hoạt tính ức chế α-amylase và hoạt tính kháng nấm (VaD1,
VrD1). Nhóm 14 gồm các defensin từ ngô được biểu hiện trong giao tử cái và
tương tác với một kênh kali trên ống phấn gây vỡ ống phấn [31]. Defensin từ nhóm
15 đến 18 mỗi loại chỉ chứa một thành viên. Defensin ZmESR6 tách từ ngô thuộc
nhóm 15 có hoạt tính chống lại cả nấm và vi khuẩn. Defensin SoD2 (nhóm 16) là
một peptide kháng khuẩn và kháng nấm. Brazzein (nhóm 17) là một peptide có vị
rất ngọt từ quả của loài cây bui hay dây leo (Pentadiplandra brazzeana) và ATTp
(nhóm 18) là một chất ức chế trypsin tách từ cây Arabidopsis [152]. Kết quả phân
tích chức năng của các nhóm defensin cho thấy; các defensin trong cùng nhóm có
hoạt tính giống nhau, còn các defensin khác nhóm thì có hoạt tính khác nhau.
Chẳng hạn, các loại defensin của củ cải RsAFP1-4 đều phân bố trong cùng nhóm và
thể hiện hoạt tính kháng nấm. Defensin của cây đậu xanh (Vigna radiata) VrD1

thuộc nhóm 13 là một chất ức chế α-amylase, trong khi VrD2 thuộc nhóm 10 thì
không có hoạt tính này. Điều này có thể nhận xét rằng phương pháp phân tích phát
sinh chủng loại có thể là một công cụ hữu ích để dự đoán chức năng của các
defensin mới.
1.2.2. Cấu trúc của defensin thực vật
Defensin thực vật là một chuỗi polypeptide gồm đoạn dẫn đầu là peptide tín
hiệu định hướng vận chuyển đến vùng ngoại bào và đoạn còn lại là miền peptide
trưởng thành. Một số defensin ở thực vật có hoa còn thêm miền kết thúc ở đầu
carboxyl [40]. Dựa vào cấu trúc tiền protein có thể chia các defensin thực vật làm
2 lớp chính: Lớp đầu tiên và lớn nhất là các phân tử tiền protein có chứa trình tự
tín hiệu và vùng defensin. Những protein này được vận chuyển theo con đường
tiết và không có nhân tố tín hiệu cụ thể cho quá trình biến đổi sau dịch mã hay
hướng đích dưới cấp độ tế bào (hình 1.1.A). Điểm nối giữa miền peptide tín hiệu
và miền defensin ở điểm đẳng điện (pI) bằng 3.1 [36]. Lớp defensin thứ hai được


22

sản sinh ra từ các phân tử tiền protein lớn hơn do có chứa tiền miền kết thúc C (Cterminal prodomain) (hình 1.1.B). Những defensin này được tìm thấy ở mô hoa và
quả của cây họ Cà. Một giả thuyết về chức năng của miền kết thúc C (C-terminal)
liên quan đến tín hiệu điều chỉnh sau dịch mã và bị phân hủy sau dịch mã [85].

Hình 1.1. Sơ đồ cấu trúc tiền protein của hai lớp defensin thực vật (Lay và cs, 2005)
[80]

Peptide trưởng thành của defensin thực vật có tính bazơ với điểm đẳng điện
pI khoảng 9,0. Miền defensin trưởng thành của defensin có khoảng 45 - 54 amino
acid, có khối lượng phân tử nhỏ từ 5 - 7 kDa. Defensin thực vật có một mô hình cấu
trúc chung gồm ba phiến gấp nếp β và một chuỗi xoắn α, được giữa vững bởi bốn
cầu nối disunfide giữa các Cystein [40]. Trong đó, cầu nối disulfide thứ tư có chức

năng nối đầu N và đầu C tạo ra một cấu trúc protein ổn định của defensin thực vật.
Năm 2013, Nicole và cs đã phân tích 139 trình tự amino acid của defensin thực vật
và xác định được tám vị trí cystein và tạo bốn cầu nối disulfide giữa các cystein như
sau: Cys1-Cys8, Cys2-Cys5, Cys3-Cys6, Cys4-Cys7. Giữa các cystein nối với nhau
tạo ra cấu trúc vòng (loop) [98].
Để làm rõ về đặc điểm về cấu trúc không gian của các loại protein defensin
trên các đối tượng sinh vật khác nhau, Kết quả nghiên cứu của Emma và cs (2012)
đã cho thấy: defensin động vật có vú được đại diện bởi hai dạng α và β, sự khác
nhau cơ bản giữa chúng là cầu nối disulfide như hình 1.2 [54].


23

Hình 1.2. Cấu trúc không gian của protein defensin ở động vật (A), côn trùng (B)
và thực vật (C) (Emma và cs, 2012) [54]
Trong cấu trúc không gian ba chiều, trên bề mặt protein có sự phân bố điện
tích khác nhau với các sinh vật khác nhau. Và trong cấu trúc không gian của
defensin động vật có vú không có xoắn α, cấu trúc chỉ gồm ba phiến gấp nếp β.
Trong khi đó, defensin thực vật và côn trùng thì chứa một chuỗi xoắn α và ba phiến
gấp nếp β. Nếu trong chuỗi polypeptide của defensin giữa tám vị trí cystein tạo nên
7 vòng thì trong cấu trúc không gian tạo nên ba vòng với bốn cầu nối disunfide.
Vòng 1 (L1) được tạo ra giữa phiến gấp β1 và xoắn α, Vòng 2 (L2) được tạo bởi
xoắn α và nếp gấp β2, cuối cùng vòng 3 (L3) được tạo bởi nếp gấp β2 và β3 [81],
[97]. Trong cấu trúc không gian, các vòng lặp này có vai trò quan trọng, đặc biệt là
vòng 3 có liên quan đến hoạt tính sinh học của defensin.

Hình 1.3. Cấu trúc không gian của defensin thực vật (VrD2)
A: mặt trước, B: mặt sau, màu xanh: phiến gấp β , màu đỏ xoắn α, màu vàng hình
B: cầu nối disunfide (Lin và cs, 2007- A [81], Nicole và cs, 2013-B [97])

24

1.2.3. Hoạt động ức chế của defensin thực vật
Defensin thực vật hoạt động mạnh mẽ như là các protein ức chế, ảnh hưởng
đến chức năng kênh ion, ức chế quá trình dịch mã, tác động đến hoạt động của α –
amylase và trypsin, làm suy yếu vi sinh vật, làm thay đổi trạng thái oxy hóa khử
ascorbic acid.... Ngoài ra, defensin thực vật còn ức chế sự sinh trưởng và phát triển
của một loạt các loại nấm, vi khuẩn Gram dương/Gram âm và một số loại virus gây
bệnh ở thực vật [121].
1.2.3.1. Defensin ức chế quá trình dịch mã tổng hợp protein
Hoạt tính sinh học đầu tiên của defensin thực vật là ức chế quá trình dịch mã,
trong một hệ thống tế bào được mô tả bởi Mendez và cs, 1990 [89]. Một peptide
được phân lập từ nội nhũ lúa mạch gọi là γ-hordothionin, đã được chứng minh là có
tác dụng ức chế quá trình dịch mã ở gan chuột. Một peptide khác sau đó được chiết
xuất từ nội nhũ lúa mạch và đặt tên là ω-hordothionin, cũng có khả năng ức chế quá
trình dịch mã trong gan chuột, gan thỏ và trong hệ thống Escherichia coli. Các
defensin thực vật khác cũng được chứng minh là ức chế dịch mã. Protein VrD1 ức
chế dịch mã tổng hợp protein trong phôi lúa mì, ức chế hệ thống dịch mã trong tế bào
lưới của thỏ [45],[46], [47], [145]. Tuy nhiên, cơ chế của defensin thực vật ức chế
dịch mã trong tế bào chưa được nghiên cứu kỹ. Một số tác giả cung cấp bằng chứng
cho thấy: ở nồng độ cao, các defensin lúa mạch gây phosphoryl hóa tiểu đơn vị 2α
của yếu tố khởi đầu tổng hợp chuỗi polypeptide ở tế bào eukaryote, có thể là do sự
hoạt hóa của EIF-2α kinase. Vì vậy, các bước khác nhau trong hệ thống dịch mã
protein đã bị giảm. Sử dụng tế bào lưới thỏ, Mendez và cs đã cung cấp bằng chứng về
sự ức chế dịch mã protein của defensin xảy ra ở bước khởi đầu và bước kéo dài chuỗi
polypeptid.
1.2.3.2. Defensin ức chế enzyme
Ức chế α-amylase
Defensin thực vật có khả năng ức chế α-amylase và protease. Hoạt tính sinh

học của các defensin thực vật là khả năng ức chế α-amylase của côn trùng được báo


25

cáo bởi Bloch và Richardson [37]. Ba loại peptid Siα1, Siα2 và Siα3 đã biểu hiện
khả năng ức chế đặc hiệu enzyme tiêu hóa α-amylase của côn trùng, nhưng biểu
hiện hoạt tính ức chế yếu đối với α-amylase nước bọt của người và nấm. Enzyme αamylase từ tụy lợn, lúa mạch và vi khuẩn không bị ức chế bởi defensin thực vật.
Dựa trên khả năng ức chế α-amylase trong ruột côn trùng, defensin thực vật được đề
xuất sử dụng nhằm cản trở sự tiêu hóa của côn trùng và như vậy côn trùng không
phân giải được tinh bột hạt thực vật [37].
Phân tích biểu hiện chức năng sinh học của gen mã hóa cho defensin
VrD1 từ cây đậu xanh đã được xác định trong thí nghiệm là yếu tố kháng lại các
mọt Callosobruchus chinensis hại đậu azuki (đậu đỏ). Trong một nghiên cứu
khác, các hạt nhân tạo chứa 0,2% defensin tái tổ hợp đã thể hiện một hiệu ứng
gây chết đối với ấu trùng mọt đục hạt [47]. Những kết quả tương tự cũng thu
được khi kiểm tra VrD1 tái tổ hợp biểu hiện ở nấm men [46]. Nồng độ defensin
VrD1 tái tổ hợp 0,8% đã ức chế mạnh sự phát triển mọt đậu xanh trong một thí
nghiệm ở hạt nhân tạo [45].
Mặc dù VrD1 được chỉ ra là ức chế hệ thống dịch mã protein in vitro, nhưng
hoạt tính này có thể không liên quan đến sự ức chế sự tiêu hóa của côn trùng. Thay
vào đó, cơ chế mà defensin ngăn cản sự tăng trưởng của côn trùng có nhiều khả
năng là do sự ức chế α-amylase [144]. Cơ sở của sự ức chế α-amylase đã được đề
xuất dựa trên so sánh cấu trúc của các defensin khác nhau. VrD1 khác với các
defensin không có hoạt tính ức chế α-amylase ở chỗ có một vòng dài hơn giữa nếp
gấp β2 và β3. Vòng này có thể được chèn vào trung tâm hoạt động của α-amylase,
dẫn đến sự tương tác giữa trung tâm hoạt động của enzyme với cơ chất, do vậy ức
chế hoạt động của α-amylase. Phát hiện này đã giải thích rằng, các vòng ngắn ở các
defensin đã không thể tương tác với vị trí hoạt động của enzyme và do đó không
làm mất hoạt tính α-amylase của côn trùng. Các phân tử điện tích dương của các

amino acid trong vòng này như Arg38 được cho là có liên quan đến liên kết hydro
với vị trí hoạt động của enzyme [83].
Kết quả khảo sát hoạt động của defensin VrD2 từ cây đậu xanh đã bổ sung
cho cơ chế ức chế α-amylase của VrD1. Khác với VrD1, defensin VrD2 không ức