Phân lập đoạn gen CP từ soybean mosaic virus và phát triển vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi phục vụ tạo cây đậu tương chuyển gen kháng bệnh

1

MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) là cây trồng ngắn ngày, có giá trị
kinh tế, dinh dưỡng cao, là nguyên liệu cho công nghiệp và có tác dụng cải
tạo đất trồng và bảo vệ môi trường. Hiện nay, năng suất và sản lượng đậu
tương ở nước ta còn thấp, chất lượng hạt chưa cao do mức độ ổn định của
giống, ảnh hưởng của nấm, côn trùng, vi khuẩn, virus gây bệnh và các tác
động bất lợi khác từ ngoại cảnh. Đậu tương là một trong số các cây trồng dễ
bị nhiễm nhiều loại virus, như virus gây bệnh khảm lá (Soybean mosaic virus
– SMV), virus gây bệnh khảm vàng hại đậu đỗ (Bean yellow mosaic virus –
BYMV) và một số virus gây bệnh khác. Trong đó, SMV và BYMV là những
loại virus gây bệnh khảm có tác động xấu lớn nhất đến cây đậu tương.
SMV và BYMV được lây nhiễm từ cây bệnh sang cây khoẻ do rệp là
môi giới và virus có thể truyền qua hạt. Khi cây đậu tương bị bệnh, lá cây có
những phần xanh nhạt, đậm và biến vàng xen kẽ, lá non ở ngọn bị biến dạng,
đọt non xoăn lại, các đốt thân co ngắn, cây chậm phát triển, số lượng quả ít và
biến dạng, sần sùi, có vị đắng và thường lép. Bệnh khảm do SMV và BYMV
gây thiệt hại đáng kể về năng suất, chất lượng và sản lượng hạt đậu tương.
Năng suất đậu tương có thể giảm tới 40% khi các cây bị nhiễm virus trước khi
ra hoa và 91% hạt đậu thu được có vết lốm đốm, chất lượng kém [87]. Việc
nhiễm cùng lúc nhiều loại virus khác nhau sẽ gây thiệt hại lớn về năng suất và
chất lượng hạt [95].
Hiện nay, trong sản xuất đậu tương chủ yếu mới dừng ở biện pháp
phòng mà vẫn chưa có thuốc trị bệnh khảm do SMV và BYMV. Do đó các
biện pháp phòng bệnh bao gồm chọn lọc cây sạch bệnh để làm giống, vệ sinh
đồng ruộng, luân canh cây trồng, thu dọn tàn dư cây bệnh trên đồng ruộng, diệt
trừ côn trùng truyền bệnh. Tuy nhiên, các biện pháp trên thường có hiệu quả

2

thấp và tốn nhiều công sức. Biện pháp có hiệu quả nhất để phòng hai loài SMV
và BYMV là sử dụng các giống đậu tương kháng bệnh, nhưng nguồn giống
đậu tương kháng bệnh tự nhiên đối với SMV và BYMV là rất hạn chế. Chính
vì vậy hướng tiếp cận tạo cây đậu tương chuyển gen kháng virus được quan
tâm nghiên cứu, đó là chuyển các gen có nguồn gốc từ chính loài virus gây
bệnh theo nguyên lý của kỹ thuật RNA interference (RNAi).
RNAi được xem là một kỹ thuật hiện đại và có hiệu quả được ứng dụng
để kháng lại các loài virus gây bệnh ở thực vật. Dựa trên nguyên lý bất hoạt
gen sau phiên mã, một số tác giả đã ứng dụng thành công kỹ thuật RNAi
trong chiến lược tạo cây chuyển gen kháng virus [3], [31], [98].
Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Phân lập
đoạn gen CP từ Soybean mosaic virus và phát triển vector chuyển gen
mang cấu trúc RNAi phục vụ tạo cây đậu tương chuyển gen kháng bệnh”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
2.1. Mục tiêu chung
Tạo được dòng cây chuyển gen kháng virus gây bệnh khảm trên cây
đậu tương bằng kỹ thuật RNAi.
2.2. Mục tiêu cụ thể
(i) Xác định được trình tự đoạn gen CP từ SMV gây bệnh khảm ở cây đậu
tương Việt Nam.
(ii) Phát triển vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi chứa đoạn gen CPi của
SMV và cả hai loài SMV và BYMV.
(iii) Tạo được cây thuốc lá chuyển gen mang cấu trúc RNAi có khả năng
kháng SMV và BYMV cao hơn cây đối chứng không chuyển gen;
(iv) Tạo được cây đậu tương chuyển gen mang cấu trúc RNAi .

3

3. Nội dung nghiên cứu
3.1. Thu thập thông tin về hệ gen và gen CP của SMV, thiết kế cặp mồi và
nhân đoạn gen CP, tách dòng và xác định trình tự đoạn gen CP từ SMV. Phân
tích sự đa dạng về trình tự đoạn gen CP, trình tự amino acid suy diễn của gen
CP phân lập từ SMV ở Việt Nam và một số trình tự đã công bố trên Ngân
hàng gen quốc tế.
3.2. Phân tích sự tương đồng của gen CP trong hệ gen của SMV và BYMV
phân lập từ nhiều nguồn khác nhau. Xác định đoạn bảo thủ của gen CP và
tổng hợp nhân tạo đoạn CPi từ thông tin về gen CP.
3.3. Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi chứa đoạn gen CPi của
SMV và của hai loài SMV và BYMV bằng kỹ thuật Gateway. Biến nạp
vector chuyển gen mang đoạn gen CPi đã thiết kế vào A. tumefaciens.
3.4. Biến nạp cấu trúc RNAi vào cây thuốc lá. Phân tích sự có mặt của đoạn
gen CPi của hai loài SMV và BYMV trên cây thuốc lá chuyển gen bằng kỹ
thuật PCR. Đánh giá tính kháng đối với SMV và BYMV của cây chuyển gen
so với cây đối chứng không chuyển gen.
3.5. Chuyển cấu trúc RNAi vào cây đậu tương thông qua A. tumefaciens.
Phân tích, xác định sự có mặt của đoạn gen chuyển CPi trên cây đậu tương
chuyển gen.
4. Những đóng góp mới của luận án
4.1. Phân lập được đoạn gen CP từ SMV dòng SL1 và SL2 có kích thước 720
nucleotide, mã hóa 240 amino acid. Hai trình tự đoạn gen CP của SMV đã
được đăng ký trên Ngân hàng gen quốc tế với mã số HG965102, HG965103.
4.2. Phát triển thành công hai vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi có khả
năng kháng đơn loài SMV và khả năng kháng đồng thời hai loài SMV và
BYMV.

4

4.3. Tạo được 19 dòng cây thuốc lá chuyển gen mang cấu trúc RNAi có khả

năng kháng cả hai loài SMV và BYMV.
4.4. Chuyển thành công cấu trúc RNAi vào hai giống đậu tương ĐT12 và
DT2008, thu được 5 dòng cây chuyển gen từ giống ĐT12 và 19 dòng cây
chuyển gen từ giống DT2008.
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
5.1. Về khoa học
Việc phát triển thành công vector chuyển gen mang cấu trúc gen RNAi
chứa đoạn gen CPi kháng đơn loài SMV và kháng đồng thời cả hai loài SMV,
BYMV để tạo được cây thuốc lá chuyển gen có tính kháng đối với SMV và
BYMV cao hơn cây đối chứng không chuyển gen đã khẳng định cơ sở khoa
học và tính hiệu quả của biện pháp sử dụng các gen có nguồn gốc từ chính
loài virus gây bệnh để chuyển vào cây trồng nhằm tạo cây chuyển gen kháng
virus theo nguyên lý của kỹ thuật RNAi.
5.2. Về thực tiễn
Kết quả lây nhiễm vi khuẩn A. tumefaciens tái tổ hợp vào mô đậu tương
đã tổn thương và tái sinh thành công cây đậu tương chuyển gen mang cấu trúc
RNAi chứa đoạn gen CPi của SMV và BYMV đã cho thấy khả năng ứng
dụng kỹ thuật chuyển gen và kỹ thuật RNAi trong chọn tạo giống đậu tương ở
Việt Nam.
Kết quả thiết kế vector chuyển gen mang đoạn gen CPi của SMV và
BYMV theo nguyên lý kỹ thuật RNAi để tạo được cây chuyển gen đối với
thuốc lá và đậu tương đã khẳng định hướng nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật
RNAi và mở ra triển vọng ứng dụng mới trong thực tiễn chọn giống cây trồng
ở Việt Nam.



5

Chương 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. BỆNH KHẢM DO VIRUS Ở CÂY ĐẬU TƯƠNG
1.1.1. Cây đậu tương và bệnh virus ở cây đậu tương
Cây đậu tương có tên khoa học là Glycine max (L.) Merill (2n = 40)
thuộc họ đậu (Fabaceae), họ phụ cánh bướm (Papilinoideae). Đậu tương là
loại cây trồng quan trọng bởi giá trị dinh dưỡng và giá trị cải tạo đất. Hạt đậu
tương chứa khoảng 40% protein, 20% lipid và chứa nhiều chất quan trọng cho
hoạt động sinh lý của cơ thể người và động vật, như: isoflavone, lecithin,
tocopherol và saponin. Thêm nữa hạt đậu tương còn chứa nhiều protein chức
năng và là nguồn thực phẩm rẻ tiền, có vai trò trong chăm sóc và bảo vệ sức
khỏe con người [149], [158]. Các sản phẩm từ đậu tương đã tăng lên đáng kể
so với các loại cây trồng khác do nhu cầu về protein và dầu [82].
Cây đậu tương là cây trồng cạn ngắn ngày, lấy hạt và thuộc nhóm cây
hàng năm. Rễ của cây đậu tương là loại rễ cọc, gồm rễ chính và các rễ bên. Rễ
tập trung ở tầng đất mặt 30 – 40 cm, ăn lan khoảng 20 – 40 cm. Trên rễ có
nhiều nốt sần chứa vi khuẩn Rhizobium japonicum có khả năng cố định đạm
[1]. Thân cây đậu tương ít phân cành, cây thảo, dạng bụi, có hình trụ, nhiều
lông, mang nhiều đốt, thân thường đứng, có khi dạng bò hay nửa bò. Cành đậu
tương mọc ra từ các đốt trên thân, đốt đầu tiên của thân chính mang hai lá
mầm, đốt thứ hai mang hai lá đơn đối nhau, từ đốt thứ ba trở lên mỗi đốt mang
một lá kép. Đậu tương là cây tự thụ phấn, hoa lưỡng tính, hoa được phát sinh từ
nách lá, đầu cành hoặc đầu thân. Hoa thuộc hoa cánh bướm, mọc thành chùm,
có màu tím hay trắng, thời kỳ cây ra hoa sớm hay muộn, thời gian dài hay ngắn
tuỳ thuộc vào giống và thời vụ gieo do chịu ảnh hưởng phối hợp của ánh sáng
và nhiệt độ [1], [2]. Quả đậu tương là loại quả ráp, bên ngoài vỏ quả thường có
lớp lông bao phủ, màu sắc vỏ khi chín có màu vàng hoặc xám đen. Quả thẳng

6

hoặc hơi cong. Mỗi quả thường có từ 1 - 4 hạt nhưng phổ biến là 2 hạt. Hạt đậu

tương có nhiều hình dạng như bầu dục, tròn dài, tròn dẹt. Vỏ hạt thường nhẵn
và có màu vàng nhạt, vàng đậm, xanh, nâu, đen… nhưng đa số là hạt màu
vàng. Khối lượng hạt dao động từ 200 – 400 mg/hạt và khối lượng 1000 hạt
dao động trung bình 100-200g. Hình dạng và màu sắc rốn hạt là dấu hiệu đặc
trưng cho mỗi giống đậu tương [1], [2].
Với những giá trị kinh tế và giá trị sử dụng, đậu tương được xem là loại
cây trồng chiến lược của nhiều quốc gia trên thế giới, với vị trí đứng thứ tư
chỉ sau lúa, ngô và lúa mỳ. Ở Việt Nam, cây đậu tương được trồng từ rất lâu
và nhu cầu tiêu thụ đậu tương cũng rất lớn, nên sản xuất đậu tương trong nước
đang được chú trọng, diện tích gieo trồng vì thế đã tăng lên đáng kể. Đậu
tương được trồng ở cả 7 vùng nông nghiệp, ở 28 tỉnh thành trên khắp cả nước,
trong đó 70% ở miền Bắc và 30% ở miền Nam. Cây đậu tương ở nước ta
được trồng chủ yếu ở vùng cao, những nơi đất không cần màu mỡ (khoảng
65%) và 35% được trồng ở những vùng đất thấp, ở khu vực đồng bằng sông
Hồng. Theo số liệu của Tổng cục thống kê, từ năm 2008 đến nay, diện tích
trồng, năng suất và sản lượng đậu tương không có sự tăng đáng kể so với
những năm trước. Nguồn giống đậu tương kháng bệnh và chống chịu cao là
một trong các nguyên nhân chính có thể giải thích cho sự phát triển chậm của
ngành sản xuất đậu tương ở nước ta. Vì vậy, nghiên cứu ứng dụng công nghệ
sinh học nhằm cải thiện tính kháng bệnh của cây đậu tương là cách tiếp cận
mới, có hiệu quả đối với ngành chọn giống đậu tương hiện nay.
Cây đậu tương có thể mắc một số bệnh do vi khuẩn, nấm hoặc virus,
như bệnh khảm do SMV hoặc BYMV, bệnh gỉ sắt hại đậu tương do nấm
Phakopsora pachyrhizi, bệnh Sương mai (đốm phấn) do nấm
Peronospora manshurica, bệnh lở cổ rễ do nấm Rhizoctonia solani hoặc
Fusarium solani fsp. Phaseoly, bệnh đốm lá vi khuẩn hại đậu tương và một số
bệnh hại khác. Thống kê trên thế giới cho thấy có hơn 100 loại virus gây hại

7

trên cây đậu tương. Bệnh virus đậu tương phân bố rộng khắp và gây thiệt hại
lớn đến năng suất và chất lượng sản phẩm. Tại những nơi bị nhiễm bệnh
nặng, năng suất có thể bị giảm đến 50% ở ngoài đồng, mức giảm có thể lên
đến 93% - 95% trong điều kiện lây nhiễm trong thí nghiệm [17]. Một số nước
có tỷ lệ thiệt hại lớn do bệnh virus ở đậu tương, như vùng Georgia ở Mỹ
(37%), Australia và Thái lan (60%), New Zealand và khu vực Bắc Mỹ (40-
50%) [28], [80], [158].
Bệnh khảm đậu tương do virus nhóm khảm (Potyvirus) gây ra. Bệnh
được phát hiện lần đầu tiên ở Mỹ vào năm 1900 và đến nay virus khảm đậu
tương đã có mặt hầu hết ở các vùng trồng đậu tương trên thế giới [80]. Việt
Nam cũng đã công bố phát hiện loại virus này từ năm 1994, chủ yếu tập trung
ở những vùng trồng đậu tương lớn, như khu vực trung du, miền núi Bắc bộ,
khu vực Đồng Bằng Sông Hồng và Tây Nguyên [1], [12].
Các nhà khoa học đã xác định có một số loài virus đặc biệt nguy hiểm,
gây hại trên cây đậu tương, trong đó có SMV và BYMV [17], [73]. SMV là
loài virus gây bệnh khảm ở cây đậu tương, thuộc nhóm Potyvirus, họ
Potyviridae, và là một trong những virus chủ yếu nhất gây bệnh ở đậu tương,
bệnh xảy ra trên toàn thế giới [44]. SMV gây thiệt hại đáng kể về năng suất,
thậm chí ở một số trường hợp tổn thất có thể lên đến 94% tổng sản lượng đậu
tương. Những cây đậu tương bị nhiễm SMV thường sinh trưởng phát triển
chậm, hình thái thân, lá, quả bị biến dạng, và khi bị nhiễm ở giai đoạn muộn
sẽ làm giảm sản lượng và chất lượng hạt [85] [86]. Họ Potyviridae được biết
đến là có số lượng loài lớn nhất trong các loài virus gây bệnh ở thực vật. Nếu
nhiễm Potyvirus và các loài virus khác thì thiệt hại về năng suất và chất lượng
hạt đậu tương tăng lên gấp bội [32], [145]. Những cây bị nhiễm Potyvirus
cũng dễ bị nhiễm nấm gây bệnh hơn [145]. SMV có thể lây nhiễm qua hạt với
tỷ lệ trung bình là 10% và thay đổi theo chủng virus, kiểu gen thực vật và thời
gian bị nhiễm [104].

8

Phản ứng khác biệt của giống về sức đề kháng với SMV được biểu hiện
ở hiện tượng cây đậu tương mẫn cảm với bệnh khảm hoặc khảm hệ thống (S),
chết hoại (N), và không có triệu chứng hoặc kháng (R). Quan sát này đã được
Cho và Goodman (1982) sử dụng để phân loại SMV thành các nhóm, chủng
SMV từ G1 đến G7 [49].
BYMV là loài virus cũng thuộc nhóm Potyvirus, có thể tìm thấy ở các
cây thuộc họ đậu đỗ (đậu tương, lạc, đậu xanh, đậu đen, …) và một số loài thực
vật khác [28], [80]. Khi cây đậu tương nhiễm BYMV sẽ xuất hiện những vết
khảm và đường biến vàng ngoằn ngoèo trên bề mặt lá, làm cây không phát
triển được và dẫn tới bị chết. Bệnh khảm vàng do BYMV cũng gây thiệt hại
đáng kể về năng suất và chất lượng hạt, đặc biệt đối với các cây đậu đỗ, trong
đó có đậu tương [137]. Khi cây bị nhiễm BYMV, năng suất hạt đậu tương bị
giảm, một số trường hợp có thể giảm tới 74% - 80% [96].
Đối với cây đậu tương, SMV và BYMV có thể nhiễm đồng thời trên
cùng một cây và triệu chứng rất khó phân biệt. Ảnh hưởng của việc nhiễm
cùng lúc nhiều loại virus khác nhau dẫn tới năng suất đậu tương có thể bị giảm
từ 66% - 80% [80], [91]. Bằng các quan sát thực địa nhóm tác giả ở Ukraine
đã xác định được triệu chứng nhiễm hai loại SMV và BYMV ở đậu tương
vùng Cherkassy, Vinnitsa, Kiev và kết quả đã được xác nhận bằng kính hiển
vi điện tử và kỹ thuật ELISA [103]. Trên cơ sở phân tích gen và thiết lập cây
phát sinh loài một số tác giả cho rằng BYMV phân lập từ các vùng thuộc Cộng
hòa Séc được phân bố ở ba nhóm trên sơ đồ hình cây và không phụ thuộc vào
cây chủ [142]. Phản ứng của cây đậu tương đối với SMV và BYMV phụ
thuộc vào kiểu gen của giống, chủng virus, tuổi cây, thời gian lây nhiễm,
nhiệt độ không khí và các điều kiện môi trường khác [41].
1.1.2. Sự xâm nhập của SMV và BYMV vào tế bào đậu tương
SMV và BYMV có thể xâm nhiễm trực tiếp vào tế bào đậu tương hoặc
có thể xâm nhiễm qua môi giới trung gian là rệp. Virus và cơ thể côn trùng có

9

mối quan hệ sinh học với nhau, virus có thể tiềm ẩn một thời gian dài trong cơ
thể côn trùng, qua tuyến nước bọt để đi vào hệ thống tiêu hoá thấm qua thành
ruột vào máu rồi trở lại tuyến nước bọt. Sau giai đoạn tiềm ẩn, virus được
nhân lên trong cơ thể côn trùng và ở thời điểm này côn trùng có khả năng
truyền bệnh một cách nhanh chóng. Tuy nhiên khả năng truyền bệnh của côn
trùng cũng có những hạn chế do tuổi của côn trùng thường rất ngắn [12], [13].
SMV có khả năng xâm nhập vào tế bào qua các vết thương nhẹ do cọ
xát giữa các cây với nhau, hoặc còn có thể truyền bệnh trong trường hợp hạt
phấn bị nhiễm virus rơi vào noãn của cây. SMV di chuyển trong tế bào chất
và có thể di chuyển sang tế bào khác thông qua các sợi liên bào. Sau 3 ngày
virus mới nhiễm hết một lá đơn, sau 4 ngày thì mới nhiễm hết đoạn gân của lá
kép và một phần đoạn thân sát gốc [80], [145]. Sau 5 ngày virus nhiễm hết
dọc thân chính và các lá ngọn, khoảng sau 25 ngày virus có thể nhiễm trên toàn
bộ cây. Virus có thể nhiễm qua nhân giống vô tính, qua hạt giống, qua phấn
hoa, hoặc qua côn trùng [108]. Cách thức truyền virus gây bệnh qua trung gian
làm cho cây đậu tương có khả năng nhiễm bệnh rất cao, khi cây trưởng thành
có thể bị nhiễm virus từ 90 - 100% ở các mức độ biểu hiện bệnh khác nhau
[80], [161].
SMV và BYMV có cấu tạo đơn giản, gồm hai thành phần chính là
protein (60 - 95%) và nucleic acid (5 - 40%) [80], [91]. Hệ gen của SMV và
BYMV là RNA sợi đơn dương (RNA (+)). Đời sống của Potyvirus sau khi
xâm nhập vào các tế bào chủ qua mô tổn thương bao gồm quá trình dịch mã,
xử lý polyprotein, nhân lên của mRNA, quá trình lắp ráp RNA và protein vỏ
thành hạt virus và di chuyển đến các tế bào khác, tới các bộ phận của cây và
các cây khác [145]. Quá trình xâm nhiễm của SMV và BYMV cùng với quá
trình nhân lên của RNA được mô tả ở hình 1.1.

10










Hình 1.1. Sơ đồ mô phỏng quá trình xâm nhiễm và nhân lên của SMV và
BYMV vào tế bào cây đậu tương
1. Virus xâm nhập vào tế bào qua màng; 2. Phân tử RNA (+) của virus được giải phóng
vào nhân tế bào chủ; 3. RNA (+) virus làm khuôn để tổng hợp sợi RNA(-); 4. RNA (-) phiên
mã tổng hợp mRNA; 5. mRNA dịch mã tạo các protein của virus; 6. RNA(-) làm khuôn tổng
hợp các RNA (+) tức hệ gen virus; 7. Các phân tử RNA(+) kết hợp với protein vỏ tạo thành
các virus mới; 8. Virus phá vỡ màng tế bào ra ngoài và xâm nhiễm vào các tế bào khác.

1.1.3. Hệ gen của SMV và BYMV
1.1.3.1. Đặc điểm hệ gen của SMV, BYMV và Potyvirus
Các Potyvirus có dạng thanh, khúc khuỷu dài khoảng 750 nm và đường
kính là 11-15 nm và bao gồm các protein vỏ được sắp xếp đối xứng, xoắn ốc
xung quanh phân tử RNA sợi đơn dương có khoảng 10.000 nucleotide. Hệ gen
RNA có đầu 3’gắn đuôi poly A và một protein virion kết nối gen (VPg) ở đầu
5’. RNA virus được dịch mã tạo ra một polyprotein được phân cắt bởi
protease tạo thành ít nhất 10 phân tử protein [93].
Các gen trong hệ gen của virus đang được sử dụng ngày càng nhiều để
phân tích các loài virus và các chủng virus khác nhau. Jayaram và đtg (1992)

11
đã lập bản đồ và xác định trình tự nucleotide của các chủng SMV G2 và G7
và trình tự CP của của một số chủng SMV cũng được mô tả [93]. Các vùng
trong hệ gen của các Potyvirus chứa hầu hết các gen mã hóa protein thể vùi ở
dạng hình trụ (Cl), gen RNA polymerase - phụ thuộc- RNA (POL hoặc Nib
và gen protein vỏ (CP) [93], [132]. Các protein 21K và 27K ở SMV là giống
như protein NIa ở TEV và VPg, NIa, PI, P3 và HC-Pro là các loại protein
chịu trách nhiệm về hoạt động xử lý protein sau khi được tổng hợp [61], [93].
Nghiên cứu của Jayaram & đtg (1992) lưu ý rằng sự khác biệt lớn nhất
về trình tự NIa giữa các dòng SMV G2 và G7 biểu hiện ở vùng đầu 5' của hệ
gen virus, chủ yếu ở ở các gen PI, P3, Cl và HC - Pro của hệ gen virus [93].
Kim & đtg đã sử dụng enzyme giới hạn EcoRI để cắt các sản phẩm RT-PCR
của gen Cl phân lập từ SMV và phân biệt được năm chủng (G5H, G5, G3, G6
và G7) [102]. Các chủng gây bệnh đốm vòng đu đủ Potyviruses và virus khảm
xà lách cũng đã được phân loại bằng cách sử dụng enzyme giới hạn [35], [109].
Hệ gen của SMV gồm các gen mã hóa 3066 amino acid, gồm 10
chuỗi polypeptid: P1 proteinase (P1), Helper component proteinase (HC-pro),
Protein P3 (P3), 6 kDa protein 1(6K1), Cytoplasmic inclusion protein (CI), 6
kDa protein 2 (6K2), Protein liên kết hệ gen virus (VPg), Nuclear inclusion
protein A (NIa), Nuclear inclusion protein B (NIb), Capsid protein (CP) (Hình
1.2). Hệ gen của BYMV gồm các gen mã hóa 3056 amino acid, và cũng gồm
10 chuỗi polypeptid giống như ở SMV [182].
Won-Seok Lim và đtg (2003) đã thông báo trình tự nucleotide hoàn chỉnh
của hệ gen SMV chủng G5 (SMV-G5), G7H (SMV-G7H) gồm 9588 nucleotide
(chưa kể đuôi poly A), chứa một khung đọc mở (ORF) mã hóa cho một
polyprotein mà sau đó được phân cắt thành 10 phân tử protein chức năng. So
sánh trình tự amino acid của 2 chủng G5 và G7 với các chủng SMV khác cho
thấy sự tương đồng lớn giữa chúng. Hệ số tương đồng về trình tự nucleotide và

12
trình tự amino acid suy diễn giữa chủng SMV-G5 và SMV-G7H là 99% [168].
Trình tự đầy đủ các nucleotide của các chủng này có thể cung cấp những cơ sở
để xác định các yếu tố quyết định đến triệu chứng bệnh khảm ở cây đậu tương,
từ đó có các biện pháp hiệu quả để phòng trừ SMV cho cây đậu tương.







Hình 1.2. Bản đồ hệ gen của SMV và dự đoán các điểm cắt của protease
Bản đồ được xây dựng dựa trên cơ sở trình tự gen của SMV chủng G2 và G7 theo
Jayaram và đtg, 1992 [95]. Các hộp đề cập đến các gen khác nhau và UTR là vùng chưa
dịch mã ở 5 'và 3'. Các số ở dưới đề cập đến vị trí amino acid cắt từ polyprotein và các
con số trong ngoặc đơn đề cập đến vị trí nucleotide cắt từ trình tự gen của SMV G2 và
G7. CP là protein vỏ của virus, CI là protein hình trụ; HC-Pro là thành phần trợ giúp và
protease; NIb là RNA polymerase phụ thuộc RNA; P1, P3, và NIa là protease; VPg là
protein liên kết

Gen P1 mã hóa proteinase serine, tương tự trypsin – nằm ở đầu N của
polyprotein tự động tách từ polyprotein. P1 không có vai trò sự lây nhiễm
virus vào tế bào chủ mà nó kích thích sự tái bản hệ gen và cùng với HC-Pro
hoạt động theo hướng tăng cường khả năng gây bệnh bằng cách ức chế gen
của tế bào chủ [159].
HC - Pro là một proteinase nhiều thành phần tham gia vào quá trình lây
nhiễm virus của rệp, khuếch đại gen và vận chuyển polyprotein trong cây chủ.
Kasschau và đtg (1997) đưa ra giả thuyết rằng, HC-Pro có thể hoạt động như

13
một chất ức chế sao chép, hạn chế phản ứng phòng vệ và vận chuyển trong
cây chủ [99]. HC-Pro của virus khảm đậu tương ức chế sự tích lũy mRNA ở
cây chủ trong sự thúc đẩy việc lây nhiễm virus ở phôi hạt đậu non [164].
Vùng trung tâm của HC-Pro có chức năng trong sự di chuyển của virus trong
cây thuốc lá và có liên quan đến sự ức chế làm bất hoạt gen sau phiên mã
[99]. Mặc dù đã có nghiên cứu về gen Rsv4 kháng SMV trên cây đậu tương,
nhưng vai trò tiềm năng của HC-Pro trong sự tương tác của SMV với cây đậu
tương vẫn chưa được nghiên cứu nhiều.
Chức năng của sản phẩm từ gen P3 không được biết nhiều, nhưng nó
được cho là có vai trò trong sự lây nhiễm của virus và được minh chứng bằng
kết quả nghiên cứu đột biến liên quan đến việc gây cảm ứng héo ở cây [159].
Gen mã hóa protein Cl của các Potyvirus có chức năng trung gian trong
sự di chuyển của virus từ tế bào này đến tế bào khác trong cây chủ. Sự thay thế
amino acid ở vùng đầu N của protein Cl đã ức chế sự di chuyển của virus trong
cây Nicotiana tabacum Xanthi [47]. Protein Cl của Potyvirus hạn chế các cấu
trúc có tổ chức đặc biệt, các thể vùi, gắn vào plasmodesmata ngay sau khi
nhiễm virus [90].
Gen NIa mã hóa protein NIa bao gồm cả VPg và miền proteinase ở vùng
đầu C. NIa nằm ở thể vùi trong nhân tế bào bị nhiễm. VPg của nhiều Potyvirus
được cho là có liên quan đến sự di chuyển của virus [140], [116]. VPg liên kết
với màng và có liên quan đến việc nhân lên của virus [135]. NIb là RNA
polymerase phụ thuộc RNA (RdRp) cần cho sao chép của hệ gen và protein
này có liên quan đến hoạt động liên kết với RNA [159].
Bằng chứng về tầm quan trọng của VPg là sự kháng lại sức đề kháng
đối với Potyvirus của thực vật khi nghiên cứu TVMV ở các giống thuốc lá
Burley TN86 [119] và ở Pea seed-borne mosaic virus (PSMV; chi Potyvirus)
trên cây Pisum sativum [100]. Những phát hiện từ kết quả nghiên cứu TVMV

14
đã chỉ ra rằng, có sự thay đổi ở một trong bốn amino acid ở miền 6 amino
acid (Cys, Ser, Lys, và Ser ở các vị trí tương ứng là: 1928, 1929, 1932 và
1923) của vùng TVMV-S. VPg có chức năng phá vỡ sức đề kháng virus của
cây chủ. Đây là báo cáo đầu tiên về yếu tố quyết định trong vùng mã hóa của
protein VPg ở virus có liên quan đến sự phá vỡ khả năng kháng bệnh ở cây.
Sự thay đổi amino acid có thể phá vỡ sức đề kháng đối với PVY ở cây thuốc
lá “Virgin A Mutant” cũng đã được Masuta & đtg (1998) báo cáo [116].
1.1.3.2. Gen CP và sự đa dạng của các Potyvirus
Các Potyvirus lây nhiễm trên cây họ đậu biểu hiện sự đa dạng về đặc
tính sinh học hơn là sự đa dạng về trình tự nucleotide trong nucleic acid. Một
cách để phân biệt virus về loài, chủng là so sánh trình tự nucleotide, đặc biệt
là vùng đầu 3’ không mã hóa và trình tự gen CP. Gen CP là gen đặc trưng
nhất ở các Potyvirus, mã hóa protein CP và được chia thành ba vùng: vùng
đầu N, vùng lõi và vùng đầu C. Chức năng của CP thể hiện trong sự nhân lên,
capsid hóa, di chuyển của virus từ tế bào đến tế bào và trong sự truyền virus
của rệp [159].
Thành phần và trình tự amino acid của CP là đặc trưng cho loài virus
và từng cá thể. Rất ít có sự tương đồng về trình tự của CP giữa các chi virus
thực vật khác nhau. Tuy nhiên, sản phẩm của các gen ở Potyvirus (trừ sản
phẩm của gen CP) lại có sự tương đồng về trình tự amino acid so với các chi
và họ virus thực vật khác. Điều này cho thấy sự phân loại các thành viên của
nhóm Potyvirus có thể dựa trên trình tự gen CP và trình tự amino acid của CP
[144].
Phân tích trình tự amino acid của CP và trình tự nucleotide của gen CP
từ các Potyvirus đã được coi là công cụ mạnh mẽ không chỉ để nghiên cứu
phân loại các virus thuộc chi mà còn đối với các chủng trong Potyvirus [118].
Phân tích sự phát sinh loài dựa trên trình tự nucleotide của Potyvirus cho thấy,

15

các thành viên có trình tự với hệ số tương đồng là 38% - 71% được nhận dạng
là các loài virus khác nhau; còn các thành viên có trình tự với hệ số tương
đồng ít nhất là 90% được nhận dạng là cùng chủng virus [144].
Trình tự gen CP phân lập từ bốn chủng SMV đã khẳng định vị trí của
gen CP ở vùng đầu 3, tiếp theo là vùng chưa dịch mã (UTR) và đến đuôi
polyA [93], [132]. Trong vùng đầu N của CP ở Potyvirus, bộ ba amino acid
DAG được biết là có liên quan đến côn trùng truyền bệnh và các vùng của CP
giữ vai trò khác nhau đối với sự di chuyển của virus trong tế bào [92]. Bộ ba
amino acid GRD ở vị trí 2120 đến 2122 trong protein VPg tồn tại giống nhau
ở một số Potyvirus khác nhau [82]. Bộ ba amino acid GRD có ở SMV G2,
nhưng không có ở SMV G7, trong đó lysine được thay thế cho arginine tại vị
trí amino acid 2121, kết quả tạo ra bộ ba GKD. Sự thay thế amino acid này có
liên quan với khả năng kháng SMV chủng G7 ở cây đậu tương [93].
Gen CP ở SMV có kích thước là 807 nucleotide, vùng mã hóa gồm 804
nucleotide mã hóa 267 amino acid, và từ amino acid thứ 33 đến 264 trong CP
được gọi là vùng Poty-coat [93]. Ở BYMV, gen CP có kích thước 933
nucleotide, vùng mã hóa gồm 822 nucleotide, mã hóa 273 amino acid, trong
đó vùng Poty-coat từ amino acid thứ 37 đến 272 [103]. Các số liệu so sánh
cho thấy có sự khác biệt lớn về kích thước và trình tự amino acid của CP, tuy
nhiên lại có sự tương đồng cao về trình tự ở vùng đầu C của CP [75].
Các chủng virus cũng được phân biệt bởi những thay đổi trong hệ gen
của chúng. Sử dụng enzyme giới hạn RsaI và HinfI cắt sản phẩm PCR khuếch
đại gen CP từ Citrus tristeza virus (Chi Closterovirus) kết quả cho thấy đã có
sự thay đổi về trình tự gen CP [74]. Sự khác biệt được xác định bằng phương
pháp PCR có liên quan chặt chẽ với sự khác biệt về mặt sinh học của virus gây
bệnh đốm vòng (Chi Ilarvirus) [77]. Phân tích sự phát sinh loài cũng được sử
dụng để phân biệt Potyvirus khác nhau [35], [132].

16
1.2 . NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN Ở CÂY ĐẬU TƯƠNG

1.2.1. Ứng dụng tiến bộ kỹ thuật trong chuyển gen ở cây đậu tương
Cho đến nay, các nhà khoa học đã và đang sử dụng nhiều hệ thống sinh
học, bao gồm vi khuẩn, nấm, các dòng tế bào côn trùng, thực vật, động vật có
vú, virus của côn trùng, của thực vật, các sinh vật đa bào,… để tạo protein tái
tổ hợp. So với các hệ thống truyền thống, thực vật có nhiều lợi thế trong việc
sản xuất protein tái tổ hợp, bởi vì: (1) Khả năng glycosit hoá các protein, bởi
các glycoprotein là nhóm protein có vai trò quan trọng trong các phản ứng
miễn dịch; (2) Protein tạo thành từ thực vật tương đối an toàn so với protein
có nguồn gốc động vật bậc cao; (3) Thực vật có thể trồng trên diện tích lớn
với chi phí thấp về phân bón, công chăm sóc và nguyên liệu đầu vào, nên giá
thành thấp.
Kỷ nguyên Genomics (Hệ gen học) đang được ứng dụng trên cây đậu
tương và ở nhiều cây trồng khác. Gần đây dữ liệu hệ gen học được phát triển dựa
trên những thông tin về trình tự các gen trong hệ gen của cây đậu tương [45] và
một lượng lớn thông tin về giải mã hệ gen cây đậu tương có thể tìm thấy ở Ngân
hàng gen quốc tế [182]. Ngoài ra, nguồn thông tin khác cũng được phát triển,
như dữ liệu EST (expressed sequence tag), thư viện cDNA, microarray [182].
Những nguồn thông tin này là cơ hội của việc ứng dụng các tiến bộ chọn giống
đậu tương bằng chỉ thị phân tử và kỹ thuật chuyển gen, là cơ sở của những hiểu
biết về chức năng gen trên cơ sở tách dòng gen và phương pháp di truyền ngược.
Trên cơ sở đó, nghiên cứu xây dựng một hệ thống chuyển gen ổn định và có hiệu
quả ở cây đậu tương là điều cần thiết đi tới thành công trong chiến lược chọn
giống đậu tương bằng kỹ thuật chuyển gen.
Hai nhóm phương pháp được ứng dụng trong nghiên cứu chuyển gen ở
thực vật là chuyển gen trực tiếp và chuyển gen gián tiếp. Trong đó, phương
pháp chuyển gen trực tiếp bằng súng bắn gen và chuyển gen gián tiếp thông

17
qua A. tumefaciens đã được ứng dụng phổ biến và thành công đối với cây đậu
tương [56].

1.2.1.1. Chuyển gen bằng súng bắn gen vào phôi soma đậu tương
Chuyển gen trực tiếp là kỹ thuật chuyển đoạn DNA trực tiếp vào tế bào
thực vật với sự giúp đỡ của các phương tiện hóa học hay vật lý, trong đó kỹ
thuật chuyển gen bằng súng bắn gen đã được ứng dụng thành công ở cây đậu
tương [171].
Chuyển gen bằng súng bắn gen ở thực vật là kỹ thuật dẫn các hạt nhỏ
bằng vàng hoặc bằng tungsten được bọc bởi gen chuyển vào tế bào, mô đích
[50], [171]. Ưu điểm của phương pháp bắn gen là thao tác dễ dàng, bắn một lần
được nhiều tế bào, nguyên liệu để bắn gen đa dạng (hạt phấn, tế bào nuôi cấy,
tế bào của các mô biệt hóa và mô phân sinh). Giống đậu tương chuyển gen đầu
tiên được tạo ra bằng kỹ thuật sử dụng súng bắn gen từ năm 1988, đến nay
phương pháp chuyển gen này đã được cải tiến, phát triển và áp dụng cho hầu
hết các giống đậu tương [117], [171], và hàng loạt các công bố về biến nạp
thành công trên cây lúa, đu đủ, mía, bông,… những kết quả này đã khẳng định
tính ưu việt của phương pháp bắn gen. Tuy nhiên, nhược điểm của phương
pháp này là tần số biến nạp còn thấp, cây tạo ra có thể ở dạng thể khảm.
Kể từ khi súng bắn gen được sử dụng lần đầu tiên trên cây đậu tương,
kỹ thuật chuyển gen đã đạt được thành công đối với phôi mầm hạt chưa chín
[117], phôi soma [66] và đỉnh mô phân sinh [30]. Phôi soma được tạo ra từ lá
mầm non nuôi cấy trong môi trường có bổ sung 2,4D với nồng độ cao và
được sử dụng để tạo ra các phôi mầm có thể tái sinh và tạo cây hoàn chỉnh
[66]. Vì quá trình hình thành mô phân sinh phụ thuộc vào kiểu gen cho nên
chỉ có một số ít giống đậu tương sử dụng chuyển gen thành công. Căn cứ vào
tiềm năng của phôi soma, phôi tăng sinh và tái sinh cây mà giống đậu tương
“Jack” được xem là có đủ các đặc tính cần thiết cho chuyển gen và được sử

18
dụng để tạo ra cây đậu tương chuyển gen [154], bởi sự thay đổi quy trình nuôi
cấy mô chỉ có thể khắc phục được một phần ảnh hưởng của kiểu gen đến hiệu
quả chuyển gen. Phôi soma là một đặc tính di truyền nhưng cũng có thể cải

thiện được nhờ lai giống [125]. Khả năng tạo phôi soma có thể thành công đối
với các kiểu gen đậu tương khác nhau [106].
Các quá trình vật lý trong chuyển gen có xu hướng dẫn đến sự kết hợp,
phân mảnh và tái cấu trúc gen chuyển, điều này đôi khi dẫn đến làm bất hoạt
gen chuyển. Việc sử dụng các gen thông báo và gen chỉ thị chọn lọc có thể trợ
giúp làm giảm sự bất hoạt gen chuyển của hệ thống chuyển gen vật lý và tạo
điều kiện cho sự phục hồi cây chuyển gen cũng như sự thể hiện của gen đích
giữa hai gen chỉ thị [120].
Phôi soma đậu tương đã thu hút sự chú ý như một mô hình phôi
zygotic. Phôi soma tăng sinh có thể duy trì các đặc tính tái sinh trong hơn một
năm và khi cần nó có thể được làm cho trở lại trạng thái biệt hóa và phát triển
một cách nhanh chóng [66]. Phôi soma sinh trưởng tích lũy protein dự trữ hạt
có các đặc tính như hạt đang phát triển [56] và thành phần acid béo của chúng
cũng tương tự như ở hạt [57]. Phôi chuyển gen thường được tạo ra sau 7 tuần
kể từ khi dùng súng bắn gen để biến nạp gen chuyển vào phôi [101], các khối
mô đồng nhất chuyển gen có thể dễ dàng và liên tục tạo ra sự biệt hóa. Vì vậy
phôi soma đã được sử dụng để đánh giá đặc tính của hạt chuyển gen trước khi
tạo cây hoàn chỉnh, và sau đó là quá trình chọn lọc các dòng cây chuyển gen
tái sinh in vitro [84], [121].
1.2.1.2. Chuyển gen ở đậu tương nhờ vi khuẩn A. tumefaciens lây nhiễm
qua nách lá mầm tổn thương
Khác với các phương pháp chuyển gen trực tiếp ở thực vật, phương
pháp chuyển gen gián tiếp được thực hiện thông qua vi khuẩn đất A.
tumefaciens. Đối với cây đậu tương, phương pháp chuyển gen nhờ A.

19
tumefaciens được ứng dụng từ năm 1988 và hiện nay đã đạt được những
thành tựu rất đáng khích lệ [87].
Chuyển gen gián tiếp ở đậu tương thông qua vi khuẩn Agrobacterium
là kỹ thuật bao gồm các bước: (i) Nghiên cứu thu thập thông tin về gen liên

quan đến đặc tính, tính trạng quan tâm và phân lập gen; (ii) Thiết kế vector
chuyển gen; (iii) Tạo vi khuẩn mang cấu trúc gen chuyển; (iv) Lây nhiễm vào
mô tế bào thực vật; (v) Chọn lọc các thể biến nạp và tái sinh cây biến nạp; (vi)
Phân tích cây chuyển gen.
Agrobacterium là loài vi khuẩn đất Gram âm gây bệnh khối u ở thực
vật và có khả năng lây nhiễm một cách tự nhiên giữa các loài thực vật khác
nhau [58]. Agrobacterium có thể gây ra bệnh khối u (A. tumefaciens) và gây
bệnh rễ tơ (A. rhizogenes) phổ biến trên nhiều loài thực vật [72]. A.
tumefaciens chủ yếu lây nhiễm vào thực vật qua các vết thương và do vậy có
thể coi A. tumefaciens là một công cụ sử dụng để chuyển các gen mong muốn
vào cây đậu tương [37]. Ưu điểm của phương pháp chuyển gen thông qua A.
tumefaciens là đơn giản, quen thuộc và yêu cầu tối thiểu về dụng cụ, dễ dàng
chuyển một gen đơn lẻ vào cây chủ hoặc chỉ cần số bản copy thấp [79].
Chuyển gen thông qua A. tumefaciens ở đậu tương trong môi trường đồng
nuôi cấy được tiến hành trên nách lá mầm [87] mà khởi nguồn phương pháp
này dựa vào kiểu gen đậu tương mẫm cảm với A. tumefaciens và khả năng tái
sinh cây từ nách lá mầm [123]. Nách lá mầm là phần nối giữa lá mầm và thân
chứa các tế bào mầm có khả năng phát sinh chồi và tăng sinh trong môi trường
nuôi cấy chứa cytokinin. Mức độ hình thành chồi ở nách lá mầm phụ thuộc vào
loại cây sử dụng chuyển gen. Nhìn chung gây tổn thương nách lá mầm bằng
các vết cắt và kim châm đòi hỏi phải có kỹ thuật và sự khéo léo để tạo ra đủ mô
đích cho sự nhiễm khuẩn [181]. Tuy nhiên, nếu sử dụng bàn chải làm từ thép
không gỉ để tạo các vết thương ở nách lá mầm thì không yêu cầu nhiều về mặt
kỹ thuật [171].

20
Những cây đậu tương chuyển gen đầu tiên mang cấu trúc gen npII đã
sử dụng kháng sinh kanamycin làm chất chọn lọc [87] và đến nay các dòng tế
bào chuyển gen đã sử dụng các chất chọn lọc bởi sự kết hợp gen bar và
glufosinate. Nồng độ chất chọn lọc có ảnh hưởng lớn đối với tần suất chuyển

gen [176], vì thế phương pháp lựa chọn chất chọn lọc là khác nhau giữa các
kiểu gen đậu tương. Các giống có thời gian sinh trưởng ngắn có thể sử dụng
để phát triển các dòng đậu tương chuyển gen. Paz và đtg (2006), Zeng và đtg
(2004) cho rằng, hiệu suất chuyển gen có thể đạt từ 0,2% đến khoảng 10% và
hiệu quả chuyển gen phụ thuộc vào kỹ thuật và kiểu gen của đậu tương [125],
[176]. Ở Mỹ, cây đậu tương chuyển gen chủ yếu được tạo ra từ phương pháp
chuyển gen nhờ A. tumefaciens qua nách lá mầm và các các giống đậu tương
chuyển gen được cung cấp bởi các cơ sở nghiên cứu do chính phủ quản lý,
bao gồm Trung tâm Plant Transformation Facility thuộc Đại học Iowa State,
Trung tâm Plant Transformation Core Facility thuộc Đại học Missouri [171].
Điều này đã gợi ý sự cần thiết và kinh nghiệm tổ chức và quản lý chặt chẽ quá
trình nghiên cứu chuyển gen ở đậu tương ở các quốc gia trên thế giới, trong
đó có Việt Nam.
1.2.1.3. Phân tích cây đậu tương chuyển gen
Kỹ thuật chuyển gen ở thực vật nói chung và chuyển gen ở cây đậu tương
nói riêng được hiểu đẩy đủ là: (i) gen ngoại lai (gen chuyển) phải được hợp nhất
vào hệ gen tế bào chủ; (ii) gen chuyển phải được biểu hiện ở tế bào chủ; (iii) gen
chuyển phải được di truyền cho các thế hệ sau; (iv) trong mỗi thế hệ sản phẩm
của gen chuyển phải được biểu hiện, và (v) sản phẩm của gen chuyển biểu
hiện được chức năng sinh học. Chính vì vậy quá trình chọn lọc, phân tích cây
chuyển gen trong mỗi thế hệ được thực hiện bằng hệ thống chọn lọc tế bào và
mô chuyển gen, xác định sự có mặt của gen chuyển trong tế bào cây chủ,
kiểm tra sự biểu hiện của gen chuyển thông qua xác định sản phẩm biểu hiện
là mRNA, protein và phân tích sự biểu hiện chức năng sinh học của gen

21
chuyển. Có thể mô tả khái quát các thí nghiệm chuyển gen và phân tích cây
chuyển gen ở sơ đồ hình 1.3.

Hình 1.3. Sơ đồ các bước chuyển gen và phương pháp phân tích cây chuyển
gen

Quá trình tạo cây chuyển gen đòi hỏi một phương tiện hiệu quả để xác
định và lựa chọn các tế bào và mô chuyển gen và không phụ thuộc vào hệ
thống chuyển gen được sử dụng. Gen chỉ thị chọn lọc có thể sử dụng gen
kháng kháng sinh hoặc kháng thuốc diệt cỏ sẽ cho phép chọn được các vật
liệu biến đổi gen [43]. Kháng sinh hygromycin đã được sử dụng thành công
như một nhân tố chọn lọc và trở thành kháng sinh tiêu chuẩn cho việc chọn
lọc các mô chuyển gen ở đậu tương, đặc biệt là các mô phát sinh phôi [88],
[111] và các tế bào của nách lá mầm đậu tương [122]. Điều này đã chứng
minh hygromycin giúp loại bỏ những mô không mang gen chuyển và làm
giảm thời gian nuôi cấy.


22
Biện pháp tăng hiệu quả chuyển gen ở cây đậu tương qua nách lá mầm
được thực hiện bằng cách sử dụng mức tối ưu glufosinate [176], đồng thời

một hệ thống mới cũng được phát triển để chọn lọc tế bào mô phân sinh biến
đổi gen từ phôi trục đạt được khả năng kháng thuốc diệt cỏ imidazolinone
bằng cách đưa vào một gen đột biến của cây Arabidopsis (csr1-2). Rao và đtg
(2009) đã phát triển thành công một hệ thống chọn phôi soma bằng cách sử
dụng gen E. coli dap A, mà sản phẩm của gen này có khả năng kháng
glufosinate, glyphosate, S-(2 aminetyl)-L-cysteine và imidazolinones [133].
Hệ thống gen gus (gus, gusA và uidA) mã hóa cho β-glucuronidase lần
đầu tiên được phân lập từ E. coli [95] và ngay sau khi phát hiện, nó nhanh
chóng được phát triển thành hệ thống chỉ thị cho chuyển gen ở thực vật [94].
Ngày nay, việc sử dụng gen gus trong chuyển gen thực vật ngày càng rộng
rãi, nhất là trong những thí nghiệm khảo sát quy trình chuyển gen vào một
giống cây mới [114].
Trên nguyên tắc gen ngoại lai khi được biến nạp có thể tồn tại trong tế
bào chủ ở ba trạng thái: (1) Tạm thời ở dạng DNA tự do; (2) Lâu dài dưới
dạng một thể plasmid độc lập và (3) ổn định như một đoạn DNA của hệ gen
tế bào chủ và được nhân lên trong tế bào chủ. Phương pháp sinh học phân tử
đã được ứng dụng nhằm xác định sự có mặt, sự di truyền và sự biểu hiện của
gen chuyển trong tế bào chủ. Có thể sử dụng PCR để phân tích cây chuyển
gen, tuy nhiên phương pháp lai Southern blot xác định số bản sao trong cây
chuyển gen là phương pháp tin cậy và thông dụng nhất. Gần đây, một kỹ thuật
thường sử dụng để hỗ trợ cho lai Southern blot trong việc phát hiện số bản sao
trong cây chuyển gen là Quantitave real-time PCR (Q-PCR). Q-PCR có thể
tiến hành với số lượng cây cần phân tích nhiều, do dễ thực hiện, tiết kiệm
nguyên liệu chi phí và công sức [92].
Biểu hiện gen là quá trình hoạt động của gen để tạo ra sản phẩm cuối
cùng là protein. Quá trình biểu hiện gen được thể hiện qua hai giai đoạn: (1)

23
Phiên mã từ DNA sang mRNA và (2) Dịch mã từ mRNA tổng hợp các phân
tử protein thông qua bộ máy ribosome. Để xác định sự có mặt của sản phẩm

phiên mã có thể sử dụng kỹ thuật RT-PCR, real-time RT-PCR, thực hiện lai
Northern blot. Đối với các bệnh do virus ở thực vật người ta có thể sử dụng
kỹ thuật real-time RT-PCR để đánh giá cây chuyển gen kháng virus thông qua
phiên mã để phát hiện và định lượng virus trên cây nhiễm bệnh [137]. Để
đánh giá sự có mặt của protein do gen chuyển tạo ra có thể thực hiện một số
kỹ thuật khác nhau như kỹ thuật lai Western blot, ELISA và các kỹ thuật phát
hiện hoạt động của protein (hoặc enzyme).
1.2.2. Định hướng ứng dụng và thành tựu nghiên cứu chuyển gen ở cây
đậu tương
1.2.2.1. Tiếp cận kỹ thuật chuyển gen nhằm cải thiện các thành phần của hạt
Cải thiện hàm lượng và chất lượng protein
Kỹ thuật chuyển gen được ứng dụng nhằm tăng cường hàm lượng, chất
lượng protein trong hạt đậu tương. Protein đậu tương có hàm lượng dinh
dưỡng được xem tương đương với protein của thịt và trứng, ngoại trừ sự khác
biệt về amino acid chứa lưu huỳnh đặc biệt là methionine [65]. Vì vậy để tăng
cường các loại protein có hàm lượng methionine cao ở hạt đậu tương, người
ta đã chuyển gen mã hóa β-casein phân lập từ trâu, bò và zein phân lập từ ngô
vào cây đậu tương theo nguyên tắc thiết kế vector chuyển gen chứa promoters
biểu hiện ở hạt [112]. Mặc dù chưa có thông tin về hiện tượng tăng hàm
lượng amino acid tự do chứa các gốc lưu huỳnh trong hạt đậu tương, nhưng
ba loại amino acid quan trọng khác là lysine, tryptophan và threonine đã tăng
đáng kể trong hạt đậu tương bởi sự biểu hiện gen mã hóa các enzyme liên
quan đến chuỗi phản ứng tổng hợp các amino acid này [130]. Cải thiện hàm
lượng các loại amino acid trong hạt đậu tương được xem là một cách tiếp cận
đáng tin cậy để nâng cao chất lượng dinh dưỡng của hạt đậu tương.

24
Đậu tương cũng được xem là một lò phản ứng sinh học sản xuất protein
có hiệu quả nhất trong các cây trồng nông nghiệp. Các protein có hoạt tính
dược học như hormone sinh trưởng người, nhân tố sinh tế bào sợi và vaccine

ăn được đã được tích lũy trong hạt của cây đậu tương chuyển gen [55]. Mặc
dù các loại protein có hoạt tính sinh học chiếm tới 3% so với tổng hàm lượng
protein trong hạt, nhưng các loại protein có hoạt tính dược học gần như là con
số không so với hàm lượng protein dự trữ trong hạt. Thay vào đó, một giải
pháp khác là sử dụng các protein dự trữ chính trong hạt, -conglycinin và
glycinin, như là một chất vận chuyển các peptid có hoạt tính sinh học [172].
Một peptid sáu vòng có hoạt tính sinh học, novo-kinin đã được ghép vào tiểu
đơn vị α của -conglycinin ở 4 vị trí bằng cách thay thế amino acid, và các
hạt đậu chuyển gen chứa các protein đã được thay đổi với sự biểu hiện các
đặc tính mong muốn [172].
Cải thiện thành phần dầu
Khoảng 75% lượng dầu thực vật trên thế giới từ dầu dừa, hạt đậu
tương, hạt cải dầu, hạt hướng dương và một số cây trồng khác. Dầu đậu tương
được sử dụng rộng rãi làm dầu ăn, trong công nghiệp mực in, dầu nhờn và
xăng sinh học. Với mục đích cải thiện hàm lượng dầu và thành phần dầu trong
hạt đậu tương người ta sử dụng kỹ thuật chuyển gen. Dầu được chứa trong hạt
ở dạng triacylglycerol, gen mã hóa acyltransferase đã được chuyển vào đậu
tương để tăng cường sinh tổng hợp triacylglycerol kết quả làm tăng tối đa
3,2% hàm lượng dầu trong hạt [133]; hoặc tăng sự tích tụ của acid vernolic và
12-epoxy-18: 2Delta (9,15) trong hạt đậu tương chuyển gen [46].
Đặc tính của dầu được quyết định bởi thành phần lipid. Các phương
pháp chuyển gen có thể cung cấp nhiều lựa chọn để làm thay đổi thành phần
dầu trong hạt đậu tương cho các mục đích sử dụng khác nhau. Dầu đậu tương
có các thành phần palmitic, stearic, oleic, linoleic và acids linoleic [170]. Hàm
lượng cao của các axit béo không no trong dầu đậu tương làm cho dầu không

25
ổn định và có mùi khó chịu. Phương pháp chuyển gen mang cấu trúc RNAi
làm bất hoạt gen liên quan đến sự tổng hợp acid béo không no đã được ứng
dụng để cải thiện đặc tính này ở cây đậu tương [98].

Vitamin E bao gồm các dạng khác nhau như tocopherols và
tocotrienols (dạng , ,  và ). Tất cả đều có khả năng chống oxy hoá lipid,
trong đó mạnh nhất là -tocophetal [42], [82]. Vitamin E được dùng rộng rãi
trong công nghiệp thực phẩm như chất chống oxy hoá, đồng thời cũng được
dùng cho người và động vật để giúp phòng bệnh. Trong chế biến đậu tương,
tocopherols được chiết xuất cùng dầu. Thành phần của chúng chỉ chiếm 1,5%
hàm lượng dầu được chiết xuất, nhưng chúng có vai trò quan trọng đối với sự
ổn định và không bị oxi hoá của dầu [89]. Tác động vào bước chính để
chuyển đổi -tocophenol sang -tocophenol làm tăng hàm lượng -
tocophenol lên 95% của tocophenol toàn phần trong hạt đậu tương chuyển
gen [153].
Cải thiện một số thành phần khác
Isoflavones là các thành phần quan trọng được tổng hợp trong cây họ
đậu. Ngoài vai trò kiểm soát quá trình tương tác giữa cây và vi sinh vật,
chúng còn được biết đến như chất nội tiết phyloustogen và các chất hoạt tính
sinh học khác liên quan đến sức khoẻ con người, như có hiệu quả chống ung
thư, giảm nguy cơ bệnh mạch vành [143]. Saponins là một nhóm chất có cấu
trúc đa dạng phân bố nhiều trong các loài thực vật. Dựa trên cơ sở cấu trúc
hoá học người ta đã xác định saponins ở đậu tương được phân bố trong bốn
nhóm (A, B, E và DDMP) và chúng có tác dụng dược học khác nhau như
chống phù lipid, chống lại sự nhân lên của tế bào ung thư trực tràng. Theo
Takagi và đtg (2011), gen mã hóa -amyrin synthase tham gia tổng hợp một
loại chất trong quá trình sinh tổng hợp saponins của hạt đậu tương chuyển gen
đã bị ức chế bởi cơ chế RNAi [152].