Nghiên cứu tạo cây đậu xanh chuyển gen có khả năng kháng mọt (TT LA tiến sĩ)

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
1. Kết luận
1.1. Khả năng kháng mọt của 8 giống đậu xanh được đánh giá thông qua các
chỉ tiêu như khối lượng hạt hao hụt, tỷ lệ nhiễm mọt, hệ số gia tăng quần thể.
Giống đậu xanh Tằm TH có khả năng kháng mọt tốt nhất, chỉ số mẫn cảm với
mọt C. chinensis là 634,63; giống đậu xanh ĐX22 có khả năng kháng mọt
kém nhất, chỉ số mẫn cảm với mọt là 1058,72 và cao hơn ở giống Tằm TH
1,67 lần.
1.2. Gen VrPDF1 phân lập từ cây đậu xanh gồm 356 bp, có cấu trúc phân
đoạn, gồm hai exon và một intron. Đoạn mã hóa của gen VrPDF1 có kích
thước 228 bp, mã hóa 75 amino acid.
1.3. Vector chuyển gen thực vật pBetaPhaso-VrPDF1 biểu hiện ở hạt đã được
thiết kế thành công và hoạt động tốt trên cây thuốc lá. Gen chuyển VrPDF1 đã
hợp nhất vào hệ gen của cây thuốc lá chuyển gen và được di truyền từ thế hệ
T0 sang thế hệ T1. Protein tái tổ hợp VrPDF1 có kích thước khoảng 10 kDa
được biểu hiện ở hạt thuốc lá và có khả năng ức chế -amylase của ruột ấu
trùng mọt.
1.4. Biến nạp thành công cấu trúc pBetaPhaso-VrPDF1 và tạo được dòng cây
đậu xanh chuyển gen ở thế hệ T1 từ giống đậu xanh ĐX22. Xác định được
protein tái tổ hợp VrPDF1 biểu hiện ở hai dòng cây đậu xanh chuyển gen thế
hệ T1 (DX1-3 và DX1-7) có kích thước khoảng 10 kDa. Hiệu suất chuyển gen
ở giống đậu xanh ĐX22 đạt 0,32%. Protein tái tổ hợp VrPDF1 biểu hiện ức
chế -amylase của ấu trùng mọt, hiệu suất ức chế -amylase ở hai dòng đậu
xanh chuyển gen DX1-3 và DX1-7 thế hệ T1 tăng 166,40 % và 178,19% so
với cây không chuyển gen.
2. Đề nghị
Tiếp tục theo dõi, đánh giá hai dòng đậu xanh DX1-3 và DX1-7 ở các
thế hệ tiếp theo, thử nghiệm khả năng kháng mọt thông qua lây nhiễm nhân
tạo nhằm chọn tạo dòng đậu xanh chuyển gen ổn định về khả năng kháng mọt
cao.
24

MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Đậu xanh là một trong ba cây đậu đỗ chính trong nhóm các cây đậu
ăn hạt, đứng sau đậu tương và lạc. Hạt đậu xanh là nguồn thực phẩm giàu
đạm. Hạt đậu xanh vừa cung cấp protein cho con người, vừa có giá trị trong
y học, và cũng là cây có giá trị trong cải tạo đất. Việt Nam là quốc gia có
điều kiện tốt để phát triển sản xuất nông nghiệp, tuy nhiên cũng là yếu tố
thuận lợi cho sâu hại phát sinh, phát triển gây tổn thất nghiêm trọng tới năng
suất và phẩm chất của nông sản. Theo ước tính, tổn thất sau thu hoạch
khoảng từ 10% - 30% sản lượng cây trồng nông nghiệp. Điều này có nghĩa
là khoảng 10% - 30% lượng lương thực không bao giờ được sử dụng và
cũng là tỷ lệ tổn thất của công sức và tài chính đầu tư trong sản xuất nông
nghiệp. Do đó, việc đánh giá và hạn chế tổn thất sau thu hoạch là công tác
rất có ý nghĩa trong việc đảm bảo lương thực trong điều kiện hạn chế diện
tích trồng trọt và dân số đang gia tăng hiện nay.
Đối với nhóm nông sản là hạt thì một trong những nguyên nhân chính
gây tổn thất đến số lượng và chất lượng hạt là côn trùng mà chủ yếu là một số
thuộc Bộ cánh cứng (thường gọi là mọt). Các loài mọt gây hại chủ yếu cho
đậu đỗ là: mọt đậu xanh (Callosobruchus chinensis L.), mọt đậu đỏ
(Callosobruchus maculatus F.), mọt đậu nành (Ancanthoscelides obtectus)…
Trong đó, mọt đậu xanh Callosobruchus chinensis L. thuộc họ Bruchid,
bộ Coleoptera là loài gây hại chủ yếu cho hạt đậu xanh. Sự tổn hại do mọt gây
ra là rất lớn, do đó công tác phòng trừ mọt đậu nói chung và mọt đậu xanh nói
riêng đang là một vấn đề cần được quan tâm nghiên cứu.
Hiện nay, đã có một số nghiên cứu bước đầu đánh giá về khả năng
kháng mọt, kháng nấm, kháng virus … trên một số loại cây trồng trong đó có
đậu xanh. Theo các nghiên cứu đã công bố, đặc tính kháng mọt hại hạt của
cây trồng rất phức tạp và liên quan đến hoạt động của protein defensin.
Defensin thực vật là nhóm chuỗi peptide nhỏ đặc trưng bởi cấu trúc gấp cuộn

ba chiều qua 8 cầu nối disulfide của các cystein. Defensin thực vật hoạt động
mạnh sẽ tổng hợp protein ức chế, ảnh hưởng đến kênh trao đổi ion, tác động
đến hoạt động của α-amylase và trypsin, làm suy yếu vi sinh vật… Cơ chế gây
độc của defensin đối với mọt đậu xanh là sự cản trở hoạt động phân giải tinh
1


DX1-3, DX1-7 ở bảng 3.10 cho thấy hiệu suất hoạt động của -amylase từ ấu
trùng mọt đậu xanh và dịch protein chiết từ cây chuyển gen giảm so với dịch
protein chiết từ cây không chuyển gen, chỉ bằng 33,60% (DX1-3) và 21,81%
(DX1-7). Như vậy có thể thấy trong nghiên cứu này, protein tái tổ hợp
rVrPDF1 của hai dòng đậu xanh chuyển gen T1 đã ức chế hoạt động amylase của ấu trùng mọt đậu xanh. So với cây không chuyển gen, hiệu suất
ức chế -amylase từ ấu trùng mọt đậu xanh của rVrPDF1 ở dòng đậu xanh
chuyển gen DX1-3 tăng 166,40% và 178,19% ở dòng DX1-7 (Hình 3.24).
Defensin ở hạt đậu xanh có khả năng ức chế -amylase của mọt đậu
xanh. Gen VrPDF1 (gen nội tại) mã hóa protein defensin ở đậu xanh có kích
thước 356 bp, gen chuyển VrPDF1 có kích thước 228 bp cùng hoạt động
phiên mã và dịch mã tổng hợp protein defensin VrPDF1 và protein VrPDF1
đều ức chế hoạt động -amylase của ấu trùng mọt đậu xanh. Kết quả so sánh
hiệu suất ức chế -amylase ở từ ấu trùng mọt đậu xanh của rVrPDF1 ở dòng
đậu xanh chuyển gen DX1-3 tăng 166,40% và 178,19% ở dòng DX1-7 so với
cây không chuyển gen đã chứng minh sự tăng cường biểu hiện defensin trong
hạt bằng ứng ứng dụng kỹ thuật chuyển gen là biện pháp nâng cao khả năng
kháng mọt hại hạt của cây đậu xanh.

2

23

%

bột của -amylase trong ruột mọt và ngăn chặn sự tiêu hoá tinh bột của mọt,
ức chế sự sinh trưởng phát triển của mọt. Defensin trong hạt đậu xanh có hàm
lượng thấp và khác nhau giữa các giống, vì thế để tăng hiệu quả ức chế α-amylase
của ruột ấu trùng mọt, việc ứng dụng công nghệ gen nhằm tăng cường biểu hiện,
nâng cao hàm lượng defensin trong hạt được quan tâm nghiên cứu. Xuất phát từ
những cơ sở trên, chúng tôi lựa chọn đề tài cho luận án là: “Nghiên cứu tạo cây
đậu xanh chuyển gen có khả năng kháng mọt”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
(i) Phân tích được đặc điểm của gen defensin 1 (VrPDF1) phân lập từ các
giống đậu xanh Việt Nam có khả năng kháng mọt khác nhau.
(ii) Biểu hiện được gen defensin 1 trên cây thuốc lá chuyển gen.
(iii) Tạo được cây đậu xanh chuyển gen chứa gen liên quan đến tính kháng mọt
Callosobruchus chinensis L.
3. Nội dung nghiên cứu
3.1. Nghiên cứu đánh giá khả năng kháng mọt của một số giống đậu xanh
trồng phổ biến ở miền Bắc Việt Nam.
3.2. Nghiên cứu thông tin, tách dòng và xác định trình tự gen VrPDF1 phân
lập từ cây đậu xanh. Phân tích đặc điểm trình tự nucleotide, trình tự amino
acid suy diễn của gen VrPDF1 phân lập từ giống đậu xanh có khả năng kháng
mọt tốt nhất và giống đậu xanh kháng mọt kém nhất.
3.3. Thiết kế vector chuyển gen thực vật mang gen VrPDF1 và phân tích hoạt
động của vector chuyển gen trên cây thuốc lá chuyển gen ở thế hệ T0 và T1.
3.4. Nghiên cứu chuyển cấu trúc chứa gen VrPDF1 và tạo cây đậu xanh
chuyển gen. Phân tích biểu hiện protein tái tổ hợp rVrPDF1 ở cây đậu xanh
chuyển gen ở thế hệ T1.
4. Những đóng góp mới của luận án
Luận án là công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu có hệ thống từ
đánh giá và phân nhóm các giống đậu xanh có khả năng kháng mọt khác
nhau; phân lập, tách dòng gen VrPDF1 đến thiết kế vector chuyển gen, tạo

cây chuyển gen và phân tích sự biểu hiện gen chuyển VrPDF1, cụ thể là:
1) Đã phân lập được gen VrPDF1 từ DNA hệ gen của hai giống đậu xanh có
khả năng kháng mọt khác biệt nhau. Gen VrPDF1 có kích thước 356 bp gồm

200,0
180,0
160,0
140,0
120,0
100,0
80,0
60,0
40,0
20,0
0,0

178,19
166,40

100

100

33,60

21,81

Hiệu suất hoạt động của alphaHiệu suất ức chế alphaamylase của dòng cây chuyển amylase của dòng cây chuyển
gen giảm so với cây WT
gen tăng so với cây WT

WT

ĐX1-3

ĐX1-7

Hình 3.24. Biểu đồ so sánh hiệu suất hoạt động -amylase và hiệu suất ức
chế -amylase của protein defensin trong hỗn hợp -amylase từ ấu trùng mọt
đậu xanh và dịch protein chiết từ cây chuyển gen, cây không chuyển gen.


Phân tích định tính hoạt độ của -amylase từ ấu trùng mọt phân giải
cơ chất tinh bột được thể hiện ở hình 3.23.

Hình 3.23. Hình ảnh phân tích định tính khả năng ức chế α-amylase ấu trùng mọt
đậu xanh của protein tái tổ hợp rVrDEF1 từ hạt cây đậu xanh chuyển gen ĐX22
thế hệ T1 và hạt cây đậu xanh ĐX22 đối chứng không chuyển gen.
3.3.5. Thảo luận kết quả tăng cường biểu hiện protein VrPDF1 ở cây đậu
xanh chuyển gen
Gen chuyển biểu hiện trong cây chuyển gen được kiểm tra dựa trên kết
quả phân tích hoạt động phiên mã và dịch mã của gen chuyển bằng sử dụng
các kỹ thuật RT-PCR, Real time RT-PCR, Western blot. Tương tự các phân
tích biểu hiện gen của các nghiên cứu trước đây, trong kết quả nghiên cứu của
chúng tôi, protein tái tổ hợp VrPDF1 được biểu hiện ở cả cây mô hình và cây
chuyển gen với kích thước khoảng 10 kDa. Khác với các nghiên cứu trên,
trong phân tích protein tái tổ hợp ở cây chuyển gen chúng tôi sử dụng kỹ thuật
ELISA để so sánh mức độ biểu hiện protein tái tổ hợp giữa các dòng cây
chuyển gen. Theo đó, kết quả phân tích ELISA ở 2 dòng đậu xanh chuyển gen
DX1-3 và DX1-7 đã xác định được hàm lượng protein tái tổ hợp VrPDF1 ở

dòng DX1-7 cao hơn dòng DX1-3 (Hình 3.22). Như vậy, theo hướng tiếp cận
khả năng kháng mọt tương quan với hàm lượng protein defensin VrPDF1 thì
kết quả phân ELISA ở trên có thể dự đoán ở thế hệ đậu xanh chuyển gen T1
dòng DX1-7 có khả năng kháng mọt cao hơn dòng DX1-3. Tuy nhiên, điều
này cần được kiểm chứng bằng thực nghiệm phân tích hoạt động ức chế amylase của protein tái tổ hợp VrPDF1 và so sánh khả năng kháng mọt giữa
các dòng đậu xanh chuyển gen và giữa dòng chuyển gen và cây đối chứng
không chuyển gen. Trong kết quả đánh giá hoạt động ức chế -amylase từ ấu
trùng mọt đậu xanh của protein tái tổ hợp rVrPDF1 của hai dòng đậu xanh
22

1 intron (128 bp) xen giữa 2 exon (228 bp); cDNA của gen VrPDF1 có
228bp, mã hóa 75 amino acid.
2) Protein tái tổ hợp rVrPDF1 được biểu hiện trên cây thuốc lá chuyển gen và
dịch chiết chứa protein rVrPDF1 từ dòng thuốc lá chuyển gen T1 có khả năng
ức chế -amylase của ruột ấu trùng mọt.
3) Tạo được cây đậu xanh của giống ĐX22 mang gen chuyển VrPDF1 ở thế
hệ T1 và biểu hiện thành công protein tái tổ hợp rVrPDF1. Chứng minh được
dịch chiết chứa protein tái tổ hợp rVrPDF1 biểu hiện ức chế -amylase của ấu
trùng mọt, hiệu suất ức chế -amylase ở hai dòng chuyển gen DX1-3 và DX17 tăng 166,40 % và 178,19% so với cây không chuyển gen.
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
5.1. Về mặt khoa học
Kết quả nghiên cứu góp phần làm sáng tỏ đặc điểm cấu trúc của gen
VrPDF1 phân lập từ các giống đậu xanh Việt Nam có khả năng kháng mọt
khác nhau. Sự tăng cường biểu hiện protein tái tổ hợp rVrPDF và biểu hiện
khả năng ức chế -amylase của ruột ấu trùng mọt của protein này từ cây
chuyển gen là những cơ sở khoa học để khẳng định hiệu quả của việc ứng
dụng công nghệ gen nhằm nâng cao khả năng kháng mọt của đậu xanh nói
riêng và cây trồng thu hạt nói chung.
5.2. Về mặt thực tiễn
Các trình tự gen VrPDF1 phân lập được, cấu trúc vector chuyển gen

thực vật mang gen VrPDF1, các dòng cây chuyển gen ở T1, dịch chiết chứa
rVrPDF1 có khả năng ức chế -amylase của ruột ấu trùng mọt đã góp phần
giải quyết những vấn đề cụ thể về việc ứng dụng kỹ thuật chuyển gen trong
cải thiện khả năng kháng mọt của cây đậu xanh, mở ra triển vọng ứng dụng
công nghệ sinh học hiện đại vào thực tiễn chọn giống cây trồng thu hạt ở Việt
Nam.
6. Cấu trúc của luận án: Luận án có 119 trang (kể cả tài liệu tham khảo)
được chia thành các chương, phần: Mở đầu (4 trang), Chương 1: Tổng quan
tài liệu (31 trang); Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu (22 trang);
Chương 3: Kết quả và thảo luận (42 trang); Kết luận và đề nghị (1 trang); Các
công trình công bố liên quan đến luận án (1 trang); Tài liệu tham khảo (18
trang). Luận án có 21 bảng, 31 hình và tham khảo 158 tài liệu.
3


Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Luận án đã tham khảo và tổng kết 158 tài liệu, trong đó có 27 tài liệu
tiếng Việt, 126 tài liệu tiếng Anh và 5 địa chỉ trang web về 3 vấn đề cơ bản
liên quan, như: (1) Đặc điểm của mọt hại đậu xanh và sự thiệt hại của mọt gây
ra cho đậu xanh; (2) Defensin thực vật; (3) Ứng dụng kỹ thuật chuyển gen và
biểu hiện gen defensin thực vật ở một số loài thuộc chi Vigna.
Đậu xanh là cây thực phẩm ngắn ngày giá trị kinh tế cao, dễ canh tác,
là nguồn thực phẩm chứa đầy thành phần dinh dưỡng cho con người và vật
nuôi. Hiện nay, đậu xanh đóng vai trò quan trọng sau đậu tương và lạc, bởi
vậy là nhóm cây trồng được ưu tiên khuyến khích sản xuất. Nhằm nâng cao
năng suất, sản lượng đậu xanh, nhiều công trình tập trung nghiên cứu, chọn
tạo và đưa ra các giống có chất lượng, chống chịu điều kiện bất lợi và phù
hợp với mọi vùng đất canh tác.
Sâu bệnh là nguyên nhân trực tiếp ảnh hưởng tới năng suất và bảo quản
sau thu hoạch các loài cây lấy hạt như đậu xanh, đậu tương,…, làm giảm chất

lượng và giá trị thương phẩm của sản phẩm, trong đó có mọt hại đậu xanh.
Mọt gây hại đậu xanh (Callosobruchus chinensis L.) không những gây hại
trong kho dự trữ mà chúng còn lan truyền và gây hại cả ở ngoài đồng ruộng.
Mọt đậu xanh gây hại trên các loại đậu: đậu xanh, đậu tằm, đậu đũa, đậu Hà
Lan, đậu đen trong đó hại nặng nhất là đậu xanh với tỷ lệ hại 100% (Bùi Công
Hiển, 1995). Sự thiệt hại do chúng gây ra là rất lớn, do đó công tác phòng trừ
sâu mọt đậu nói chung và mọt đậu xanh nói riêng đang là một vấn đề cấp thiết
cần được quan tâm nghiên cứu. Trong những năm qua có nhiều công trình
nghiên cứu chọn tạo các loại cây trồng có khả năng kháng các loại côn trùng,
nấm và virus. Các nghiên cứu đều thống nhất rằng đặc tính kháng mọt hại hạt
của cây trồng rất phức tạp và liên quan đến hoạt động của protein defensin.
Defensin thực vật là nhóm chuỗi peptide nhỏ đặc trưng bởi cấu trúc gấp
cuộn ba chiều qua tám cầu nối disulfide của các cystein. Defensin thực vật
hoạt động mạnh sẽ tổng hợp protein ức chế, ảnh hưởng đến chức năng kênh
ion, tác động đến hoạt động của α-amylase và trypsin, làm suy yếu vi sinh vật
(Cavalho et al., 2011). Cơ chế gây độc của defensin đối với côn trùng ở hạt
đậu xanh được mô tả như là sự cản trở enzyme phân giải tinh bột, làm cho
4

3.3.4. Kiểm tra hoạt động ức chế -amylase từ ấu trùng mọt của protein
tái tổ hợp rVrPDF1 ở thế hệ T1
Dịch chiết protein từ hạt đậu xanh của hai dòng chuyển gen DX1-3,
DX1-7 ở thế hệ T1 đã kiểm tra sự biểu hiện protein defensin tái tổ hợp bằng
Western blot và ELISA và dịch chiết protein từ hạt của cây không chuyển gen
WT được sử dụng thử nghiệm kiểm tra khả năng ức chế -amylase của ấu
trùng mọt đậu xanh. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.10.
Bảng 3.10. Hoạt độ của -amylase từ ấu trùng mọt đậu xanh trong các mẫu ủ
với dịch chiết protein từ hạt của các dòng đậu xanh chuyển gen T1 và từ hạt
cây không chuyển gen
Mẫu

Chỉ có amylase từ ấu
trùng mọt

ĐC

Hoạt độ αamylase
(ĐVHĐ/mg)

9,47 ± 0,29

6,19 ± 0,09

Hỗn hợp -amylase từ ấu
trùng mọt đậu xanh và dịch
protein chiết từ các dòng
cây chuyển gen
DX1-3
DX1-7
2,08 ± 0,06

1,35 ± 0,05

Bảng 3.10 cho thấy hoạt độ của -amylase trong thí nghiệm chỉ có amylase từ ấu trùng mọt và cơ chất tinh bột là 9,47 (ĐVHĐ/mg), trong khó đó
hoạt độ của -amylase trong hỗn hợp -amylase từ ấu trùng mọt đậu xanh và
dịch protein chiết từ cây không chuyển gen là 6,19 (ĐVHĐ/mg). Đối với hai
dòng cây chuyển gen, hoạt độ của -amylase trong hỗn hợp -amylase từ ấu
trùng mọt đậu xanh và dịch protein chiết từ dòng cây chuyển gen DX1-3 là
2,08 (ĐVHĐ/mg), từ dòng DX1-7 là 1,35 (ĐVHĐ/mg). Như vậy có thể thấy,
dịch chiết protein từ cây chuyển gen và cây không chuyển gen đều có hiện

tượng làm giảm hoạt độ -amylase so với thí nghiệm chỉ có -amylase từ ấu
trùng mọt và cơ chất tinh bột. Kêt quả phân tích cho thấy hỗn hợp -amylase
từ ấu trùng mọt đậu xanh và dịch protein chiết từ hai dòng cây chuyển gen
(DX1-3 và DX1-7) có hoạt độ -amylase thấp hơn ở cây không chuyển gen.
Điều này cho thấy protein tái tổ hợp rVrPDF1 trong hai dòng đậu xanh
chuyển gen ở thế hệ T1 có khả năng ức chế -amylase từ ấu trùng mọt.

21


và cây WT không xuất hiện băng protein. Kết quả phân tích Western blot đã
chứng minh protein tái tổ hợp rVrPDF1 đã được biểu hiện thành công trên hai
dòng đậu xanh chuyển gen DX1-3 và DX1-7 có nguồn gốc từ giống đậu xanh
ĐX22. Như vậy có thể nhận xét rằng, gen chuyển VrPDF1 đã di truyền qua
sinh sản hữu tính từ thế hệ T0 sang T1, hoạt động ổn định và biểu hiện ở cả
hai thế hệ cây chuyển gen.

Hình 3.21. Kết quả phân tích Western blot từ 3 dòng đậu xanh chuyển gen thế hệ T1
và cây đối chứng không chuyển gen.

Hàm lượng protein tái tổ hợp rVrPDF1 trong hạt của hai dòng DX1-3
và DX1-7 ở thế hệ T1 được phân tích bằng ELISA, kết quả được thể hiện ở
hình 3.22. Biểu đồ cho thấy hai dòng đậu xanh chuyển gen tổng hợp rVrPDF1
với hàm lượng protein dao động từ 6,23 µg/mg đến 9,26 µg/mg. Dòng DX1-7
là hàm lượng protein rVrPDF1 cao hơn protein rVrPDF1 của dòng DX1-3.
Kết quả này đã chứng minh rằng ở hai dòng đậu xanh chuyển gen, protein
VrPDF1 được tăng cường biểu hiện.

mọt không thể tồn tại được. Khi mọt ăn hạt đậu xanh, defensin đã ức chế hoạt
động của α-amylase, do đó ngăn chặn sự tiêu hóa tinh bột, kìm hãm sự sinh

trưởng, phát triển và dần mọt sẽ chết (Henrik et al., 2009; Liu et al., 2006).
Trong những năm gần đây đã có một số nghiên cứu về cấu trúc và hoạt
tính sinh học của defensin thực vật, đề xuất ứng dụng trong công nghệ sinh học
trong nghiên cứu chức năng của gen defensin và nâng cao khả năng kháng mọt
ở cây đậu xanh (Cavalho et al., 2009, 2011; Dos et al., 2010; Henrik et al.,
2009; Tavars et al, 2008). Defensin thực vật biểu hiện ở nhiều cơ quan khác
nhau của cây và tạo ra tuyến phòng vệ đầu tiên trước các đối tượng sâu bệnh.
Mặc dù sự tác động giữa defensin thực vật và nhiều đối tượng sâu bệnh còn
chưa được hiểu rõ, nhưng những defensin có thể được sử dụng để tạo ra cây
trồng biến đổi gen, giúp cải thiện khả năng chống chịu mọt. Chuyển gen
defensin ở đậu xanh là biện pháp công nghệ làm tăng hàm lượng defensin nhằm
tăng cường khả năng ức chế α-amylase của ấu trùng mọt, từ đó nâng cao khả
năng kháng mọt ở đậu xanh.
Chương 2

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Hình 3.22. Kết quả phân tích ELISA xác định hàm lượng protein tái tổ hợp
VrPDF1 của ba dòng đậu xanh chuyển gen (DX1-3, DX1-4, DX1-7) và cây đối
chứng không chuyển gen (WT).

2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
Sử dụng hạt 8 giống đậu xanh, trong đó 6 giống (Tằm TH, ĐX11, ĐX22,
ĐXVN5, ĐXVN6, ĐX14) do Trung tâm nghiên cứu và phát triển đậu đỗ, Viện
Cây Lương thực và Thực phẩm, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam cung cấp,
hai giống (ĐX17, V123) do Viện nghiên cứu Ngô Đan Phượng cung cấp. Giống
thuốc lá K326 do Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học,
Viện Hàn lâm Khoa học và công nghệ Việt Nam cung cấp.
Các chủng vi khuẩn E. coli DH5α và A. tumefaciens CV58 do phòng
Công nghệ tế bào thực vật của Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa

học và Công nghệ Việt Nam cung cấp. Các loại vector: Vector tách dòng
pBT, vector pBeta-Phaseolin và vector pDON201-SLHEP do Phòng Công
nghệ ADN ứng dụng, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và
Công nghệ Việt Nam cung cấp.
2.2. HOÁ CHẤT, THIẾT BỊ VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

20

5


Hoá chất, các bộ KIT được mua tại các hãng nổi tiếng Thế giới như
Bio-Neer, Fermentas, Invitrogen...; Thí nghiệm đánh giá khả năng kháng mọt
của 8 giống đậu xanh nghiên cứu được thực hiện tại phòng thí nghiệm của
Trung tâm Công nghệ sinh học, Trường Đại học Nông Lâm Bắc Giang. Các thí
nghiệm phân lập gen, thiết kế vector chuyển gen vào cây thuốc lá và phân tích
cây chuyển gen được tiến hành tại phòng Công nghệ ADN ứng dụng, phòng
Công nghệ Tế bào thực vật - Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa
học và Công nghệ Việt Nam. Thí nghiệm chuyển gen vào cây đậu xanh được
tiến hành tại phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào thực vật, Khoa Sinh học,
trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên.
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Phương pháp đánh giá kháng mọt của các giống đậu xanh nghiên
cứu
Phương pháp lây nhiễm mọt nhân tạo theo Tomooka và cs (1992), Hà
Quang Hùng (2005).
2.3.2. Phương pháp phân lập, tách dòng và xác định trình tự nucleotide
Kỹ thuật tách dòng gen được thực hiện theo Sammbrook và cs (2001).
Trình tự nucleotide của gen VrPDF1 được xác định trên máy đọc trình
tự nucleotide tự động ABI PRISM@ 3100 Advant Genetic Analyzer (Applied

Biosystem) sử dụng bộ hoá chất sinh chuẩn BigDye® Terminator v3.1 Cycle
Sequencing.
2.3.3. Thiết kế vector chuyển gen
(1) Tạo cấu trúc độc lập mang gen chuyển pDON201-SLHEP-VrPDF1; (2)
Gắn cấu trúc mang gen chuyển VrPDF1 vào vector chuyển gen thực vật
pBetaphaso-VrPDF1.
2.3.4. Phương pháp tạo cây chuyển gen nhờ vi khuẩn A. tumefaciens
Tạo cây thuốc lá chuyển gen: Phương pháp chuyển gen gián tiếp thông qua A.
tumefaciens được tiến hành theo phương pháp của Topping (1998).
Tạo cây đậu xanh chuyển gen: Phương pháp chuyển gen thông qua nách lá
mầm nhờ A. tumefaciens được tiến hành dựa trên nghiên cứu của Sonia và cs
(2007) và tham khảo hệ thống tái sinh phục vụ chuyển gen vào đậu xanh của
Nguyễn Thị Luyện (2009), Chu Hoàng Mậu (2010) và Nguyễn Vũ Thanh
Thanh (2012).

Hiệu suất chuyển gen VrPDF1 ở giai đoạn này được xác định đạt 0,79% (5/630
=0,79%).
Sử dụng Southern blot kiểm tra kết quả gắn gen chuyển VrPDF1 vào
hệ gen của tế bào chủ. Năm dòng đậu xanh chuyển gen T0 dương tính với
PCR DX0-1, DX0-3, DX0-4, DX0-7, DX0-8 và cây đối chứng không chuyển
gen WT đã được sử dụng để phân tích Southern blot, kết quả thể hiện ở hình
3.20.

6

19

Kb

M

(+) WT 1

2

3

4

5

10,0
7,0
5,0
4,0
3,0
2,0
1,5

Hình 3.20. Kết quả phân tích Southern blot của DNA tổng số các cây đậu xanh
chuyển gen VrPDF1 với đoạn dò nptII được đánh dấu bằng biotin. M: Marker
1kb, (-): cây đậu xanh ĐX22 không chuyển gen; DX0-1, DX0-3, DX0-4, DX0-7
và DX0-8: các dòng đậu xanh chuyển gen T0 dương tính với PCR

Như vậy, những bằng chứng về sự có mặt và dung hợp của gen
chuyển trong hệ gen của các cây chuyển gen ở thế hệ T0 bằng PCR và
Southern blot chính là kết quả bước đầu tạo cơ sở cho sự thành công của quy
trình chuyển gen VrPDF1 vào cây đậu xanh. Các dòng cây đậu xanh chuyển
gen được chăm sóc và ưu tiên phát triển phục vụ những phân tích tiếp theo về
khả năng hoạt động và biểu hiện mạnh của gen chuyển VrPDF1 trong cây

chuyển gen.
3.3.3. Phân tích sự biểu hiện của gen chuyển VrPDF1 trong các dòng cây
đậu xanh chuyển gen T1
Kết quả lai Western phân tích biểu hiện protein tái tổ hợp từ hạt của 3
dòng cây đậu xanh chuyển gen và cây WT trên hình 3.21 cho thấy, trên màng
lai xuất hiện băng màu ở vị trí kích thước khoảng gần 10 kDa ở 2 dòng cây
đậu xanh chuyển gen (DX1-3, DX1-7) ở thế hệ T1. Dòng chuyển gen DX1-4


Bảng 3.9. Kết quả biến nạp cấu trúc pPhaso-dest-VrPDF1 vào giống đậu xanh
ĐX22
Đối chứng và
thí nghiệm
ĐC0*
ĐC1*

Tổng Số mẫu
số mẫu tạo chồi

30
30
630

Số
chồi
kéo
dài
0
45
107

0
30
247

Số
chồi
ra rễ
0
25
46

Số cây
sống
trên giá
thể
0
10
35

Số cây
sống sót
trong nhà
lưới
0
10
23

2.3.5. Nhóm phương pháp phân tích cây chuyển gen
Kiểm tra sự có mặt của gen chuyển bằng kỹ thuật PCR. Phân tích cây

đậu xanh chuyển gen bằng Southern blot ở thế hệ T0 được thực hiện theo
0
Southern EM (1975). Phân tích biểu hiện protein tái tổ hợp VrPDF1 trong hạt
cây chuyển gen ở thế hệ T1 bằng phương pháp điện di protein theo Laemmli
(1970) và Western blot. Định lượng protein VrPDF1 tái tổ hợp bằng kỹ thuật
ELISA theo phương pháp của Sun và cs (2006).

3
lần
Ghi chú: ĐC0* lá mầm đậu xanh không chuyển gen được cấy trên môi trường tái
sinh có bổ sung kháng sinh; ĐC1* lá mầm đậu xanh không chuyển gen được cấy
trên môi trường tái sinh không bổ sung kháng sinh

Thí nghiệm

3.3.2. Xác định sự có mặt và sự dung hợp của gen chuyển VrPDF1 trong
hệ gen cây đậu xanh chuyển gen
Để kiểm tra sự có mặt của gen chuyển VrPDF1 trong hệ gen của các
dòng cây đậu xanh được chuyển gen, thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi
đặc hiệu, kết quả thể hiện ở hình 3.19.
M

(+) (-) 1

2

3

4

5

6

7

8

Chương 3

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG MỌT VÀ PHÂN LẬP GEN VrPDF1
CỦA CÂY ĐẬU XANH
3.1.1. Khả năng kháng mọt của các giống đậu xanh nghiên cứu
Chỉ số mẫn cảm mọt được xác định thông qua các chỉ tiêu: khối
lượng đậu xanh hao hụt, tỷ lệ nhiễm mọt và hệ số gia tăng quần thể mọt.
Giống có chỉ số mẫn cảm mọt nhỏ thì khả năng kháng mọt cao và ngược lại.
Kết quả được thể hiện qua bảng 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả đánh giá khả năng kháng mọt của các giống đậu xanh qua
các thời gian nhiễm mọt

0,5 kb 
0,25 kb 

 ~ 0,35 kb
 ~ 0,25 kb

Giống Tằm TH ĐX11
Hình 3.19. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân gen VrPDF1 từ các
dòng cây đậu xanh được chuyển gen ở thế hệ T0 bằng cặp mồi VrPDF1-HinIIIF/VrPDF1-SalI-R. M: thang DNA chuẩn 1 kb; (+): đối chứng dương là plasmid

pBT-VrPDF1; (-) sản phẩm PCR nhân gen VrPDF1 cây đậu xanh không chuyển
gen; 1-8: các dòng cây đậu xanh được chuyển gen VrPDF1

Chỉ số
mẫn
cảm
mọt

634,63

ĐX22

828,89 1058,71

ĐXVN5 ĐXVN6 ĐX14 ĐX17
760,35

V123

792,55 961,54 902,88 687,76

Kết quả trên đã chỉ ra rằng, trong hệ gen của cây đậu xanh chuyển gen
tương ứng với làn điện di số 1, 3, 4, 7, 8 đã có mặt của gen chuyển VrPDF1. Trong
630 mẫu biến nạp thu được 5 cây đậu xanh T0 dương tính với PCR và 5 dòng cây
đậu xanh chuyển gen T0 được ký hiệu là DX0-1; DX0-3, DX0-4, DX0-7, DX0-8.

Bảng 3.1 cho thấy, giống đậu xanh Tằm TH có chỉ số mẫn cảm mọt
thấp nhất (634,63) và giống ĐX22 có chỉ số mẫn cảm mọt cao nhất (1058,72).
Kết hợp các các kết quả phân tích trên có thể nhận thấy giống đậu xanh Tằm
TH có khả năng kháng mọt tốt nhất và giống ĐX22 kháng mọt kém nhất. Lựa

chọn 2 giống này để tiếp tục phân lập, tách dòng gen.

18

7


3.1.2. Khuếch đại và tách dòng gen VrPDF1 từ giống đậu xanh Tằm TH
và ĐX22
Lựa chọn hạt của giống Tằm TH (kháng mọt tốt nhất) và giống ĐX22
(kháng mọt kém nhất) làm đối tượng để phân tích đặc điểm của gen VrPDF1.
RNA tổng số, DNA tổng số được tách từ mầm hạt đậu xanh và được kiểm tra
bằng điện di trên gel agarose. Kết quả được thể hiện ở hình 3.2.
1

0,5 kb 
cDNA 

2

M

3

4

1

0,22 kb 

 Gen (DNA)

2

3

4 M

5

6

3.3. TẠO CÂY ĐẬU XANH CHUYỂN GEN VÀ BIỂU HIỆN PROTEIN
TÁI TỔ HỢP rVrPDF1 Ở GIỐNG ĐẬU XANH ĐX22

3.1.1. Chuyển cấu trúc pPhaso-dest-VrPDF1 và tạo cây đậu xanh chuyển gen
Chuyển cấu trúc pBetaPhaso-dest-VrPDF1 vào giống đậu xanh ĐX22
được thực hiện nhờ A.tumefaciens lây nhiễm qua nách lá mầm. Kết quả được
thể hiện ở hình 3.18 và bảng 3.9.

7 8

C

A

B

F

G

H

K

L

M

D

E

I

J

 0,35 kb

 0,25 kb

Hình 3.2. Kết quả điện di kiểm tra sản
phẩm PCR nhân gen VrPDF1 của hai
giống đậu xanh Tằm TH và ĐX22 (M:
Thang DNA chuẩn 1 kb plus; 1, 3: sản
phẩm PCR nhân từ mRNA và DNAhệ
gen của Tằm TH ; 2, 4: sản phẩm PCR
nhân từ mRNA và DNA hệ gen của
ĐX22 ).

Hình 3.3. Kết quả điện di kiểm tra sản
phẩm colony-PCR nhân gen VrPDF1
từ các dòng khuẩn lạc E. coli DH5.
(M: Thang DNA chuẩn 1 kb; 1, 2, 5, 6:
các dòng khuẩn lạc chứa vector mang
cDNA và DNA gen VrPDF1 của giống
Tằm TH; 3, 64, 7, 8: các dòng khuẩn
lạc chứa vector mang cDNA và DNA
VrPDF1 của giống ĐX22)

N

O

Hình 3.2 cho thấy, băng DNA có kích thước khoảng 0,25 kb và 0,35 kb
đúng như tính toán lý thuyết về kích thước cDNA và kích thước của gen
VrPDF1. Sản phẩm PCR được tách khỏi bản gel, tinh sạch và gắn trực tiếp
vào vector tách dòng pBT, sau đó được nhân dòng trong tế bào E. coli DH5.
Tiến hành chọn dòng bằng phản ứng colony-PCR trực tiếp từ khuẩn lạc. Kết
quả điện di cho thấy sản phẩm colony-PCR xuất hiện một băng DNA có kích
thước khoảng 0,22 kb và 0,35 kb đúng như tính toán lý thuyết (Hình 3.3). Kết
quả ở hình 3.3 cũng cho thấy kết quả chọn dòng thành công và các dòng
khuẩn lạc dương tính với PCR được sử dụng tách chiết plasmid tái tổ hợp
phục vụ việc xác định trình tự nucleotide.

Hình 3.18. Hình ảnh quá trình biến nạp cấu trúc pBetaPhaso-VrPDF1 qua
mô nách lá mầm và tái sinh cây đậu xanh chuyển gen. A: Hạt đậu xanh
ĐX22; B: Khử trùng hạt bằng khí clo; C: Gieo hạt trên môi trường GM; D:
Nảy mầm hạt sau 3 ngày; E: lá mầm và nách lá mầm làm nguyên liệu biến

nạp; F: Nhiễm khuẩn trong 30 phút; G: Đồng nuôi cấy trên CCM; H: Cảm
ứng tạo chồi trên SIM 1; I: Sau 2 tuần trên SIM 1; J: Cảm ứng tạo chồi 2
tuần trên SIM 2; K: Chọn lọc và kéo dài chồi trên SEM; L: Ra rễ; M: Cây
ra giá thể; N-O: Cây trồng trong chậu ở điều kiện nhà lưới

8

17


10

8,57

8
5,69

5,35

6
3,57

4
2
0

0
WT

T1-7

T1-8

T1-10

T1-11

Hình 3.16. Biểu đồ so sánh hàm lượng protein rVrPDF1 tái tổ hợp (g/mg protein
tổng số) giữa các dòng thuốc lá chuyển gen. WT: cây thuốc lá không chuyển gen,
T1-7, T1-8, T1-10, T1-11: bốn dòng thuốc lá chuyển gen. Các số liệu trên mỗi cột
biểu đồ là hàm lượng protein rVrPDF1 (g/mg protein tổng số). Thanh đứng trên

3.1.3. Đặc điểm của gen VrPDF1 phân lập từ hai giống đậu xanh Tằm TH
và ĐX22
Đặc điểm của đoạn mã hóa thuộc gen VrPDF1 phân lập từ mRNA
Kết quả đọc trình tự nucleotide cho thấy: Đoạn cDNA gen VrPDF1
có 228 nucleotide và bằng BLAST trong NCBI cho thấy: So với trình tự gen
PDF1 mang mã số AB020613.1 với gen VrPDF1 phân lập từ mRNA của
giống Tằm TH và DX22 có độ tương đồng tương ứng là 99% và 96% (Hình
3.4). Trình tự nucleotide của gen VrPDF1 (cDNA) phân lập từ mRNA của hai
giống đậu xanh Tằm TH và ĐX22 đã được đăng ký trên ngân hàng gen với
mã số LN913082.1 và LN913083.1. So với AB020613.1 gen VrPDF1 của
Tằm TH có 5 vị trí nucleotide sai khác và ĐX22 có 8 vị trí nucleotide .

mỗi cột biểu đồ là sai số chuẩn.

Thử nghiệm hoạt động ức chế -amylase của protein tái tổ hợp rVrPDF1
Để phân tích chức năng sinh học của protein tái tổ hợp rVrDEF1
trong hạt của các dòng thuốc lá chuyển gen ở thế hệ T1. Dịch chiết chứa
enzyme -amylase của ấu trùng mọt đậu xanh được ủ với dịch chiết protein từ

hạt các dòng cây chuyển gen và dịch chiết protein từ hạt cây đối chứng không
chuyển gen để kiểm tra ảnh hưởng của protein tái tổ hợp rVrDEF1 đến hoạt
động của -amylase phân giải tinh bột, kết quả được trình bày ở hình 3.17.
120

Hình 3.4. Trình tự nucleotide của gen VrPDF1 (cDNA) ở hai giống đậu xanh
Tằm TH, ĐX22 và trình tự mang mã số AB020613 trên GenBank

100,00

100
80
60
32,12

40

29,40
19,24

20

27,95

Tiếp tục phân tích, so sánh trình tự amino acid suy diễn từ trình tự
cDNA của giống Tằm TH và ĐX22 với protein suy diễn từ AB020613.1 trên
Ngân hàng Gen, kết quả được thể hiện ở hình 3.5.

0
WT

T1-7

T1-8

T1-10

T1-11

Hoạt độ của alpha-amylase từ ấu trùng mọt khi ủ với dịch chiết protein của cây
chuyển gen so với khi ủ với dịch chiết protein của cây đối chứng

Hình 3.17. Biểu đồ so sánh kết quả thử nghiệm hoạt động ức chế của rVrPDF1
đối với -amylase từ ấu trùng mọt đậu xanh.

Kết quả biểu hiện gen ở cây thuốc lá mô hình thành công là cơ sở để
chúng tôi tiến hành chuyển cấu trúc vào cây đậu xanh.
Hình 3.5. Trình tự amino acid suy diễn từ gen VrPDF1 của hai giống đậu xanh
Tằm TH, ĐX22 và đoạn trình tự mang mã số AB020613.
16

9


Từ hình 3.5 cho thấy, protein VrPDF1 gồm 75 amino acid và có độ
tương đồng cao. So với protein mang mã số AB020613 thì trình tự amino acid
suy diễn của giống Tằm TH có độ tương đồng 96%, của mẫu ĐX22 có độ
tương đồng 92%; còn trình tự amino acid suy diễn VrPDF1 của hai giống đậu
xanh tương đồng là 88%.
Trình tự gen VrPDF1 (cDNA) phân lập từ mRNA của giống Tằm TH

kháng mọt tốt nhất được sử dụng để thiết kế vector chuyển gen VrPDF1 nhằm
mục đích nâng cao khả năng kháng mọt của cây đậu xanh.
Đặc điểm của gen VrPDF1 phân lập từ DNA tổng số
Kết quả giải trình tự nucleotide của gen VrPDF1 phân lập từ DNA tổng số
của giống đậu xanh Tằm TH và ĐX22 cho thấy: Gen VrPDF1 có kích thước 356
nucleotide và bằng BLAST trong NCBI độ tương đồng của gen VrPDF1 so với
gen PDF1 mang mã số AB020613.1 trên GenBank từ 95% đến 99%. Việc so
sánh trình tự gen VrPDF1 phân lập từ DNA và từ cDNA ở hai giống đậu xanh
Tằm TH và ĐX22 cho phép xác định được đặc điểm cấu trúc của gen.

vào cây thuốc lá và gen chuyển VrPDF1 đã được hợp nhất vào hệ gen cây
thuốc lá.
3.2.4. Phân tích sự biểu hiện protein VrPDF1 tái tổ hợp trên cây thuốc lá
chuyển gen ở thế hệ T1
Trong 7 dòng thuốc lá chuyển gen cho kết quả lai Southern có 5 cây
chuyển gen thu được hạt. Hạt của các cây T0 chính là thế hệ cây chuyển gen
T1 và các dòng thuốc lá chuyển gen T0 thu được hạt ký hiệu là T1-4, T1-7,
T1-8, T1-10, T1-11. Sử dụng 5 dòng thuốc lá chuyển gen T1 và cây đối chứng
không chuyển gen để phân tích sự biểu hiện protein VrPDF1 tái tổ hợp trong
hạt. Kết quả thể hiện qua hình 3.15.
M

WT T1-4 T1-7

T1-8

T1-10

T1-11

35 kDa 

25 kDa 
15 kDa 
10 kDa 



Kết quả so sánh trình tự nucleotide của gen VrPDF1 phân lập từ DNA hệ
gen và gen VrPDF1 phân lập từ mRNA đã khẳng định gen VrPDF1 đã phân
lập thành công từ hệ gen hai giống đậu xanh Tằm TH và ĐX22. Hai trình tự
gen VrPDF1 của giống Tằm TH và ĐX22 đã được công bố trên Ngân hàng
Gen với các mã số LT797533, LT797534.
3.1.4. Thảo luận về cấu trúc của protein defensin

Hình 3.15 cho thấy, trên màng lai nitrocellulose xuất hiện băng màu ở

Kết quả so sánh vùng chức năng của VrPDF1 giữa giống đậu xanh
kháng mọt tốt và kháng mọt kém không thấy có sự thay đổi ở các cầu nối
disunfide giữa 4 cặp Cys trong vùng chức năng của defeinsin (Hình 3.7) và
cấu trúc không gian giữa hai protein VrPDF1 không có sự khác nhau.
L1

L2

L3

Hình 3.15. Kết quả lai Western của protein hạt từ một số dòng thuốc lá
chuyển gen thế hệ T1 với kháng thể cmyc. M: thang protein chuẩn từ 10 đến
180 kDa; WT: protein cây thuốc lá đối chứng (không chuyển gen); T1-4, T17, T1-8, T1-10, T1-11: protein của các dòng cây thuốc lá chuyển gen dương

tính với lai Southern.

L4

L5

L6

L7

vị trí kích thước khoảng gần 10 kDa ở 4 dòng cây thuốc lá chuyển gen (T1-7,
T1-8, T1-10, T1-11) ở thế hệ T1.
Để đánh giá mức độ biểu hiện protein tái tổ hơp sử dụng kỹ thuật
ELISA, kết quả được thể hiện ở biểu đồ trên hình 3.16. Trên hình 3.16 các
dòng thuốc lá chuyển gen có hàm lượng protein rVrPDF1 dao động từ 3,57

Tam TH

g/mg protein tổng số đến 8,57 g/mg protein tổng số và dòng T1-10 có hàm

DX22
a

b

c

d

Hình 3.7. Sơ đồ các cầu nối disulfide giữa các cặp Cys trong vùng chức năng của

protein VrPDF1. Các cầu nối disulfide: a-Cys14 - Cys35; b-Cys20 - Cys41; c10

lượng protein VrPDF1 cao nhất (8,57 g/mg protein tổng số).

15


tuần thì tiến hành thu lá để thực hiện phản ứng PCR kiểm tra sự có mặt của
gen chuyển.
3.2.3. Kết quả phân tích sự có mặt của gen chuyển VrPDF1 ở các dòng
cây thuốc lá chuyển gen bằng kỹ thuật PCR và Southern blot
Chọn 12 cây thuốc lá được chuyển gen ở thế hệ T0 cây thuốc lá không
chuyển gen (cây WT) để kiểm tra sự có mặt của gen chuyển VrPDF1 trong
cây chuyển gen bằng kỹ thuật PCR. Kết quả thể hiện ở hình 3.13.
1

2

3

4

5

6

7

8

9

(+) M

WT 10 11 12

Cys24 - Cys43; d-Cys3 - Cys47. L1, L2, L3, L4, L5, L6, L7: Các vòng lặp trong
cấu trúc không gian của protein VrPDF1

Như vậy, có giả thuyết rằng sự khác nhau về mức độ kháng mọt giữa hai
giống có liên quan đến hàm lượng defensin dự trữ trong hạt; rất có thể giống
đậu xanh có hàm lượng VrPDF1 trong hạt cao thì khả năng kháng mọt tốt và
ngược lại giống có hàm lượng VrPDF1 trong hạt thấp thì khả năng kháng mọt
kém. Chính vì vậy, ứng dụng kỹ thuật biểu hiện gen để nâng cao hàm lượng
defensin1 trong hạt là biện pháp công nghệ nhằm tăng cường khả năng kháng
mọt gây hại ở đậu xanh.
3.2. THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN VrPDF1 VÀ PHÂN TÍCH HOẠT

 0,25 kb

Hình 3.13. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân gen VrPDF1 từ dòng
cây thuốc lá được chuyển gen ở thế hệ T0. M: thang DNA 1 kb; (+): đối chứng
dương là plasmid pBT-VrPDF1; WT: cây đối chứng không chuyển gen; 1-12: các
dòng cây thuốc lá được chuyển gen VrPDF1 ký hiệu là T0-1, T0-2, T0-3, T0-4,
T0-5, T0-6, T0-7, T0-8, T0-9, T0-10, T0-11, T0-12.

ĐỘNG CỦA VECTOR CHUYỂN GEN TRÊN CÂY THUỐC LÁ
3.2.1. Thiết kế vector biểu hiện ở hạt thực vật mang gen VrPDF1 bằng kỹ
thuật Gateway
Trình tự nucleotide của gen VrPDF1 (cDNA) phân lập từ giống đậu

xanh Tằm TH (kháng mọt tốt nhất) có kích thước 228 nucleotide, mã hóa 75
amino acid được sử dụng để thiết kế vector chuyển gen thực vật, biểu hiện ở
hạt. Kết quả được thể hiện ở hình 3.10.

Để kiểm chứng gen chuyển VrPDF1 đã được gắn vào hệ gen thuốc lá, kỹ
thuật lai Southern được sử dụng để xác định sự có mặt của gen chuyển trong hệ
gen của cây thuốc lá chuyển gen. Kết quả được thể hiện qua hình 3.14.
M

T0-1

T0-2

T0-4 T0-6

T0-7

T0-8 T0-10 T0-11 T0-12

A
M

Hình 3.14. Kết quả phân tích cây thuốc lá chuyển gen bằng lai Southern ở các
dòng cây thuốc lá chuyển gen dương tính với PCR với đoạn dò VrPDF1 được
đánh dấu bằng biotin. M: thang DNA 1 kb; T0-1, T0-2, T0-4, T0-6, T0-7, T0-8,
T0-10, T0-11, T012: các dòng thuốc lá chuyển gen ở thế hệ T0.

1

2

3

4

5

6

1,0 kb 


0,25 kb 

B

Southern blot đã thu được 7 dòng cây cho kết quả lai dương tính, đó là
các dòng T0-4, T0-6, T0-7, T0-8, T0-10, T0-11, T0-12. Như vậy, có thể
khẳng định rằng cấu trúc pPhaso-dest -VrPDF1 đã được chuyển thành công

Hình 3.10. Sơ đồ cấu trúc vector pDON201-SLHEP-VrPDF1 (A) và kết quả điện
di sản phẩm colony-PCR kiểm tra vector pDON201-SLHEP-VrPDF1 (B). M:

14

11


thang DNA 1 kb; 1, 2, 3, 4, 5, 6: các dòng khuẩn lạc được kiểm tra bằng colonyPCR.

Vector pBetaPhaso-dest chứa promoter Phaseolin điều khiển biểu hiện
protein tái tổ hợp ở hạt mang gen VrPDF1 được tạo thành bằng kỹ thuật
Geteway. Kết quả thể hiện qua hình 3.11A. Cấu trúc pBetaPhaso-destVrPDF1 được nhân dòng trong E.coli DH5α trên môi trường có chứa
kanamycin và được chọn dòng bằng phản ứng colony-PCR với cặp mồi đặc
hiệu VrPDF1-F/VrPDF1-R, kết quả thể hiện ở hình 3.11B. 6 dòng khuẩn lạc
bằng phản ứng colony-PCR cho thấy 3 dòng (dòng số 1, 5, 6) cho sản phẩm
PCR đúng với kích thước gen chuyển VrPDF1. Các dòng này được sử dụng
tách plasmid tái tổ hợp pBetaPhaso-dest-VrPDF1. Cấu trúc vector chuyển gen
pBetaPhaso-dest-VrPDF1 được biến nạp vào A. tumefeciens CV58 bằng kỹ
thuật xung điện. Vi khuẩn A. tumefaciens được nuôi cấy trên môi trường LB
đặc bổ sung kháng sinh chọn lọc kanamycin, kiểm tra A. tumefaciens tái tổ
hợp bằng colony -PCR, lưu giữ và sử dụng trong chuyển gen.

3.2.2. Tạo cây thuốc lá chuyển gen in vitro mang gen VrPDF1
Để đánh giá hoạt động của cấu trúc mang gen chuyển VrPDF1 đã
thiết kế và làm cơ sở tạo cây đậu xanh chuyển gen VrPDF1, cấu trúc
pBetaPhaso-dest -VrPDF1 được biến nạp vào cây thuốc lá mô hình. Kết quả
các giai đoạn biến nạp vào mô lá thuốc lá thể hiện qua hình 3.12.

B

A

C

H

G

E

D

K

Hình 3.12. Hình ảnh quá trình biến nạp cấu trúc pBetaPhaso-VrPDF1 vào mô

lá thuốc lá giống K326 và tái sinh cây thuốc lá chuyển gen.
Bảng 3.7. Kết quả biến nạp cấu trúc pPhaso-dest -VrPDF1 vào mô lá thuốc lá

A
M

1

2

3

4

5

Đối chứng và
thí nghiệm

6

1,0 kb 
 0,25 kb

0,25 kb 

ĐC0*
ĐC1*
Thí
nghiệm

3 lần

Tổng
số
mảnh
lá
30
30
130

Số
mảnh
lá sống
sót sau
4 tuần
0
30
114

Số
mảnh
lá cảm

ứng tạo
chồi
0
27
93

Số cây ra
rễ trên
môi
trường
chọn lọc
0
15
80

Số
cây
ra
bầu

Số cây
sống sót
trong
nhà lưới

0
10
37

0

10
28

*

B

Ghi chú: ĐC0 mô lá thuốc lá không chuyển gen được cấy trên môi trường
*

Hình 3.11. A: Sơ đồ một đoạn trong cấu trúc vector pPhaso-dest-VrPDF1(A); B:
Kết quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra vector chuyển gen pPhaso-dest-VrPDF1.
M: thang DNA 1 kb; 1, 2, 3, 4, 5, 6: các dòng khuẩn lạc được kiểm tra bằng
colony-PCR

tái sinh có bổ sung kháng sinh; ĐC1 mô lá thuốc lá không chuyển gen được cấy
trên môi trường tái sinh không bổ sung kháng sinh

12

13

Tổng số cây sống sót trong nhà lưới là 28 cây cùng với 10 cây đối
chứng thu được tiếp tục chăm só để phục vụ phân tích sự biểu hiện gen. Các
dòng cây thuốc lá chuyển gen sau khi trồng trong nhà lưới được khoảng 3-4