THU NHẬN ENZYM PAPAIN ĐỂ ỨNG DỤNG VÀO PHẢN ỨNG THỦY PHÂN PROTEIN TRONG BÁNH DẦU ĐẬU PHỘNG

Header Page 1 of 166.

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM

THU NHẬN ENZYM PAPAIN ĐỂ ỨNG DỤNG VÀO
PHẢN ỨNG THỦY PHÂN PROTEIN TRONG BÁNH
DẦU ĐẬU PHỘNG

CHUYÊN NGÀNH: HÓA HỮU CƠ
MÃ SỐ: 604427

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC
GS.TS. TRẦN KIM QUI

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2009

Footer Page 1 of 166.


Header Page 2 of 166.

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành chƣơng trình cao học và luận văn này, em đã
nhận đƣợc sự hƣớng dẫn, giúp đỡ và góp ý nhiệt tình của quý thầy cô

khoa Hóa trƣờng Đại Học Khoa Học Tự Nhiên.
Trƣớc hết, em xin chân thành cảm ơn đến quý thầy cô khoa Hóa
trƣờng Đại Học Khoa Học Tự Nhiên TpHCM, đặc biệt là những thầy
cô đã tận tình dạy bảo cho em trong suốt thời gian học tập tại trƣờng.
Em xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến GS.TS. Trần Kim Qui, TS. Lê
Việt Tiến đã dành nhiều thời gian và tâm huyết hƣớng dẫn nghiên
cứu và giúp em hoàn thành luận văn này.
Nhân đây, em cũng xin chân thành cảm ơn các anh chị nghiên
cứu sinh đã động viên và giúp đỡ em rất nhiều trong quá trình hoàn
thành luận văn.
Em xin chân thành cảm ơn anh Hồ Anh Vũ, anh luôn động viên
và đồng hành cùng em trong suốt thời gian học tập cũng nhƣ thời
gian em thực hiện luận văn này.
Cuối cùng con xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến gia đình
đã cho con có đƣợc thành quả nhƣ ngày hôm nay.
Mặc dù đã có nhiều cố gắng để hoàn thiện luận văn bằng tất cả
sự nhiệt tình và năng lực của mình, tuy nhiên không thể tránh khỏi
những thiếu sót, rất mong nhận đƣợc những ý kiến đóng góp quý báu
của quý thầy cô và các bạn.
Tp.HCM – Ngày 12 tháng 09 năm 2009

Footer Page 2 of 166.


Header Page 3 of 166.

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1
Chương 1
TỔNG QUAN ...................................................................................2

1.1 GIỚI THIỆU VỀ ENZYME PAPAIN ......................................................2
1.1.1 Cysteine protease .................................................................................2
1.1.2 Papain ....................................................................................................2
1.1.2.1 Nguồn gốc .......................................................................................2
1.1.2.1.1. Giới thiệu về cây đu đủ. ..........................................................3
1.1.2.1.2. Phân bố sinh thái của cây đu đủ. ............................................4
1.1.2.1.3. Hoạt tính sinh học và công dụng của một số chất có trong
cây đu đủ .................................................................................................4
1.1.2.2 Tính chất của papain .....................................................................5
1.1.2.2.1 Tính chất vật lý .........................................................................5
1.1.2.2.2 Tính chất hóa học .....................................................................5
a) Cấu tạo hóa học ...........................................................................5
b) Cấu trúc không gian .....................................................................6
c) Cấu trúc tâm hoạt động của papain .............................................7
d) Phản ứng của papain ...................................................................7
e. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của papain ................9
1.1.2.3 Ứng dụng của enzyme papain .................................................10
1.1.2.3.1 Trong y học: .......................................................................10
1.1.2.3.2 Trong công nghiệp thực phẩm: ..........................................10
1.1.2.3.3 Trong các ngành công nghiệp khác: ..................................10
1.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA BÁNH DẦU ĐẬU PHỘNG ................10
1.3 PHẢN ỨNG THỦY PHÂN BÁNH DẦU ĐẬU PHỘNG ...........................12
1.3.1 Khái niệm phản ứng thủy phân ............................................................12
1.3.2 Quy trình thực hiện phản ứng thủy phân ............................................13
1.3.3 Các thay đổi hóa sinh trong quá trình thủy phân: .............................14
1.3.4 Tính chất của sản phẩm sau thủy phân ...............................................14
1.3.5 Ƣu và nhƣợc điểm của phản ứng thủy phân: ......................................15
1.3.5.1 Ƣu điểm: ...........................................................................................15
1.3.5.2 Nhƣợc điểm: .....................................................................................15
1.4 ỨNG DỤNG ENZYME PAPAIN LÀM XÚC TÁC CHO PHẢN ỨNG

THỦY PHÂN PROTEIN TRONG BÁNH DẦU ĐẬU PHỘNG ....................15
Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ........................................................17
2.1. HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ ........................................................................17
2.1.1. Hóa chất .................................................................................................17
2.1.2. Thiết bị ...................................................................................................18
2.2 PHƢƠNG PHÁP THỰC HIỆN ...................................................................18
2.2.1 Phƣơng pháp trích nhựa đu đủ từ trái.................................................18
2.2.2 Phƣơng pháp thu nhận papain tinh khiết ............................................19

Footer Page 3 of 166.


Header Page 4 of 166.

2.2.2.1 Loại bỏ các chất không tan ở pH 9. ................................................20
2.2.2.2 Quá trình phân đoạn bằng amonium sulfate .................................20
2.2.2.3 Quá trình phân đoạn bằng NaCl .....................................................20
2.2.2.4 Kết tinh..............................................................................................20
2.2.2.5 Tái kết tinh ........................................................................................21
2.2.2.6 Đông khô chân không. .....................................................................21
2.2.3 Xác định lƣợng protein theo phƣơng pháp Lowry .............................22
2.2.4 Xác định hoạt tính protein theo phƣơng pháp Anson ........................23
2.2.5 Xác định đạm tổng số theo phƣơng pháp Kjeldahl ............................24
2.2.5.1 Nguyên tắc: ......................................................................................24
2.2.5.2 Cách tính: .........................................................................................24
2.2.6 Phƣơng pháp xác định đạm formol (phƣơng pháp Sorensen) ..........25
2.2.6.1 Nguyên tắc........................................................................................25
2.2.6.2 Tiến hành .........................................................................................25
2.2.6.3 Cách tính ..........................................................................................26
2.2.7 Xác định đạm amoniac ..........................................................................26

2.2.7.1 Nguyên tắc........................................................................................26
2.2.7.2 Tiến hành .........................................................................................27
2.2.7.3 Cách tính ..........................................................................................27
2.2.8 Phƣơng pháp chung tiến hành phản ứng thủy phân bánh dầu đậu
phộng với xúc tác papain thô. ........................................................................27
2.2.8.1 Phƣơng pháp loại béo: ....................................................................27
2.2.8.2 Phƣơng pháp thực hiện phản ứng .................................................27
2.2.8.3 Hiệu suất thủy phân ........................................................................28
Chương 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................30
3.1 KHẢO SÁT LƢỢNG NHỰA Ở QUẢ ĐU ĐỦ ...........................................30
3.2 KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN SƠ CHẾ NHỰA TƢƠI .....................................30
3.3 KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN THU NHẬN PAPAIN TỪ NHỰA KHÔ .......31
3.4 PHƢƠNG PHÁP LOWRY XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG PROTEIN .......33
3.5 PHƢƠNG PHÁP ANSON XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH PROTEASE ........34
3.6 KHẢO SÁT LƢỢNG ENZYME THU ĐƢỢC SAU CÁC GIAI ĐOẠN
TINH CHẾ. ..........................................................................................................35
3.7 KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CỦA ENZYME SAU CÁC GIAI ĐOẠN
TINH CHẾ ...........................................................................................................37
3.8 KHẢO SÁT SỰ BIẾN ĐỔI LƢỢNG PROTEIN TRONG CÁC CHẾ
PHẨM PROTEASE THU ĐƢỢC THEO THỜI GIAN ..................................39
3.9 KHẢO SÁT SỰ BIẾN ĐỔI HOẠT TÍNH CỦA CÁC CHẾ PHẨM
THEO THỜI GIAN. ...........................................................................................41
3.10 KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN HOẠT TÍNH CỦA
ENZYME PAPAIN. ............................................................................................44
3.10.1. Khảo sát ảnh hƣởng của pH ...............................................................44
3.10.2 Khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ .......................................................45

Footer Page 4 of 166.

Header Page 5 of 166.

3.11 KHẢO SÁT HÀM LƢỢNG ĐẠM FORMOL VÀ AMONIAC THEO
THỜI GIAN TRONG PHẢN ỨNG THỦY PHÂN. .........................................46
3.12 KHẢO SÁT PHẢN ỨNG THỦY PHÂN BÁNH DẦU ĐẬU PHỘNG
VỚI XÚC TÁC PAPAIN THÔ. .........................................................................49
3.12.1. Khảo sát phản ứng thủy phân ở hàm lƣợng xúc tác là 0.25% so
với cơ chất theo thời gian............................................................................50
3.12.2. Khảo sát phản ứng thủy phân ở hàm lƣợng xúc tác là 0.50% so
với cơ chất theo thời gian............................................................................57
3.12.3. Khảo sát phản ứng thủy phân ở hàm lƣợng xúc tác là 0.75% so
với cơ chất ....................................................................................................65
3.12.4. Khảo sát phản ứng thủy phân ở hàm lƣợng xúc tác là 1.00% so
với cơ chất ....................................................................................................72
KẾT LUẬN ..............................................................................................................80
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................81
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1 Tính chất vật lý của papain ..........................................................................5
Bảng 1.2 Thành phần hóa học của hạt đậu phộng ....................................................10
Bảng 1.3. Thành phần acid béo trong bánh dầu đậu phộng ......................................11
Bảng 1.4 Thành phần hóa học của bã đậu phộng đã loại béo ...................................11
Bảng 1.5. Thành phần amino acid trong đậu phộng .................................................11
Bảng 3.1. Hàm lượng phần trăm của nhựa đu đủ trong các loại quả khác nhau. .....30
Bảng 3.2. Các phương pháp làm khô nhựa đu đủ .....................................................30
Bảng 3.3. Mật độ quang của albumin ở bước sóng 750nm ......................................33
Bảng 3.4. Mật độ quang của tyrosin ở bước sóng 720nm ........................................34
Bảng 3.5. Lượng protein thu được ở các phân đoạn tinh chế khác nhau. .................36
Bảng 3.6. Hoạt tính protease của enzyme sau các giai đoạn tinh chế .......................38
Bảng 3.7. Hàm lượng protein của các chế phẩm theo thời gian ..............................40

Bảng 3.8. Hoạt tính protein của các chế phẩm theo thời gian ..................................42
Bảng 3.9. Hoạt tính của protein P(UI) biến đổi theo pH .........................................44
Bảng 3.10. Hoạt tính của protein P(UI) trong nhựa khô biến đổi theo nhiệt độ ......45
Bảng 3.11: Biến thiên hàm lượng đạm formol theo thời gian ở tỉ lệ enzyme là 0.25%
so với cơ chất. ...........................................................................................................47
Bảng 3.12: Biến thiên hàm lượng đạm formol theo thời gian ở tỉ lệ enzyme là 0.50%
so với cơ chất. ...........................................................................................................47
Bảng 3.13: Biến thiên hàm lượng đạm formol theo thời gian ở tỉ lệ enzyme là 1.00%
so với cơ chất. ...........................................................................................................47
Bảng 3.14: Biến thiên hàm lượng đạm amoniac ở các nồng độ enzyme khác nhau 48
Bảng 3.15. Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 60OC và hàm lượng xúc tác là 0.25% .....51
Bảng 3.16. Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 70OC và hàm lượng xúc tác là 0.25% .....51
Bảng 3.17. Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 80OC và hàm lượng xúc tác là 0.25% .....52
Bảng 3.18. Hiệu suất phản ứng ở pH 7.0, 60OC và hàm lượng xúc tác là 0.25% .....53
Bảng 3.19. Hiệu suất phản ứng ở pH 7.0, 70OC và hàm lượng xúc tác là 0.25%.....53
Bảng 3.20. Hiệu suất phản ứng ở pH 7.0, 80OC và hàm lượng xúc tác là 0.25% .....54

Footer Page 5 of 166.


Header Page 6 of 166.

3.11 KHẢO SÁT HÀM LƢỢNG ĐẠM FORMOL VÀ AMONIAC THEO
THỜI GIAN TRONG PHẢN ỨNG THỦY PHÂN. .........................................46
3.12 KHẢO SÁT PHẢN ỨNG THỦY PHÂN BÁNH DẦU ĐẬU PHỘNG
VỚI XÚC TÁC PAPAIN THÔ. .........................................................................49
3.12.1. Khảo sát phản ứng thủy phân ở hàm lƣợng xúc tác là 0.25% so
với cơ chất theo thời gian............................................................................50
3.12.2. Khảo sát phản ứng thủy phân ở hàm lƣợng xúc tác là 0.50% so
với cơ chất theo thời gian............................................................................57

3.12.3. Khảo sát phản ứng thủy phân ở hàm lƣợng xúc tác là 0.75% so
với cơ chất ....................................................................................................65
3.12.4. Khảo sát phản ứng thủy phân ở hàm lƣợng xúc tác là 1.00% so
với cơ chất ....................................................................................................72
KẾT LUẬN ..............................................................................................................80
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................81
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1 Tính chất vật lý của papain ..........................................................................5
Bảng 1.2 Thành phần hóa học của hạt đậu phộng ....................................................10
Bảng 1.3. Thành phần acid béo trong bánh dầu đậu phộng ......................................11
Bảng 1.4 Thành phần hóa học của bã đậu phộng đã loại béo ...................................11
Bảng 1.5. Thành phần amino acid trong đậu phộng .................................................11
Bảng 3.1. Hàm lượng phần trăm của nhựa đu đủ trong các loại quả khác nhau. .....30
Bảng 3.2. Các phương pháp làm khô nhựa đu đủ .....................................................30
Bảng 3.3. Mật độ quang của albumin ở bước sóng 750nm ......................................33
Bảng 3.4. Mật độ quang của tyrosin ở bước sóng 720nm ........................................34
Bảng 3.5. Lượng protein thu được ở các phân đoạn tinh chế khác nhau. .................36
Bảng 3.6. Hoạt tính protease của enzyme sau các giai đoạn tinh chế .......................38
Bảng 3.7. Hàm lượng protein của các chế phẩm theo thời gian ..............................40
Bảng 3.8. Hoạt tính protein của các chế phẩm theo thời gian ..................................42
Bảng 3.9. Hoạt tính của protein P(UI) biến đổi theo pH .........................................44
Bảng 3.10. Hoạt tính của protein P(UI) trong nhựa khô biến đổi theo nhiệt độ ......45
Bảng 3.11: Biến thiên hàm lượng đạm formol theo thời gian ở tỉ lệ enzyme là 0.25%
so với cơ chất. ...........................................................................................................47
Bảng 3.12: Biến thiên hàm lượng đạm formol theo thời gian ở tỉ lệ enzyme là 0.50%
so với cơ chất. ...........................................................................................................47
Bảng 3.13: Biến thiên hàm lượng đạm formol theo thời gian ở tỉ lệ enzyme là 1.00%
so với cơ chất. ...........................................................................................................47
Bảng 3.14: Biến thiên hàm lượng đạm amoniac ở các nồng độ enzyme khác nhau 48
Bảng 3.15. Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 60OC và hàm lượng xúc tác là 0.25% .....51

Bảng 3.16. Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 70OC và hàm lượng xúc tác là 0.25% .....51
Bảng 3.17. Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 80OC và hàm lượng xúc tác là 0.25% .....52
Bảng 3.18. Hiệu suất phản ứng ở pH 7.0, 60OC và hàm lượng xúc tác là 0.25% .....53
Bảng 3.19. Hiệu suất phản ứng ở pH 7.0, 70OC và hàm lượng xúc tác là 0.25%.....53
Bảng 3.20. Hiệu suất phản ứng ở pH 7.0, 80OC và hàm lượng xúc tác là 0.25% .....54

Footer Page 6 of 166.


Header Page 7 of 166.

Bảng 3.21. Hiệu suất phản ứng ở pH 8.0, 60OC và hàm lượng xúc tác là 0.25% .....55
Bảng 3.22. Hiệu suất phản ứng ở pH 8.0, 70OC và hàm lượng xúc tác là 0.25% .....56
Bảng 3.23. Hiệu suất phản ứng ở pH 8.0, 80OC và hàm lượng xúc tác là 0.25% .....56
Bảng 3.24. Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 60OC và hàm lượng xúc tác là 0.50% .....58
Bảng 3.25. Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 70OC và hàm lượng xúc tác là 0.50% .....59
Bảng 3.26. Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 80OC và hàm lượng xúc tác là 0.50% .....59
Bảng 3.27. Hiệu suất phản ứng ở pH 7.0, 60OC và hàm lượng xúc tác là 0.50% .....60
Bảng 3.28. Hiệu suất phản ứng ở pH 7.0, 70OC và hàm lượng xúc tác là 0.50% .....61
Bảng 3.29. Hiệu suất phản ứng ở pH 7.0, 80OC và hàm lượng xúc tác là 0.50% .....61
Bảng 3.30. Hiệu suất phản ứng ở pH 8.0, 60OC và hàm lượng xúc tác là 0.50% .....62
Bảng 3.31. Hiệu suất phản ứng ở pH 8.0, 70OC và hàm lượng xúc tác là 0.50% .....63
Bảng 3.32. Hiệu suất phản ứng ở pH 8.0, 80OC và hàm lượng xúc tác là 0.50% .....63
Bảng 3.33. Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 60OC và hàm lượng xúc tác là 0.75% .....65
Bảng 3.34. Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 70OC và hàm lượng xúc tác là 0.75% .....66
Bảng 3.35. Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 80OC và hàm lượng xúc tác là 0.75% .....66
Bảng 3.36. Hiệu suất phản ứng ở pH 7.0, 60OC và hàm lượng xúc tác là 0.75% .....68
Bảng 3.37. Hiệu suất phản ứng ở pH 7.0, 70OC và hàm lượng xúc tác là 0.75% .....68
Bảng 3.38. Hiệu suất phản ứng ở pH 7.0, 80OC và hàm lượng xúc tác là 0.75% .....69
Bảng 3.39. Hiệu suất phản ứng ở pH 8.0, 60OC và hàm lượng xúc tác là 0.75% .....70

Bảng 3.40. Hiệu suất phản ứng ở pH 8.0, 70OC và hàm lượng xúc tác là 0.75% .....70
Bảng 3.41. Hiệu suất phản ứng ở pH 8.0, 80OC và hàm lượng xúc tác là 0.75% .....71
Bảng 3.42. Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 60OC và hàm lượng xúc tác là 1.00% .....72
Bảng 3.43. Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 70OC và hàm lượng xúc tác là 1.00% .....73
Bảng 3.44. Hiệu suất phản ứng ở pH 6.0, 80OC và hàm lượng xúc tác là 1.00% .....74
Bảng 3.45. Hiệu suất phản ứng ở pH 7.0, 60OC và hàm lượng xúc tác là 1.00% .....75
Bảng 3.46. Hiệu suất phản ứng ở pH 7.0, 70OC và hàm lượng xúc tác là 1.00% .....75
Bảng 3.47. Hiệu suất phản ứng ở pH 7.0, 80OC và hàm lượng xúc tác là 1.00% .....76
Bảng 3.48. Hiệu suất phản ứng ở pH 8.0, 60OC và hàm lượng xúc tác là 1.00% .....77
Bảng 3.49. Hiệu suất phản ứng ở pH 8.0, 70OC và hàm lượng xúc tác là 1.00% .....77
Bảng 3.50. Hiệu suất phản ứng ở pH 8.0, 80OC và hàm lượng xúc tác là 1.00% .....78
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
Hình 2.1. Các loại hoa và trái của cây đu đủ. .............................................................3
Hình 1.2 Cấu trúc bậc 3 của papain ............................................................................6
Hình 1.3 Cấu trúc tâm hoạt động của papain ..............................................................7
Hình 1.4. Phản ứng hóa học của papain ......................................................................8
Hình 1.8. Sơ đồ phản ứng thủy phân.........................................................................13
Hình 2.1 Cách lấy nhựa đu đủ ...................................................................................19
Hình 2.2 Sơ đồ thu nhận papain từ nhựa đu đủ đông khô.........................................21
Hình 3.1a. Điện di đồ của nhựa khô ở trái non sơ chế bằng dung môi etanol .........31
Hình 3.1 b. Điện di đồ của chế phẩm Merk và papain tinh chế từ nhựa đu đủ đông
khô. ............................................................................................................................32

Footer Page 7 of 166.


Header Page 8 of 166.

Hình 3.2. Đường chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc của mật độ quang vào nồng độ
albumin. .....................................................................................................................33

Hình 3.3. Đường chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc của mật độ quang vào nồng độ
tyrosin. .......................................................................................................................34
Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn sự biến thiên lượng protein sau mỗi giai đoạn tinh chế. .36
Hình 3.5. Sự biến thiên hoạt tính của protein sau các giai đoạn tinh chế. ................39
Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn sự biến thiên hàm lượng protein theo thời gian .............40
Hình 3.7. Sự biến đổi hoạt tính của các chế phẩm theo thời gian .............................42
Hình 3.8 Hoạt tính của protein P(UI/ml) trong nhựa khô biến đổi theo pH .............44
Hình 3.9:Hoạt tính của protein trong nhựa khô theo nhiệt độ ..................................46
Hình 3.10: Đồ thị biểu diễn sự biến thiên hàm lượng đạm formol theo thời gian
phản ứng. ...................................................................................................................48
Hình 3.11. Sự phụ thuộc của hiệu suất vào thời gian phản ứng ở pH 6.0 và hàm
lượng xúc tác là 0.25%. .............................................................................................52
Hình 3.12. Sự phụ thuộc của hiệu suất vào thời gian phản ứng ở pH 7.0 và hàm
lượng xúc tác là 0.25%. .............................................................................................55
Hình 3.13. Sự phụ thuộc của hiệu suất vào thời gian phản ứng ở pH 8.0 và hàm
lượng xúc tác là 0.25%. .............................................................................................57
Hình 3.14. Sự phụ thuộc của hiệu suất vào thời gian phản ứng ở pH 6.0 và hàm
lượng xúc tác là 0.50%. .............................................................................................60
Hình 3.15. Sự phụ thuộc của hiệu suất vào thời gian phản ứng ở pH 7.0 và hàm
lượng xúc tác là 0.50%. .............................................................................................62
Hình 3.16. Sự phụ thuộc của hiệu suất vào thời gian phản ứng ở pH 8.0 và hàm
lượng xúc tác là 0.50%. .............................................................................................64
Hình 3.17. Sự phụ thuộc của hiệu suất vào thời gian phản ứng ở pH 6.0 và hàm
lượng xúc tác là 0.75%. .............................................................................................67
Tại pH 7.0, hiệu suất phản ứng ở mỗi nhiệt độ khác nhau được trình bày trong bảng
3.36 – 3.38. ................................................................................................................67
Hình 3.18. Sự phụ thuộc của hiệu suất vào thời gian phản ứng ở pH 7.0 và hàm
lượng xúc tác là 0.75%. .............................................................................................69
Hình 3.19. Sự phụ thuộc của hiệu suất vào thời gian phản ứng ở pH 8.0 và hàm
lượng xúc tác là 0.75%. .............................................................................................71

Hình 3.20. Sự phụ thuộc của hiệu suất vào thời gian phản ứng ở pH 6.0 và hàm
lượng xúc tác là 1.00%. .............................................................................................74
Hình 3.21. Sự phụ thuộc của hiệu suất vào thời gian phản ứng ở pH 7.0 và hàm
lượng xúc tác là 1.00%. .............................................................................................76
Hình 3.22. Sự phụ thuộc của hiệu suất vào thời gian phản ứng ở pH 8.0 và hàm
lượng xúc tác là 1.00%. .............................................................................................78
Hình 3.23 Kết quả điện di của dung dịch sau phản ứng ở các hàm lượng xúc tác
khác nhau...................................................................................................................79

Footer Page 8 of 166.


Header Page 9 of 166.

1

MỞ ĐẦU
Hiện nay vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm và ô nhiễm môi trường đang là
vấn đề được quan tâm hàng đầu. Trong quá trình sản xuất nước chấm có hàm lượng
đạm cao, người ta thường dùng các phương pháp thủy phân protein tạo thành các
dung dịch amino acid. Có 3 phương pháp tiến hành phản ứng thủy phân protein:
Phương pháp hóa học: thủy phân protein với xúc tác acid, thời gian tiến hành
phản ứng là 24 giờ. Nhược điểm của phương pháp này là tạo thành sản phẩm phụ 3MCPD, một chất độc gây ung thư.
Phương pháp dùng men vi sinh: sử dụng chủng nấm Aspergillus oryzae để
xúc tác phản ứng thủy phân protein. Nhược điểm của phương pháp này là thời gian
thực hiện phản ứng khá dài khoảng từ 6 – 8 tháng.
Phương pháp hóa sinh: sử dụng xúc tác là các enzyme protease có nguồn gốc
động thực vật làm xúc tác. Phương pháp này có thời gian phản ứng ngắn và không
tạo sản phẩm phụ có khả năng gây ung thư.
Các phản ứng sử dụng xúc tác enzyme được ứng dụng rất rộng rãi trong lĩnh

vực này vì chúng không những cho hiệu suất cao mà thời gian thực hiện phản ứng
cũng ngắn hơn so với phản ứng được tiến hành theo phương pháp cổ điển. Hơn nữa
các enzyme thường được phân bố rất rộng rãi trong tất cả các mô, cơ quan động vật
và thực vật, tế bào vi sinh vật nên tương đối dễ tìm.
Trong phạm vi luận văn này chúng tôi sẽ tiến hành thu nhận enzyme papain
có trong nhựa đu đủ và ứng dụng tính chất thủy phân protein của enzyme papain để
làm xúc tác cho phản ứng thủy phân protein trong bánh dầu đậu phộng đã được ép
lấy dầu. Chúng tôi chọn enzyme papain vì đây là enzyme có hoạt tính protease cao,
hiện diện nhiều trong nhựa trái đu đủ, một loại cây được trồng rất phổ biến ở nước
ta.

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HÓA HỌC

Footer Page 9 of 166.

CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM


Header Page 10 of 166.

2

TỔNG QUAN

Chương 1

1.1 GIỚI THIỆU VỀ ENZYME PAPAIN
1.1.1 Cysteine protease [8, 9,

19, 34, 43]

Cysteine proteases (EC.3.4.22) là nhóm các protein có trọng lượng phân tử
trong khoảng 21-30 kDa, các protein này có khả năng xúc tác để thủy phân các loại
liên kết: peptide, amide, ester thiol. Đây cũng là những enzyme có nhóm –SH trong
tâm hoạt động.
Người ta đã tìm thấy hơn 20 họ cysteine proteases (Barrett, 1994) và nhiều
enzyme trong số này (papain, bromelain, ficain, animal cathepsins) được ứng dụng
rộng rãi trong công nghiệp.
Có

hai

loại

carboxypeptidase

B)

cysteine
và

proteases

endopeptidases

là

exopeptidase

(bromelain,

(cathepsin

ficain,

X,

cathepsin...).

Exopeptidase thủy phân liên kết peptide ở đầu N hoặc đầu C tự do trong khi đó
endopeptidase cắt đứt các liên kết peptide ở giữa chuỗi polypeptide.
1.1.2 Papain
1.1.2.1 Nguồn gốc[2,17, 19, 32 ]
Papain (EC 3.4.22.3) là cysteine protease được biết đến nhiều nhất và được
phân lập lần đầu tiên vào năm 1879 từ nhựa trái đu đủ (Carica papaya). Đây cũng
là enzyme đầu tiên được xác định cấu trúc tinh thể (Drenth et al., 1968; Kamphuis
et al., 1894). Trong nhựa đu đủ ngoài enzyme papain còn có các loại protease khác
như chymopapain, caricain, glycyl endopeptidase và một số enzyme khác (Baines
and Brock-lehurst, 1979). Nhựa đu đủ có hàm lượng và hoạt tính papain cao nhất
tập trung ở vùng có nắng nóng và độ ẩm ổn định quanh năm.

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HÓA HỌC

Footer Page 10 of 166.

CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM


Header Page 11 of 166.

3

1.1.2.1.1. Giới thiệu về cây đu đủ.[7, 8, 41]

A: hoa cái

B: hoa lưỡng tính

C: hoa đực

D: trái của cây cái

E: trái lưỡng tính

F: cây đực

Hình 2.1. Các loại hoa và trái của cây đu đủ.
Tên khoa học: Carica papaya L., thuộc họ đu đủ - Caricaceae
Cây đu đủ còn được gọi thù đủ ở Huế, phiên mộc, cà lào, phiên qua, phan
qua thụ, lô hong phlê (Campuchia), mắc hung (Lào), má hống (Thái).
Đu đủ thường là cây đồng chu, nhưng đu đủ có thể xếp thành 3 loại trên
phương diện giới tính: cây đực, cây lưỡng tính và cây cái. Vài cây đu đủ cũng có thể
trổ cả ba loại hoa nói trên. Ngoài ra cũng có cây ra hoa không hẳn hoàn toàn đực,
cái hay lưỡng tính mà lại pha lẫn nhiều ít đặc tính của ba loại hoa. Khuynh hướng
thay đổi giới tính phần lớn do thời tiết gây ra tỉ như khô hạn và thay đổi nhiệt độ.

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HÓA HỌC

Footer Page 11 of 166.

CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM


Header Page 12 of 166.

4

1.1.2.1.2. Phân bố sinh thái của cây đu đủ.[7, 26, 33]
Chi Carica L. có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới châu Mỹ. Ở vùng núi cao
(1500-3000m), từ Panama đến Bolivia, cây đu đủ trồng hiện nay rất có thể là giống
lai tự nhiên của loài C. peltata Hook & Ann. Vào khoảng thế kỷ 16, người Tây Ban
Nha đã đưa đu đủ vào trồng ở vùng Caribê và một số nước Đông Nam Á. Từ các địa
điểm này, cây tiếp tục được trồng rộng rãi ở Ấn Độ, Srilanca, châu Đại Dương và
châu Phi.
1.1.2.1.3. Hoạt tính sinh học và công dụng của một số chất có trong cây đu
đủ [8,41, 45]
1. Nhựa đu đủ có thể gây viêm da.
2. Ở Trung Mỹ, trong dân gian, người ta sử dụng đu đủ để điều trị bệnh lỵ
amip (Entamoeba histolytica), một loại ký sinh trùng gây tiêu chảy dạng lỵ và biến
chứng áp- xe gan.
3. Ở Samoa, người dân dùng phần dưới vỏ thân cây đu đủ để chữa chứng
nhức răng.
4. Nhựa đu đủ có chứa papain, là một trong hai loại men tiêu hủy protein
(proteolytic enzymes) có tác dụng làm mềm thịt bắp. Chính do tác dụng này, khi
dùng đu đủ hầm chung với thịt, thịt sẽ mềm hơn. Người dân vùng Ca-ri-bê, Trung
Mỹ cho biết họ có thể dùng khẩu phần với số lượng lớn thịt cá nhưng vẫn không hề
gì nếu ăn đu đủ xanh sau đó.
5. Phần cơm đu đủ là thành phần chính của các loại mỹ phẩm như kem nền
(mặt), kem đánh răng, xà bông gội đầu.
6. Các ứng dụng quan trọng trong y học của nhựa đu đủ là chiết xuất papain

để dùng trong phẫu thuật cột sống (là một loại "dao phẫu thuật tự nhiên" để mở đĩa
đệm). Nghiên cứu cho thấy chiết xuất papain có hoạt tính kháng sinh (antibiotic
activity) với tác dụng chống vi khuẩn gram dương (gram-positive bacteria). Nó còn
được dùng để điều trị lở loét, làm tiêu giả mạc trong bệnh bạch hầu, chống kết dính
sau phẫu thuật, làm thuốc giúp tiêu hóa. Trong công nghiệp, papain được dùng để
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HÓA HỌC

Footer Page 12 of 166.

CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM


Header Page 13 of 166.

5

tinh chế bia; xử lý len và lụa trước khi nhuộm; là phụ gia trong công nghệ chế biến
cao su; khi tinh chế dầu gan cá tuna, người ta tiêm papain vào gan trước khi chiết
xuất, làm cho thành phẩm giàu Vitamin A và D hơn. Khoảng 1,500 quả đu đủ xanh
cỡ vừa cho được khoảng 650g papain.
1.1.2.2 Tính chất của papain[8]
1.1.2.2.1 Tính chất vật lý
Bảng 1.1 Tính chất vật lý của papain
Tính chất vật lý
Điểm đẳng điện

Giá trị
pI = 8.75

Hằng số sa lắng S20

2.42 ± 0.04

Hằng số phân tán D20 (10-7giây.cm2)

10.27 ± 0.13

Phân tử lượng

20,700

D
Độ triền quang [] 20

-66.7o

Độ xoắn

17%

Vòng hiệu ứng cotton

290nm

Thể tích riêng phần V(mL/g)

0.724

Trị số ma sát f/fo

1.16

Bột màu vàng hay màu nâu nhạt, tùy thuộc phương pháp sấy, không tan
trong hầu hết các chất hữu cơ nhưng tan một phần trong H2O hay glycerine.
Bền nhiệt.
1.1.2.2.2 Tính chất hóa học[8, 34]
a) Cấu tạo hóa học
Theo kết quả phân tích bằng tia X, phân tử papain được cấu tạo bởi 212 acid
amin trong đó không có chứa methionine. Phân tử lượng khoảng 23,350 Da, phân tử
là một mạch polypeptide với đầu N là isoleucine, đầu C là asparagine, có 6 gốc
cysteine tạo thành 3 cầu disulfur ở các vị trí 22-63, 56-95, 153-200 không có chức
năng sinh học, chỉ làm tăng tính bền vững của cấu trúc và một nhóm –SH tự do ở vị
trí 25.

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HÓA HỌC

Footer Page 13 of 166.

CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM


Header Page 14 of 166.

6

b) Cấu trúc không gian
Phân tử papain có dạng hình cầu với kích thước 36x48x36Ao và mạch chính
bị gấp thành hai phần riêng biệt bởi một khe. Trung tâm hoạt động nằm tại bề mặt
của khe này, nhóm -SH hoạt động của cysteine 25 nằm bên trái khe và nhóm
histidine 159 nằm bên phải khe. Phần xoắn  chiếm 20% toàn bộ các amino acid có

trong phân tử.

Hình 1.2 Cấu trúc bậc 3 của papain
Hoạt tính của papain dựa trên hai tâm hoạt động là Cys25 và His159. Khoảng
pH hoạt động của papain khá rộng (3.5 – 8.0) tùy thuộc vào cơ chất. Khi cơ chất là
casein thì hoạt tính tối ưu của papain trong vùng pH từ 5.7 – 7.0 và nhiệt độ thích
hợp là 50 – 57OC.

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HÓA HỌC

Footer Page 14 of 166.

CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM


Header Page 15 of 166.

7

c) Cấu trúc tâm hoạt động của papain
Tâm hoạt động của papain gồm có nhóm –SH của cysteine 25 và nitrogen
bậc 3 của histidine 159. Bên cạnh đó nhóm imidazole của His 159 cũng liên kết với
Asp 175 bởi liên kết hydrogen.
Vùng tâm hoạt động của papain chứa mạch polypeptide với các amino acid
là:
Lys-Asp-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Ser-Cys.
Theo các nghiên cứu của Lowe, chuỗi polypeptide trong trung tâm hoạt động
của papain gần giống như của ficin hay trypsin, mặc dù chúng có nguồn gốc khác
nhau.
Ficin: Arg-Glu-Glu-Gly-Glu-Cys-Gly-Ser-Cys.

Trypsin: Lys-Asp-Ser-Cys-Glu-Gly-Gly-Asp-Ser.

Hình 1.3 Cấu trúc tâm hoạt động của papain
d) Phản ứng của papain [21, 22, 23, 35]
Papain thủy phân protein thành các polypeptide và các acid amin, nó đóng
vai trò vừa như endopeptidase vừa như exopeptidase.

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HÓA HỌC

Footer Page 15 of 166.

CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM


Header Page 16 of 166.

8

R'
NH2

R'

Cys25 S
H

25

Cys S

N
C

C

O

NH

NH
R

159

O

His

HN

S - acyl hóa

R

His159

N

H2O
R'NH2

Liên kết với chất nền

RCO-NHR'

H

H

O
Cys25 S

25

C

O

Cys S

NH
R

NH

N

His159

HN

His159

Thủy phân

RCOOH

OH

Cys25 S

C

O
NH

R

Đề acyl hóa

Papain

S-S-CH3 + R- SH

Không hoạt động

HN

Papain

His159

SH + R-S-S-CH3

Hoạt động
NH2+

NH2+
C NH2
NH
(CH2)3
C HNHC

C

O

O

C NH2 Cl

Cl

NH2

NH

Papain

(CH2)3

SH

NO2

C

HNHC

O

C OH3 +
O

NO2

Không màu

Có màu

Hình 1.4. Phản ứng hóa học của papain
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HĨA HỌC

Footer Page 16 of 166.

CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM


Header Page 17 of 166.

9

e. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của papain[8, 6, 38]
 Nhiệt độ: Papain là enzyme chịu được nhiệt độ tương đối cao. Ở dạng nhựa
khô papain không bị biến tính trong 3 giờ ở 100oC. Còn ở dạng dung dịch papain bị
mất hoạt tính sau 30 phút ở 82.5oC và nếu nhiệt độ tăng cao hơn (>100oC) thì nó sẽ
bị mất hoàn toàn hoạt tính kể cả khi thêm lượng lớn chất hoạt hóa vào dung dịch.
Điều này là do ở dạng dung dịch khi tăng lên đến nhiệt độ lớn hơn 100oC thì cấu
trúc tâm hoạt động của papain bị phá hủy hoàn toàn.
Điều đáng lưu ý là sau khi đã được tinh sạch và ở trạng thái tinh thể thì papain
có độ bền nhiệt thấp hơn papain ở trong nhựa, do trong nhựa còn chứa các protein
khác có tác dụng bảo vệ papain.
Papain trong dung dịch NaCl giữ ở 4oC bền trong nhiều tháng. Trong dung
dịch dẫn xuất thủy ngân, papain cũng không mất hoạt tính trong nhiều tháng. Trong
khi đó hầu hết các enzyme mất hoạt tính mỗi ngày 1-2% do sự phân hủy hoặc oxy
hóa.
Khi thủy phân các protein khác nhau, thì tùy thuộc vào cơ chất mà nhiệt độ
thích hợp cho papain cũng khác nhau chẳng hạn đối với cơ chất là casein thì nhiệt
độ tối ưu cho phản ứng là 37oC. Papain dạng ổn định ở trạng thái khô có thể chịu
nhiệt độ sấy ở 115oC trong thời gian 2 giờ mà hoạt tính vẫn duy trì được 90%.
 pH: Papain hoạt động trong khoảng pH tương đối rộng từ 4.5-8.5 nhưng lại
dễ biến tính trong môi trường acid có pH < 4.5 hoặc trong môi trường kiềm mạnh
có pH > 12.
Khi phản ứng với cơ chất thì tùy thuộc vào bản chất của cơ chất mà pH tối ưu
sẽ khác nhau. Chẳng hạn, papain phản ứng với casein ở pH tối ưu là 7-7.5.
Papain dạng ổn định tức là dạng mà cấu trúc không gian của enzyme được ổn
định, có thể chịu được các pH = 1.5 và pH = 8.5 trong 90 phút.
 Dung môi: Papain không thay đổi độ quay quang học trong dung môi là
methanol 70% và không thay đổi độ nhớt trong dung môi methanol 50%. Trong
dung dịch dimethylsulfoxide chứa 20% dung môi hữu cơ và urea 8M không làm

giảm hoạt tính cũng như thay đổi cấu hình của papain. Các chất gây biến tính mạnh
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HÓA HỌC

Footer Page 17 of 166.

CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM


Header Page 18 of 166.

10

như TCA 10%, guanidine hydrochloride 6M làm biến đổi bất thuận nghịch về độ
quay quang học và hoạt tính của papain.
1.1.2.3 Ứng dụng của enzyme papain[7, 8, 25, 29, 46]
1.1.2.3.1 Trong y học:
Papain được dùng làm thuốc chống giun sán, ăn không tiêu, chống biếng
ăn,… papain còn dùng làm thuốc rửa ráy tai, dùng trong phẫu thuật.
Papain có tác dụng lên hệ mạch dùng trị bệnh bạch cầu, viêm họng…
1.1.2.3.2 Trong công nghiệp thực phẩm:
Papain được dùng để làm mềm thịt, dùng để thủy phân gan cá ngừ làm thuốc
bổ. Papain còn được dùng trong sản xuất bia vì nó giúp tiêu hóa các protein còn hòa
tan trong bia.
1.1.2.3.3 Trong các ngành công nghiệp khác:
Papain được dùng làm mềm da trong ngành công nghiệp thuộc da, dùng tẩy
các vết máu trên quần áo. Trong công nghiệp mỹ phẩm, papain được dùng để tẩy
các vết nám, tàn nhang trên da.
1.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA BÁNH DẦU ĐẬU PHỘNG
Đậu phộng có hàm lượng lipid cao nên thường được dùng để ép dầu. Đậu
phộng sau khi ép lấy dầu được gọi là bánh dầu phộng.

Theo tài liệu công bố, trung bình trong hạt đậu phộng có thành phần như bảng 1.2:
Bảng 1.2 Thành phần hóa học của hạt đậu phộng
Thành phần
Hàm lượng (%)
Protein

20 – 34

Lipid

40 – 60

Hydrat carbon

6.0 – 22

Xenlulo

2.0 – 4.5

Tro

1.8 – 4.6

Trong protein của đậu phộng thì glubumin có hàm lượng cao nhất chiếm
khoảng 97%, ngoài ra còn có một số hàm lượng không đáng kể albumin, prolamin,
glutein.

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HÓA HỌC

Footer Page 18 of 166.

CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM


Header Page 19 of 166.

11

Trong lipid của đậu phộng có hai loại acid béo no và không no với hàm
lượng tính theo phần trăm như bảng 1.3:
Bảng 1.3. Thành phần acid béo trong bánh dầu đậu phộng
Tên acid béo Không no (%) No (%)
Oleic

50 – 70

6 - 11

Linoleic

13 – 26

2–6

Linolenoic

13 – 26

5–7

Bánh đậu phộng đã tách dầu có thành phần theo bảng 1.4:
Bảng 1.4 Thành phần hóa học của bã đậu phộng đã loại béo
Thành phần

Hàm lượng (%)

Protein

48

Acid amin

12.7

Hydrat carbon

26.5

Lipid

8.0

Tro

4.8

Hàm lượng acid amin bao gồm các acid amin cơ bản theo bảng 1.5 :
Bảng 1.5. Thành phần acid amin trong đậu phộng
Tên cấu tử

Hàm lượng (%)

Tryptophan

0.5

Leucin

3.5

Isoleucin

1.5

Valin

1.65

Threonin

0.75

Lysin

1.5

Methionin

0.6

Phenylalanin

2.7

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HÓA HỌC

Footer Page 19 of 166.

CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM


Header Page 20 of 166.

12

1.3 PHẢN ỨNG THỦY PHÂN BÁNH DẦU ĐẬU PHỘNG
1.3.1 Khái niệm phản ứng thủy phân[13, 14, 15]
Phản ứng thủy phân là phản ứng phân hủy các chất có sự tham gia của nước.
Phản ứng thủy phân là phản ứng quan trọng trong các ngành công nghiệp, đặc biệt
là trong công nghiệp thực phẩm. Người ta ứng dụng phản ứng thủy phân trong công
nghiệp thực phẩm để sản xuất ra hàng loạt sản phẩm mới khác xa với tính chất của
nguyên liệu ban đầu về tính cảm quan, về tính dinh dưỡng của sản phẩm. Tuy
nhiên, trong nhiều trường hợp phản ứng thủy phân có hại cho các sản phẩm thực
phẩm trong quá trình bảo quản.
Phương trình tổng quát của phản ứng thủy phân

R1R2 + H2O

Enzym

+

-

R1OH + R2H

(H , HO )

Các tác nhân làm xúc tác cho phản ứng thủy phân thường là các acid, base
hay các enzyme hydrolase trong đó đặc biệt được ứng dụng rộng rãi là các enzyme
có nguồn gốc vi sinh vật và thực vật.
Trong phản ứng thủy phân có sự tham gia của một lượng nước rất lớn do đó
tốc độ của phản ứng thủy phân chỉ tùy thuộc vào nồng độ của cơ chất. Như vậy,
phản ứng thủy phân xúc tác bởi enzyme là phản ứng đơn phân có thứ bậc 1.

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HÓA HỌC

Footer Page 20 of 166.

CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM


Header Page 21 of 166.

13

1.3.2 Quy trình thực hiện phản ứng thủy phân

e

e

Hình 1.8. Sơ đồ phản ứng thủy phân
Quá trình chuyển từ protein bánh đậu phộng thành acid amin là một quá trình
khá phức tạp. Dưới điều kiện thích hợp cho quá trình thủy phân, enzyme sẽ tham
gia phản ứng theo sơ đồ sau:
E + S ---> ES --> S + P
Người ta cho rằng ban đầu enzyme sẽ liên kết với cơ chất (bánh dầu đậu
phộng), sau đó mới diễn ra sự thủy giải và tạo ra các sản phẩm là các acid amin và
các đoạn peptid ngắn.
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HÓA HỌC

Footer Page 21 of 166.

CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM


Header Page 22 of 166.

14

Ở đây E là enzyme papain và S là protein đậu phộng, ES là phức hợp trung
gian giữa enzyme và cơ chất, P là sản phẩm (chủ yếu là các acid amin và các peptid
cấp thấp).
Sự tạo thành và chuyển biến của hợp chất trung gian ES xảy ra qua 3 bước:
Bước 1: Enzyme kết hợp với protein tạo thành phức enzyme – protein (ES).
Bước 2: Có sự thay đổi mật độ điện tử và sự biến dạng hình học của các mối liên
kết đồng hóa trị trong phân tử cơ chất S cũng như trung tâm hoạt động của E.
Bước 3: Giai đoạn tạo thành acid amin hay peptid cấp thấp và giải phóng enzyme.
1.3.3 Các thay đổi hóa sinh trong quá trình thủy phân:

Những nghiên cứu về sự liên kết enzyme và cơ chất đề ra giả thuyết: phần
lớn các enzyme trở nên hấp thụ với bề mặt ngoài của protein đậu phộng theo một
tiến trình tương đối nhanh, sau đó sự khuếch tán những phân tử enzyme vào trong
những thành phần này xảy ra chậm hơn. Sự thủy phân những nối peptid của protein
đậu phộng có thể chia làm hai pha:
Pha nhanh (pha động): xảy ra ở giai đoạn đầu. Trong suốt pha này, một số
lớp peptid bị phá hủy trong một đơn vị thời gian và một phần chất hòa tan được
phóng thích vào trong dung dịch.
Pha chậm (pha tĩnh): tốc độ thủy phân càng về sau càng giảm, tiến trình hầu
như ít có sự thay đổi cho đến khi phản ứng thủy phân kết thúc.
1.3.4 Tính chất của sản phẩm sau thủy phân[16]
Tính chất quan trọng nhất của sản phẩm là tính dinh dưỡng. Chiều dài chuỗi
peptid của sản phẩm thủy phân có tầm quan trọng đặc biệt. Khả năng hòa tan, khả
năng nhũ tương, vị đắng …đều phụ thuộc ít nhiều vào kích thước và trọng lượng
phân tử của các loại proteint có trong sản phẩm. Tất cả các sản phẩm thủy phân đều
có vị đắng ở những mức độ khác nhau làm hạn chế rất nhiều tính cảm quan của sản
phẩm. Vị đắng là nhược điểm chung của các sản phẩm thủy phân với xúc tác
enzyme và được cho là có liên quan đến những peptid có trọng lượng phân tử thấp
(khoảng 6,000 Da). Ta không thể khử được vị đắng nhưng có thể giảm bớt được

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HÓA HỌC

Footer Page 22 of 166.

CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM


Header Page 23 of 166.

15

bằng cách kiểm soát mức độ thủy phân để cho những peptid có phân tử lượng lớn
chiếm ưu thế.
Việc sử dụng enzyme làm xúc tác có nhược điểm là thủy phân không triệt để,
sau thủy phân còn khoảng 20% nitơ tổng số vẫn không tan, do đó người ta thường
phối hợp thủy phân bằng hóa chất để nâng cao hiệu suất thủy phân.
1.3.5 Ƣu và nhƣợc điểm của phản ứng thủy phân:
1.3.5.1 Ƣu điểm:
Do enzyme hydrolase có tính đặc hiệu cao nên ít hoặc hầu như không tạo
thành sản phẩm phụ. Dịch thủy phân thu được có độ thuần khiết cao.
Sử dụng enzyme xúc tác phản ứng có thể định hướng được phản ứng xảy ra
và sản phẩm tạo thành.
Có thể điều chỉnh được phản ứng nhằm tạo ra sản phẩm mong muốn.
Hiệu suất thủy phân của enzyme khá cao, chỉ cần một lượng nhỏ enzyme
cũng có thể thủy phân được một lượng rất lớn cơ chất.
Trong phản ứng xúc tác bởi enzyme thì yêu cầu về độ thuần khiết của cơ
chất không cao.
Không như một số phản ứng hóa học khác, phản ứng thủy phân với xúc tác
enzyme xảy ra ở những điều kiện ít khắc nghiệt hơn.
Phản ứng thủy phân bằng enzyme có biệt tính chọn lọc lập thể cao.
1.3.5.2 Nhƣợc điểm:
Thời gian thủy phân với xúc tác enzyme thường kéo dài hơn so với thủy
phân với xúc tác acid.
Dịch sau thủy phân thường khó lọc.
1.4 ỨNG DỤNG ENZYME PAPAIN LÀM XÚC TÁC CHO PHẢN ỨNG
THỦY PHÂN PROTEIN TRONG BÁNH DẦU ĐẬU PHỘNG
Trong luận văn này, chúng tôi điều chế enzyme papain để thủy phân protein
trong bánh dầu đậu phộng với các nội dung sau:
1. Thu nhận enzyme papain từ nhựa trái đu đủ
 Khảo sát các điều kiện thu nhận enzyme papain

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HÓA HỌC

Footer Page 23 of 166.

CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM


Header Page 24 of 166.

16

 Định lượng và hoạt tính của enzyme papain sau mỗi giai đoạn tinh
chế.
 Khảo sát sự biến đổi lượng và hoạt tính enzyme papain theo thời gian.
 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme papain.
2. Khảo sát phản ứng thủy phân bánh dầu đậu phộng
 Xác định hàm lượng đạm formol và đạm amoniac theo thời gian phản
ứng
 Khảo sát sự thay đổi hàm lượng xúc tác, pH và nhiệt độ ảnh hưởng
đến hiệu suất phản ứng thủy phân.

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HÓA HỌC

Footer Page 24 of 166.

CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM


Header Page 25 of 166.

17

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.1. HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ
2.1.1. Hóa chất
Thuốc thử Folin – Merck, Đức.
Tyrosin – Merck, Đức.
Casein – Merck, Đức.
Albumin – Merck, Đức.
Dung dịch Citrat Natri 1%: cân chính xác 1g Citrat Natri pha với nước cất
thành 100ml.
Dung dịch Na2HPO4 1/15M: cân chính xác 5.9690g Na2HPO4.12H2O hòa tan
trong nước cất và định mức cho đủ 250ml.
Dung dịch KH2PO4 1/15M: cân chính xác 0.9072g KH2PO4 hòa tan trong
nước cất và định mức lại cho đủ 100ml.
Dung dịch đệm Sorosen 1/15M, pH 7.6: trộn chung 177ml dung dịch
Na2HPO4 1/15M và 23ml dung dịch KH2PO4 1/15M.
Dung dịch casein 1%: đun sôi cách thủy 1g casein trong dung dịch đệm
Sorensen cho đến khi tan hoàn toàn rồi định mức lại cho đủ 100ml.
Dung dịch TCA 5%: hòa tan 5g TCA trong nước cho đủ 100ml.
Dung dịch NaOH 0.5N: hòa tan 10g NaOH trong nước cho đủ 500ml.
Dung dịch HCl 0.2N: trộn 4.25ml HCl đậm đặc với nước cho đủ 250ml.
Dung dịch Tyrosin 20 mM/l: khuấy nghiền 1.8119 Tyrosin trong dung dịch
HCl 0.2N vừa đủ 500ml.
Dung dịch Tyrosin chuẩn 1mM/l trong dung dịch HCl 0.2N: pha loãng 5ml
dung dịch Tyrosin 20mM/l trong dung dịch HCl 0.2N thành 100ml.
Nhựa đu đủ lấy mẫu tại thị trấn Xuyên Mộc - tỉnh Bà Rịa Vũng Tàu.

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

Footer Page 25 of 166.

CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM