Xác định các đột biến trên gen katG liên quan đến tính kháng thuốc i soniazid của một số chủng vi khuẩn lao tại Việt Nam

Header Page 1 of 166.

MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Nhiễm vi khuẩn lao (Mycobacterium tuberculosis) là một trong những
nhiễm trùng phổ biến nhất ở loài người

. Hiện nay tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lao

được xác đị nh là chiếm 1/3 dân số thế giới . Có khoảng 9 triệu người mắc lao
mới và hơn 3 triệu người chết do lao mỗi năm . Tuy vậy tỷ lệ phát hiện chỉ đạt
37% số bệnh nhân ước tí nh . Vì vậy còn rất nhiều bệnh nhân lao không được
chữa trị và đang tiếp tục làm lây lan bệnh cho c ộng đồng.
Hiện nay, bệnh lao đang trở nên nghiêm trọng hơn với đặc trưng là kháng
đa thuốc. Trong các trường hợp bệnh lao kháng đa thuốc, khó khăn không chỉ là
điều trị thất bại cao , dẫn đến lan truyền nhanh chóng vi khuẩn lao

kháng đa

thuốc mà còn chưa tì m ra được những thuốc thay thế hiệu quả và hợp lý , trong
khi các thuốc chống lao thực sự có hiệu quả chỉ tập trung co5́ thuốc.
Những bệnh nhân bị nhiễm các chủng vi khuẩn lao kháng đa thuốc rấ

t

khó điều trị. Do đó việc phát hiện sớm các chủng vi khuẩn lao kháng đa thuốc
sẽ góp phần đáng kể trong điều trị bệnh lao .
Để ch ẩn đoán vi khuẩn lao kháng thuốc

, hiện nay các cơ sở trong

nước vẫn phải dựa vào nuôi cấ y vi khuẩn và làm kháng sinh đồ
chuẩn đoán lao kháng thuốc cần í t nhất

. Thời gian

4 – 6 tuần. Với thời gian dài như

vậy sẽ khó khăn cho công tác điều trị

, khó đáp ứng yêu cầu giám sát và

thanh toán bệnh lao .
Khắc phục nhữ ng nhược điểm đó , việc ứng dụng sinh học phân tử đang
tạo ra những đột phá trong chẩn đoán vi khuẩn lao kháng thuốc
chẩn đoán có thể rút ngắn xuống còn vài ngày

. Thời gian

, với độ nhậy và độ đặc hiệu

cao, tạo điều kiện cho việc kiểm soát bệnh lao dễ dàng hơn .

1

Footer Page
ofTrung
166.
Số hóa1bởi
tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Header Page 2 of 166.

Các nghiên cứu về sinh học phân tử trong chẩn đoán vi khuẩn lao
kháng thuốc đã chỉ ra rằng mỗi loại kháng thuốc là do các gen tương ứng chịu
trách nhiệm.
Ví dụ, nếu chỉ ra được độ t biến ở gen KatG cũng có nghĩa là chủng lao
đó kháng isoniazid .
Xuất phát từ những lý do trên , chúng tôi tiến hành đề tài : "Xác định
các đột biến trên gen katG liên quan đến tí nh kháng thuốc i soniazid của
một số chủng vi khuẩn lao tại Việt Nam".
2. Mục tiêu nghiên cứu
1. Nhân bản đoạn gen katG từ các chủng vi khuẩn lao nghiê n cứu.
2. Phát hiện đột biến trên gen katG liên quan đến tính kháng isoniazid ở
các chủng vi khuẩn lao nghiê n cứu.
3. Nội dung nghiên cƣ́u
- Nhân bản đoạn gen katG từ các chủng vi khuẩn lao nghiên cứu .
- Tạo vector tái tổ hợp và biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào vi khuẩn
E. coli.
- Tách dòng gen katG.
- Giải trình tự gen katG.
- Phát hiện, phân tích đột biến trên gen katG liên quan đến tí nh kháng
thuốc isoniazid ở các chủng vi khuẩn lao nghiên cứu .

2

Footer Page
ofTrung

166.
Số hóa2bởi
tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




Header Page 3 of 166.

CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tình hình bệnh lao
1.1.1. Tình hình bệnh lao trên thế giới
Bệnh lao gắn liền với sự phát triển xã hội loài người từ hàng ngàn năm
nay, trên thế giới chưa bao giờ và không có một quốc gia nào, một khu vực
nào, một dân tộc nào không có người mắc bệnh lao và chết do lao [1]. Do sự
phát minh các thuốc hóa học chống lao khiến việc chữa lao đơn giản hơn và
hiệu quả hơn, đồng thời đã phát sinh tâm trạng chủ quan của y giới, đã làm
lãng quên căn bệnh nguy hiểm này. Ngày nay, bệnh lao đang xuất hiện trở
lại và cùng với đại dịch HIV/AIDS trở thành một trong những căn nguyên
gây mắc bệnh và tử vong chủ yếu, đặc biệt tại các nước đang phát triển.
Năm 1993, Tổ chức Y tế thế giới (TCYTTG) đã tuyên bố tình trạng
khẩn cấp toàn cầu của bệnh lao và mối hiểm hoạ của nó trong tương lai là
bệnh lao kháng thuốc [22].
Hiện nay, trên thế giới có khoảng 2,2 tỷ người đã nhiễm lao (chiếm 1/3
dân số thế giới). Theo số liệu công bố của TCYTTG (2004), ước tính trong
năm 2003 có thêm khoảng 9 triệu người mắc lao mới và 2 triệu người chết
do lao. Khoảng 95% số bệnh nhân lao và 98% số người chết do lao ở các
nước có thu nhập vừa và thấp, 75% số bệnh nhân lao cả nam và nữ ở độ tuổi
lao động. Trong đó, có khoảng 80% số bệnh nhân lao toàn cầu thuộc 22

nước có gánh nặng bệnh lao cao [1,22].
Hiện nay, tỷ lệ điều trị thành công trên toàn cầu đạt 82%, nhưng tỷ lệ
phát hiện chỉ đạt 37% số bệnh nhân ước tính. Như vậy, còn rất nhiều bệnh
nhân lao không được chữa trị đang tiếp tục lây bệnh cho cộng đồng, và theo

3

Footer Page
ofTrung
166.
Số hóa3bởi
tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




Header Page 4 of 166.

ước tính của TCYTTG, mỗi năm có thêm 1% dân số thế giới bị nhiễm lao
(65 triệu người) [22].
Hơn 33% số bệnh nhân lao toàn cầu tại khu vực Đông nam Châu Á.
Dưới đây là ước tính bệnh nhân lao mới mắc năm 2002 theo khu vực [22].
Bảng 1.1: Ƣớc tính bệnh nhân lao mới mắc năm 2002 theo khu vực
Số BN (nghìn)
Khu vực
Các thể

Châu Phi
Châu Mỹ
Trung Đông

Châu Âu
Đông nam Châu Á
Tây Thái Bình Dương
Toàn cầu

2354
(26%)
370
(4%)
622
(7%)
472
(5%)
2890
(33%)
2090
(24%)
8797
(100%)

Tỷ lệ/100 000

AFB

Các

AFB

(+)

thể

(+)

1000

350

165

Tử vong do lao
(bao gồm cả nhiễm HIV)
SL (nghìn)

TL/100000

149

556

83

43

19

53

6

279

124

55

143

28

211

54

24

73

8

1294

182

81

625

39

939

122

55

373

22

3887

141

63

1823

29

Mức độ nặng nề của bệnh lao đã ảnh hưởng tới thu nhập quốc dân và
chỉ số phát triển con người của các quốc gia. Các nghiên cứu về kinh tế y tế
cho thấy, mỗi bệnh nhân lao sẽ mất trung bình 3-4 tháng lao động, làm giảm
20-30% thu nhập bình quân của gia đình. Những gia đình có người chết sớm
vì bệnh lao có thể sẽ mất tới 15 năm thu nhập. Bệnh lao đã tác động mạnh

4

Footer Page

ofTrung
166.
Số hóa4bởi
tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




Header Page 5 of 166.

tới 70% đối tượng lao động chính của xã hội, làm lực lượng sản xuất bị giảm
sút, năng suất lao động giảm và mùa màng, chợ búa sẽ không tham gia được.
Diễn đàn các đối tác chống lao lần thứ nhất diễn ra năm 2001 tại trụ sở của
ngân hàng thế giới ở Washington D.C với sự có mặt của đại diện cấp Bộ
trưởng từ các quốc gia có tình hình bệnh lao nặng nề đã nhận định, bệnh lao
là nguyên nhân chủ yếu làm nghèo đói dai dẳng và là trở ngại đối với sự
phát triển kinh tế xã hội [22].
Bệnh lao là bệnh của người nghèo, lây lan nhanh trong cộng đồng có
điều kiện sống chật chội, thiếu vệ sinh, thông khí và dinh dưỡng kém. Trên
95% số bệnh nhân lao, 98% số chết do lao trên toàn cầu thuộc các nước có
thu nhập vừa và thấp, 75% số người mắc bệnh lao ở các lứa tuổi 14-55, là
tuổi làm ra nhiều của cải nhất trong cuộc đời [1, 22].
Bệnh lao là kết quả của nghèo đói và nghèo đói lại là nguyên nhân làm
cho bệnh lao phát triển.
1.1.2. Tình hình bệnh lao ở Việt Nam
Ở nước ta, bệnh lao còn phổ biến và ở mức độ trung bình cao. Việt
Nam đứng thứ 13 trong 22 nước có số bệnh nhân lao cao trên toàn cầu
(TCYTTG, 2004). Trong khu vực Tây Thái Bình Dương, Việt Nam đứng thứ
ba sau Trung Quốc và Philipinnes về số lượng bệnh nhân lao lưu hành cũng
như bệnh nhân lao mới xuất hiện hàng năm [1].

Năm 1995, trước những biến động xấu đi của tình hình dịch tễ bệnh lao
toàn cầu, công tác chống lao thực sự bắt đầu phải đối mặt với những thách
thức mới là bệnh lao kháng thuốc và Lao/HIV, Nhà nước và Bộ Y tế Việt
Nam đã quyết định đưa Chương trình chống lao thành một trong những
Chương trình y tế quốc gia trọng điểm. Cùng với sự đầu tư phát triển các
Chương trình y tế quốc gia nói chung, Bộ Y tế và Chính phủ đã ưu tiên đầu tư
đồng bộ lượng rất lớn cán bộ, kinh phí và trang thiết bị cho Chương trình
5

Footer Page
ofTrung
166.
Số hóa5bởi
tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




Header Page 6 of 166.

chống lao. Ban chỉ đạo Chương trình chống lao và chính quyền địa phương
các cấp đã tham gia tích cực triển khai công tác này, cùng với sự hợp tác và
giúp đỡ có hiệu quả về tài chính và kỹ thuật của các tổ chức quốc tế [4].
Năm 1996, Chương trình chống lao quốc gia (CTCLQG) với sự hỗ trợ
về kỹ thuật và tài chính của Chính phủ Hà Lan, hiệp hội chống lao hoàng gia
Hà Lan, uỷ ban hợp tác y tế Hà Lan - Việt Nam, CTCLQG đã hình thành và
xây dựng kế hoạch phòng chống lao giai đoạn 1996-2000. Đến năm 1999,
chiến lược DOTS (điều trị bằng hoá trị liệu ngắn ngày có kiểm soát trực tiếp)
đã được bao phủ 100% số huyện trên cả nước [4].
Trong giai đoạn 1997-2002, CTCLQG đã phát hiện được 532.703 bệnh

nhân lao các thể, tỷ lệ phát hiện đạt 82% số bệnh nhân ước tính (so với mục
tiêu của TCYTTG là 70%), CTCLQG đã điều trị 260.698 bệnh nhân lao phổi
AFB (+) với tỷ lệ khỏi là 92% [3].
Năm 2002, khu vực Tây Thái Bình Dương phát hiện 806.460 bệnh nhân
lao các thể, 372.220 bệnh nhân lao phổi AFB (+) mới. Trong đó, số bệnh nhân
do CTCLQG Việt Nam phát hiện chiếm 12% bệnh nhân các thể và 15% số
bệnh nhân lao phổi AFB (+) mới [1].
Với những kết quả đạt được trong chỉ tiêu phát hiện và điều trị bệnh
nhân, năm 1996, Việt Nam là nước đầu tiên ở Châu Á đã đạt được mục tiêu
của TCYTTG. Việt Nam đã được TCYTTG và ngân hàng thế giới đánh giá
cao thành tích đạt được trong mọi hoạt động chống lao. Từ năm 1997,
TCYTTG và hiệp hội bài lao và bệnh phổi quốc tế cùng phối hợp với
CTCLQG Việt Nam tổ chức 8 khoá học về quản lý Chương trình chống lao
cho các học viên quốc tế tại Việt Nam. Mô hình hoạt động chống lao ở Việt
Nam được xem là mô hình để học viên các nước học tập [4].
Vì là một trong số ít nước sớm nhất đạt được các mục tiêu phòng chống
lao do TCYTTG đề ra, những kết quả đạt được có tính bền vững, nên tháng 10
6

Footer Page
ofTrung
166.
Số hóa6bởi
tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




Header Page 7 of 166.

năm 2003 vừa qua CTCLQG Việt Nam đã nhận được giải thưởng của hội
chống lao hoàng gia Hà Lan (KNCV) nhân lễ kỷ niệm 100 năm ngày thành
lập tổ chức này.
Nhân ngày thế giới chống lao, 24/3/2004, tại diễn đàn các đối tác chống
lao lần thứ 2 do TCYTTG tổ chức tại New Dehli, CTCLQG Việt Nam là một
trong 6 nước trên thế giới (bao gồm: Việt Nam, Peru, Madives, Cuba, Tunisia
và Morocco) và là nước duy nhất trong 22 nước có gánh nặng bệnh lao cao
được nhận giải thưởng của TCYTTG về thành tích đã đạt được mục tiêu của
TCYTTG và kết quả có tính bền vững trên 4 năm [4].
Hiện nay nguy cơ nhiễm lao hàng năm ở nước ta ước tính là 1,5% (ở
các tỉnh phía nam là 2%, ở các tỉnh phía bắc là 1%).
Ước tính với dân số 70-80 triệu, hàng năm ở nước ta có một s ố lượng
lớn người bị mắc lao mới . Số lư ợng người mắc lao mới được thể h iện qua
bảng 1.2.
Bảng 1.2: Bảng ƣớc tính số bệnh nhân mắc lao mới qua mỗi năm ở Việt Nam
Số mới mắc lao (mọi thể):

130.000

Số lao phổi BK dương tính mới:

60.000

Tổng số trường hợp lao:

260.000

Tổng số lao phổi BK dương tính:

120.000

Nước ta thuộc loại trung bình về dịch tễ lao so với các nước vùng Tây
Thái Bình Dương, vùng dịch tễ lao vào loại trung bình trên thế giới.
Trên thực tế có thể chỉ số nguy cơ nhiễm lao hàng năm có thể cao hơn
1,5% như vậy các con số nêu trên có thể còn lớn hơn. Điều đó sẽ tăng thêm sự
khó khăn đối với công tác chống lao không những trong những năm tới mà có
thể còn trong thời gian khá dài, ngay cả khi đã bước sang thiên niên kỷ mới.
7

Footer Page
ofTrung
166.
Số hóa7bởi
tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




Header Page 8 of 166.

1.1.3. Tình hình lao kháng thuốc
Theo báo cáo dựa trên thăm dò lớn về lao kháng thuốc toàn cầu của
TCYTTG công bố ngày 26/2/2008, tỷ lệ nhiễm lao kháng nhiều thuốc hiện
nay ở mức cao chưa từng có. Mỗi năm có khoảng nửa triệu ca lao kháng đa
thuốc, theo ước tính của TCYTTG, chiếm khoảng 5% trong số 9 triệu ca
nhiễm lao hàng năm. Cũng trong báo cáo này, lần đầu tiên lao kháng thuốc
cực mạnh được đề cập, đây là một dạng gần như không chữa lành được [5].
Theo TCYTTG, hiện nay bệnh lao kháng thuốc là một vấn đề toàn cầu,
đặc biệt nghiêm trọng là tình hình kháng đa thuốc. Bệnh lao kháng thuốc xuất
hiện khi có vi khuẩn lao kháng với một hoặc nhiều loại thuốc chống lao,

nguyên nhân là do bệnh nhân không hợp tác, không tuân thủ đúng nguyên tắc
điều trị được quy định của chương trì nh chống lao , một nguyên nhân khác
hay gặp là do thầy thuốc kê đơn không đúng do không phối hợp đầy đủ các
thuốc chống lao, liều lượng thuốc không đủ, hướng dẫn bệnh nhân không
đúng cách, điều trị không đủ thời gian...
Kết quả điều trị với bệnh nhân kháng thuốc thường không cao, nhất là
đối với bệnh nhân kháng đa thuốc. Chi phí điều trị bệnh nhân lao kháng đa
thuốc tăng lên 100 lần so với bệnh nhân lao không kháng thuốc và thậm chí
không điều trị được ở một số trường hợp.
Tỷ lệ kháng đa thuốc trong bệnh nhân lao mới ở khu vực Tây Thái
Bình Dương dao động trong khoảng 1% đến 10,8% (theo một số nghiên cứu
trong khu vực) [4].
Dự án nghiên cứu kháng t huốc lao trên cơ sở toàn c ầu được thực hiện
từ năm 1995 với mục tiêu là xác đị nh được tổng số bệnh nhân lao kháng
thuốc trên thế giới bằng những phương pháp thống nhất thử độ nhạy với thuốc
lao của vi khuẩn . Năm 1998, TCYTTG đã công bố kết quả khảo sát tì nh hì nh
vi khuẩn lao kháng thuốc ở 35 nước và khu vực trên thế giới [6].
Theo công bố này , tỷ lệ kháng thuốc tiê n phát trung bì nh với riêng từ ng
loại thuốc có khác nhau , cụ thể là : kháng isoniazid 3,2%, rifampicin 0,2%,
8

Footer Page
ofTrung
166.
Số hóa8bởi
tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Header Page 9 of 166.

ethambutol 0,3%, steptomycin 2,5% %, trong đó kháng steptomycin ở vùng
Ivanovo (Nga) là nơi kháng đơn thuốc cao nhất . Tỷ lệ kh áng thuốc tiên phát
trung bì nh là 9,9 % trong đó kháng 1 thuốc chiếm 6,6 %, kháng 2 thuốc chiếm
2,5 %, kháng 3 thuốc chiếm 0,6 %, kháng bốn thuốc chiếm 0,2 %, kháng đa
thuốc trung bì nh là 1,4 %. Tỷ lệ kháng thuốc tiên phát cao n hất 40,6 % ở cộng
hòa Dominica , thấp nhất là 2% ở cộng hòa Séc [6].
Tình hình kháng thuốc mắc phải với từng loại thuốc cũng khác nhau
kháng isoniazid trung bì nh

:

6,3 %, rifampicin 0,7 %, ethambutol 0,4 %,

steptomycin 2,6 %. Kháng thuốc mắc phải với steptomycin ở Cuba có tỷ lệ
cao nhất 57 %. Tỷ lệ kháng thuốc mắc phải trung bình trên toàn thế giới là

36

%, trong đó kháng 1 loại thuốc 12,2 %, 2 loại thuốc 9,7 %, 3 loại thuốc 5,4 %,
4 loại thuốc 4,4 %. Lao kháng đa thuốc mắc phải có tỷ lệ trung bì nh là

13 %.

Kháng đa thuốc mắc phải cao nhất ở Latvia , có tỷ lệ 54 % [6].
Vi khuẩn lao kháng đa thuốc là một thách thức lớn

, đe dọa công cuộc

phòng chống lao trên toàn cầu , vì các thuốc chống lao có hiệu quả hiện nay
đang bị vi khuẩn lao kháng lại nhất là kháng đa thuốc

. Trong khi các thuốc

chống lao hàng đầu chỉ có năm thuốc thì các thuốc chống lao loại hai lại
thường có độc tí nh cao và giá thành đắt [5].
Việc nghiên cứu lao kháng thuốc ở Việt Nam được tiến hành khá sớm .
Năm 1958 Phạm Ngọc Thạc h và cộng sự đã công bố t ỷ lệ kháng thuốc mắc
phải v ới isoniazid là

53 %, với paraminosalicylic acid là 26 %, với

steptomycin là 59 % [6].
Báo cáo của CTCLQG năm 1998 cho thấy tì nh hì nh kháng thuốc của vi
khuẩn lao ở Việt Nam là một vấn đề đáng lo ngại

. Tỷ lệ kháng thuốc tiên

phát là 32,5 % đứng thứ tư trong khảo sát của TCYTTG sau Latvia

(34%),

Thái Lan (36,6%), và Cộng hòa Dominica (40,6%). Qua các nghiên cứu đã
cho thấy Việt Nam là một trong những quốc gia có tỷ lệ bệnh lao kháng thuốc
cao trên thế giới [6].

9

Footer Page

ofTrung
166.
Số hóa9bởi
tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




Header Page 10 of 166.

Nhiễm vi khuẩn lao kháng thuốc là nguyên nhân dẫn đến thấ t bại trong
điều trị . Những bệnh nhân lao mới có thể chữa khỏi 95 – 100%. Nhưng bệnh
nhân lao kháng thuốc mắc phải , tỷ lệ chữa khỏi chỉ 20 – 30% [22]. Kết quả
còn thấp hơn nữa ở những trường hợp kháng đa thuốc mắc phải, thậm chí không
chữa được. Nguy hiểm hơn là các bệnh nhân này có thể tiếp tục truyền bệnh cho
người khác. Vì vậy việc phát hiện và ngăn chặn sự lan tràn của các chủng lao
kháng đa thuốc là vấn đề quan trọng nhất trong chiến lược điều trị lao hiện nay.
1.2. Vi khuẩn lao
1.2.1. Đặc điểm phân loại
Vi khuẩn lao thuộc giới Bacteria

, ngành Actinobacteria , bộ

Actinomycetales , phân bộ, họ Mycobacteriaceae, giống Mycobacterium [18].
Tên khoa học của vi khuẩn lao là: Mycobacterium tuberculosis.
Các chủng vi khuẩn lao được chia làm
tuberculosis gồm bốn

2 nhóm : Mycobacterium

loài có khả năng gây bệnh ở người

, và nhóm

Mycobacteria other than tuberculosis gồm nhiều loài không gây bệnh ở
người [6,7].
1.2.2. Đặc điểm hình thể
Vi khuẩn lao có hình trực khuẩn , kích thước 2 – 4 μm, rộng 0,3 – 1,5
μm. Trực khuẩn thanh mảnh , đứng riêng lẻ hoặc xếp thành hì nh chữ N , Y, V
hoặc thành dãy phân nhánh như cành cây .
Vi khuẩn lao không di động , không sinh bào tử, khó bắt màu các thuốc
nhuộm thông thường do có lớp sáp ở thành tế bào [7].
1.2.3. Khả năng gây bệnh
Các bệnh lý nhiễm trùng là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên thế
giới. Không chỉ có những bệnh nhiễm trùng mới phát sinh mà những bệnh
nhiễm trùng cũ gây chết người đã biết từ lâu cũng tái xuất hiện. Hơn nữa tỉ lệ
vi khuẩn gây bệnh đề kháng kháng sinh ngày càng tăng cao là nguy cơ lớn
cho sức khỏe cộng đồng. Những bằng chứng gần đây cho thấy các tác nhân
gây bệnh mặc dù rất khác nhau đều sử dụng những phương thức chung để
10

Footer Page
166.
Số hóa10
bởi of
Trung
tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Header Page 11 of 166.

phát động quá trình nhiễm trùng và gây bệnh. Những cơ chế này tạo nên độc
lực của vi khuẩn. Tìm hiểu các cơ chế mà vi khuẩn sử dụng để xâm nhập và
gây bệnh có ý nghĩa quan trọng trong cuộc chiến chống lại các tác nhân bé
nhỏ này [7].
Độc lực của vi khuẩn lao có liên quan đến “Cord factor”

(trehalose –

6,6’ – dimycolate ) là chất gây ức chế hoạt động của tế bào bạch cầu , gây nên
những u hạt mãn tí nh . Miễn dị ch trong bệ nh lao ngày nay được xác đị nh là
đáp ứng miễn dị ch qua trung gian tế bào

. Đáp ứng miễn dị ch làm chậm sự

nhân lên của vi khuẩn lao , gây hạn chế sự lan tràn của vi khuẩn lao , dẫn tới
phá hủy tế bào vi khuẩn . Đáp ứng miễn d ịch trong bệnh lao phát sinh một
phản ứng quá muộn . Một số trường hợp vi khuẩn lao có khả năng ức chế hoặc
tiêu diệ t trở lại bạch cầu người và tồn tại dưới dạng ngủ trong các u hạt nên cơ
thể không tiêu diệt được . Đặc biệt trong các trường hợp lao kháng thuốc cơ
thể không tiêu diệt được vi khuẩn và các thuốc cũng không tác động được . Đó
là một vấn đề nan giả i trong điều trị bệnh lao [8].
Vi khuẩn lao có thể vào cơ thể qua nhiều đường , thườ ng là qua đường
hô hấp, bên cạnh đó là các đường tiêu hóa , da, kết mạc mắt ... Sau khi gây tổn
thương tiên phát , vi khuẩn lao có thể theo đường bạch huyết hoặc đường máu
tới cơ quan khác gây tổn thương thứ phát .
Nhiều cơ quan : phổi, thận, màng não , xương, hạch, da... đều có thể bị
vi khuẩn lao xâm nhập , nhưng thường bị hơn cả là phổi và vị trí gặp nhiều

nhất là đỉ nh phổi , nơi có phân áp oxy 120 mmHg [6].
1.2.4. Hệ gen của vi khuẩn lao
Hệ gen của v i khuẩn lao đã được đọc trì nh tự , có chiều dài 4.411.522
cặp base trong đó có 3.924 trình tự được dự đoán là có mã hóa protein , tỷ lệ G
+ C chiếm đến 65,6%. Genome của vi khuẩn lao có chứa tới 90,8 % trình tự
mã hóa protein và chỉ có 6 gen giả [28].

11

Footer Page
166.
Số hóa11
bởi of
Trung
tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




Header Page 12 of 166.

1.3. Gen KatG và tính kháng thuốc isoniazid ở vi khuẩn lao
Gen katG là một đoạn DNA có kích thước 2223 bp, nằm trên nhiễm sắc
thể của vi khuẩn lao và chị u trách nhiệm mã hóa cho enzyme catalase

-

peroxidase. Người ta nhận thấy có khoảng 95% các chủng vi khuẩn lao kháng
isoniazid có đột biến trên gen này [28].
Gen katG mã hóa cho enzyme catalase-peroxidase. Enzyme này hoạt

hóa isoniazid bằng cách kết hợp axyl isonicotinic với NADH để tạo thành
phức hệ axyl isonicotinic-NADH. Phức hệ này liên kết chặt chẽ với enzyme
ketoenoylreductase (mã hóa bởi gen InhA), theo đó làm ngăn cản cơ chất
enoyl-AcpM. Quá trình này làm ức chế sự tổng hợp axit mycolic cần cho
thành tế bào vi khuẩn lao. Cơ chế phân tử của tính kháng isoniazid chủ yếu có
liên quan tới đột biến thêm đoạn/mất đoạn hoặc các đột biến nhầm nghĩa/vô
nghĩa, trong đó chủ yếu diễn ra tại codon 315 và 463 (S315T) của gen katG
mã hóa catalase-peroxidase. Nếu có sự biến dạng hay đột biến ở base thứ 2 tại
codon 315 của gen katG (AGC biến thành ACC hay ACA) sẽ dẫn đến làm
giảm hoặc mất hoàn toàn hoạt tính của enzyme catalase-peroxidase do đó M.
tuberculosis sẽ trở thành kháng thuốc isoniazid [51]. Do đó phát hiện sự thay
đổi di truyền này trong gen katG có thể cung cấp một phương pháp sàng lọc
nhanh và chính xác cho việc phát hiện các chủng M. tuberculosis kháng
isoniazid.
1.4. Chẩn đoán vi khuẩn lao kháng Isoniazid
Vi khuẩn lao kháng isoniazid được xác định theo phương pháp

chẩn

đoán kiểu gen. Các phương pháp chẩn đoán kiểu gen đều dựa trên cơ sở xác
đị nh đột biến ở các gen có liên quan kháng thuốc tương ứng .
Để xác đị nh đột biến trên gen

katG hiện có nhiều phương pháp , song

giải trình gen vẫn là phương phá p cơ bản, chính xác , rõ ràng nhất . Tuy nhiên
đây là phương pháp không phải nơi nào cũng làm được vì đòi hỏi máy móc
thiết bị đắt tiền và nhân lực có trì nh độ để vận hành khai thác [28].

12

Footer Page
166.
Số hóa12
bởi of
Trung
tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




Header Page 13 of 166.

Giải trình tự (DNA squencing ) là phương pháp xác đị nh vị trí sắp xếp
các nucleotide trong phân tử DNA . Nguyên lý của phương pháp này là : Tổng
hợp các mạch đơn DNA mới có độ dài ngắn hơn mạch khu ôn, nhờ kỹ thuật
đánh dấu và ngắt đoạn trong quá trì nh tổng h
mạch đơn hơn kém nhau một base

ợp mạch DNA , thu được các

từ đó có được sơ đồ trật tự mạch DNA

khuôn mẫu. So sánh trật tự của mẫu thí nghiệm với trật tự DNA ch uẩn ta biết
được vị trí các sai lệch (đột biến) [33].
Ứng dụ ng các kỹ thuật sinh học phân tử đã xác đị nh các chủng vi
khuẩn lao kháng isoniazid là do có đột biến ở gen

katG. Codon xảy ra đột

biến là codon 315 [34].
Sự đột biến xảy ra là do thay thế nucleotid e ở codon 315 (AGC  ACC
hoặc AGC  ACA) [34].
Để giải trì nh tự gen katG, hiện nay người ta có thể thực hiện trực tiếp
từ sản phẩm PCR . Khi sản phẩm PCR là đơn nhất và có độ dài thích hợp cho
việc phân tí ch kết quả thì có thể thực hiện giải trì nh
giải trình tự thông

tự trực tiếp . Cũng có thể

qua tách dòng , gắn đoạn gen katG cần nghiên cứu vào

vector. Đoạn gen cùng với vector tái tổ hợp được nhân lên trong tế bào E.coli.
Khi giải trì nh tự gen , cả đoạn gen katG và 1 phần vector đề u được xác đị nh
trình tự . Giải trình tự thông qua tách dòng được ứng dụng khi sản phẩm PCR
không được tốt , đặc biệt là trong các trường hợp gây đột biến nhân tạo kiểm
chứng kháng thuốc và trong nghiên cứu biểu h iện gen [6].

13

Footer Page
166.
Số hóa13
bởi of
Trung
tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Header Page 14 of 166.

CHƢƠNG 2
ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CƢ́U
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Các chủng vi khuẩn lao M. tuberculosis được cung cấp bởi Học viện
Quân y.
Bảng 2.1: Đặc điểm kháng sinh đồ của các chủng vi khuẩn lao
Mã DNA

Mã Chủng

Kháng thuốc

ĐA1

TB06-22

HSRE

ĐA2

TB06-23

HSRE

ĐA3

TB06-26

HSRE

ĐA4

TB06-27

HSR

ĐA5

TB06-28

HSRE

ĐA6

TB06-31

HSRE

ĐA7

TB06-33

HSRE

ĐA8

TB06-35

HSR

ĐA9

TB06-36

HSRE

ĐA10

TB06-37

HSRE

ĐA11

TB06-38

HSRE

ĐA12

TB06-39

HSR

ĐA13

TB06-41

HSRE

ĐA14

TB06-51

HSRE

14

Footer Page
166.
Số hóa14
bởi of
Trung
tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




Header Page 15 of 166.

2.2. Vật liệu thiết bị và dụng cụ nghiê n cƣ́u
2.2.1. Các sinh phẩm hóa chất chính
Bảng 2.2: Các sinh phẩm hóa chất chính
Tên hóa chất

Hãng sản xuất

1. H/c dùng trong PCR

Tris base

Applied BioSciences (Mỹ)

Lysozyme

Fermentas (Mỹ)

Proteinase K

Sigma (Mỹ)

Agarose

Sigma (Mỹ)

Thang chuẩn DNA

Fermentas (Mỹ)

EDTA

Fermentas (Mỹ)

Taq-DNA-polymerase

Fermentas (Mỹ)

2. H/c sinh phẩm dùng trong tách dòng
Pepton

Fermentas (Mỹ)

Yeast Extract

Fermentas (Mỹ)

Nacl

Fermentas (Mỹ)

Agar

Fermentas (Mỹ)

Ampicilin

Fermentas (Mỹ)

X-gal

Fermentas (Mỹ)

IPTG

Fermentas (Mỹ)

Accuprep plasmid Mini Extraction Kit

Fermentas (Mỹ)

EcoRI

Fermentas (Mỹ)

pBT

Fermentas (Mỹ)

3. H/c phục vụ giải trì nh tƣ̣ gene
Big Dye Terminator V3.1

Applied BioSciences (Mỹ)

HiDi Formamid

Applied BioSciences (Mỹ)

Ethanol tuyệ đối

Fermentas (Mỹ)
15

Footer Page
166.
Số hóa15
bởi of
Trung
tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Header Page 16 of 166.

2.2.2. Các máy và thiết bị chính
Bảng 2.3: Các máy và thiết bị chính
Tên máy, thiết bị

Hãng sản xuất

Tủ ấm ổn nhiệt

Sanyo (Nhật Bản)

Máy PCR (GenAmp PCR System 9700)

Applied BioSciences (Mỹ)

Máy PCR (Thermo cycle)

Bio-rad (Pháp)

Máy ly tâm (Biofuge Primo R)

Heraeus (Mỹ)

Máy đo pH (Digital pH Meter Delta 320)

Thommas Scientific (Mỹ)

Máy chụp ảnh Gel-Doc

Dolphin (Mỹ)

Tủ lạnh -200C, -800C

Nuaire (Mỹ)

Lò vi sóng

Sanyo (Nhật Bản)

Tủ an toàn sinh học cấp II Nuaire

Nuaire (Mỹ)

Bể ổn nhiệt

Memmert (Đức)

Máy lắc Gyromax 737R

Amerex Instrument (Đức)

Máy quang phổ tử ngoại khả biến Nano Drop

Analitika (Đức)

Máy phân tích trình tự DNA ABI 3100-

Applied BioSciences (Mỹ)

Avant
2.2.3. Các mồi dùng trong nghiên cứu
Các mồi đặc hiệu cho phát hiện trực khuẩn lao và lao kháng thuốc được
sử dụng cho phản ứng PCR n hân các đoạn gen đí ch có trì nh tự tương ứng là :
- Cặp mồi dùng cho nhân trì nh tự gen katG:
KatG F: 5'-GAG CCC GAT GAG GTC TAT TG-3'
KatG R: 5'-ACA AGC TGA TCC ACC GAG AC-3'
- Cặp mồi dùng cho giải trình tự gen katG:
M13 F: 5'-GTAAAACGACGGCCAG-3'
M13 R: 5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3'
Các trình tự này được gửi tổng hợp ở công ty Invitrogen , Hồng Kông .

16

Footer Page
166.
Số hóa16
bởi of
Trung
tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




Header Page 17 of 166.

2.3. Phƣơng pháp nghiên cƣ́u

2.3.1. Thiết kế nghiên cƣ́u
Tiến hành nghiên cứu theo phương pháp :
- Dịch tễ học mô tả, điều tra cắt ngang, có đối chứng.
- Thực nghiệm labo có đối chứng .
Sơ đồ nghiên cƣ́u
DNA (Tách từ vi khuẩn
lao đã đƣợc xác đị nh tí nh
kháng thuốc)

Nhân bản đoạn gen katG
sƣ̉ dụng mồi đặc hiệu

Sản phẩm gen KatG

Tách dòng gen KatG

Sản phẩm vector có đoạn
gen KatG

Xác định đột biến liên
quan đến tí nh kháng INH

Giải trình tự gen KatG

17

Footer Page
166.
Số hóa17
bởi of

Trung
tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




Header Page 18 of 166.

2.3.2. Các kỹ thuật cụ thể
2.3.2.1. Kỹ thuật nhân bản đoạn gen katG sử dụng mồi đặc hiệu
Sơ đồ qui trì nh nhân bản đoạn gen KatG
Đo nồng độ DNA của mẫu
nghiên cƣ́u

Tính toán giá trị các thành
phần phản ứng PCR

Tạo hỗn hợp phản ứng

Nhân gen theo chu trì nh
nhiệt đã đƣợc tối ƣu hóa

Điện di kiểm tra vạch đặc
hiệu

Sƣ̉ dụng sản phẩm PCR làm
DNA chèn vào plasmid

Cụ thể:
1. Sau khi đo nồng độ DNA khuô n, tính và tạo các nồng độ DNA của

các mẫu như nha u để khi đưa vào hỗn hợp sản phẩm cùng một thể tí ch DNA
khuôn, và đạt khoảng 100 ng/thể tí ch 25µl phản ứng.
2. Tính các giá trị của các thành phần khác .

18

Footer Page
166.
Số hóa18
bởi of
Trung
tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




Header Page 19 of 166.

Bảng 2.4: Tính toán các thành phần cho phản ứng PCR
Thành phần phản ứng PCR

Thể tí ch (µl)

Nước

Nồng độ

10,25

MgCl2 (25 mM)

2,5

2 mM

PCR bufer (10X)

2,5

1X

dNTP mix (5mM)

2,5

0,2 mM

Mồi KatG F

1

0,5 µM

Mồi KatG R

1

0,5 µM

0,25

1 unit

Taq Polymerase
DNA khuôn

5
Tổng

25

Các thành phần này ở phản ứng của các mẫu bệnh phẩm

đều giống

nhau. Có đối chứng âm khi tiến hành phản ứng .
3. Chu trì nh nhiệt như sau :
35 chu kỳ
950C
5 phút

950C
1 phút

720C
1 phút

720C
4 phút

560C
45 giây
40C
60 phút
4. Điện di sản phẩm PCR trên a garose 1,5%, nhuộm Ethidium bromide
và đọc kết quả trên máy Gel - Doc.

19

Footer Page
166.
Số hóa19
bởi of
Trung
tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




Header Page 20 of 166.

2.3.2.2. Kỹ thuật tách dòng (cloning), tạo sản phẩm phục vụ giải trình tự gen
katG
Sơ đồ qui trì nh tách dòng
Tinh sạch và gắn đoạn gen vào vector tách
dòng pBT tạo vector tái tổ hợp

Đƣa vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến

Nuôi cấy tế bào có vector

Lƣ̣a chọn tế bào mang vector tái tổ hợp theo
nguyên tắc chọn lọc khuẩn lạc xanh trắng

Kiểm tra và tách plasmid

Thu plasmid, kiểm tra đoạn gen

Sau khi nhân bản thành công đoạn gen

katG, chúng tôi tiến hành làm

sạch (thôi gel) bằng bộ kit QIAquick Gel Extraction . Trong quá trì nh thao tác
trên đèn tí m rất có thể bị đứt gẫy các

nucleotide sẽ gây ảnh hưởng k hông tốt

tới sản phẩm kết nối , vì vậy trước k hi thực hiện phản ứng kết nối
tiến hành thực hiện phản ứng nối đầu A

chúng tôi

. Thành phần phản ứng được trình

bày ở bảng 2.5.

20

Footer Page
166.

Số hóa20
bởi of
Trung
tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




Header Page 21 of 166.

Bảng 2.5: Tính toán các thành phần cho phản ứng nối đầu A
Thành phần phản ứng PCR

Thể tí ch (µl)

Nồng độ

Nước

5,25

MgCl2 (25 mM)

2,5

2 mM

PCR bufer (10X)

2,5

1X

dNTP mix (5mM)

2,5

0,2 mM

Taq Polymerase

0,25

1 unit

DNA khuôn

7
Tổng

20

Sản phẩm được tiến hành trên máy PCR ở 720C trong 10 phút.
Sau đó tiến hành tinh sạch sản phẩm PCR theo qui trì nh của nhà sản xuâ
. ́t
Qui trì nh:
- Thêm 100 µl building buffer và o các Eppendorf chứa mẫu vừa được
nối đầu A. Vortex nhẹ .
- Hút hết sản phẩm trên sang các Eppendorf có bổ sung cột lọc.
- Ly tâm 13000 vòng/phút/40C. Đổ dịch lỏng, thu cặn bám trên cột lọc.

- Thêm 500 µl Washing buffer vào

Eppendorf. Ly tâm

13000

vòng/phút/40C. Đổ dịch, thu cặn bám trên cột lọc.
- Lặp lại bước trên.
- Làm khô bằng cách ly tâm thêm 1 lần nữa.
- Thêm 15 µl nước deion vào. Đợi trong vòng 1 phút.
- Thu dị ch, loại bỏ cột lọc.
Sau đó thực hiện các bước sau:
1. Tạo sản phẩm kết nối
Kết nối đoạn gen katG cần nghiên cứ u với vector pBT theo qui trì nh
của nhà sản xuất .
21

Footer Page
166.
Số hóa21
bởi of
Trung
tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




Header Page 22 of 166.

Qui trì nh:

- 2X Papid Ligation Buffer 1 µl
- T4 DNA Ligase 1 µl
- pBT Vector 1
- PCR product 5 µl
- Nước cất khử ion vừa đủ 10 µl.
Sau đó sản phẩm đượctiến hành trên máy PCRở 220C trong vòng60 phút.
2. Biến nạp và nuôi cấy tế bào có vector tái tổ hợp
Biến nạp sản phẩm kết nối trên vào tế bào khả biến E.coli DH5α theo
phương pháp sốc nhiệt [15]. Nuôi cấy tế bào và kiểm tra sự có mặt của vector
tái tổ hợp trong tế bào theo qui trình sau :
- Lấy tế bào khả biến ra khỏi tủ âm , để trong nước đá (40C) trong vòng
10-15 phút.
- Hút 5 µl sản phẩm kết nốicho vào các ôń g tế bào khả biến(có đảo nhẹ).
- Để ống tế bào khả biến trong nước đá (40C) 30 phút, sốc nhiệt ở 420C
trong vòng 90 giây.
- Tiếp tục giữ ở 40C trong vòng 1-2 phút.
- Thêm 100 µl LB lỏng vào các ống tế bào khả biến trên (có đảo nhẹ ),
cho ngay các ống tế bào khả b iến này vào tủ nuôi cấy lắc , để ở 370C và 220
vòng/phút trong 1 giờ .
- Hút 150 µl dịch khuẩn đã nuôi lắc cấy trải trên đĩ a thạch LB đặc có
carbenicillin, X-gal, IPTG.
- Giữ sản phẩm ở tủ ổn nhiệt 370C qua đêm (18-24 giờ ).
- Khi trên bề mặt đĩ a thạch xuất hiện các tế bào xanh trắng
các khuẩn lạc trắng chấm vào 3 ml LB lỏng có kháng sinh

, lựa chọn

carbenicillin với

nồng độ 100 µg/ml.

22

Footer Page
166.
Số hóa22
bởi of
Trung
tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




Header Page 23 of 166.

- Lấy 1 µl dị ch khuẩn làm phản ứng PCR k iểm tra đoạn gen vớ i 2 mồi
KatG F và KatG R (chu trì nh nhiệt như với PCR nhân đoạn gen katG).
- Tiến hành điện di kiểm tra sản phẩm PCR , nếu mẫu nào có vạch
tương ứng với đoạn gen KatG thì sử dụng mẫu đó để tách plasmid .
3. Tách chiết plasmid (Sử dụng các hóa chất có tại phòng Công nghệ tế
bào thực vật - Viện CNSH).
Sử dụng kit QIAprep spin Miniprep (của hãng QIAGEN ) và quy trình
của nhà sản xuất để tách chiết plasmid

. Đây là phương pháp tách chiết

plasmid lượng nhỏ từ 1-1,5 ml khuẩn lạc E. coli.
- Hút 2 ml dị ch khuẩn cho vào Eppendorf 2 ml.
- Ly tâm 8000 vòng/2 phút ở 40C thu khuẩn.
- Thêm 100 µl sol I, vortex nhẹ cho tan cặn.

- Thêm 200 µl sol II, đảo nhẹ Eppendorf.
- Thêm 150 µl sol III, đảo nhẹ Eppendorf cho dị ch chuyển sang màu
trắng. (Đảo ngay khi thêm hóa chất vào Eppendorf, tránh kết tủa cục bộ).
- Ly tâm 13000 vòng/10 phút/40C. Hút 300 µl dị ch, bỏ cặn.
- Thêm 1 lượng tương đương P

CI 24:1 (24 phenol-chloroform -

isoamylalchohol). Lắc mạnh, ly tâm 13000 vòng/10 phút/40C. Thu pha trên.
- Thêm 1 lượng tương tương isopropanol . Lắc đều.
- Ly tâm 13000 vòng/10 phút/40C. Thu cặn.
- Rửa cồn. Ly tâm 13000 vòng/5 phút/40C.
- Đợi khô.
- Thêm 50 µl nước deion.
4. Kiểm tra sự có mặt của đoạn gen chèn vào plasmid
Sử dụng enzym cắt giới hạn

BamHI để cắt plasmid . Theo như sơ đồ

vector pBT thì chỉ cần một enzym này là có thể cắt ở cả hai đầu phí a trước vị
trí của đoạn gen chè n vào. Kết quả sau khi thực hiện phản ứng cắt sẽ thu được
23

Footer Page
166.
Số hóa23
bởi of
Trung
tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Header Page 24 of 166.

hai phần: tạo một vạch trên hình ảnh điện di có kích thước khoảng 684 bp và
một vạch là phần còn lại của plasmid khoảng 2705 bp.
Qui trì nh dùng BamHI:
- 10X BamHI buffer:

2µl

- BamHI enzym:

1µl

- DNA plasmid:

5µl

- Nước deion vừa đủ 20µl
Sản phẩm được tiến hành ở bể ổn nhiệt 370C trong vòng 90 phút. Sau
đó điện di trong agarose 1% kiểm tra vạch đặc hiệu . Những mẫu nào có vạch
tương ứng với vị trí 684 bp thì có thể sử dụng để đọc trình tự .
Sau khi xác đị nh được mẫu plasmid đi đọc trì nh tự , pha loãng plasmid
50 lần rồi hút 10µl mẫu đó cho vào Eppendorf, bổ xung thêm 5µl RNAase.
Sản phẩm được tiến hành ở bể ổn nhiệt 370C trong vòng 90 phút để khử RNA.
2.3.2.3. Phương pháp đọc trì nh tự DNA theo Sanger trên máy đọc trì nh
tự tự động phân tí ch kết quả bằng các phần mềm chuyên dụng
Plasmid được gửi đọc trì nh tự

tại phòng Công nghệ gen t rọng điểm -

Viện Công nghệ Sinh học .
* Phân tí ch kết quả :
- Kiểm tra kết quả thu được bằng phần mềm máy tí nh ABI 3130.
- Khai thác dữ liệu từ ngân hàng gen , thiết lập chủn g chuẩn wild type
để so sánh.
- Xử lý, phân tí ch các trình tự đoạn gen katG có kích thước khoảng 684
bp của các chủng vi khuẩn lao bằng chương trình phân tích chuỗi BioEdit . So
sánh đối chiếu với các dữ liệu ở ngân hàng gen để có kết quả các vị trí đột
biến của từng chủng nghiên cứu .
Xử lý số liệu theo phương pháp thống kê , sử dụng chương trì nh phân
tích sinh học Star View v5.0 để xác định các mối liên quan kháng thuốc .
24

Footer Page
166.
Số hóa24
bởi of
Trung
tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




Header Page 25 of 166.

CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CƢ́U VÀ THẢO LUẬN

3.1. Kết quả nhân bản gen katG các chủng vi khuẩn lao nghiên cƣ́u
Sử dụng cặp mồi katG F và katG R nhân bản đoạn gen katG bằng kỹ
thuật PCR. Sau khi có được sản phẩm PCR , chúng tôi tiến hành kiểm tra đoạn
gen được nhân lên bằng phương pháp điện di trên agarose

1%. Kết quả được

thể hiện như trong ảnh 3.1 và 3.2.

25

Footer Page
166.
Số hóa25
bởi of
Trung
tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên