Nghiên cứu thu nhận chất kháng sinh vancomycin từ môi trường lên men chủng xạ khuẩn S. orientalis (LV thạc sĩ)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
-------------------

HOÀNG THỊ NƢƠNG

NGHIÊN CỨU THU NHẬN VANCOMYCIN TỪ MÔI TRƢỜNG
LÊN MEN CHỦNG XẠ KHUẨN S. orientalis

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN - 2015

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
-----------------------

HOÀNG THỊ NƢƠNG

NGHIÊN CỨU THU NHẬN VANCOMYCIN TỪ MÔI TRƢỜNG
LÊN MEN CHỦNG XẠ KHUẨN S. orientalis

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Mã số: 60420201

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC
TS. Nguyễn Phƣơng Nhuệ

THÁI NGUYÊN – 2015
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu do chính tôi thực hiện. Các
số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa có ai công
bố trong bất cứ công trình nào khác.
Thái Nguyên, ngày 20 tháng 9 năm 2015
Tác giả

Hoàng Thị Nƣơng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




LỜI CẢM ƠN
Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới TS.
Nguyễn Phương Nhuệ - phó trưởng phòng Công nghệ lên men - Viện công nghệ
sinh học, Viện Hàn lâm khoa học và Công nghệ Việt Nam đã định hướng nghiên
cứu, tận tình hướng dẫn và dìu dắt tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn
thành luận văn.

Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ Phòng Công nghệ lên men, Viện
Công nghệ sinh học đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá
trình nghiên cứu. Tôi xin chân thành cảm ơn những tình cảm quý báu đó.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô Khoa Khoa học Sự Sống,
Trường Đại học Khoa học đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong
quá trình học tập, nghiên cứu.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến gia đình và bạn bè, những người
luôn bên tôi, động viên, góp ý và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt thời
gian học tập và nghiên cứu.
Thái Nguyên, ngày 20 tháng 9 năm 2015
Tác giả

Hoàng Thị Nƣơng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN
LỜI CẢM ƠN
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ
MỞ ĐẦU ............................................................................................................... 1
1. Đặt vấn đề ...................................................................................................... 1
2. Mục tiêu nghiên cứu....................................................................................... 2
3. Nội dung nghiên cứu ...................................................................................... 2

Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................... 3
1.1. Giới thiệu về chất kháng sinh vancomycin ................................................. 3
1.1.1. Lịch sử phát triển và ứng dụng trong điều trị bệnh của vancomycin... 3
1.1.2. Cấu trúc phân tử và đặc tính hóa lý của vancomycin ......................... 4
1.1.3. Cơ chế kháng khuẩn của vancomycin................................................... 7
1.1.4. Sinh tổng hợp vancomycin ở xạ khuẩn ................................................. 8
1.2. Nguồn nguyên liệu có ở Việt Nam dùng cho lên men sinh vancomycin . 12
1.2.1. Nguồn bột đao ..................................................................................... 12
1.2.2. Nguồn cao nấm men ........................................................................... 12
1.3. Tối ƣu hóa môi trƣờng .............................................................................. 13
1.3.1. Khái niệm về tối ưu môi trường .......................................................... 13
1.3.2. Phương pháp bề mặt đáp ứng............................................................. 14
1.4. Phƣơng pháp tách chiết vancomycin ........................................................ 15
1.4.1. Tách chiết bằng dung môi hữu cơ ...................................................... 15
1.4.2. Tách chiết bằng hấp phụ..................................................................... 16
1.4.3. Tách chiết bằng trao đổi ion ............................................................... 18
Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................... 22
2.1. Vật liệu ...................................................................................................... 22
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




2.1.1. Đối tượng ............................................................................................ 22
2.1.2. Hóa chất .............................................................................................. 22
2.1.3. Dụng cụ ............................................................................................... 22
2.2. Môi trƣờng nghiên cứu ............................................................................. 22
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu........................................................................... 24
2.3.1. Phương pháp bảo quản giống ............................................................ 24
2.3.2. Nhận biết đặc điểm sinh học của chủng S. orientalis 4912................ 24

2.3.3. Phương pháp lên men ......................................................................... 25
2.3.4. Phương pháp xác định hoạt tính kháng sinh ...................................... 27
2.3.5. Phương pháp tách chiết vancomycin .................................................. 28
Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................... 32
3.1. Nhận biết đặc điểm sinh học của chủng Streptomyces orientalis 4912.... 32
3.1.1. Đặc điểm hình thái .............................................................................. 32
3.1.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa .................................................................. 33
3.2. Lựa chọn môi trƣờng lên men ................................................................... 35
3.3. Ảnh hƣởng của các thành phần trong môi trƣờng lên men ...................... 36
3.3.1. Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến khả năng sinh tổng hợp
vancomycin của chủng S. orientalis 4912 .................................................... 36
3.3.2. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh tổng hợp vancomycin
của chủng S. orientalis 4912......................................................................... 38
3.4. Tối ƣu hoá thành phần môi trƣờng lên men sinh tổng hợp vancomycin từ
chủng S. orientalis 4912 theo phƣơng pháp bề mặt đáp ứng........................... 40
3.5. Động thái quá trình lên men sinh tổng hợp vancomycin của chủng S.
orientalis 4912 trên môi trƣờng tối ƣu ............................................................. 44
3.6. Nghiên cứu chế độ lên men vancomycin .................................................. 46
3.6.1. Chế độ lên men vancomycin theo mẻ.................................................. 46
3.6.2. Chế độ lên men bán liên tục ............................................................... 48
3.7. Tách chiết vancomycin từ dịch lên men bằng dung môi .......................... 49
3.7.1. Khả năng tách chiết vancomycin của các loại dung môi khác nhau . 49

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




3.7.2. Tỉ lệ phối trộn dung môi và dịch lên men phù hợp cho tách chiết
vancomycin ................................................................................................... 52

3.7.3. Xác định thời gian tách chiết .............................................................. 54
3.8. Tách chiết vancomycin từ dịch lên men bằng phƣơng pháp hấp phụ ...... 55
3.8.1. Khả năng hấp phụ vancomycin của một số chất hấp phụ .................. 55
3.8.2. Nồng độ than hoạt tính và dung môi sử dụng để nhả hấp phụ........... 55
3.8.3 Xác định pH và thời gian nhả hấp phụ ................................................ 57
3.8.4. Xác định tỷ lệ hỗn hợp dung môi ........................................................ 58
3.9. Tách chiết vancomycin từ dịch lên men bằng phƣơng pháp trao đổi ion . 60
3.9.1. Tách chiết vancomycin với một số chất trao đổi ion .......................... 60
3.9.2. Kiểm tra vancomycin tách chiết được từ dịch lên men ...................... 63
Chƣơng 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................... 64
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 65
PHỤ LỤC ............................................................................................................ 69

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
PG
B. subtilis ATCC 6633

Peptidoglycan
Bacillus subtilis ATCC6633

E. coli

Escherichia coli

MRSA

Methicillin resistant Staphylococcus aureus

S. orientalis 4912

Streptomyces orientalis 4912

DLM

Dịch lên men

KSC

Kháng sinh chuẩn

HPLC

Sắc kí lỏng cao áp

CKS

Chất kháng sinh

RSM

Reponse Surface methodology

HTKS

Hoạt tính kháng sinh

ĐKVVK

Đƣờng kính vòng vô khuẩn

VVK

Vòng vô khuẩn

SKU

Sinh khối ƣớt

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




DANH MỤC CÁC BẢNG
Số
Tên bảng
Trang
hiệu
1.1 Phổ kháng khuẩn của vancomycin
6
Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến sinh trƣởng của chủng S.orientalis
3.1 4912
32
3.2 Ảnh hƣởng của pH đến sinh trƣởng của chủng S.orientalis 4912
32

3.3 Khả năng đồng hoá đƣờng của chủng S. orientalis 4912
34
Khả năng sinh tổng hợp vancomycin của chủng S. orientalis
3.4 4912 trên một số môi trƣờng
35
Ảnh hƣởng của các nguồn cacbon đến khả năng sinh tổng hợp
3.5 vancomycin của chủng S. orientalis 4912
36
Ảnh hƣởng của các nguồn nitơ đến khả năng sinh tổng hợp
3.6 vancomycin của chủng S. orientailis 4912
39
Các yếu tố biến đổi của thành phần môi trƣờng lên men
Bố trí thí nghiệm và kết quả tối ƣu hóa môi trƣờng sinh tổng
hợp vancomycin từ chủng S. orientalis 4912 theo RSM-CCD

41

Bảng phân tích hồi quy mô hình tối ƣu
Kết quả kiểm chứng sự tƣơng thích của mô hình với thực
3.10 nghiệm
3.11 HTKS của chủng S. orientalis 4912 khi lên men theo mẻ

42

3.12 Hiện tƣợng trộn dịch lên men với các dung môi
Hoạt tính kháng khuẩn của các dung môi khác nhau sau quá
3.13 trình tách chiết từ dịch lên men
Hoạt tính kháng khuẩn của dung môi n – Butanol tách chiết tỉ lệ
3.14 2/1 ở các khoảng thời gian khác nhau

50

3.15 Khả năng hấp phụ chất kháng sinh của một số chất hấp phụ
Ảnh hƣởng của nồng độ than hoạt tính tới khả năng hấp phụ
3.16 chất kháng sinh

55

3.17 Ảnh hƣởng của dung môi tới khả năng nhả hấp phụ vancomycin
Ảnh hƣởng của pH và thời gian đến quá trình nhả hấp phụ
3.18 vancomycin
Ảnh hƣởng của tỷ lệ hỗn hợp dung môi tới quá trình nhả hấp
3.19 phụ vancomycin

56

3.20 Khả năng tách chiết vancomycin với một số chất trao đổi ion

60

3.7
3.8
3.9

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN



41

44
47

52
54

56

58
59


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ
Số
hiệu

Tên hình và đồ thị

Trang

1.1

Cấu trúc hóa học và cấu trúc không gian của vancomycin

4

3.1

Khuẩn lạc của chủng S. orientalis 4912 trên MT thạch 48
Hình dạng khuẩn ty và chuỗi bào tử của chủng S. orientalis

4912
Hoạt tính vancomycin của chủng S. orientalis 4912 trên các
môi trƣờng lên men khác nhau
Ảnh hƣởng của các nguồn cacbon đến khả năng sinh tổng hợp
vancomycin của chủng S. orientalis 4912
Ảnh hƣởng của nồng độ bột đao đến khả năng sinh tổng hợp
vancomycin của chủng S. orientalis 4912
Ảnh hƣởng của nồng độ cao nấm men đến khả năng sinh tổng
hợp vancomycin của chủng S. orientalis 4912

33

43

3.8

Vùng tối ƣu của cặp yếu tố ảnh hƣởng bột đao – cao nấm men
Động thái quá trình lên men sinh tổng hợp vancomycin của
chủng S. orientalis 4912 trên môi trƣờng tối ƣu

3.9

Hoạt tính kháng sinh của chủng S. orientalis lên men theo mẻ

48

3.2
3.3
3.4
3.5

3.6
3.7

34
36
37
38
40

46

3.10 HTKS của chủng S. orientalis lên men bán liên tục

48

3.11 Kết quả tách chiết vancomycin bằng các dung môi khác nhau
Hoạt tính kháng khuẩn của dung môi 2 - Butanol sau khi chiết
3.12 vancomycin từ dịch lên men
Hoạt tính kháng khuẩn của dung môi n - Butanol sau khi chiết
3.13 vancomycin từ dịch lên men
Hoạt tính kháng MRSA của dung môi n – Butanol tách chiết tỉ
3.14 lệ 2:1 ở các khoảng thời gian khác nhau
Nhả hấp phụ vancomycin từ than hoạt tính với các dung môi
3.15 khác nhau
3.16 Kết quả sắc ký giấy chất kháng sinh vancomycin

51

3.17 Sơ đồ tách chiết vancomycin trên cột trao đổi ion
3.18 Sơ đồ quy trình tách chiết vancomycin bằng nhựa trao đổi ion

Sắc kí đồ HPLC của vancomycin sau khi đã làm tinh khiết từ
3.19 dịch lên men chủng S. orientalis 4912

61
62

3.20 Sắc đồ HPLC của vancomycin chuẩn (Merck)

63

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN



53
53
54
57
59

63


MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Trong suốt tiến trình phát triển của nhân loại, trên con đƣờng hoàn thiện
mình, loài ngƣời luôn phải đấu tranh để vƣợt qua mọi trở ngại, thách thức khác
nhau. Bệnh tật chính là một trong số các trở ngại đó và rất nhiều bệnh có nguyên
nhân do vi sinh vật gây ra. Với phát minh vĩ đại về penicillin, cùng với việc phát
triển và hoàn thiện của công nghệ lên men hiện đại đã tạo ra cho nhân loại các

chất kháng sinh, công cụ hữu hiệu mới để đấu tranh chống lại các bệnh nhiễm
khuẩn. Tuy nhiên, việc sử dụng kháng sinh tràn lan trong những thập kỷ vừa qua
đã dẫn đến sự xuất hiện của rất nhiều chủng vi khuẩn đề kháng kháng sinh và
tạo nên một mối nguy cơ toàn cầu trầm trọng đe dọa nền y học hiện đại. Để khắc
phục hiện tƣợng kháng thuốc của vi sinh vật gây bệnh, việc nghiên cứu, sản xuất
các chất kháng sinh đã biết với các đặc tính ƣu việt hơn và việc tìm kiếm phát
hiện các kháng sinh mới vẫn luôn là vấn đề mang tính thời sự và rất cấp thiết,
đặt ra không chỉ ở thời điểm hiện tại mà ngay cả trong tƣơng lai.
Vancomycin là chất kháng sinh thuộc nhóm glycopeptit có tác dụng tích
cực trong điều trị nhiều loại bệnh, từng đƣợc coi là thần dƣợc hay là phƣơng
thuốc cuối cùng vì có khả năng điều trị đƣợc các bệnh nhiễm trùng nguy hiểm
do nhóm vi khuẩn Staphylococcus (nhóm này có khả năng kháng lại penixillin
và methixillin) gây nên. Vancomycin đã đƣợc đƣa vào chữa bệnh từ hơn 40 năm
qua, nhƣng ngày nay vẫn đƣợc coi là kháng sinh quan trọng do hiệu quả chữa
bệnh cao khi dùng một mình hoặc khi phối hợp với các thuốc kháng sinh khác,
chống lại các vi khuẩn đã nhờn với các thuốc kháng sinh thông dụng. Hiện nay,
vancomycin từ chủng xạ khuẩn Streptomyces orientalis đã đƣợc đƣa ra sản xuất
ở quy mô công nghiệp nhƣng hiệu suất còn thấp và giá thành của chất kháng
sinh này còn cao.
Vì vậy, nghiên cứu lên men vancomycin và nắm vững quy trình sản xuất
chất kháng sinh này còn tạo tiền đề cho việc xây dựng cơ sở sản xuất chất kháng
1


sinh ở quy mô công nghiệp trong điều kiện Việt Nam, góp phần làm giảm lƣợng
kháng sinh nhập khẩu từ nƣớc ngoài, đáp ứng đƣợc phần lớn nhu cầu chăm sóc
sức khỏe cho ngƣời dân, tiết kiệm hàng nghìn tỷ đồng tiền thuốc nhập khẩu.
Xuất phát từ nhu cầu thực tế trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu
thu nhận chất kháng sinh vancomycin từ môi trƣờng lên men chủng xạ
khuẩn S. orientalis”.

2. Mục tiêu nghiên cứu
Thu nhận đƣợc chất kháng sinh vancomycin từ môi trƣờng lên men chủng
xạ khuẩn S. orientalis.
3. Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu tối ƣu môi trƣờng lên men vancomycin từ nguồn nguyên
liệu trong nƣớc.
- Nghiên cứu các chế độ lên men vancomycin theo mẻ và lên men bán
liên tục.
- Nghiên cứu tách chiết vancomycin từ môi trƣờng lên men chủng xạ
khuẩn S. orientalis.

2


Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu về chất kháng sinh vancomycin
1.1.1. Lịch sử phát triển và ứng dụng trong điều trị bệnh của vancomycin
Vancomycin là một chất kháng sinh tiêu biểu nhất thuộc nhóm kháng sinh
glycopeptit, đƣợc Eli Lilly và cộng sự mô tả lần đầu tiên vào năm 1956, do
chủng xạ khuẩn S. orientalis phân lập từ đất ở Indonexia và Ấn Độ sinh tổng
hợp ra [27].
Nhiễm trùng Staphylococcus aureus là nguyên nhân chính gây nhiễm trùng
máu trong bệnh viện và cộng đồng trên toàn thế giới với tỉ lệ mắc bệnh và tử
vong tƣơng đối lớn, đặc biệt là khi không đƣợc điều trị phù hợp. Với sự xuất
hiện của methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) trong năm 1960
kháng lại các kháng sinh là một thách thức lớn đối với việc điều trị nhiễm trùng
nghiêm trọng, đặc biệt là nhiễm trùng endovascular. Đến nay, hầu hết các chủng
MRSA kháng với nhiều loại kháng sinh và không thể đƣợc điều trị bằng βlactams thông thƣờng, làm cho glycopeptide (Vancomycin hoặc Teicoplanin) là
giải pháp điều trị duy nhất đƣợc lựa chọn [14].
Trong những năm gần đây, sự xuất hiện của chủng MRSA giảm nhạy cảm

với glycopeptide đã nhấn mạnh sự cần thiết cho các loại thuốc mới có hiệu quả
hơn. Thuốc mới antistaphylococcal nhƣ linezolid, đó là các kháng sinh
oxazolidinone đầu tiên đƣợc chấp thuận của Cục Quản lý Thực phẩm và Dƣợc
phẩm (FDA), đã phát triển và cho thấy hiệu quả tƣơng đƣơng với vancomycin
trong điều trị viêm phổi và nhiễm trùng mô mềm. Tuy nhiên, linezolid đã không
đƣợc sử dụng vì giá mua cao hơn cũng nhƣ thiếu các thử nghiệm lâm sàng và
kinh nghiệm so với vancomycin. Do đó, vancomycin vẫn đƣợc duy trì nhƣ một
dòng thuốc ƣu tiên của quốc phòng trong điều trị nhiễm trùng MRSA [14].
Kể từ khi đƣợc phát hiện, cấu trúc phân tử và đặc tính của vancomycin đã
luôn lôi cuốn sự quan tâm nghiên cứu của nhiều nhà khoa học thuộc nhiều
chuyên ngành khác nhau. Kháng sinh này đã đƣợc xem nhƣ cấu trúc sinh học
3


chủ yếu, từ đó biển đổi bằng cách bán tổng hợp hoặc bằng công nghệ sinh học
tạo ra những chất thay thế với những đặc tính ƣu việt [24].
1.1.2. Cấu trúc phân tử và đặc tính hóa lý của vancomycin
Vancomycin có công thức phân tử C66H75Cl2N9O24, trọng lƣợng phân tử
của vancomycin là 14449.3 Da. Vancomycin có 3 hệ thống vòng, 2 nhóm
cacbonhydrat, 5 vòng thơm, 9 nhóm –OH trong đó có 3 nhóm phenol, 7 liên kết
amit và 2 liên kết amin, điểm đẳng điện pI 7.2. Vancomycin khác với các kháng
sinh khác thuộc nhóm glycopeptit bởi cấu trúc phức tạp, đặc biệt sự khác biệt đó
là bởi trong cấu trúc của vancomycin chứa một disacarit ở vị trí axit amin thứ 4,
là vị trí cho phép gắn phân tử ngoại lai để tạo nên các vancomycin bán tổng hợp
hoạt tính cao và bền vững với các tác nhân kháng. Đây là hƣớng đang đƣợc quan
tâm nghiên cứu nhằm mở ra một thế hệ kháng sinh mới có hoạt tính cao và chọn
lọc [9], [28].

Hình 1.1. Cấu trúc hóa học và cấu trúc không gian của vancomycin
Các phân tử vancomycin thƣờng không kết hợp với nhau nên vancomycin

là chất vô định hình, không màu sắc và có tính chất lƣỡng tính. Nó hòa tan trong
4


nƣớc trong vùng pH axit và bazơ, hòa tan ít hơn trong điều kiện trung tính, bền
vững ở dạng rắn và dung dịch nƣớc hòa tan của nó có vùng pH từ 2.5 – 9. Nó
thƣờng hòa tan nhiều trong các rƣợu bậc thấp và hầu nhƣ không hòa tan trong
các dung môi hữu cơ khác [24].
Vancomycin có bản chất lƣỡng tính nên phản ứng với các axit vô cơ ví dụ
nhƣ HCl, H2SO4, H3PO4 và các axit khác và tạo thành dạng muối để thuận tiện
trong việc thu hồi. Vancomycin chlohydride (Vancomycin HCl) là một dạng
muối bền vững của vancomycin. Vancomycin HCl bền ở dạng rắn và trong dung
dịch nƣớc ở nhiệt độ trên 70oC trong vùng pH 2.5 – 9. Giá trị pKa của
vancomycin là: 2,9; 7,2; 8,6; 9,6; 10,5 và 11,7. Vancomycin HCl là một hợp
chất màu trắng hòa tan trong nƣớc, ít hòa tan trong ethanol và methanol, hầu
nhƣ không hòa tan trong các dung môi khác nhƣ là chloroform, ether, ethyl
acetate. Khả năng hòa tan trong nƣớc ở pH 7.0 là khoảng 1 mg/ml và nó hòa tan
nhiều trong nƣớc ở giá trị pH thấp và giá trị pH trên 8.5 – 9 [24].
Theo những phân tích cơ bản đã chỉ ra rằng phân tử vancomycin chứa
khoảng 1,17% nitơ và khoảng 4,26% Cl. Vancomycin bền trong nƣớc ở pH =
3,0-7,0 và nhiệt độ 37°C trong 6 ngày, nếu nhiệt độ thấp hơn thì hoạt tính giảm
dần theo thời gian. Nếu pH nằm trong khoảng từ 7-12 và nhiệt độ đƣợc nâng nhẹ
(trên 22oC) thì sự phân huỷ có thể quan sát đƣợc.
Bảng 1.1 cho thấy phổ kháng khuẩn của vancomycin. Giá trị nồng độ ức
chế tối thiểu (µg/ml) là nồng độ vancomycin nhỏ nhất làm ức chế sự sinh trƣởng
của vi sinh vật kiểm định sau một khoảng thời gian, cụ thể là 24 giờ, 48 giờ ở
37oC. Theo bảng này thì vancomycin chủ yếu hoạt động chống lại vi khuẩn
gram dƣơng, bị hạn chế trong việc chống lại mycobacteria và không có hoạt tính
chống lại các vi khuẩn gram âm sử dụng trong thử nghiệm trên.
Khi tiêm tĩnh mạch ở chuột trắng theo chuẩn dƣợc, liều gây chết của

vancomycin HCl biểu hiện ở LD50 tìm thấy ở khoảng 435,7 ± 4,22 mg/kg [20].
Chế phẩm vancomycin cần đạt 1007 U/mg, nghĩa là một đơn vị
vancomycin bao gồm 0,993 mcg vancomycin sunfat.
5


Bảng 1.1. Phổ kháng khuẩn của vancomycin
Nồng độ

Nồng độ ức

ức chế tối
Vi sinh vật

thiểu

Vi sinh vật

kiểm định

(µg/ml)

kiểm định

chế tối thiểu
(µg/ml)

24

48

24

48

giờ

giờ

giờ

giờ

Achromobacter

Bacillus brevis

3.13 3.13

Bacillus cereus

3.13 3.13 Aerobacter aerogenes

fischeri

Brucella

>100 >100
>100 >100

Bacillus licheniformis

0.78 0.78

Bacillus polymyxa

0.39 0.39

Escherichia coli

>100 >100

Bacillus subtilis

0.39 0.39

Klebsiella pneumonia

>100 >100

Corynebacterium
diphtheriae

bronchiseptica

0.00 0.78 Mycobacterium avium

Micrococcus pyogenes
var. aureus (kháng lại

Pseudomonas

0.78 0.78

aeruginosa

penixillin)
Micrococcus pyogenes
var. aureus H
Mycobacterium phiei
Mycobacterium
smegmatis
Sarcina lutea

Shigella

1.56 1.56

12.5

paradysenteriae
Saccharomyces

25

carlsbergensis

>100 >100

100

100

>100 >100

>100 >100

>100 >100

0.00 3.13

Aspergillus niger

>100 >100

0,78 0.70

Trichophyton rubrum

>100 >100

6


1.1.3. Cơ chế kháng khuẩn của vancomycin
Hoạt tính kháng vi sinh vật của vancomycin và các kháng sinh khác thuộc
nhóm glycopeptit đạt đƣợc từ việc ức chế sự tổng hợp thành tế bào vi khuẩn.
Vancomycin ức chế giai đoạn cuối của quá trình sinh tổng hợp peptidoglycan
(PG) [25], [31], lớp cơ bản để vi khuẩn chống lại các điều kiện bất lợi của môi
trƣờng. Nếu không có lớp này hoặc vì một lý do nào đó mà lớp PG bị phá huỷ

thì tế bào vi khuẩn trở nên cứng nhắc, không linh động và kết quả là tế bào bị
chết [29].
Quá trình ức chế này xảy ra qua 3 giai đoạn:
Giai đoạn 1: Vancomycin không xâm nhập vào tế bào chất mà chỉ hoạt
động ở bên ngoài màng tế bào chất, ức chế các chất bên ngoài màng tế bào.
Giai đoạn 2: Khi không có mặt vancomycin, các peptit cơ chất đƣợc
glycosyl hóa nhờ enzym transglycosylaza tạo thành các disacaryl pentapeptit sau
đó liên kết chéo peptit đƣợc tạo thành giữa các cơ chất này nhờ transpetidaza để
tạo nên PG thành tế bào vi khuẩn. Đích tác dụng của vancomycin là gắn với các
peptit cơ chất, ngăn cản chúng liên kết với vị trí hoạt động của enzym. Khi đó,
phân tử vancomycin có dạng hình chiếc cốc liên kết ái lực cao nhờ bề mặt lõm
của nó tạo năm liên kết hydro với đoạn cuối N-acyl-D-Alanyl-D-Alanin của cầu
liên kết chéo peptit chƣa nối với pentapeptit.
Giai đoạn 3: Vancomycin không tấn công disacaryl pentapeptit mà làm
giảm các liên kết đồng hoá trị, giảm tính bền cơ học của lớp PG và làm cho tế
bào vi khuẩn dễ dàng bị phân giải do thay đổi áp suất thẩm thấu, dẫn đến vi
khuẩn bị tiêu diệt [29], [31].
Vancomycin có hiệu quả cao trong việc chống lại các vi khuẩn Gram (+)
nhƣ: Enterococcus, Streptococcus và Staphylococcus nhƣng không chống lại
đƣợc hoặc chống lại yếu vi khuẩn Gram (-) nhƣ: E. coli hoặc Salmonella
typhimurium… Điều này đƣợc giải thích bởi hai nguyên nhân: một là do sự khác
biệt giữa cấu trúc thành tế bào vi khuẩn Gram (+) và vi khuẩn Gram (-). Trong
tế bào vi khuẩn Gram (-), lớp PG và lớp màng bên trong đƣợc bao bọc bởi một
7


lớp màng ngoài ngăn chặn sự tiếp cận của kháng sinh với đoạn cuối PG-DAlanyl-D-Alanin trong tế bào chất, từ đó ngăn cản sự khuếch tán của các kháng
sinh glycopeptit đến lớp PG. Ngƣợc lại, lớp PG của vi khuẩn Gram (+) đƣợc xác
định trên bề mặt ngoài của thành tế bào và do đó nó mẫn cảm với các kháng sinh
glycopeptit. Hai là, phân tử glycopeptit là những phân tử lớn, chúng không thể

hoà tan lớp lipit của màng tế bào vi khuẩn Gram (-), do đó mà khó có thể xâm
nhập đƣợc vào lớp bên trong của thành tế bào [29].
Ngoài ra, vancomycin còn có tác dụng ức chế quá trình sinh tổng hợp
ARN. Có thể do cơ chế tác động kép này mà sự kháng vancomycin ít xảy ra.
Những vi sinh vật nhạy cảm với vancomycin và kể cả những chủng kháng
methixillin thƣờng bị tiêu diệt ở nồng độ vancomycin từ 1-5 g/ml [31].
Các nhà khoa học thuộc Trung tâm Công nghệ nano London (LCN) đang
sử dụng một phƣơng pháp nano để nghiên cứu hoạt động của vancomycin.
Nhóm nghiên cứu nhận định rằng khi kháng sinh này tự gắn vào vi khuẩn, nó
tạo ra một áp lực bề mặt lên vi khuẩn, áp lực này góp phần phá vỡ thành tế bào
và giết chết vi khuẩn. Nhóm nghiên cứu so sánh sự tƣơng tác của vancomycin
với loại vi khuẩn không kháng và vi khuẩn kháng kháng sinh. Những “siêu vi
khuẩn” kháng lại kháng sinh vì một đột biến đơn giản xóa kết nối hyđro khỏi
cấu trúc thành tế bào của chúng. Thay đổi nhỏ này làm sự tiếp xúc và thâm nhập
vi khuẩn của kháng sinh trở nên khó khăn gấp hàng nghìn lần việc phá vỡ cấu
trúc tế bào gần nhƣ không thể [34].
1.1.4. Sinh tổng hợp vancomycin ở xạ khuẩn
1.1.4.1. Con đường sinh tổng hợp vancomycin ở xạ khuẩn
Trong nhóm xạ khuẩn có tới 60-70% số loài có khả năng sinh CKS. Chất
kháng sinh do xạ khuẩn sinh ra có thể là kháng sinh ngoại bào hoặc kháng sinh
nội bào. Có nhiều nhóm CKS khác nhau đã đƣợc tìm thấy ở xạ khuẩn nhƣ:
streptomyxin, tetraxyclin, enthromyxin.... Cho đến thời điểm hiện nay, đã có rất
nhiều xạ khuẩn có khả năng sinh kháng sinh cao đã tìm thấy nhƣ: Streptomyces,
8


Micromonospora… nhƣng Streptomyces là loài sản xuất kháng sinh lớn nhất
trong giới vi sinh vật.
Sự tổng hợp kháng sinh vancomycin là quá trình tổng hợp từ các axit amin
cơ bản với quá trình liên kết theo những con đƣờng chlorination, hydroxylation,

sulfonation hoặc glycosylation. Quá trình tổng hợp chịu sự chi phối của nhiều
gen, các gen này quyết định sự tổng hợp vancomycin theo con đƣờng riêng,
khác con đƣờng tổng hợp axit amin để hình thành nên protein. Trong khoảng 20
axit amin cơ bản đƣợc tạo thành trong tổng hợp protein thì có 3 axit amin là phydroxyphenylglyxin, hydroxytyrozin và 3,5 di-hydroxyphenyl-glyxin  và  là
các thành phần chính của kháng sinh. Quá trình hình thành vòng heptapeptit
không xảy ra tại riboxom. Để thay thế riboxom, các mạch peptit đƣợc tổng hợp
nhờ enzym NRPSs (nonribosomal protein synthaza). NRPSs là một enzym có
khối lƣợng phân tử lớn, cấu tạo gồm 4 vùng: vùng A (adenyl hóa), vùng C
(ngƣng tụ hoặc kéo dài), vùng E (epime hóa) và T (thioesteraza). Tại các vùng
tổng hợp, NRPSs chịu trách nhiệm phát hiện, loại bỏ các axit amin có những sai
khác, chỉ sử dụng các axit amin có hoạt tính, ATP (Adenozintriphotphat) đƣợc
dùng làm năng lƣợng cho hoạt động của enzym. Vùng A có trách nhiệm cung
cấp các axit amin liên tục cho quá trình liên kết và chuyển đến vùng E. Vùng E
ngay lập tức thực hiện phản ứng epime hoá các axit amin. Kết thúc ở vùng C các
liên kết peptit đƣợc hình thành giữa các axit amin hoạt tính. Sự tổng hợp này
hình thành nên các mạch heptapeptit thẳng, sau đó, vancomycin phải trải qua
một loạt các biến đổi tiếp theo nhờ hoạt động của 8 enzym nhƣ oxy hóa liên kết
chéo, quá trình glycozyl hóa… để trở thành phân tử có hoạt tính sinh học. Quá
trình hình thành kháng sinh glycopeptit còn chịu sự chi phối của rất nhiều gen,
mỗi gen hoạt động lại chịu sự chi phối của rất nhiều yếu tố [26, 27].
1.1.4.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp kháng sinh ở xạ khuẩn
Đa số chất kháng sinh đƣợc dùng hiện nay là do xạ khuẩn sinh ra. Sự sinh
tổng hợp CKS ở xạ khuẩn phụ thuộc vào nhiều yếu tố nhƣ thành phần môi
trƣờng, điều kiện lên men…
9


* Thành phần môi trường
Quá trình sinh tổng hợp kháng sinh từ xạ khuẩn phụ thuộc rất nhiều vào các
yếu tố nhƣ pH, nhiệt độ… và thành phần của môi trƣờng lên men. Để đảm bảo

cho xạ khuẩn có thể phát triển tốt cần đảm bảo trong môi trƣờng có đầy đủ
nguồn cacbon, nguồn nitơ và các nguyên tố vi lƣợng. Mỗi một chủng xạ khuẩn
khác nhau cần một nguồn cơ chất khác nhau, tuy nhiên tỉ lệ C/N đóng vai trò
quyết định đến sự tổng hợp kháng sinh [4].
1. Nguồn cacbon : Nguồn cacbon có ảnh hƣởng rất lớn đến quá trình sinh
trƣởng cũng nhƣ sinh tổng hợp CKS của chủng S. orientalis do nguồn cacbon
không những tham gia vào cấu tạo thành tế bào mà còn tham gia vào quá trình
hình thành cấu trúc của sản phẩm.
Nguồn cacbon thƣờng sử dụng là các nguồn đƣờng đơn nhƣ glucoza,
fructoza…, các loại đƣờng kép nhƣ maltoza, lactoza, saccaroza…, ngoài ra có
thể sử dụng rỉ đƣờng. Trong đó nguồn đƣờng glucoza là nguồn cacbon dễ sử
dụng nhất, tuy nhiên nếu sử dụng nhiều nguồn đƣờng này thì hiệu suất của quá
trình lên men sẽ giảm đi. Nguyên nhân do glucoza làm tăng lƣợng axit hữu cơ
trong môi trƣờng đồng thời cũng làm tăng các chất hữu cơ và axit nucleic trong
khuẩn ty làm thay đổi hoạt tính các enzym phân giải glucoza… Tuy nhiên, có
thể khắc phục đƣợc hiện tƣợng này bằng cách liên tục bổ sung một cách định kì
một lƣợng nhỏ glucoza để không xảy ra sự tích luỹ các chất trao đổi ức chế. Bên
cạnh đó, tinh bột và dextrin là các nguyên liệu lên men kháng sinh tốt đối với
các chủng vi sinh vật có hoạt tính enzym amylaza cao [4].
2. Nguồn nitơ: Quá trình sinh tổng hợp chất kháng sinh từ xạ khuẩn đòi hỏi
cung cấp đầy đủ nguồn nitơ vô cơ và nitơ hữu cơ. Nguồn nitơ hữu cơ thích hợp
thƣờng sử dụng là cao nấm men, cao thịt, pepton, bột đậu tƣơng…, còn nguồn
nitơ vô cơ thƣờng sử dụng là các muối amon, muối nitrat.
3. Khoáng chất: Vi sinh vật nói chung và xạ khuẩn nói riêng rất cần chất
khoáng trong quá trình trao đổi chất của chúng. Một lƣợng nhỏ các nguyên tố vi
lƣợng cũng có ảnh hƣởng nhất định đến sự hình thành CKS của xạ khuẩn. Sự có
10


mặt của một số muối khoáng nhƣ Na, Fe, Al, Bo, K, Cr, Cu, Mn, Zn... trong môi

trƣờng lên men sẽ tác dụng khác nhau đến khả năng sinh kháng sinh của vi sinh
vật. Có thể sự có mặt của nguyên tố này sẽ làm giảm tác dụng kìm hãm hoặc
làm tăng tác dụng kích thích của nguyên tố kia. Một số muối khoáng nhƣ Ca2+,
Cu2+… đƣợc cho là có ảnh hƣởng tới khả sinh ra một vài loại kháng sinh trong
đó có vancomycin. Các khoáng chất này có tác động lên hoạt động của các
enzym trong sinh tổng hợp kháng sinh [23].
* Điều kiện nuôi cấy
Nhiệt độ: Nhiệt độ có ảnh hƣởng rất lớn đến sinh trƣởng và khả năng tổng
hợp CKS của xạ khuẩn. Phần lớn xạ khuẩn sinh trƣởng tốt ở 28-30°C. Nhiệt độ
tối ƣu cho tổng hợp chất kháng sinh nằm trong khoảng từ 18-28°C.
Độ thông khí: xạ khuẩn có nhu cầu oxy cao hơn so với các vi sinh vật khác,
nhất là trong giai đoạn nhân giống. Do vậy để đảm bảo thông khí tốt, ngƣời ta
thƣờng bổ sung vào môi trƣờng lên men benzilthioxyanat... làm tăng khả năng
hòa tan oxy. Sự có mặt của oxy cũng là điều kiện cần thiết cho xạ khuẩn sinh
chất kháng sinh.
Độ pH: pH thích hợp cho tổng hợp kháng sinh thƣờng là trung tính. Đối với
chủng Streptomyces thì pH thích hợp là 6,5-8,0. Môi trƣờng kiềm hay axit đều
ảnh hƣởng đến quá trình này.
Nhân giống: sinh tổng hợp chất kháng sinh không chỉ phụ thuộc vào điều
kiện lên men mà còn phụ thuộc vào chất lƣợng giống. Môi trƣờng nhân giống
giàu chất dinh dƣỡng hơn môi trƣờng lên men sẽ cho hiệu suất sinh tổng hợp
kháng sinh cao. Lƣợng giống, tuổi giống cũng có ảnh hƣởng không nhỏ đến khả
năng sinh tổng hợp và thời gian sinh tổng hợp, thông thƣờng lƣợng giống bổ
sung vào môi trƣờng lên men từ 2-10 %.
Ngoài ra, sự sinh tổng hợp chất kháng sinh từ vi sinh vật còn chịu ảnh
hƣởng của cơ chế điều hoà ngƣợc. Chất kháng sinh do chúng sinh ra tích luỹ
trong môi trƣờng đến một nồng độ nhất định nào đấy sẽ ức chế sự sinh trƣởng
và phát triển của chúng dẫn đến làm giảm hiệu suất sinh kháng sinh [31].
11

1.2. Nguồn nguyên liệu có ở Việt Nam dùng cho lên men sinh vancomycin
1.2.1. Nguồn bột đao
Các hợp chất cacbon có ý nghĩa hàng đầu trong sự sinh trƣởng và hình
thành chất kháng sinh. Đối với nhiều chủng xạ khuẩn, nguồn cacbon thích hợp
là tinh bột. Thành phần chủ yếu của bột đao là củ dong riềng. Trong 100g củ
dong riềng chứa 20,3g gluxit, đây là thành phần quan trọng nhất và trong đó chủ
yếu là tinh bột [1]. Bột đao chứa hàm lƣợng gluxit cao nên cung cấp đầy đủ
nguồn cacbon hữu cơ cho môi trƣờng lên men sinh tổng hợp vancomycin từ xạ
khuẩn.
Ở Việt Nam củ dong riềng đƣợc trồng với diện tích khoảng 300.000 ha,
sản xuất hàng năm gần 300.000 tấn củ tƣơi, đƣợc trồng nhiều ở Hà Tây, Sơn
Tây, Huế, Đồng Nai, Tuyên Quang, Hƣng Yên... [1].
Củ dong riềng đƣợc trồng nhiều với giá thành rẻ từ 1.000 – 2.000
đồng/kg. Sau khi chế biến thành bột đao giá vào khoảng 28.000 đồng/kg. Với
nguồn nguyên liệu rẻ này thì giá thành chất kháng sinh đƣợc giảm mạnh đồng
thời đem lại lợi ích kinh tế cho ngành nông nghiệp và vùng trồng dong riềng.
1.2.2. Nguồn cao nấm men
Môi trƣờng lên men sinh tổng hợp vancomycin từ xạ khuẩn đòi hỏi cung
cấp đầy đủ nguồn nitơ vô cơ và nitơ hữu cơ. Trong đó nguồn nitơ vô cơ cho khả
năng sinh chất kháng sinh không cao, còn nguồn nitơ hữu cơ có ảnh hƣởng tốt
đến khả năng sinh tổng hợp chất kháng sinh. Nguồn nitơ hữu cơ cung cấp các
nguồn axit amin quan trọng dễ dàng đi vào chu trình tổng hợp để hình thành nên
mạch heptapeptit, là bộ khung của vancomycin. Trong số các nguồn nitơ hữu cơ
thƣờng sử dụng, cao nấm men cho hiệu quả sinh tổng hợp chất kháng sinh khá
cao. Trong sản xuất vancomycin, thay vì sử dụng trực tiếp cao nấm men, ngƣời
ta có thể tận dụng nấm men bia đƣợc loại bỏ các tạp chất, bã hoa houblon sau đó
cho nấm men tự phân (ủ với men ở 52°C trong 48 giờ) để tạo thành dịch tự phân
có chứa các axit amin. Bổ sung các thành phần khác vào dịch tự phân nấm men,
12

khử trùng để tạo môi trƣờng. Sau khử trùng, dung dịch nói trên có thể dùng làm
môi trƣờng cho lên men sản xuất vancomycin [17, 18].
Tại Việt Nam, hằng năm sản lƣợng bia rất lớn, trong đó hai tổng công ty
Bia – Rƣợu – Nƣớc giải khát Hà Nội và Sài Gòn là những đơn vị sản xuất nhiều
nhất. Cùng với sản lƣợng bia, lƣợng nấm men thải của 2 nhà máy bia này là vô
cùng lớn (cứ sản xuất 10 lít bia thì thải ra khoảng 2-3kg nấm men). Nấm men
bia thải ra chứa chủ yếu tế bào nấm men, một ít bã hoa houblon và một số chất
dinh dƣỡng nhƣ vitamin, protein… Những protein này đƣợc cấu thành từ
khoảng 20 axit amin, trong đó có đầy đủ các axit amin thiết yếu. Ở những nƣớc
có nền công nghiệp phát triển, men bia đã đƣợc sử dụng rộng rãi để làm men
bánh mỳ, thức ăn chăn nuôi và cao nấm men. Men bia đƣợc sử dụng nhƣ là một
chất điều vị trong chế biến thực phẩm hay các chất dinh dƣỡng để bổ sung vào
thành phần nuôi vi sinh vật. Tế bào nấm men tự phân ở 52°C trong 48 giờ tạo ra
dịch tự phân nấm men (yeast autolysis), sau đó cô đặc và sấy khô thành dạng bột
làm cao nấm men (yeast extract). Trong công nghiệp sản xuất vancomycin có
thể sử dụng ngay dịch tự phân nấm men không cần cô đặc, sấy khô sẽ đem lại
hiệu quả kinh tế cao.
1.3. Tối ƣu hóa môi trƣờng
1.3.1. Khái niệm về tối ưu môi trường
Tối ƣu hóa là quá trình xác định cực trị của một hàm hay tìm điều kiện tối
ƣu tƣơng ứng để thực hiện một quá trình cho trƣớc. Trong công nghệ lên men,
quá trình lên men thu hồi một loại sản phẩm nhất định phụ thuộc vào môi trƣờng
nhân giống hoặc môi trƣờng lên men. Môi trƣờng có thể ở dạng lỏng hoặc gel
đƣợc tạo ra để cung cấp dinh dƣỡng cho sự phát triển của vi sinh vật [17]. Đối
với mỗi loại vi sinh vật, nguồn dinh dƣỡng cần thiết cho sự phát triển khác nhau,
nhƣng nhìn chung thành phần môi trƣờng bao gồm một số yếu tố chính nhƣ:
nguồn nitơ, nguồn cacbon và các yếu tố khác nhƣ: các nguyên tố vi lƣợng,
vitamin, các chất cảm ứng… Ngoài ra, để phát triển đƣợc, vi sinh vật cần điều

kiện thích hợp nhƣ: nhiệt độ môi trƣờng, pH môi trƣờng, oxy (hiếu khí, yếm
13


khí)… Việc thay đổi thành phần môi trƣờng và điều kiện lên men có quan hệ
chặt chẽ với hoạt động trao đổi chất của vi sinh vật, dẫn đến thay đổi các sản
phẩm tạo thành [2]. Do đó, việc tối ƣu hóa môi trƣờng lên men trƣớc tiên là tìm
hiểu các nhu cầu dinh dƣỡng, điều kiện lên men phù hợp cho vi sinh vật, sau đó
là xác định các thông số của quá trình sao cho việc thu hồi sản phẩm quan tâm
cao nhất là cao nhất.
1.3.2. Phương pháp bề mặt đáp ứng
Có nhiều phƣơng pháp tối ƣu hóa khác nhau, trong đó phƣơng pháp bề mặt
đáp ứng (RSM-Reponse Surface methodology) là một phƣơng pháp tối ƣu hiệu
quả đƣợc áp dụng rộng rãi trong việc tối ƣu hóa quá trình lên men. Hiện đã có
một số công trình lý thuyết và thực nghiệm cho thấy hiệu quả của RSM ví dụ
nhƣ tối ƣu hóa môi trƣờng sản xuất enzyme, tối ƣu hóa quá trình sinh bào tử và
tạo sinh khối... Các vi sinh vật khi lên men trong môi trƣờng thích hợp và chọn
lọc bằng cách sử dụng RSM sẽ nâng cao năng suất, chất lƣợng sản phẩm để sử
dụng cho các ứng dụng thƣơng mại và công nghiệp [18].
Các nguyên tắc cơ bản của RSM đƣợc quy định trong các báo cáo của Box
và Wilson (1951), Box và Draper (1959), Khuri và Cornell (1996), Myers và
Montgomery (2002). RMS sử dụng kỹ thuật mô hình thống kê thực nghiệm để
phân tích hồi quy đa điểm tập hợp dữ liệu định lƣợng nhận đƣợc từ thiết kế yếu
tố nhằm giải đồng thời các phƣơng trình đa biến. RSM sử dụng một chuỗi các
thí nghiệm đƣợc thiết kế, thƣờng sử dụng thiết kế có 2k yếu tố (k là số biến độc
lập) để có đƣợc một phản ứng tối ƣu. Phƣơng trình tối ƣu đƣợc đƣa ra dựa trên
cơ sở phƣơng trình bậc hai:
Y= β0 + ∑βixi + ∑βiixi2 + ∑βijxj
Trong đó Y là kết quả dự đoán, β0 là hệ số tự do, βi là hệ số bậc một, βii là
hệ số bậc hai và βij là hệ số của từng cặp yếu tố, xi là giá trị đƣợc mã hóa vô

hƣớng của biến đầu vào.
Sự biểu diễn hình học của hàm mục tiêu (Y) dƣới dạng một đƣờng cong,
một mặt phẳng hoặc một mặt siêu phẳng đƣợc gọi là bề mặt đáp ứng, tại đó tất
14


cả các giá trị của hàm mục tiêu ứng với tất cả các giá trị của biến đầu vào và sự
thay đổi giá trị của các biến đầu vào sẽ kéo theo sự thay đổi của hàm mục tiêu.
Ƣu điểm của phƣơng pháp bề mặt đáp ứng là: mang tính thực tế vì số liệu
đƣợc lấy từ thực nghiệm, có thể áp dụng cho bất kỳ hệ thống nào có biến đầu
vào và mục tiêu đầu ra, đánh giá đƣợc tác động đồng thời của các yếu tố ảnh
hƣởng; thực hiện dễ dàng và nhanh chóng. Tuy nhiên phƣơng pháp này chỉ
mang tính gần đúng; phạm vi tác dụng bị giới hạn; mặt đáp ứng sẽ không có giá
trị đối với những vùng khác ngoài dải yếu tố đang nghiên cứu và thiếu việc sử
dụng các nguyên tắc thống kê.
1.4. Phƣơng pháp tách chiết vancomycin
1.4.1. Tách chiết bằng dung môi hữu cơ
Chất kháng sinh đƣợc xạ khuẩn sinh ra có thể nằm trong sinh khối tế bào
hoặc đƣợc tiết ra môi trƣờng nuôi cấy. Khi lên men chủng xạ khuẩn S. orientalis
4912, chất kháng sinh vancomycin đƣợc tiết ra môi trƣờng nuôi cấy, không có
trong sinh khối tế bào. Đây là một đặc điểm rất thuận lợi, vì chúng ta có thể tách
chiết vancomycin một cách triệt để chỉ từ dịch lên men đã loại sinh khối có thể
bằng ly tâm hoặc lọc. Quy trình tách chiết dễ dàng hơn rất nhiều so với tách
chiết từ sinh khối tế bào.
Hiện nay có rất nhiều các phƣơng pháp tách chiết vancomycin đƣợc công
bố trong các bằng sáng chế của Châu Âu cho hiệu quả tách chiết và độ tinh sạch
rất cao đáp ứng đƣợc các tiêu chuẩn dƣợc điển Mỹ. Các phƣơng pháp đƣợc cải
tiến và hoàn thiện qua các năm. Tuy nhiên, các phƣơng pháp này khá phức tạp,
muốn đạt đƣợc kết quả nhƣ thế cần làm đúng quy trình với đúng các hóa chất và
thiết bị đƣợc cung cấp, phải nhập khẩu rất đắt. Để có thể ứng dụng trong sản

xuất kháng sinh ở quy mô lớn, với mục đích giảm giá thành sản phẩm thì cần
quy trình đơn giản với hóa chất có sẵn và rẻ tiền hơn.
Tách chiết kháng sinh bằng cách sử dụng dung môi là phƣơng pháp đơn
giản và thông dụng đƣợc thực hiện nhiều trong các nghiên cứu về tách chiết các
loại kháng sinh. Vancomycin là kháng sinh hòa tan trong nƣớc. Để tách chiết
15