Phân tích trình tự gen mã hóa Flavonol synthase từ cây chè bản địa ở Thái Nguyên (LV thạc sĩ)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

MAI THỊ HUYỀN TRANG

PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ GEN MÃ HÓA
FLAVONOL SYNTHASE TỪ CÂY CHÈ BẢN ĐỊA
Ở THÁI NGUYÊN (Camellia sinensis)

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

THÁI NGUYÊN - 2016


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

MAI THỊ HUYỀN TRANG

PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ GEN MÃ HÓA
FLAVONOL SYNTHASE TỪ CÂY CHÈ BẢN ĐỊA
Ở THÁI NGUYÊN (Camellia sinensis)
Chuyên nghành: Công nghệ Sinh học
Mã số: 60.42.02.01

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Người hướng dẫn khoa học: TS. Hoàng Thị Thu Yến

THÁI NGUYÊN - 2016

i
LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số
liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chưa được ai công bố
trong bất kỳ công trình nào khác. Mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi rõ
nguồn gốc.
Tác giả

Mai Thị Huyền Trang


ii
LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Hoàng Thị Thu Yến
- Giảng viên, phó trưởng khoa - Khoa Khoa học Sự sống - Trường Đại học Khoa
học - người đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm quý
báu để tôi hoàn thành luận văn này.
Tôi xin cảm ơn các thầy cô và tập thể cán bộ phòng thí nghiệm Khoa
Khoa học Sự sống, cảm ơn lãnh đạo Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái
Nguyên và các cán bộ công tác tại Viện Nghiên cứu hệ gen - Viện Hàn lâm
Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã nhiệt tình hướng dẫn tôi trong quá trình
làm đề tài.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Cử nhân Phạm Thị Hằng, TS. Huỳnh Thị
Thu Huệ, Phòng đa dạng sinh học hệ gen, Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn
lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã tận tình chỉ dẫn và giúp đỡ tôi hoàn
thành đề tài nghiên cứu khoa học này.
Nhân dịp này tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS. Dương

Trung Dũng – Khoa Nông học – Trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên đã
giúp đỡ tôi trong thời gian tôi thu thập vật liệu nghiên cứu làm đề tài.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới toàn thể gia đình, bạn bè và
đồng nghiệp đã luôn cổ vũ, động viên tôi trong suốt thời gian qua.
Tác giả

Mai Thị Huyền Trang


iii
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ...........................................................................................................i
LỜI CẢM ƠN.................................................................................................................ii
MỤC LỤC .....................................................................................................................iii
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT .......................................................................................v
DANH MỤC CÁC BẢNG ..........................................................................................vi
DANH MỤC CÁC HÌNH...........................................................................................vii
MỞ ĐẦU........................................................................................................................1
1. Lý do chọn đề tài ........................................................................................................1
2. Mục tiêu nghiên cứu...................................................................................................2
3. Nội dung nghiên cứu ..................................................................................................2
Chương 1: TỔNG QUAN VỀ CÂY CHÈ ...............................................................3
1.1. Giới thiệu chung về cây chè....................................................................................3
1.1.1. Nguồn gốc và phân loại cây chè ........................................................... 3
1.1.2. Đặc điểm sinh học của cây chè ............................................................. 4
1.1.3. Thành phần hóa học của lá chè............................................................................6
1.1.4. Giá trị của cây chè ................................................................................ 7
1.2. Tình hình sản xuất chè trên thế giới và Việt Nam .................................... 9
1.2.1. Tình hình sản xuất chè trên thế giới ...................................................... 9
1.2.2. Tình hình sản xuất chè ở Việt Nam..................................................... 11

1.3. Tình hình nghiên cứu chè trên thế giới và ở Việt Nam.......................................12
1.3.1. Tình hình nghiên cứu chè trên thế giới .............................................................12
1.3.2. Tình hình nghiên cứu chè ở Việt Nam..............................................................13
1.4. Flavonol synthase và con đường sinh tổng hợp polyphenol ở chè ....................14
1.4.1. Polyphenol ở chè ................................................................................................14
1.4.2. Con đường sinh tổng hợp polyphenol ở chè.....................................................16
1.4.3. Flavonol synthase ở chè.....................................................................................17
Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...............................18


iv
2.1. Vật liệu nghiên cứu ...............................................................................................18
2.1.1. Nguyên liệu ........................................................................................ 18
2.1.2. Hóa chất ..............................................................................................................18
2.1.3. Thiết bị ................................................................................................................19
2.2. Phương pháp nghiên cứu ......................................................................................19
2.2.1. Phương pháp tách chiết RNA tổng số...............................................................19
2.2.2. Điện di RNA tổng số..........................................................................................20
2.2.3. Tổng hợp cDNA.................................................................................................20
2.2.4. Nhân gen FLS bằng kỹ thuật PCR ....................................................................21
2.2.5. Tinh sạch sản phẩm PCR...................................................................................23
2.2.6. Tách dòng gen FLS ............................................................................................24
2.2.7. Xác định trình tự gen..........................................................................................27
2.2.8. Xử lý số liệu bằng các phần mềm chuyên dụng...............................................28
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.................................................................29
3.1. Tách RNA tổng số từ các mẫu chè nghiên cứu...................................................29
3.2. Nhân gen mã hóa Flavonol synthase từ các mẫu chè nghiên cứu......................31
3.3. Tạo dòng gen FLS .................................................................................................32
3.4. Xác định và phân tích trình tự gen mã hóa Flavonol synthase...........................34
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................................................41

KẾT LUẬN ..................................................................................................................41
KIẾN NGHỊ..................................................................................................................41
TÀI LIỆU THAM KHẢO...........................................................................................42


v
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

Từ viết tắt

Nghĩa tiếng Việt

Nghĩa tiếng Anh

cDNA

cDNA

Complementary DNA

DNA

Axit Deoxiribonucleic

Deoxyribonucleic Acid

dNTP

dNTP

Deoxynucleoside triphosphate

Đtg

Đồng tác giả

et al.

EDTA

EDTA

Ethylene Diamine Tetraacetic Acid

EST

Đoạn trình tự biểu hiện

Expressed Sequence Tag

EtBr

EtBr

Ethidium Bromide

Kb

Kilô bazơ

Kilo base

LB

Môi trường LB

Luria Bertani

PCR

Phản ứng chuỗi trùng hợp Polymerase Chain Reaction

Primer F

Mồi xuôi

Primer forward

Primer R

Mồi ngược

Primer reverse

RNA

Axit Ribonucleic

Ribonucleic Acid

Rnase

Enzyme phân hủy RNA

Ribonuclease

SDS

SDS

Natri Dodexyl Sulfat

TAE

TAE

Tris Acetate EDTA

Taq

Vi khuẩn chịu nhiệt

Thermus aquaticus

HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao High Performance Liquid Chromatography

FLS

Flavonol synthase

Flavonol synthase


vi
DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Diện tích, năng suất, sản lượng chè trên thế giới giai đoạn
2001- 2010 ..................................................................................... 9
Bảng 1.2. Diện tích, năng suất, sản lượng một số nước trồng chè trên thế
giới năm 2010............................................................................... 10
Bảng 1.3. Tình hình diện tích, năng suất, sản lượng chè ở Việt Nam
trong những năm gần đây ............................................................ 12
Bảng 2.1. Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA......................................................21
Bảng 2.2. Chu trình nhiệt thực hiện phản ứng tổng hợp cDNA................................21
Bảng 2.3. Trình tự các đoạn oligonucleotide sử dụng nhân gen FLS .......................21
Bảng 2.4. Thành phần phản ứng PCR nhân gen FLS ................................................22
Bảng 2.5. Thành phần phản ứng nối đoạn gen FLS với vector pJET 1.2.................24
Bảng 2.6. Thành phần phản ứng ghép nối giữa đoạn gen và vector .........................25
Bảng 2.7. Phản ứng cắt được tiến hành với thành phần.............................................27
Bảng 3.1. Kết quả kiểm tra nồng độ RNA tổng số từ các mẫu chè Trung Du.......30
Bảng 3.2. Sự sai khác trình tự nucleotide gen FLS của chè Trung du xanh
và chè Trung du tím với trình tự đã công bố trên Genbank ........... 38
Bảng 3.3. Sự sai khác trình tự amino acid của FLS với trình tự FLS chè
Trung du xanh và Trung du tím .................................................... 38


vii
DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Một số giống chè trồng tại Thái Nguyên......................................................9
Hình 1.2. Sơ đồ con đường sinh tổng hợp các hợp chất polyphenol ở chè [26] ......16
Hình 2.1. Chu kỳ nhiệt thực hiện phản ứng nhân gen FLS .......................................22
Hình 2.2. Sơ đồ vector tách dòng pJET 1.2 ................................................................24
Hình 3.1. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm tách chiết RNA tổng số .....................30
Hình 3.2. Kết quả PCR nhân gen FLS từ cDNA của hai mẫu chè Trung du xanh
(chè xanh) và chè Trung du tím (chè tím)...................................................................31
Hình 3.3. Hình ảnh điện di tách plasmid của mẫu chè Trung du tím........................32
Hình 3.4. Hình ảnh điện di tách plasmid của mẫu chè xanh......................................33
Hình 3.5. Hình ảnh điện di kiểm tra 4 dòng plasmid .................................................34
Hình 3.6. Kết quả phân tích trình tự gen FLS phân lập từ mẫu chè xanh và
chè tím ......................................................................................................... 37
Hình 3.7. So sánh trình tự amino acid suy diễn của FLS đã công bố (DQ198089.1)
với FLS chè Trung du xanh (FLS CX) và chè Trung du tím (FLS CT)...................40


1
MỞ ĐẦU

1. Lý do chọn đề tài
Chè (Camellia sinensis (L) O. Kuntze) là loại cây công nghiệp lâu năm,
có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới và Á nhiệt đới. Cây chè sinh trưởng và phát
triển tốt trong điều kiện khí hậu nóng ẩm, tập trung chủ yếu ở Châu Á và
Châu Phi. Chè là thứ nước uống tự nhiên lâu đời nhất, được tiêu thụ rộng rãi
với chi phí thấp. Sản phẩm từ cây chè đang được sử dụng rộng rãi trên khắp
thế giới dưới nhiều công dụng khác nhau nhưng phổ biến nhất vẫn là đồ uống.
Uống chè chống được lạnh, khắc phục được sự mệt mỏi của cơ bắp và hệ thần
kinh trung ương, kích thích vỏ đại não làm cho tinh thần minh mẫn sảng
khoái, hưng phấn trong những thời gian lao động căng thẳng cả về trí óc và

chân tay. Lá chè có khả năng chữa được một số bệnh đường ruột như kiết lị,
tiêu chảy (do chứa tamin), lợi tiểu (do chứa theofilin, theobromin), chống lão
hóa. Hơn nữa, còn kích thích tiêu hoá mỡ, chống béo phì, chống sâu răng, hôi
miệng, phòng ngừa ung thư (do chứa catesin), phòng ngừa bệnh tăng huyết
áp, tiểu đường và ngăn ngừa cholesteron tăng cao… Trong chè còn chứa
nhiều loại vitamin như C, B2, PP, K, E, F… và những amino acid cần thiết
cho cơ thể. Ngoài ra, chè còn có khả năng bảo vệ da khỏi tác hại của tia cực
tím, chè cũng được cho là ức chế sự xâm nhiễm và sinh sản của HIV. Hầu hết
các đặc tính có lợi cho sức khỏe được liệt kê ở trên đã được chứng minh là do
các hợp chất polyphenol có trong chè.
Thành phần hóa học chính trong chất rắn chiết xuất từ chè xanh là
polyphenol, thành phần các chất hóa học trong chè đen giống với chè xanh.
Tuy nhiên, hàm lượng của một số hợp chất polyphenol được thay đổi do quá
trình oxi hóa. Hàm lượng polyphenol quyết định đến màu sắc, độ chát của
nước chè và góp phần tạo hương vị của chè. Có rất nhiều các hợp chất
polyphenol được tìm thấy ở chè. Tuy nhiên, tùy vào loại sản phẩm chè mà


2
thành phần hóa học của polyphenol khác nhau, các polyphenol phức tạp được
tạo ra trong quá trình sản xuất từ sự trùng hợp của các polyphenol đơn giản.
Bằng kỹ thuật HPLC đã xác định nhanh chóng một số polyphenol quan trọng
ở chè bao gồm catechin, f1avonols, glycosides flavonol và theaflavins…
Ở Việt Nam, cây chè còn mang lại nhiều lợi ích kinh tế xã hội như: giải
quyết công ăn việc làm, đem lại nguồn thu nhập ổn định cho người dân, thúc
đẩy quá trình công nghiệp hóa và hiện đại hóa nông thôn. Hiện nay, hoạt tính
sinh học và cơ chế tổng hợp polyphenol ở mức độ phân tử được các nhà khoa
học trên thế giới tập trung nghiên cứu, đặc biệt là các gen thực hiện chức năng
tổng hợp polyphenol. Trong đó, Flavonol synthase là enzyme quan trọng
trong cơ chế tổng hợp polyphenol. Ở chè Việt Nam, gen mã hóa Flavonol

synthase vẫn chưa được phân lập. Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi đã tiến
hành thực hiện đề tài: “Phân tích trình tự gen mã hóa Flavonol synthase từ
cây chè bản địa ở Thái Nguyên”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Tạo dòng, xác định và phân tích trình tự gen mã hóa Flavonol synthase
từ cây chè bản địa Thái Nguyên.
3. Nội dung nghiên cứu
+ Tách chiết RNA tổng số từ lá chè của 1 số mẫu nghiên cứu.
+ Nhân gen mã hóa Flavonol synthase bằng kỹ thuật PCR và tạo dòng gen.
+ Xác định và phân tích trình tự gen mã hóa Flavonol synthase.


3
Chương 1
TỔNG QUAN VỀ CÂY CHÈ
1.1. Giới thiệu chung về cây chè
1.1.1. Nguồn gốc và phân loại cây chè
Nguồn gốc cây chè là vấn đề phức tạp, cho đến nay có nhiều quan điểm
khác nhau về nguồn gốc cây chè, dựa trên những cơ sơ về lịch sử, khảo cổ
học và thực vật học. Một số quan điểm được nhiều nhà khoa học công nhận
nhất là:
+ Cây chè có nguồn gốc ở Vân Nam Trung Quốc:
Nhiều công trình nghiên cứu, khảo sát trước đây cho rằng nguồn gốc
của cây chè là ở Vân Nam – Trung Quốc, nơi có khí hậu ẩm ướt và ấm. Theo
các tài liệu Trung Quốc thì cách đây trên 4000 năm, người Trung Quốc đã
biết dùng chè làm dược liệu và sau đó là để uống [35].
Theo Daraselia Gruzia (1989) thì các nhà khoa học Trung Quốc như:
Schenpen, Jaiding, …đã giải thích cây chè mẹ ở Trung Quốc: Tỉnh Vân Nam
là nơi bắt đầu hàng loạt các con sông lớn đổ về các con sông ở Việt Nam,
Lào, Campuchia, Mianma. Đầu tiên cây chè mọc ở Vân Nam, sau đó hạt chè

di chuyển theo đường nước đến các nước nói trên và sau đó lan dần ra các nơi
khác, dọc theo cao nguyên Tây Tạng [7], [11].
+ Cây chè có nguồn gốc ở vùng Atxam (Ấn Độ):
Năm 1823, Bruce đã phát hiện được cây chè dại lá to ở vùng Atxam
(Ấn Độ), từ đó các học giả người Anh cho rằng: Nguyên sản của cây chè là ở
vùng Atxam chứ không phải ở Vân Nam – Trung Quốc [7].
+ Cây chè có nguồn gốc ở Việt Nam:
Những công trình nghiên cứu của Djemukhatze (1961 – 1976) về phức
catechin của lá chè từ các nguồn gốc khác nhau, so sánh về thành phần các chất


4
catechin giữa các loại chè được trồng và chè mọc hoang dại đã nêu lên luận
điểm về sự tiến hóa sinh hóa của cây chè, trên cơ sở đó xác minh nguồn gốc
của cây chè. Djemukhatze đã kết luận rằng những cây chè mọc hoang dại từ cổ
xưa, tổng hợp chủ yếu là (-) - epicatechin galat, ở chúng có khả năng tổng hợp
(-) - epigalocatechin và các galat của nó để tạo (+) galocatechin chậm hơn.
Nghiên cứu các cây chè dại ở Việt Nam cho thấy chủ yếu là tổng hợp (-) –
epicatechin và (-) – epicatechin galat (chiếm 70 % tổng các loại catechin). Khi
di thực các cây chè dại này lên phía Bắc với các điều kiện khí hậu khắc nghiệt
hơn, chúng sẽ thích hợp dần với các điều kiện sinh thái bằng cách có thành
phần catechin phức tạp hơn, cùng với tạo thành (-) epigalocatechin và các galat
của nó. Điều đó có nghĩa là trao đổi chất ở đây hướng về phía tăng cường quá
trình hidroxil hóa và galil hóa. Từ những biến đổi hóa sinh này của các cây chè
dại và cây chè được trồng trọt, chăm sóc cho phép đi tới một kết luận mới là
“Nguồn gốc cây chè chính là ở Việt Nam”. Từ đó có sơ đồ tiến hóa cây chè trên
thế giới: Camellia → Chè Việt Nam → Chè Vân Nam lá to → Chè Trung
Quốc → Chè Assam (Ấn Độ) [7], [11]. Tuy có sự khác nhau nhưng quan điểm
nêu trên đều có sự thống nhất rằng: Cây chè có nguồn gốc từ Châu Á, nơi có
điều kiện khí hậu nóng, ẩm.

1.1.2. Đặc điểm sinh học của cây chè
Đặc điểm hình thái
Thân: Thẳng và tròn, phân nhánh liên tục thành một hệ thống cành và
chồi. Trên thân có mấu chia thành nhiều lóng.
Cành: Do mầm dinh dưỡng biến đổi thành. Trên cành chia ra làm nhiều
đốt, chiều dài đốt cành biến đổi từ 1 - 10 cm tùy theo giống và điều kiện sinh
trưởng. Tùy theo lứa tuổi mà màu sắc cành chè biến đổi từ màu xanh thẫm,
xanh nhạt, màu đỏ, màu nâu và khi cành già có màu xám.
Chồi: Mọc ra từ nách lá, chia theo sự biệt hóa của chồi có chồi dinh
dưỡng mọc ra lá và chồi sinh thực mọc ra nụ, hoa, quả. Chia theo vị trí trên
cành có: Chồi ngọn (đỉnh), chồi nách, chồi ngủ (trong cành).


5
Lá: Lá chè là loại lá hình đơn nguyên, có hệ gân lá rất rõ, rìa lá có răng
cưa, chiều dài từ 4 - 15 cm, rộng từ 2 - 5 cm. Mặt phiến lá có thể nhẵn, lồi
lõm, láng bóng. Hệ gân lá hình mạng lông chim. Lá chè có thể có hình thuôn,
mũi mác, ô van, trứng gà, gần tròn. Gốc lá nhọn, tròn đến tù; chóp lá nhọn tù.
Lá chè thường thay đổi về hình dạng, màu sắc và kích thước tùy theo giống,
điều kiện tự nhiên và điều kiện canh tác. Các độ tuổi khác nhau của lá chè tạo
ra các các sản phẩm chè có chất lượng khác nhau do thành phần hóa học trong
các lá này khác nhau.
Hoa: Hoa chè là loại hoa lưỡng tính, trong hoa có 5 - 8 cánh màu trắng,
có khi lại hơi phớt hồng. Tràng có 5 - 9 cánh màu trắng hay phớt hồng, bộ nhị
đực trung bình có 200 - 300 cái; bao phấn có hai nửa bao, chia 4 túi phấn, hạt
phấn hình tam giác màu vàng nhạt (khi chín màu hoàng kim). Bầu nhị cái có
3 - 4 ô, chứa 3 - 4 noãn, ngoài phủ lớp lông tơ, núm nhị cái chẻ ba. Ở gốc bầu
nhụy có tuyến mật làm thành một vòng tròn gọi là đĩa.
Quả: Quả chè là một loại quả nang có từ 1- 4 hạt. Quả chè có dạng hình
tròn, tam giác, vuông tùy theo số hạt. Khi còn non quả chè có màu xanh, khi

chín chuyển sang màu xanh thẫm hoặc nâu. Khi quả chín vỏ nứt ra giải phóng
các hạt chè. Kích thước của hạt phụ thuộc vào giống, kỹ thuật canh tác. Hạt
chè có khối lượng từ 0,6 - 2g thường từ 1- 1,6g.
Hạt: Hình cầu, bán cầu, tam giác tùy giống chè; vỏ sành thường màu
nâu, cứng, bên trong là lớp vỏ mỏng.
Hệ rễ: Gồm rễ cọc (trụ), rễ dẫn (hay rễ nhánh, rễ bên) màu nâu hay nâu
đỏ và rễ hút hay rễ hấp thụ màu vàng ngà.
Đặc tính sinh lý, sinh thái của cây chè
Nhiệt độ không khí thuận lợi cho sự sinh trưởng và phát triển của chè là
22 - 28oC, độ ẩm không khí tương đối thích hợp là 80 - 85 %. Hàm lượng
nước cần thiết cho cây chè biến động tùy từng giống chè. Loại đất thích hợp
cho trồng chè dày 60 - 100 cm; mực nước ngầm dưới 100 cm; độ chua pH:
4,5 - 5,5; tỷ lệ mùn 3 - 4 %.


6
Sinh trưởng và phát triển của cây chè
Sự phát triển của cây chè chia làm hai chu kỳ: Chu kì phát triển lớn
gồm suốt đời sống cây chè từ khi hạt nảy mầm đến khi cây chết và chu kì phát
triển nhỏ bao gồm các giai đoạn sinh trưởng, phát triển lặp lại nhiều lần trong
một năm.
1.1.3. Thành phần hóa học của lá chè
Cây chè được trồng chủ yếu để lấy búp và lá, do đó thành phần hóa học
của lá chè có liên quan chặt chẽ với quy trình sản xuất và chế biến chè thành
phẩm, gồm chủ yếu là nước, các hợp chất vô cơ và hữu cơ.
Nước là thành phần quan trọng và chủ yếu trong búp chè, chiếm 75 - 80
% khối lượng lá chè, hàm lượng phụ thuộc vào giống chè, thời vụ và độ non
già của lá chè. Nước trong nguyên liệu chè tham gia trực tiếp vào nhiều phản
ứng thủy phân, oxi hóa khử, liên quan trực tiếp đến các quá trình hóa sinh
trong búp chè và có ảnh hưởng đến sự hoạt động của các enzyme.Trong chế

biến chè, nước có vai trò quan trọng trong các quá trình biến đổi, tạo nên mùi
vị và ngoại hình của búp chè, nó có liên quan trực tiếp đến chất lượng chè
nguyên liệu và chất lượng chè thành phẩm.
Chất khô chiếm 18 - 25 % khối lượng lá chè, gồm có các polyphenol,
pectin, chất xơ (xenlulo), protein, amino acid, các alcoloit (cafein, theofilin,
theobromin), các enzyme (enzyme oxi hóa và enzyme thủy phân) và chất tro.
Các hợp chất polyphenol chiếm 28 - 37 % chất khô, nó quyết định tính
chất, chất lượng chè tươi và sản phẩm. Polyphenol tạo màu, mùi, vị cho chè,
có vị chát đắng dưới tác dụng của enzyme thủy phân có trong nước bọt. Hợp
chất polyphenol trong chè là thành phần quan trọng được xúc tác bởi enzyme
polyphenol oxidase có trong lá chè, nó có tính chất quyết định đến màu sắc
nước pha, hương thơm và vị chát của chè (các polyphenol chứa 70% là các
dạng catechin) [33].


7
Hợp chất alkaloid: trong chè có nhiều loại nhưng nhiều nhất vẫn là loại
cafein. Hàm lượng cafein trong chè chiếm từ 3 - 5% chất khô. Hàm lượng
cafein trong chè thay đổi phụ thuộc vào giống, kỹ thuật canh tác, mùa vụ thu
hái và thay đổi theo bộ phận của cây.
Protein và amino acid: là hợp chất phức tạp có chứa N, phân bố không
đều ở phần búp chè và thay đổi tùy theo giống và thời vụ, điều kiện canh tác
và các yếu tố khác. Protein có thể kết hợp trực tiếp với tanin, polyphenol tạo
nên những phẩm chất chè Thái Nguyên đen. Do đặc điểm của của việc chế
biến chè xanh là dệt men ngay từ đầu, nên hàm hượng tanin bị thay đổi và còn
quá cao làm cho chè có vị đắng. Protein kết hợp với một phần tanin làm cho
có vị chát và đắng giảm đi. Vì thế trong một trừng mực nào đó, protein có lợi
cho phẩm chất chè xanh.
Ngoài ra, trong chè còn có các amino acid, gluxit và pectin, dầu thơm,
các loại vitamin trong chè, các enzyme, chất tro…

1.1.4. Giá trị của cây chè
Cây chè là loại cây công nghiệp lâu năm, mau cho sản phẩm, cho hiệu
quả kinh tế cao, có đời sống kinh tế lâu dài. Chè trồng một lần, có thể thu
hoạch 30 - 40 năm hoặc lâu hơn nữa. Chè được dùng làm nước uống từ thời
xa xưa, đến nay đã trở thành một thức uống lý tưởng được nhân dân trên thế
giới ưa dùng. Có giá trị về nhiều mặt như: Thực phẩm, dược liệu, kinh tế xã
hội, văn hóa…
Giá trị về mặt thực phẩm: Trong chè có các thành phần hóa học giàu
chất dinh dưỡng, có tác dụng tốt đối với cơ thể con người như hỗn hợp tanin
chè có khả năng giải khát, chữa một số bệnh đường ruột (tả lỵ, thương hàn),
các loại protein, vitamin, muối khoáng… Cafein và một số alkanoit khác là
chất có thể kích thích hệ thần kinh trung ương, vỏ cầu đại não, giúp tăng
cường sự hoạt động của cơ thể, giảm mệt nhọc [34].


8
Giá trị y học: Nước chè tươi còn giảm được các quá trình viêm như
viêm khớp, viêm gan mãn tính, tăng cường tính đàn hồi của thành mạch máu.
Uống chè giảm nguy cơ tim mạch, chống lão hóa, chống nhiễm độc. Mới đây
nhất, các nhà khoa học còn phát hiện ra chè còn có tác dụng chống khả năng
gây ung thư của các chất phóng xạ. Người ta đã trích ly các chất trong chè để
điều chế các thuốc trợ tim, cầm máu, lợi tiểu… Những giá trị tiềm ẩn của cây
chè vẫn còn đang được quan tâm nghiên cứu [34].
Giá trị về mặt kinh tế xã hội: Cây chè giữ vai trò quan trọng trong cơ
cấu cây trồng nông nghiệp, sản phẩm chè là mặt hàng xuất khẩu quan trọng
của ngành nông nghiệp Việt Nam. Sản xuất chè đã góp phần tạo công ăn việc
làm, xóa đói giảm nghèo, tạo nguồn thu nhập ổn định cho người dân và thúc
đẩy quá trình công nghiệp hóa, hiện đại hóa nông thôn, nhất là vùng Trung du
và miền núi [34].
Ngoài ra, trồng chè còn giúp phủ xanh đất trống đồi trọc, chống sói

mòn đất, bảo vệ môi trường…
Giá trị về mặt văn hóa: Lá chè được sử dụng không chỉ để chế biến
thức uống phục vụ nhu cầu của con người, mà từ lâu chè thành phẩm đã trở
thành nét văn hóa đặc trưng của nhiều quốc gia. Uống chè là nét văn hóa lâu
đời của người Việt Nam, mang một giá trị thiêng liêng, cao quý trong đời
sống tinh thần của con người. Thưởng thức chè là một thú vui tao nhã, tạo
được cảm hứng trong văn thơ, hội họa… Ở Việt Nam chè không thể thiếu
trong lễ nghi giao tiếp, giáo dục, cưới xin, ma chay, hội hè.


9

Hình 1.1. Một số giống chè trồng tại Thái Nguyên
1.2. Tình hình sản xuất chè trên thế giới và Việt Nam
1.2.1. Tình hình sản xuất chè trên thế giới
Cây chè sinh trưởng và phát triển tốt trong điều kiện nóng ẩm, tập trung
chủ yếu ở Châu Á và Châu Phi, tuy nhiên ngày nay chè được trồng phổ biến ở
58 quốc gia với quy mô khác nhau, phân bố rộng khắp 5 Châu. Nhu cầu về
mặt hàng chè thành phẩm cao cấp ngày càng tăng vì vậy sản xuất chè trên thế
giới tăng nhanh cả về diện tích, năng suất và sản lượng.
Bảng 1.1. Diện tích, năng suất, sản lượng chè trên thế giới giai đoạn 2001- 2010
Năm

Diện tích (ha)

Năng suất (Tạ khô/ ha)

Sản lượng (Tấn khô)

2001

2.395.093

12.928

3.096.274

2002

2.448.862

13.039

3.192.978

2003

2.449.723

13.035

3.258.426

2004

2.578.977

13.380

3.450.569

2005

2.686.924

13.624

3.660.637

2006

2.738.701

13.524

3.703.751

2007

2.905.768

13.678

3.974.514

2008

2.967.935

14.190

4.211.397

2009

2.997.607

14.152

4.242.280

2010

3.123.561

14.464

4.518.060

Nguồn: http:// FAOSTAT.FAO.ORG (23/02/2012)


10
Từ bảng 1.1 trên ta thấy: diện tích, năng suất, sản lượng chè trên thế giới
đạt 10 năm qua tăng đều, đến năm 2010 diện tích chè trên thế giới đã đạt
3.123.561 ha, năng suất đạt 14,464 tạ khô/ha, sản lượng đạt 4.242.280 tấn chè
búp khô.

Bảng 1.2. Diện tích, năng suất, sản lượng một số nước trồng chè
trên thế giới năm 2010

STT

Nước

Xuất khẩu

Diện tích

Năng suất

Sản lượng

(ha)

(tạ khô/ha)

(tấn khô)

1.419.530

10,338

1.467.467

305.352

năm 2009
(tấn)

1

Trung Quốc

2

Ân Ðộ

583.000

17,001

991.180

203.863

3

Srilanca

218.300

12,932

282.300

228.528

4

Kênia

171.900

23,211

399.000

331.594

5

Việt nam

113.200

17,532

198.466

82.416

3.123.561

14,464

4.518.060

1.774.815

Toàn thế giới

Nguồn: http:// FAOSTAT.FAO.ORG (23/02/2012)
Từ bảng số liệu trên, ta thấy mặc dù có tới 58 quốc gia trồng chè trên
thế giới, nhưng sản suất chè chỉ tập trung ở một số nước như Trung Quốc, Ấn
Độ, Srilanca, Kênia và Việt Nam, trong đó:
Trung quốc là quốc gia đứng đầu thế giới về diện tích đạt 1.419.530 ha,
chiếm 45,45% diện tích chè thế giới, tuy năng suất chè của Trung Quốc
không cao, chỉ đạt 10.338 tạ khô/ha, nhưng do diện tích cao nên sản lượng
chè của Trung Quốc vẫn đứng đầu thế giới đạt 1.467.467 tấn, chiếm 32,48 %
sản lượng chè thế giới.
Ấn Độ đứng thứ 2 về diện tích chè, đạt 583.000 ha, chiếm 17,22 % diện
tích thế giới, năng suất đạt 17.001 tạ/ha, sản lượng đứng thứ 2 sau Trung
Quốc, đạt 991.180 tấn, chiếm 21,94 % sản lượng chè thế giới.


11
Srilanca đứng thứ 3 trên thế giới về diện tích 218.300 ha, sản lượng đạt
282.300 tấn.
Kênia là nước đứng thứ 4 về diện tích chè đạt 171.900 tấn, nhưng lại là
nước có năng suất chè cao nhất, chiếm 8,83 % sản lượng chè toàn thế giới.
Việt Nam có diện tích trồng chè đứng thứ 5 trên thế giới nhưng về năng
suất lại đứng thứ 2 (17.532 tạ khô/ha) chỉ sau Kênia. Tuy nhiên về xuất khẩu,
nước ta chỉ đạt 82.416 tấn (đứng thứ 8).
1.2.2. Tình hình sản xuất chè ở Việt Nam
Tại Việt Nam, cây chè và sản phẩm chè đã được người dân sản xuất, chế
biến và sử dụng từ rất lâu. Theo Nguyễn Ngọc Kính, lịch sử của ngành sản xuất
chè Việt Nam có thể chia làm 3 giai đoạn:
Giai đoạn từ 1890 đến 1945: giai đoạn nền móng, sơ khai của ngành
sản xuất chè, những đồn điền đầu tiên được thiết lập. Năm 1938 diện tích

trồng chè là 13 nghìn ha, sản lượng đạt 6100 tấn chè khô.
Giai đoạn 1945 đến 1954: do ảnh hưởng của chiến tranh, ngành sản
xuất chè suy giảm rõ rệt, tổng sản lượng chè khô năm 1946 chỉ đạt 300 tấn.
Giai đoạn từ năm 1954 đến nay: giai đoạn phát triển không ngừng của
ngành chè, không chỉ đáp ứng nhu cầu nội địa mà còn hướng tới xuất khẩu.
Năm 2013 tổng sản lượng chè xuất khẩu của cả nước đạt 145 nghìn tấn.
Hiện nay chè được trồng ở trên 35 tỉnh thành trong cả nước, tập trung
chủ yếu ở các tỉnh phía Bắc (cả về diện tích và sản lượng). Với lợi thế về
giống, đất đai và nguồn lao động, chè được xác định là ngành kinh tế chủ đạo
các tỉnh trung du và miền núi nước ta.
Phát triển cây chè ở nước ta là một trong 10 chương trình trọng điểm về
phát triển nông nghiệp nông thôn. Đến nay, cây chè được xác định là cây có
giá trị kinh tế cao, thực sự là cây trồng mũi nhọn, có tầm quan trọng trong
chiến lược phát triển kinh tế, xã hội của vùng trung du và miền núi phía Bắc


12
và Tây Nguyên. Tình hình sản xuất chè ở Việt Nam trong những năm gần đây
được thể hiện ở bảng 1.3.

Bảng 1.3. Tình hình diện tích, năng suất, sản lượng chè ở Việt
Nam trong những năm gần đây
Năm

Diện tích

Năng suất

Sản lượng

Xuất khẩu

(1000 ha)

(Tạ khô/ha)

(1000 tấn)

(1000 tấn)

2005

70,30

9,90

69,90

55,60

2006

80,00

9,46

75,70

67,90

2007

98,00

9,61

94,20

74,80

2008

99,00

9,54

94,50

62,00

2009

102,00

9,51

97,00

95,00

Nhờ sự đổi mới về nhiều mặt của ngành chè, tiến hành lai tạo, tuyển
chọn những giống chè mới có triển vọng về năng suất và chất lượng, áp dụng
tốt quy trình sản xuất. Hiện nay, nước ta là một trong 10 quốc gia đứng đầu
thế giới về diện tích và sản lượng chè, đứng thứ 8 về xuất khẩu. Cả nước ta có
34 tỉnh thành phố sản xuất chè với tổng diện tích là 120.000 ha, tổng sản
phẩm chè chế biến hàng năm trên 120 nghìn tấn. Nhìn chung, diện tích trồng
chè, sản lượng và mức suất khẩu chè nước ta đều tăng đáng kể qua các năm.
Điều đó nói lên phần nào triển vọng lớn, mở ra nhiều cơ hội phát triển ngành
chè Việt Nam.
1.3. Tình hình nghiên cứu chè trên thế giới và ở Việt Nam
1.3.1. Tình hình nghiên cứu chè trên thế giới
Trung Quốc là quốc gia sản xuất chè hàng đầu thế giới, các nhà khoa
học Trung Quốc đã nghiên cứu và sử dụng giống chè tốt trong sản xuất từ rất
sớm. Ngoài những giống chè nổi tiếng từ lâu đời, hiện nay Trung Quốc có
nhiều giống chè cho năng suất cao, chất lượng tốt để chế biến cả chè xanh và


13
chè đen như: Phúc Vân Tiên, Hoa Nhật Kim, Hùng Đỉnh Bạch (Phúc Kiến),
Phú Thọ 10...
Ấn Độ là quốc gia đứng đầu thế giới về sản lượng chè do rất quan tâm
nghiên cứu triển khai các giống tốt vào sản xuất.
Công tác chọn dòng chè, kết hợp chọn dòng có sản lượng cao và có khả
năng chống hạn, chống bệnh rất được chú ý ở Srilanca.Nhờ đó đã tạo được các
giống nổi tiếng như TRI777, TRI2043. Trong những năm 1950, 1960 Srilanca đã
chọn ra các dòng chè có triển vọng như: TRI14, DT, DN, DP và DV.
Nhật Bản đặc biệt quan tâm chú ý đến nghiên cứu chọn dòng, nhiều giống
chè mới và cho năng suất cao đã được đưa vào sản xuất. Trong đó có giống
Yabukita được trồng phổ biến nhất chiếm tới 70% diện tích chè ở Nhật Bản.
Ngày nay, để có được các giống chè cho năng suất cao thì việc áp dụng

các tiến bộ khoa học kỹ thuật vào quá trình sản xuất chè luôn được chú trọng
đầu tư. Bên cạnh đó, các nhà khoa học cũng bắt đầu tập trung nghiên cứu sâu
hơn về cây chè ở mức độ phân tử. Kích thước genome của chè lớn, khoảng 4
Gb. Do thiếu sự hiểu biết về nuôi cấy mô cũng như quá trình dịch mã xảy ra ở
chè nên rất ít các thông tin về trình tự genome được biết đến. Đến năm 2010,
chỉ có 819 trình tự nucleotide, 12.664 đoạn trình tự biểu hiện (Expressed
Sequence Tags - EST), 1 giả thuyết về trình tự genome và 478 protein từ chè
được công bố trên ngân hàng Genbank.
1.3.2. Tình hình nghiên cứu chè ở Việt Nam
Ở nước ta, cây chè đang được coi là cây trồng chủ lực góp phần xóa đói
giảm nghèo cho vùng sâu, vùng xa, vùng núi cao. Qua nhập nội, lai tạo, trong
những năm gần đây nước đã tạo được nhiều giống chè mới đem lại hiệu quả
kinh tế cao, trong đó có các giống chè Shan. Ở Việt Nam, chè Shan được quan
tâm nghiên cứu từ rất lâu, đã khẳng định được vai trò của sự phát triển của cây
chè Shan đối với phát triển kinh tế xã hội vùng núi phía Bắc Việt Nam.


14
Năm 1923 khi nghiên cứu tập đoàn giống chè nhập nội, Dupasquier cho
rằng hai giống chè: Manipur và Assamica thích hợp và có khả năng sinh
trưởng, phát triển tốt ở Việt Nam. Năm 1931, trạm nghiên cứu chè Bảo Lộc đã
tiếp nhận một số giống chè Shan ở Phú Hộ và chọn được hai giống chè tốt là
TB11 và TB14.
Qua nhiều năm nghiên cứu, Viện nghiên cứu chè đã ứng dụng thống kê
sinh học qua phân tích tương quan dựa vào đặc trưng hình thái kết hợp với
xem xét các đặc điểm phát triển bộ rễ, sinh trưởng sinh thực, màu sắc lá, sâu
bệnh,khả năng giâm cành… để chọn nhanh các loại chè có triển vọng khi cây
chè 2 - 3 tuổi. Tại trung tâm nghiên cứu phát triển chè – Viện KHKT Nông
lâm nghiệp miền núi phía Bắc, bằng phương pháp gây đột biến bằng bức xạ
đã chọn được một số cá thế chè sinh trưởng và phát triển tốt. Ngoài ra, Viện

còn sử dụng Consixin xử lý trên mầm chè giống PH1 trong thời gian 24 – 48h
với nồng độ 0,2% cũng đã thu được kết quả bước đầu. Ngoài ra, các nhà khoa
học đã tiến hành nghiên cứu nhân giống bằng phương pháp nhân vô tính từ rất
sớm như ghép, giâm cành và đã thu được những kết quả tốt [2].
Hiện nay, ở Việt Nam có rất nhiều công trình nghiên cứu về cây chè được
đề xuất, triển khai có hiệu quả, góp phần không nhỏ vào việc nâng cao sản lượng
và chất lượng chè thành phẩm. Giúp cho ngành chế biến và sản xuất chè ở Việt
Nam ngày càng có thương hiệu, đáp ứng được yêu cầu của thị trường.
1.4. Flavonol synthase và con đường sinh tổng hợp polyphenol ở chè
1.4.1. Polyphenol ở chè
Theo thống kê của Harbowy (1997), thành phần hóa học chính trong
chất rắn chiết xuất từ chè xanh là polyphenol, chiếm 30-40% trọng lượng,
tiếp theo là các hợp chất chứa N có khoảng 15% bao gồm caffein (khoảng 25%), protein (6%) và các amino acid (5%). Điều đặc biệt là ngoài các amino
acid phổ biến, theanine là amino acid chỉ có ở trong chè chiếm đến 3% trọng
lượng. Thành phần hydratcacbon ở chè có khoảng 11% bao gồm các
polysaccharide, pectin và các gốc đường tự do. Ở chè có khoảng 3-4% lipit,


15
tuy nhiên khả năng hòa tan của lipit vào dịch chiết xuất là thấp hơn. Ngoài ra,
trong chè còn có axit hữu cơ, các vitamin, muối khoáng, các sắc tố như
chlorophyll, caroten… đặc biệt là tinh dầu và các hợp chất dễ bay hơi liên
quan đến tạo hương vị trong chế biến chè chỉ chiếm một phần rất nhỏ. Thành
phần các chất hóa học trong chè đen giống với chè xanh. Tuy nhiên, hàm
lượng của một số hợp chất polyphenol được thay đổi do quá trình oxi hóa,
thành phần chính của polyphenol trong lá chè bao gồm Flavan-3-ols
(catechin); flavonol và glycosides; anthocyanins, leucoanthocyanidin...
Hàm lượng polyphenol quyết định đến màu sắc, độ chát của nước chè
và góp phần tạo hương vị của chè. Hầu hết các đặc tính có lợi cho sức khỏe
của chè đã được chứng minh là do các hợp chất polyphenol. Vai trò của

polyphenol là chất chống oxy hóa được biết đến và đang được nghiên cứu
như các tác nhân có thể làm giảm yếu tố nguy cơ liên quan đến bệnh ung thư
và bệnh tim. Có rất nhiều các hợp chất polyphenol được tìm thấy ở chè. Tuy
nhiên, tùy vào loại sản phẩm chè mà thành phần hóa học của polyphenol khác
nhau, các polyphenol phức tạp được tạo ra trong quá trình sản xuất từ sự
trùng hợp của các polyphenol đơn giản. Ở chè xanh chứa cả polyphenol đơn
giản và phức tạp, trong đó Flavonoid là thành phần polyphenol chủ yếu, được
tổng hợp từ các polyphenol đơn giản và là đại diện cho các hợp chất chứa
khoảng 15 nguyên tử C. Hàm lượng catechin (30%) và flavonol (0,2-5%) là
các hợp chất chính của flavonoid. Các polyphenol ở chè đen cũng có các
thành phần như chè xanh. Ngoài ra, chè đen có polyphenol chứa khoảng 30
nguyên từ C, được tạo thành do sự trùng hợp của các polyphenol có trong chè
xanh (theaflavin và thearubigin). Bằng kỹ thuật HPLC đã xác định nhanh
chóng một số polyphenol quan trọng ở chè bao gồm catechin, f1avonols,
glycosidesflavonol và theaflavins…[21].
1.4.2. Con đường sinh tổng hợp polyphenol ở chè
Việc nghiên cứu phân tích đặc tính phân tử của các gen liên quan đến các
quá sinh học của chè luôn được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu (Hình


16
1.2). Tuy nhiên, hầu hết các nghiên cứu đều tập trung vào các gen liên quan đến
con đường sinh tổng hợp các hợp chất polyphenol ở chè [17], [19], [22], [25],
[29], [30], [31], [32]. Hàm lượng catechin (30%) và flavonol (0,2-5%) là các hợp
chất chủ yếu của polyphenol. Con đường sinh tổng hợp các chất này còn có tên
là con đường Flavonoid (Hình 1.3) đã được nghiên cứu ở Arabidopsis thaiana,
Petunia hybrida [21], [28] và ở chè Camellia sinenis [26].

Hình 1.2. Sơ đồ con đường sinh tổng hợp các hợp chất
polyphenol ở chè [26]

ANR (anthocyanidin reductase); ANS (anthocyanin synthase); 4CL (4coumarate : CoA ligase); C4H (cinnamate 4-hydroxylase); CHI (chalcone
isomerase); CHS (chalcone synthase); DFR (dihydroflavonol reductase); F3H
(flavanone 3β-hydroxylase); F3′H (flavonoid 3′-hydroxylase); F3′5′H
(flavonoid

3′5′-hydroxylase);

FLS

(flavonol

synthase);

LAR

(leuacoanthocyanidin reductase); PAL (phenylalanine ammonialyase); UFGT
(UDP-glucoseflavonoid 3-O-glucosyl transferase).
Nhiều gen mã hóa cho các enzyme tham gia vào con đường flavonoid
đã được nghiên cứu tạo dòng và xác định trình tự ở chè như FLS [24]);