Tinh sạch các hợp chất thứ cấp có hoạt tính kháng nấm từ chủng Bacillus phân lập ở Việt Nam (LV thạc sĩ)

i

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

LÝ THỊ BÍCH HẠNH

TINH SẠCH CÁC HỢP CHẤT THỨ CẤP
CÓ HOẠT TÍNH KHÁNG NẤM TỪ CHỦNG BACILLUS
PHÂN LẬP Ở VIỆT NAM

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số: 60 42 02 01

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. Đỗ Thị Tuyên

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




ii

THÁI NGUYÊN - 2015
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan các kết quả nghiên cứu dƣới đây là do tôi và nhóm
cộng sự nghiên cứu tại phòng Công nghệ sinh học enzyme – Viện Công nghệ
sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam thực hiện từ
tháng 5 năm 2014 đến tháng 5 năm 2015.

Thái Nguyên, ngày 06 tháng 11 năm 2015
Học viên

Lý Thị Bích Hạnh

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




iii

LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận văn này, tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới TS.
Đỗ Thị Tuyên, Phó trƣởng phòng Công nghệ sinh học Enzyme, Viện Công
nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công Nghệ Việt Nam đã định
hƣớng nghiên cứu, sửa luận văn và tạo mọi điều kiện về hóa chất, thiết bị,
thời gian cho tôi trong quá trình thực hiện đề tài này.
Tôi xin cảm ơn các anh chị cán bộ Phòng Công nghệ sinh học enzyme,
Viện Công nghệ sinh học đã chỉ bảo, giúp đỡ tận tình cho tôi trong quá trình
nghiên cứu cũng nhƣ chia sẻ những kinh nghiệm chuyên môn.
Tôi xin cảm ơn PGS.TS. Nguyễn Vũ Thanh Thanh các thầy cô giáo tại
trƣờng Đại Học Khoa học, Đại học Thái Nguyên, các thầy cô trong Viện
Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo
điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập.
Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình bạn bè đã giúp
đỡ, tạo điều kiện, động viên tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận
văn này.
Hà Nội, Tháng 5 năm 2015
Học viên

Lý Thị Bích Hạnh

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




iv

BẢNG CHỮ VIẾT TẮT
APS

Ammonium presulphate

AFC

Antifungal compound

B. subtilis

Bacillus subtilis

BCF

Biological Control Fungi

CFU

Connoly-Forming unit

DEAE-cellulose

Dimethylaminoethyl-cellulose

ĐC

Đối chứng

F. oxysporum

Fusarium oxysporum

kDa

Kilo Dalton

LB

Luria – Bertani

PDA

Potato Dextrose agar

M

Marker

MIC

Minimal Inhibitory Concentration

FTIR

Fourirer ransform infrared spectroscopy

TLC

Thin Layer Chromatography

Pr

Protein

R. solani

Rhizoctonia solani

SDS

Sodium doecyl sulfate

TB

Trung bình

TEMED

N, N, N’, N’, - Tetramethyl ethylene diamine

TN

Thí nghiệm

v/v

Volume/volume (thể tích/ thể tích)

w/v

Weight/volume (khối lƣợng/thể tích)

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




v

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN .............................................................................................. i
LỜI CẢM ƠN .................................................................................................. iii
BẢNG CHỮ VIẾT TẮT .................................................................................. iv
MỤC LỤC ......................................................................................................... v
DANH MỤC HÌNH ........................................................................................ vii
DANH MỤC BẢNG ....................................................................................... vii
MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1
1. Lí do chọn đề tài ............................................................................................ 1
2. Mục tiêu của đề tài ........................................................................................ 2

3. Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 2
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 3
1.1. Khái quát về chất đối kháng sinh trƣởng nấm .......................................... 3
1.2. Vai trò của vi khuẩn B. subtilis trong kiểm soát sinh học ......................... 5
1.2.1. Đại cƣơng về vi khuẩn B. subtilis ........................................................... 5
1.2.2. Nghiên cứu các hợp chất có hoạt tính kháng nấm .................................. 6
1.3. Tình hình nghiên cứu các chế phẩm sinh học phòng trừ nấm trên thế giới ... 8
1.4. Tình hình nghiên cứu các chế phẩm sinh học phòng trừ nấm tại Việt Nam .....13
CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ............................................ 16
2.1. Vật liệu và hóa chất .................................................................................. 16
2.1.1. Chủng giống .......................................................................................... 16
2.1.2. Hóa chất................................................................................................. 16
2.1.3. Các loại đệm và dung dịch .................................................................... 16
2.1.4. Môi trƣờng ............................................................................................ 17
2.1.5. Thiết bị thí nghiệm ................................................................................ 18
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu.......................................................................... 18
2.2.1. Phƣơng pháp nuôi cấy vi sinh và thu nhận dịch ngoại bào .................. 18
2.2.2. Phƣơng pháp đánh giá hoạt tính ức chế sinh trƣởng nấm..................... 19
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




vi

2.2.3. Thử hoạt tính kháng nấm bằng khoanh giấy lọc ................................... 20
2.2.4. Phƣơng pháp tủa muối amonium sulfate .............................................. 20
2.2.5. Phƣơng pháp sắc ký trao đổi ion DEAE-cellulose ............................... 20
2.2.6. Phƣơng pháp sắc ký lọc gel Biogel P100.............................................. 21
2.2.7. Xác định hàm lƣợng protein tổng số ..................................................... 23

2.2.8. Điện di SDS - PAGE ............................................................................. 23
2.2.9. Đánh giá tính chất lý hóa của protein tinh sạch .................................... 25
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 27
3.1. Hoạt tính ức chế nấm của dịch lọc ngoại bào chủng B. subtilis AS ........ 27
3.1.1. Hoạt tính ức chế của dịch lọc ngoại bào đối với nấm F. oxysporum.... 27
3.1.2. Hoạt tính ức chế của dịch lọc ngoại bào đối với nấm R. solani ........... 29
3.2. Tinh sạch protein có hoạt tính kháng nấm ............................................... 31
3.2.1. Tủa protein bằng muối amonium sulfate .............................................. 31
3.2.1. Tinh sạch qua cột sắc ký trao đổi ion DEAE – cellulose ..................... 31
3.2.2. Tinh sạch protein có hoạt tính kháng nấm qua sắc ký lọc gel Biogel P100 ..35
3.3. Đánh giá tính chất của protein tinh sạch .................................................. 39
3.3.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ ........................................................................ 40
3.3.2. Ảnh hƣởng của proteinase K................................................................. 41
3.3.3. Khả năng ức chế sợi bào tử nấm ........................................................... 43
3.3.4. Hoạt tính nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của protein với nấm R.solani
và F. oxysporum .............................................................................................. 45
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................... 48
1. Kết luận ....................................................................................................... 48
2. Đề nghị ........................................................................................................ 48
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 49
PHỤ LỤC

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




vii

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Hình thái khuẩn lạc chủng B.subtilis AS trên môi trƣờng PDA ....... 5
Hình 2.1. Quy trình tinh sạch protein kháng nấm từ chủng B. subtilis AS .... 22
Hình 2.2. Đƣờng chuẩn Brardford .................................................................. 23
Hình 3.1. Hoạt tính ức chế của dịch lọc ngoại bào chủng B. subtilis AS đối
với nấm F. oxysporum sau 5 ngày. ................................................................. 28
Hình 3.2. Hoạt tính ức chế nấm của dịch lọc ngoại bào chủng B. subtilis AS
đối với nấm R. solani sau 3 ngày. ................................................................... 30
Hình 3.3. Sắc ký đồ các phân đoạn qua cột sắc ký trao đổi ion DEAEcellulose ........................................................................................................... 32
Hình 3.4. Điện di đồ các phân đoạn protein tinh sạch qua cột DEAE –
celulose ........................................................................................................... 33
Hình 3.5. Hoạt tính kháng nấm F. oxysporum (A, D) và R. solani (B, C)
...................................................................................................34_Toc434515732
Hình 3.6. Sắc ký đồ các phân đoạn proteintinh sạch có hoạt tính kháng nấm
sau khi qua cột Biogel P100 ............................................................................ 36
Hình 3.7. Điện di đồ các phân đoạn protein có hoạt tính kháng nấm qua cột
Biogel P100 ..................................................................................................... 36
Hình 3.8. Các phân đoạn protein tinh sạch có hoạt tính kháng nấm qua cột
Biogel P100,. .................................................................................................. 38
Hình 3.9. Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên hoạt tính kháng nấm F. oxysporum (A) ......40
Hình 3.10. Ảnh hƣởng của proteinase K đến hoạt tính kháng nấm F. oxysporum
(A) và nấm R. solani (B) .................................................................................. 42
Hình 3.11. Khả năng ức chế sự nảy mầm bào tử F. oxysporum của protein
tinh sạch từ chủng B. subtilis AS. ................................................................... 44
Hình 3.12. Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của protein tinh sạch từ chủng B.
subtilis AS lên hoạt tính kháng nấm F. oxysporum ........................................ 45
Hình 3.13. Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của protein tinh sạch từ chủng B.
subtilis AS lên hoạt tính kháng nấm nấm R. solani. ....................................... 46

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

viii

DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Thành phần các loại đệm và dung dịch .......................................... 17
Bảng 2.2. Thành phần môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật .................................. 17
Bảng 2.3. Danh sách các thiết bị thí nghiệm đƣợc sử dụng ............................ 18
Bảng 2.4. Thành phần gel cô và gel tách ........................................................ 24
Bảng 3.1. Ảnh hƣởng của nồng độ dịch lọc tế bào B. subtilis AS lên sinh
trƣởng của F. oxysporum ................................................................................ 28
Bảng 3.2. Ảnh hƣởng của nồng độ dịch lọc tế bào B. subtilis AS lên sinh
trƣởng của nấm R. solani ................................................................................ 29
Bảng 3.3. Tóm tắt quá trình tinh sạch protein kháng nấm từ chủng B. subtillis
AS qua các bƣớc tinh sạch .............................................................................. 39

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




1

MỞ ĐẦU
1. Lí do chọn đề tài
Hàng năm, các bệnh cây trồng đã gây ra những tổn thất to lớn cho sản
xuất nông nghiệp. Theo tổ chức nông lƣơng liên hợp quốc (FAO, 2004), thiệt
hại trong nông nghiệp do các bệnh vi nấm gây ra đến 537,3 triệu tấn các loại
nông sản chủ yếu, chiếm khoảng 11,6% tổng sản lƣợng nông nghiệp trên thế

giới. Trong đó chiếm 83% là bệnh do vi nấm gây ra, chủ yếu là các bệnh nhƣ:
đạo ôn, khô vằn, thối cổ rễ, mốc sƣơng… đặc biệt bệnh do nấm Fusarium và
Rhizoctonia gây ra chiếm tỉ lệ tƣơng đối lớn.
Hiện nay, các biện pháp hóa học vẫn đƣợc sử dụng rất phổ biến và rộng
rãi với một lƣợng rất lớn vì nó mang lại hiệu quả phòng trừ cao, rẻ tiền. Tuy
nhiên bên cạnh đó, nó cũng gây ra những tác hại rất to lớn đến môi trƣờng và
sức khỏe con ngƣời, tạo ra sự kháng thuốc với nhiều loại bệnh hại. Vì vậy gây
nên nhiều khó khăn trong công tác phòng trừ bệnh.
Để khắc phục những nhƣợc điểm do biện pháp hóa học gây ra nhƣ trên,
hiện nay trên thế giới cũng nhƣ ở Việt Nam, việc sử dụng các chế phẩm sinh
học thay thế một phần thuốc hóa học để phòng trừ một số bệnh cây trồng do
vi sinh vật gây ra đang là xu hƣớng chủ yếu. Chế phẩm sinh học diệt nấm có
nguồn gốc từ vi khuẩn đối kháng có tác dụng tích cực đối với nông nghiệp, ƣu
việt hơn so với việc dùng thuốc hóa học. Sử dụng chế phẩm có nguồn gốc từ
vi khuẩn để diệt nấm gây hại trên cây trồng sẽ mang lại những lợi ích lâu dài
cho ngƣời sản xuất nhƣ: làm tăng năng suất của cây trồng, giảm chi phí đầu
tƣ, làm đất không bị bạc màu, thân thiện với môi trƣờng sinh thái, không ảnh
hƣởng đến sức khỏe của con ngƣời và vật nuôi, góp phần quan trọng trong
việc phát triển nền nông nghiệp hữu cơ bền vững và hiệu quả.
Vi khuẩn Bacillus theo nhiều tài liệu đã công bố đƣợc biết đến với vai
trò quan trọng trong việc kiểm soát bệnh cây trồng. Chúng có khả năng sinh
tổng hợp nhiều hợp chất kháng nấm khác nhau nhƣ các chất kháng sinh,


2

lipopeptide, bacillomycin, iturin, mycosubtilin và fengycin. Một số chủng
Bacillus subtilis đã đƣợc ứng dụng để kiểm soát bệnh cây trồng do nấm gây ra.
Việc nghiên cứu phòng trừ nấm bệnh cây trồng bằng các chế phẩm sinh
học đã đƣợc hình thành và phát triển ở Việt Nam nhƣng vẫn còn nhiều hạn

chế. Các chế phẩm dƣới dạng tinh sạch tách chiết từ vi sinh vật mới nghiên
cứu chủ yếu ở trong phòng thí nghiệm và quy mô sản xuất thử nên giá thành
còn cao. Các sản phẩm trên thị trƣờng chủ yếu là các sản phẩm có chứa tế bào
vi sinh vật đối kháng nên thời gian hữu hiệu ngắn hiệu quả không cao. Mặt
khác, các sản phẩm sử dụng tế bào mang nguy cơ gây bệnh rất lớn cho con
ngƣời. Vì vậy, để phát triển sản phẩm sinh học đạt độ tinh sạch cao để phòng
chống nấm bệnh cây trồng là một vấn đề rất cấp thiết. Trong quá trình nghiên
cứu, chúng tôi đã phân lập và tuyển chọn đƣợc chủng B. subtilis AS có khả
năng ức chế mạnh các nấm gây bệnh cây trồng nhƣ F. oxysporum và R.
solani. Xuất phát từ những lý do trên và tình hình nghiên cứu ở Việt Nam,
chúng tôi đã thực hiện đề tài luận văn: "Tinh sạch các hợp chất thứ cấp có
hoạt tính kháng nấm từ chủng Bacillus phân lập ở Việt Nam" .
2. Mục tiêu của đề tài
- Tinh sạch hợp chất thứ cấp có hoạt tính kháng nấm F. oxysporum và
R. solani từ chủng B. subtilis AS.
- Đánh giá tính chất lý hóa của hợp chất đƣợc tinh sạch.
3. Nội dung nghiên cứu
- Đánh giá khả năng ức chế sinh trƣởng và phát triển của dịch lọc ngoại
bào vi khuẩn B. subtilis AS đối với hai chủng nấm F. oxysporum và R. solani.
- Tách chiết và tinh sạch protein có hoạt tính kháng nấm từ dịch lọc
ngoại bào vi khuẩn B. subtilis AS.
- Đánh giá sự ảnh hƣởng của nhiệt độ, proteinase K, ức chế sợi tử bào nấm
và nồng độ ức chế tối thiểu lên hoạt tính kháng nấm của protein tinh sạch đƣợc.


3

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Khái quát về chất đối kháng sinh trƣởng nấm
Chất đối kháng sinh trƣởng nấm (Antifungal – compounds, AFC) là

những chất có khả năng ức chế sự sinh trƣởng hoặc tiêu diệt sự phát triển của
các loại nấm.Các chất này đã đƣợc ứng dụng để phòng và chữa trị các bệnh
do nấm gây ra, đặc biệt là các loại nấm gây bệnh hại trên cây trồng nhƣ lạc, cà
chua, đậu tƣơng, cây cà phê và nhiều loại cây khác. Các protein và peptide có
hoạt tính kháng nấm đều đƣợc tách chiết phần lớn từ động vật, thực vật, vi
khuẩn và nấm. Năm 1993, Lijima và cộng sự đã xác định đƣợc protein chống
nấm Candida albicans, Shizosaccharomyces pombe có trong hemolymph của
ấu trùng Sarcophaga (2,5 mg protein tinh khiết thu đƣợc từ 10ml hemolymph
với nồng độ ức chế sự tăng trƣởng 50% là 30 pg/ml) [25].
Hoạt tính kháng nấm cũng đƣợc phát hiện ở thực vật nhƣ tính kháng
nấm của heme preoxidase từ cây mây Acoru peroxidase có vai trò trong việc
ức chế các sợi nấm của Phaseolina macrophomina, Fusarium moniliforme và
trichosporium vesiculosum [23]. Một chất ức chế protease cysteine đƣợc công
bố có khả năng kháng nấm từ hạt kê. Chất này ức chế mạnh hoạt động của
nấm T. reesei một loại nấm gỗ, nồng độ tối thiểu để ức chế sự tăng trƣởng của
sợi nấm hay bào tử nảy mầm là 1 µg/ml (250mg/đĩa). Ngoài ra chúng còn ức
chế một số loại nấm gây hại thực vật khác nhƣ: Claviceps, Helminthosprium,
Curvularia, Alternaria và các loài thuộc chi Fusarium [27].
Một protein kháng nấm đƣợc tách chiết từ vi khuẩn Bacillus
amyloliquefaciens MET0908 có khả năng kiểm soát sự sinh trƣởng của nấm
Colletotrichum lagenarium gây bệnh trên dƣa hấu. Protein này còn có thể
hoạt động đƣợc trên vách tế bào C. lagenarium [28].
Đặc biệt hoạt chất kháng nấm còn đƣợc phân lập từ quả thể của nấm
hypsizygus marmoreus là Hypsin một protein chịu nhiệt ức chế sự tăng trƣởng


4

của sợi nấm trong các loài nấm khác nhau bao gồm Mycosphaerella
arachidicola, Physalospora piricola, F. oxyproum, và Botrytis cinerea với giá

trị IC50 tƣơng ứng là 2,7; 2,5; 14,2 và 0,06 µM [33].
Trong các nguồn trên thì các chất AFC tách chiết từ vi khuẩn thuộc các
chi Bacillus đƣợc quan tâm nhiều hơn cả bởi tính phổ biến và thuận lợi trong
tinh sạch. Các chủng Bacillus có rất nhiều đặc tính tốt nhƣ: dễ nuôi cấy, phổ
biến, sinh trƣởng nhanh trong môi trƣờng lỏng, cho nhiều bào tử và đặc biệt
chúng có khả năng tổng hợp nhiều chất đối kháng sinh trƣởng nấm.
Các protein và peptide có khả năng kháng nấm đƣợc phân loại theo
nhiều cách khác nhau, dựa vào cơ chế tác động có thể phân thành 3 loại đó là
loại tác động vào vách tế bào nấm: (1) ức chế sự tổng hợp chitin và glucan,
loại tác động vào màng tế bào nấm: (2) các chất gắn dính hay ức chế sự tổng
hợp ergosterol của nấm và (3) loại tác động vào quá trình tổng hợp protein và
acid nucleic của nấm. Dựa vào cấu trúc hoặc chức năng, các protein và
peptide có khả năng kháng nấm đƣợc phân loại thành nhiều lớp khác nhau,
chẳng hạn nhƣ chitinase và chitinase-like protein [14], [34], ribonuclease
[39], chất ức chế protease [27].
Peptide kháng nấm đầu tiên đƣợc tách chiết từ chủng Bacillus là iturin
và bacillomycin. Chúng có cấu trúc peptidolipid mạch vòng và có khả năng
kháng nấm và tan huyết [35]. Bacillus cũng chính là đối tƣợng vi khuẩn đƣợc
quan tâm nghiên cứu nhiều nhất hiện nay, chủng này sinh tổng hợp rất nhiều
các polypeptide có hoạt tính kháng nấm và có tiềm năng trong việc kiểm soát
các bệnh hại cây trồng do nấm gây ra cũng nhƣ trong sản xuất các chế phẩm
sinh học phòng trừ nấm.


5

1.2. Vai trò của vi khuẩn B. subtilis trong kiểm soát sinh học
1.2.1. Đại cương về vi khuẩn B. subtilis
Chủng B. subtilis đƣợc phát hiện lần đầu tiên trong phân ngựa (1941)
bởi tổ chức y học Nazi của Đức. Lúc đầu, chủng đƣợc sử dụng để phòng bệnh

lị cho bệnh sĩ Đức chiến đấu ở Bắc Phi. Đến năm 1949, khi Henry và các
cộng sự tách đƣợc chủng thuần khiết của B. subtilis thì chúng mới đƣợc dùng
để điều trị bệnh về rối loạn tiêu hóa. Ngày nay, vi khuẩn B. subtilis đã trở nên
phổ biến và đƣợc sử dụng rộng rãi trong y học, thực phẩm… và đặc biệt là
kiểm soát sinh học trong nông nghiệp.
Theo khóa phân loại của Bergey, vi khuẩn B. subtilis thuộc:
Giới: Bacteria
Ngành: Firmicutes
Lớp: Bacilli
Bộ: Bacillales
Họ: Bacillacea
Chi: Bacillus
Loài: B.subtilis

Hình 1.1. Hình thái khuẩn lạc chủng B.subtilis AS
trên môi trƣờng PDA

Vi khuẩn B. subtilis thuộc nhóm vi sinh vật bắt buộc ở đƣờng ruột,
chúng đƣợc phân bố hầu hết trong tự nhiên nhƣ: cỏ khô, bụi đất, nƣớc …
phần lớn chúng tồn tại trong đất trồng trọt chứa khoảng 10 – 100 triệu CFU/g.
B. subtilis là trực khuẩn hình que, hai đầu tròn, Gram dƣơng, kích
thƣớc từ 0,5- 0,8 µm x 1,8-3µm, đứng thành chuỗi ngắn hoặc đơn lẻ, di động
8-12 lông. Sinh bào tử nhỏ hơn vi khuẩn và nằm ở giữa tế bào. Kích thƣớc từ


6

0,8-18µm. Phát triển bằng cách nảy mầm do sự nứt bào tử, không kháng acid,
có khả năng chịu nhiệt, chịu ấm, tia tử ngoại, phóng xạ.
Điều kiện phát triển nuôi cấy là môi trƣờng hiếu khí , nhiệt độ nuôi cấy

tối ƣu là 37oC. Mặc dù là vi khuẩn hiếu khi nhƣng B. subtilis có khả năng phát
triển trong môi trƣờng thiếu oxi. pH thích hợp nhất khi nuôi cấy với pH=7,07,4. Trên môi trƣờng thạch đĩa, khuẩn lạc chủng có dạng hình tròn, rìa răng
cƣa không đều, có tâm sẫm màu, phát triển chậm, màu vàng xám, đƣờng kính
3-5mm. Sau 1-4 ngày thì bề mặt nhẵn và chuyển sang màu hơi sẫm. Trên môi
trƣờng thạch nghiêng chủng dễ mọc tạo thành màu xám rìa gợn sóng. Trên
môi trƣờng lỏng chủng phát triển làm đục môi trƣờng, tạo màng nhăn, lắng
cặn lại nhƣ vẩn mây ở đáy, khó tan đều khi lắc lên.
1.2.2. Nghiên cứu các hợp chất có hoạt tính kháng nấm
Chủng Bacillus
Vi khuẩn Bacillus theo nhiều tài liệu đã công bố đƣợc biết đến với vai
trò quan trọng trong việc kiểm soát bệnh cây trồng. Chúng có khả năng sinh
tồng hợp nhiều hợp chất kháng nấm khác nhau nhƣ các chất kháng sinh,
lipopeptide, bacillomycin, iturin, mycosubtilin và fengycin [29], [46], [47],
[50]. Một số chủng B. subtilis đã đƣợc ứng dụng để kiểm soát bệnh cây trồng
do nấm gây ra, chúng có phổ biến trong đất, chịu đƣợc nhiệt độ cao, sinh
trƣởng nhanh trong môi trƣờng lỏng và có nhiều bào tử.
Rất nhiều loài thuộc chi Bacillus đã đƣợc biết đến với khả năng sinh
tổng hợp đa dạng về chức năng và cấu trúc các chất chuyển hóa thứ cấp. Việc
sản xuất các chất chuyển hóa có hoạt tính đối kháng vi sinh vật là một trong
những yếu tố quyết định đến khả năng kiểm soát các bệnh hại cây trồng.
Những chất chuyển hóa có thể là hợp chất ribosome nhƣ subtilin [63],
subtilosin A [12], và sublancin [48]. Các peptide kháng sinh nhỏ không phải
từ ribosome nhƣ họ surfactin: surfactin và lichenysin; họ kháng sinh iturin:


7

iturin A, C, D, và E, bacillomycin D, F, L, và mycosubtilin; họ kháng sinh
fengycin: fengicin và plipastatin; các aminopolyol nhƣ zwittermycin A [54].
Trong chi Bacillus thì B. subtilis là loài có khả năng sinh tổng hợp

nhiều loại hoạt chất có hoạt tính đối kháng vi sinh vật. Loài này thƣờng tổng
hợp các loại peptide kháng sinh nhỏ không phải từ ribosome (<2.000 Da) có
hoạt tính kháng nấm, chẳng hạn nhƣ iturin [57], [19], surfactin [16], [10],
fengycin, bacilysin [41], [38], bacillomycin [49], mycosubtilin [50], và
mycobacillin [56], B. subtilis hầu nhƣ cũng sinh tổng hợp ra rất nhiều loại
protein [44], [39]. Tuy nhiên, một số ít trong tổng số các loại protein trên đã
đƣợc công bố là có hoạt tính kháng nấm.
Chủng Pseudomonas
Các chủng pseudomonas sinh tổng hợp nhiều chất đối kháng sinh
trƣởng nấm khác nhau. Nhiều chủng sinh tổng hợp các chất kháng sinh nhƣ
phenazine,

2, 4- diacetylphloroglucinol, pyrrolnitrin, pyoluteorin, hoặc

siderophore. Chủng p. syringae sinh tổng hợp syringomycin, syringostatin và
syringotoxin, có hoạt tính kháng nấm. Syringomycin là các lipodepsipeptide
nhỏ và trong số các peptide kháng nấm vi khuẩn tiềm năng đã đƣợc phát hiện
ra. Syringomycin-E (SE) là peptide phổ biến nhất. SE diệt nấm A. favus, A.
fumigatus, A. niger, F. moniliforme,và F. oxysponim,giá trị LD95 đạt 7,8
µg/ml đối với A. flavus và các giá trị LD95 với 1,9 µg/ml đối với các chủng
nấm khác [55], [20].
Một số nghiên cứu cho thấy các chủng Pseudomonas fluorescens có
khả năng đối ức chế, sinh tổng hợp nhiều chất ức chế với Phytophthora
capsici mầm bệnh thối rữa cổ rễ ở cây tiêu đen ức chế tới 72% sự phát triển
hệ sợi của Phytophthora capsici đƣợc quan sát thấy trong các thí nghiệm nuôi
cấy kép.


8

Chủng Pseudomonas sp. Đƣợc phân lập từ lá cây ô liu, có khả năng sản
xuất endophyte chống lại một số loại nấm gây bệnh. Chúng ức chế 86% sự
tăng trƣởng của nấm R. solani sau 5 ngày và giảm mạnh sự lây nhiễm trên
khoai tây. Đây có thể là một tác nhân trong việc bảo vệ cây trồng chống lại
bệnh nấm [21].
Chủng Burkholderia
Chủng Burkholderia cepacia là một vi sinh vật đất phổ biến và rất
nhiều chủng đã đƣợc biết đến sinh tổng hợp ra lƣợng lớn các chất đối kháng
sinh trƣởng nấm nhƣ cepacin, pyrrolnitrin, xylocandin (còn đƣợc gọi là
cepacidine) là các glycopeptide từ Bur. cepacia và có tác dụng cộng hƣởng
hơn là amphotericin B và hoạt động kháng nhiều nấm gồm cadida sp., A.
Niger, Cryptococcus neoformans, F. oxyporum [36].
Một số hợp chất kháng nấm C. gloeosporioides từ chủng Burkholderia
cepacia B23. Hợp chất kháng nấm đƣợc xác định là pyrrolnitrin rất bền nhiệt
từ dịch lên men ngoại bào của chủng Bur. cepacia B23 bằng phƣơng pháp
TLC. Dịch lên men ngoại bào từ chủng Bur. cepacia B23 ức chế sự phát triển
hệ sợi và và nảy mầm của bào tử nấm C. gloeosporioides từ 41% - 100%.
Năm 2013, Salgado và cộng sự đã nghiên cứu, chọn lọc từ bộ sƣu tập
gồm 15 chủng Bur. tropica từ các vùng khác nhau ở Mexico, xác định chủng
Bur. tropica Mto431 có khả năng ức chế sự sinh trƣởng nhiều loại nấm gây
bệnh thực vật. Hợp chất bay hơi siderophore đƣợc xác định trong dịch lên men
ngoại bào từ nấm, cụ thể trong 4 ngày đối với các loại nấm C. gloeosporioides,
S.rolfssi và 7 ngày đối với các nấm F. oxyporum, F. culmorum.
1.3. Tình hình nghiên cứu các chế phẩm sinh học phòng trừ nấm trên thế giới
Hàng năm trên thế giới bệnh hại cây trồng đã gây ra những tổn thất lớn
cho ngành nông nghiệp. Tính đến năm 2005 khoảng 14% các khoản thiệt hại
trên thế giới hoàn toàn là từ các bệnh hại cây trồng gây ra. Trong đó hơn 50%


9

là do nấm gây ra với hàng tỷ euro thiệt hại mỗi năm [9]. Trong đó các loại
bệnh hại cây trồng thì bệnh do nấm F. oxysporum và R. solani gây ra, nấm
bệnh gây chết héo mạch dẫn và bệnh thối thân, thối rễ, lở cổ rễ ở nhiều loại
cây rau quả và cây lƣơng thực lạc, cà chua, khoai tây, đậu tƣơng … [28].
Việc sử dụng ngày càng nhiều các loại thuốc bảo vệ thực vật hóa học
trong nông nghiệp sẽ ảnh hƣởng tiêu cực đến môi trƣờng, dẫn đến mất cân
bằng trong quần thể vi sinh vật có ích, tạo môi trƣờng bất lợi đối với các sinh
vật có ích phát triển, và tạo điều kiện để nấm bệnh, các loại côn trùng có hại
kháng thuốc hơn, đồng thời cũng tiêu diệt các loại thiên địch có ích. Dƣ lƣợng
thuốc diệt nấm, thuốc trừ sâu hóa học còn lại trên sản phẩm nông nghiệp và
trên đất sẽ làm ô nhiễm nguồn nƣớc ngầm, gây ra các tác hại nghiêm trọng
đối với sức khỏe của ngƣời và vật nuôi. Vì vậy một số nƣớc phát triển, thuốc
diệt nấm có nguồn gốc hóa học bị hạn chế hoặc cấm sử dụng [22].
Hiện nay trên thế giới, việc sử dụng các chế phẩm sinh học thay thế
một phần thuốc hóa học để phòng trừ một số bệnh do vi nấm gây ra đang là
hƣớng chủ yếu. các chế phẩm sinh học diệt nấm có nguồn gốc từ vi khuẩn đối
kháng để diệt nấm gây hại trên cây trồng sẽ mang lại những lợi ích lâu dài cho
ngƣời sản xuất.
Vì vậy mà các nhà khoa học quan tâm đặc biệt tới việc nghiên cứu và
sản xuất các chế phẩm sinh học phòng trừ nấm bệnh, các nghiên cứu đều tập
trung mạnh về hóa sinh, di truyền và bản chất của các hợp chất di vi sinh vật
tạo ra có khả năng hạn chế sự sinh trƣởng và phát triển của các loài vi sinh vật
có hại.
Kumar và cộng sự (2009) đã phân lập đƣợc chủng B.subtilis MTCC
8114 trong một số mẫu đất vƣờn, hoạt tính vòng ức chế nấm khi thử nghiệm
bằng phƣơng pháp cấy chấm điểm là 14-16mm và 22-14mm bằng phƣơng
pháp khuếch tán vòng trên thạch đối với nấm Microsporum fulvum và

10

Trichophyton. Sau khi tối ƣu môi trƣờng nuôi cấy đã tìm ra đƣợc nguồn dinh
dƣỡng là dịch chiết bột đậu tƣơng, pH 7,0, nhiệt độ 370C và thời gian lên men
48 giờ là điều kiện thích hợp cho sản xuất kháng sinh của chủng vi khuẩn này.
Phân tích dữ liệu phổ FITR đã xác định hợp chất thuộc nhóm pedtide kháng
nấm, nồng độ ức chế tối thiểu MIC của kháng sinh kháng nấm là 135-145
µg/ml [30].
Bệnh thán thƣ do nấm bệnh colletotrichum gloeosporioides gây ra làm
giảm năng suất và chất lƣợng đến nhiều loại cây trồng nhƣ hồ tiêu, quất, xoài
và nhiều loài cây trồng khác, gây tổn thƣơng nặng nề đến lợi ích thƣơng mại
trên thế giới. Trong quá trình phân lập một số chủng vi khuẩn từ đất, Kim và
cộng sự (2010) đã tìm ra đƣợc chủng B.subtilis CMB32 có tiềm năng trong
việc kiểm soát chủng nấm bệnh C.gloeosporioides, sử dụng phƣơng pháp
khối phổ MALDI-TOF để phân tích, kết quả đã cho thấy chủng B.subtilis
CMB32 có khả năng sinh tổng hợp ra 3 loại peptide kháng nấm: inturin ,
fengycin và surfactin A [29].
Mendizabal và cộng sự (2012) đã tìm ra chủng CPA-8 có khả năng
kiểm soát bệnh thối rễ do nấm bệnh monilinia spp gây ra trên cây đào. Thí
nghiệm ức chế sự tăng trƣởng bằng cách sử dụng hoạt chất từ dịch nuôi cấy tế
bào đƣợc chiết xuất bằng butanol đã cho thấy kết quả ức chế mạnh đối với
nấm M.laxa và M.fructicola. Hoạt chất kháng nấm từ chủng B.subtilis CPA-8
đã đƣợc xác định là fengycin, giống liopeptide và có hoạt tính kháng nấm
mạnh [43].
Yiu-Kowk và cộng sự (2012) đã phân lập đƣợc chủng B.subtilis D1/2 từ
đất canh tác có khả năng ức chế nấm F. graminearum. Hoạt tính kháng nấm
của chủng vi khuẩn này do một loại polypeptide ngoại bào và đã xác định là
fengycin. Ứng dụng chủng vi khuẩn trên trồng ngô và lúa mì để kiểm soát bệnh
thối tai và tàn rụi đầu đã đƣợc đã đƣợc kiểm soát hoàn toàn, trên cây ngô thì
bệnh thối tai đã giảm đi một nửa. Mặc dù chƣa kiểm soát đƣợc triệt để trên cây

11

ngô, nhƣng có thể thấy chủng B.subtilis D1/2 có tiểm năng rất lớn trong việc
kiểm soát bệnh hại cây trồng và sản xuất chế phẩm kháng nấm [61].
Năm 2012 , Malfnovan và cộng sự khi sử dụng phƣơng pháp sắc ký
lỏng khối phổ đã phát hiện tới 8 loại hợp chất polypeptide mạch vòng có hoạt
tính kháng nấm trong dịch chiết ngoại bào của chủng B. subtilis HC8. Dựa
vào thời gian lƣu và khối lƣợng phân tử, đã xác định đƣợc các hợp chất kháng
nấm này chủ yếu thuộc 3 họ kháng sinh lớn đó là iturin, fengycin và surfactin.
Trong đó thì họ kháng sinh fengycin cho kết qủa tác động mạnh nhất đến việc
ức chế sự phát triển của nấm đối kháng. Chủng B. subtilis HC8 đƣợc xác định
là chủng đầu tiên có khả năng sinh tổng hợp ngoại bào cả 3 họ kháng sinh lớn,
đây là chủng vi khuẩn có tiềm năng rất lớn trong kiểm soát dịch bệnh hại cây
trồng. [42].
Tan và cộng sự (2013) đã phân lập đƣợc vi khuẩn B. subtilis B25 từ đất
vùng rễ chuối, thí nghiệm cho thấy chủng B25 có khả năng đối kháng mạnh
mẽ đối với nấm Fusarium. Ngoài ra chúng còn có khả năng ức chế tốt đối với
các nấm corynespora casiicola, Alternaria solani, Botrytis cinerea … Sau khi
soi dƣới kính hiển vi điện tử cho thấy protein kháng nấm của B. subtilis B25
có khả năng ức chế mạnh đối với nấm dẫn đến sợi nấm sƣng lên, biến dạng,
bất thƣờng [58].
Năm 2013, khi quan sát hình thái và phân tích dữ liệu phân tử, bao gồm
cả trình tự gen 16S rDNA và gyraseA (gyrA) các mẫu vi khuẩn đƣợc lấy từ
bùn Gomsohang và Mohang ở đảo Jeju Hàn Quốc, Ji và cộng sự đã phân lập
đƣợc chủng Bacillus amyloliquefaciens CNU114001 có hoạt tính đối kháng
đáng kể đối với các loại nấm gây bệnh. Bằng sắc ký cột silica gel, sắc ký lớp
mỏng và sắc ký lỏng hiệu năng cao, đã xác định đƣợc hoạt chất kháng nấm là
iturin. Các hoạt chất bán tinh khiết hạn chế đáng kể sự phát triển của nấm sợi

gây bệnh (Alternaria, Botrytics cinema, Colletotrichum orbiculare, Penicillium
digitatum, Pyricularia grisea và Sclerotinia sclerotiorum) ở 200 độ ppm. Dịch thô


12

của hoạt chất này có khả năng chống thối dƣa chuột trong phòng thí nghiệm,
và cho thấy khả năng chống lại nấm mốc xám ở cà chua, dƣa chuột và bí đỏ
trong điều kiện nhà kính [26].
Năm 2014, Guo và cộng sự khi nghiên cứu vi khuẩn B. subtilis NCD-2
để sản xuất fengycin đã thấy rằng chúng có khả năng đối kháng mạnh mẽ với
nấm Phytopathogenic, và có chức năng nhƣ một tác nhân kiểm soát sinh học
tuyệt đối với các bệnh do nấm ở cây bông. Nghiên cứu của Guo đã chứng
minh rằng fengycin là một loại polipeptide có hoạt tính kháng nấm chính
đƣợc sản xuất bởi B. subtilis NCD-2. Những hợp chất này đóng vai trò quan
trọng trong việc ức chế và kiểm soát bệnh do nấm R. solani gây ra [24].
Nghiên cứu mới đây nhất của Christopher và cộng sự (2015) đã phân
lập đƣợc vi khuẩn B. subtilis OH131.1 là một chất đối kháng của nấm F.
graminearum, một mầm bệnh gây nên bệnh bạc lá lúa mì. Bộ gen của vi
khuẩn B. subtilis OH131.1 đƣợc giải trình tự có hoạt tính trong việc kiểm soát
sinh học [18].
Ngoài ra trên thế giới, đã có nhiều chế phẩm từ các hoạt chất vi sinh vật
đƣợc thƣơng mại hóa. Điển hình là Ballad – một chế phẩm từ chủngB.
pumilus (Stain QST 2808) của hãng AgraQuest, là sản phẩm năm 2005, có thể
sử dụng cho khoai tây, đậu tƣơng, ngũ cốc… Chủng B. pumilus sinh tổng hợp
một chất đƣờng amoni chống nấm mà ngăn sự hình thành các tế bào mới và
làm rối loạn trao đổi chất tế bào, dẫn đến phá hủy tế bào và diệt thể gây bệnh
cây trồng. Ballad cũng tạo ra các rào cản vi khuẩn trên bề mặt lá, ngăn cản thể
gây bệnh nhƣ nấm gây rỉ sắt và mốc sƣơng từ khi hình thành trên thực vật.
Thuốc này có phổ sử dụng rộng. Đƣợc ghi vào danh sách chất kiểm

soát gỉ sắt (rỉ sắt trên cây đậu tƣơng, Châu Á), mốc sƣơng, mốc lông tơ và
bệnh bạc lá.


13

1.4. Tình hình nghiên cứu các chế phẩm sinh học phòng trừ nấm tại Việt Nam
Ở Việt Nam, các nghiên cứu tập trung nhiều vào việc sản xuất các chế
phẩm phòng trừ nấm gây bệnh cây trồng dùng làm thuốc bảo vệ thực vật. Hầu
hết các nghiên cứu đã thực hiện tập trung vào sản xuất các sản phẩm sinh học
chứa các chủng nấm đối kháng (chủ yếu là các chủng Trichoderma) hoặc vi
khuẩn đối kháng (chứa B. subtilis). Các chế phẩm thƣơng mại phần lớn chứa
các chủng nấm đối kháng ở dạng phân bón.
Việc ứng dụng các vi sinh vật đối kháng nấm bệnh cây đã đƣợc thực
hiện rất sớm ở Việt Nam và đạt đƣợc những thành tựu to lớn nhƣ sử dụng vi
sinh vật đối kháng nấm nhƣ một sinh vật chức năng trong sản xuất phân bón
hữu cơ vi sinh, các chế phẩm lên men xốp sử dụng nhóm vi nấm
Trichoderma. Có rất nhiều công trình nghiên cứu sử dụng các chủng nấm
Trichoderma để phòng trừ nấm bệnh cây trồng [8].
Nghiên cứu các biện pháp sinh học phòng chống nấm bệnh cây đã đƣợc
quan tâm và thực hiện ở một số cơ sở nghiên cứu trong nƣớc trong những
năm vừa qua: Viện Công nghệ sinh học và Viện sinh học nhiệt đới (Viện KH
CNVN), Viện bảo vệ thực vật và Viện Thổ nhƣỡng và nông hóa (Bộ NN
PTNT), Đại học Nông lâm Tp HCM, Đại học Cần thơ.
Các công bố cho thấy, các nhóm vi sinh vật nhƣ Trichoderma [5],
Bacillus [6], Pseudomonas [7], và Serratia [4] đã đƣợc phân lập, tuyển chọn
và đƣợc đánh giá là những tác nhân tiềm tàng cho phát triển các chế phẩm
sinh học để phòng chống nấm bệnh cây.
Phòng Công nghệ sinh học Enzyme, Viện Công nghệ Sinh học cùng Bộ
NN&PTNT đã nghên cứu và tạo ra chế phẩm BCF từ 3 chủng vi sinh vật

Bacillus, Burkhodelia và Pseudomonas phân lập từ đất ở Việt Nam. Đƣa ra 3
dạng dịch, bột và tinh sạch để ứng dụng diệt nấm bệnh cây trồng Fusarium và
Rhizoctonia. Trong điều kiện in vivo chế phẩm dạng lỏng 1%, dạng bột 0,1%


14

và dạng tinh sạch là 30 μg/ml đã ức chế đƣợc hơn 80% sự sinh trƣởng và phát
triển của chủng nấm Fusarium và Rhizoctonia. Trong điều kiện nhà lƣới, chế
phẩm BCF dùng ở nồng độ 2 – 2,5% có hiệu quả giảm tỷ lệ bệnh khô vằn,
bệnh héo vàng trên ngô và đậu tƣơng. Chế phẩm đã đƣợc thử nghiệm thành
công trong việc kiểm soát nấm trên cây hồ tiêu tại Bình Phƣớc và Bà Rịa –
Vũng Tàu [3].
Biện pháp sinh học để phòng trừ nấm R. solani bằng cách dùng nấm
đối ức chế Trichoderma viride đã đƣợc nhóm nghiên cứu của Nguyễn Kim
Vân thử nghiệm cho thấy nấm Trichoderma viride có hiệu lực ức chế cao nấm
R. solani trong điều kiện phòng thí nghiệm và thí nghiệm bán đồng ruộng là
giảm mức độ thiệt hại của nấm R. solani gây bệnh thối cải bắp [5].
Có thể sử dụng chế phẩm sinh học nấm đối ức chế Trichoderma viride
để phòng trừ bệnh lở cổ rễ hại cây trồng cạn, hiệu quả phòng trừ bệnh cao
86% trên cây cà chua và 78% trên cây dƣa chuột trong điều kiện thí nghiệm
chậu vại [1].
Năm 2011 Đỗ Thị Tuyên và cộng sự đã tinh sạch đƣợc protein có hoạt
tính kháng nấm từ chủng B. subtilis XL62. Các phân đoạn sau khi tinh sạch
có hoạt tính kháng nấm tƣơng đối mạnh và có khối lƣợng phân tử khoảng 21
kDa trên điện di đồ SDS-PAGE. Protein kháng nấm này có hoạt tính ức chế
mạnh sự sinh trƣởng và phát triển của nấm F. oxysporum và R. solani. Protein
tinh sạch từ chủng B. subtilis XL62 có hoạt tính kháng nấm mạnh đối với
chủng nấm F. oxysporum, hoạt tính kháng nấm này vẫn còn duy trì khi ủ ở
800C, thậm chí là 1000C trong 15 phút [2].

Đặc biệt trong những năm qua, chế phẩm antiforhis có tác dụng phòng
chống bệnh thối rễ, lở cổ rễ cây trồng do nấm F. oxysporum và R. solani có
nguồn gốc từ trong đất đã đƣợc phát triển trên cơ sở sử dụng hỗn hợp các
chủng P. sluorescens, P. cholororaphis và chủng B. pumilus tại phòng Vi sinh


15

vật đất, Viện công nghệ sinh học. Chế phẩm đã đƣợc khảo nghiệm trên diện
hẹp trong trong điều kiện in vitro tại Viện bảo vệ thực vật (Bộ NN  PTNT);
kết quả cho thấy chế phẩm antiforhis cho hiệu quả giảm bệnh gần bằng hoặc
tƣơng đƣơng các hóa chất diệt nấm, tùy theo từng chất. Kết quả khảo nghiệm
trên đồng ruộng cũng cho thấy, việc tƣới chế phẩm antiforhis có tác dụng làm
giảm tỷ lệ cây con và cây trồng bị chết do bệnh thối rễ trên cây ăn quả các
loại, cây cải bắp, cây cà chua, cây ớt ngọt [6].
Trong thời gian qua, tại Phòng Vi sinh vật đất (Viện CNSH), một số
chủng vi khuẩn thuộc nhóm Burkholderia và Chryseomonas đã đƣợc phân lập
từ các mẫu vật khác nhau ở Việt Nam. Thử khả năng đối kháng nấm F.
oxysporum và R. solani của các chủng này đã đƣợc tiến hành. Kết quả cho
thấy, các chủng này có khả năng sinh tổng hợp các chất ngoại bào với hoạt
tính ức chế sinh trƣởng hay nảy mầm của bào tử nấm rất mạnh.
Nhƣ vậy, trên thị trƣờng Việt Nam, các loại sản phẩm sinh học phòng
trừ bệnh nấm R. solani và F. oxysporum chủ yếu là các sản phẩm có chứa
nấm đối kháng. Các nghiên cứu phòng trừ nấm bệnh cây bằng các tác nhân
sinh học đã đƣợc hình thành và phát triển ở Việt Nam tuy nhiên vẫn còn nhiều
hạn chế.


16

CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.1. Vật liệu và hóa chất
2.1.1. Chủng giống
Chủng vi khuẩn B. subtilis AS đƣợc phân lập ở Việt Nam do Phòng
công nghệ sinh học enzyme, Viện công nghệ sinh học cung cấp.
Chủng nấm bệnh F. oxysporum và R. solani từ bộ sƣu tập giống của
phòng bệnh cây, Viện bảo vệ thực vật, Từ Liêm, Hà Nội cung cấp.
2.1.2. Hóa chất
Các hóa chất sử dụng phòng thí nghiệm đều ở dạng tinh khiết. Các hóa
chất nhƣ: DEAE (Heledelberg, Đức), SDS (Sigma, Mỹ), APS, TEMED, Dglucose (Merck, Đức), màng lọc minisart (Biotech, Việt Nam), agar (Việt
Nam), cao nấm men, pepton đƣợc mua từ ICN (Mỹ). Một số nguyên liệu
dùng thay thế nguồn carbon và nito nhƣ tinh bột khoai tây đƣợc mua ở thị
trƣờng (Việt Nam).
2.1.3. Các loại đệm và dung dịch
Các loại đệm và dung dịch sử dụng trong thí nghiệm đƣợc pha theo các
bài báo đã đƣợc công bố và nồng độ đƣợc tóm tắt ở bảng 2.1.


17

Bảng 2.1. Thành phần các loại đệm và dung dịch

Thành phần, nồng độ

Dung dịch
Dung dịch Bradford stock

100 ml 95% ethanol, 350g serva blue G, 200
ml 88% phosphoric acid

Dung dịch Bradford working

425 ml H20, 15 ml 95% ethanol, 30 ml 88%
phosphoric acid, 30 ml dung dịch bradford
gốc.

Đệm điện di protein

20 mM Tris-HCl, 192 mM glycine; 0,1%
SDS; pH 8,8

Dung dịch A

Đệm 1,5 M Tris-HCl, pH 8,8

Dung dịch B

Đệm 0,5 M Tris-HCl; pH 6,8

Dung dịch C

30%acrylamide; 0,8% bis-acrylamide

Dung dịch D

10% SDS

Dung dịch APS

10% ammonium persulfate

Đệm Potasium phosphate 1M

K2HPO4 1 M, KH2PO4 1M, pH 6,8

2.1.4. Môi trường
Thành phần một số môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật sử dụng trong
nghiên cứu đƣợc pha theo bảng 2.2
Bảng 2.2. Thành phần môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật

Môi trƣờng

Thành phần (g)

LB lỏng(g/L)

10 peptone; 5cao nấm men, 10 NaCl

LB rắn(g/L)

10 peptone; 5cao nấm men, 10 NaCl, 20 agar

PDA(g/L)

20 khoai tây, đun sôi cách thủy 2 giờ thu dịch chiết; 20 Dglucose, 20 agar

NYD(g/L)

10 D-glucose, 8 cao thịt, 5 cao nấm men