Tuyển chọn, cải biến và nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng xạ khuẩn có khả năng kháng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa phân lập ở Việt Nam

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN


VIỆN HÀN LÂM KH&CN VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
***



LUẬN VĂN CAO HỌC
Mã số chuyên ngành: 60420103

Đề tài:
Tuyển chọn, cải biến và nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng xạ khuẩn có
khả năng kháng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa phân lập ở Việt Nam


Học viên: Nguyễn Huy Hùng
Lớp: CHST _ K16
Hƣớng dẫn: TS. Nguyễn Xuân Cảnh



Hà Nội, 2014

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN


Lời cảm ơn

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Xuân Cảnh Khoa Công nghệ
sinh học - Học viện Nông nghiệp Hà Nội, là người thầy đã hướng cho tôi những ý
tưởng khoa học, tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức, giúp đỡ và tạo mọi điều
kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành bản luận án này.
Tôi xin cảm ơn tất cả các thầy cô giáo Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật,
Viện Hàn lâm Khoa học và công nghệ Việt Nam đã chia sẻ, động viên, giúp tôi vượt
qua mọi khó khăn để hoàn thành tốt công việc nghiên cứu của mình.
Cuối cùng, tôi xin tỏ lòng biết ơn đến gia đình và bè bạn, những người luôn
bên tôi, động viên,góp ý và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt thời gian học tập
và nghiên cứu.
Tác giả



Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN


Lời cam đoan
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng
cộng tác với các đồng sự khác. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung
thực.
Hà Nội, ngày tháng năm 2014
Tác giả

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

i
MỤC LỤC
MỤC LỤC i
Danh mục hình iv

Danh mục bảng v
TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. GIỚI THIỆU VỀ XẠ KHUẨN 3
1.1.1. Sự phân bố và ý nghĩa của xạ khuẩn trong tự nhiên 3
1.1.2. Vị trí của xạ khuẩn trong sinh giới 4
1.1.3. Cấu tạo của xạ khuẩn 5
1.1.4. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn 8
1.1.5. Sự hình thành bào tử xạ khuẩn 9
1.1.6. Sinh tổng hợp chất kháng sinh 11
1.2. PHÂN LẬP CÁC CHỦNG XẠ KHUẨN SINH TỔNG HỢP CHẤT KHÁNG
SINH 13
1.2.1. Phân lập các chủng xạ khuẩn sinh chất kháng sinh 13
1.2.2. Phân loại và định tên xạ khuẩn 14
2.1. VẬT LIỆU 33
2.1.1. Chủng giống vi sinh vật 33
2.1.2. Hóa chất 33
2.1.3. Thiết bị 33
2.1.4. Môi trƣờng 33
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34
2.2.1. Bảo quản giống [3]. 34
2.2.2. Xác định đặc điểm sinh học 35
2.2.3. Xác định sinh khối 36
2.2.4. Xác định hoạt tính kháng sinh [6,19]. 36

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

ii
2.2.5. Nghiên cứu điều kiện lên men [3, 6] 37
2.2.6. Chạy sắc ký giấy chất kháng sinh 38
PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39

3.1. Phân lập vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa 39
3.2. Xây dựng kháng sinh đồ đối với các chủng P. aeruginosa phân lập 41
3.3. Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có khả năng kháng vi khuẩn P.
aeruginosa 42
3.3.1. Phân lập xạ khuẩn 42
3.3.2. Sàng lọc và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn kháng vi khuẩn P. aeruginosa 43
3.4. Nghiên cứu các đặc điểm phân loại và đặc điểm sinh học của chủng xạ khuẩn
8.9 45
3.4.1. Đặc điểm nuôi cấy và đặc điểm hình thái 45
3.4.1. Đặc điểm hình thái 46
3.4.2. Một số đặc điểm sinh hóa của chủng 8.9 46
3.4.3. Mô tả đặc điểm phân loại 48
3.4.4. Phân loại bằng phƣơng pháp sinh học phân tử 50
3.5. Nghiên cứu động thái lên men của chủng xạ khuẩn 8.9 52
3.6. Nghiên cứu một số tính chất của dịch kháng sinh thô 54
3.6.1. Tách chiết chất kháng sinh 54
3.6.2. Độ bền nhiệt của dịch kháng thô 54
3.6.3. Ảnh hƣởng của pH đến độ khuếch tán của dich kháng sinh thô 55
3.6.4. Đặc điểm sắc kí của dịch kháng sinh thô của chủng xạ khuẩn 8.9 trong một
số hệ dung môi 55
3.7. Nghiên cứu cải biến chủng xạ khuẩn 8.9 56
PHẦN 4. KẾT LUẬN 59
TÀI LIỆU THAM KHẢO 60

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

iii
Tài liệu tiếng Việt 60
Tài liệu tiếng anh 60
CÁC CHỮ VIẾT TẮT TRONG KHÓA LUẬN

HSCC Hệ sợi cơ chất
HSKS Hệ sợi khí sinh
RNA Ribonucleic acide
DNA Deoxyribonucleic acide
RA Cuống bào tử xoắn đơn hình móc câu
RF Cuống bào tử thẳng hay lƣợn song
CSBT Cuống sinh bào tử
BMBT Bề mặt bào tử
CKS Chất kháng sinh
TKMX Trực khuẩn mủ xanh
PCR Polymerase chain reaction

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

iv
Danh mục hình
Hình 1.1. Khuẩn lạc xạ khuẩn
Hình 1.2. Bào tử xạ khuẩn
Hình 1.3. Trực khuẩn mủ xanh Pseudomonas aeruginosa
Hình 3.1. Hình thái khuẩn lạc (A) và tế bào ở độ phóng đại 11000 lần trên kính
hiển vi điện tử quết của chủng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa phân lập tại tại
bệnh viện huyết học truyền máu TW sau 02 ngày nuôi cấy ở 37
0
C.
Hình 3.2. Thử hoạt tính kháng sinh chủng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa của
các chủng xạ khuẩn bằng phƣơng pháp khối thạch
Hình 3.3. Kết quả thử hoạt tính các chủng xạ khuẩn phân lập bằng phƣơng pháp
giếng thạch với vi sinh vật kiểm định là vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa
Hình 3.4. Khả năng sinh trƣởng và màu sắc khuẩn lạc chủng 8.9 khi nuôi cấy trên
môi trƣờng ISP-1 (A) và ISP-2 (B)

Hình 3.5. Hình thái cuống sinh bào tử và bề mặt bào tử của chủng xạ khuẩn NĐ
8.9 khi quan sát trên kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 1000 lần (A) và kính
hiển vi điện tử quết ở độ phóng đại 7500 lần
Hình 3.6. Sự sinh trƣởng của chủng xạ khuẩn 8.9 trên môi trƣờng có các nguồn
cacbon khác nhau
Hình 3.7. Sinh trƣởng và phát triển của chủng 8.9 trên môi trƣờng ISP-6
Hình 3.8. Điện di sản phẩm PCR gene 16S rRNA của chủng 8.9
Hình 3.9. Cây phát sinh chủng loại của chủng 8.9
Hình 3.10. Động thái của quá trình lên men sinh tổng hợp chất kháng sinh của
chủng xạ khuẩn 8.9 trên môi trƣờng Gauze-1
Hình 3.11. Biểu đồ giá trị Rf của chất kháng sinh thô 8.9


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

v
Danh mục bảng
Bảng 3.1.Kết quả phân lập vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa tại Viện huyết học
truyền máu TW.
Bảng 3.2. kết quả dựng kháng sinh đồ trên máy VITEK2 compact tại bệnh viện
Huyết học truyền máu TW
Bảng 3.3. Phân loại xạ khuẩn theo nhóm màu
Bảng 3.4. Hoạt tính kháng sinh của các chửng xạ khuẩn tuyển chọn đối với vi
khuẩn Pseudomonas aeruginosa
Bảng 3.5. Đặc điểm hình thái nuôi cấy chủng 8.9
Bảng 3.6. Khả năng sử dụng nguồn cacbon của chủng xạ khuẩn 8.9
Bảng 3.7. So sánh đặc điểm hình thái của chủng 8.9 với chủng S. parvulus
Bảng 3.8. Khả năng sử dụng nguồn cacbon của 2 chủng 8.9 và S. parvulus
Bảng 3.9. So sánh trình tự gen 16S RNA trên ngân hàng gen quốc tế
Bảng 3.10. Hoạt tính kháng sinh của chủng xạ khuẩn 8.9 trên các môi trƣờng

nghiên cứu
Bảng 3.11. Sự biến đổi pH, hoạt tính kháng sinh, sinh khối chủng 8.9
Bảng 3.12. Hoạt tính của dịch kháng sinh thô của chủng xạ khuẩn 8.9 đối với vi
sinh vật kiểm định Pseudomonas aruginosa ở các nhiệt độ khác nhau
Bảng 3.13. Ảnh hƣởng của pH tới sự khuếch tán của chất kháng sinh
Bảng 3.14. Giá trị Rf của dịch kháng sinh thô trên một số hệ dung môi
Bảng 3.15. Hoạt tính kháng sinh của các chủng xạ khuẩn đƣợc lựa chọn sau khi
gây đột biến đối với vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa




1
MỞ ĐẦU
Pseudomonas aeruginosa (hay còn gọi là Trực khuẩn mủ xanh) là một vi
khuẩn phổ biến gây bệnh ở động vật và con ngƣời. Nó đƣợc tìm thấy trong đất,
nƣớc, hệ vi sinh vật trên da và các môi trƣờng nhân tạo trên khắp thế giới. Vi khuẩn
không chỉ phát triển trong môi trƣờng không khí bình thƣờng, mà còn có thể sống
trong môi trƣờng có ít khí ôxy, và do đó có thể cƣ trú trong nhiều môi trƣờng tự nhiên
và nhân tạo. Vi khuẩn này dinh dƣỡng bằng rất nhiều các hợp chất hữu cơ; ở động vật,
nhờ khả năng thích ứng vi khuẩn cho phép nó lây nhiễm và phá hủy các mô của ngƣời
bị suy giảm hệ miễn dịch. Triệu chứng chung của việc lây nhiễm thông thƣờng là gây
ra viêm nhiễm và nhiễm trùng huyết. Nếu vi khuẩn xâm nhập vào các cơ quan thiết
yếu của cơ thể nhƣ phổi, đƣờng tiết niệu, và thận, sẽ gây ra những hậu quả chết
ngƣời; vì vi khuẩn này phát triển tốt trên các bề mặt bên trong cơ thể. Vi khuẩn cũng
đƣợc phát hiện trên các dụng cụ y khoa bao gồm catheter, gây ra nhiễm khuẩn bệnh
viện và phòng mạch. Đây cũng là nguyên nhân gây ra viêm chân lông.
Nƣớc ta là một nƣớc nhiệt đới nóng ẩm thuận lợi cho vi sinh vật nói chung và
xạ khuẩn nói riêng phát triển. Do đó, có thể tìm thấy nhiều chủng xạ khuẩn có khả
năng sinh kháng sinh quý, trong đó có kháng sinh kháng lại vi khuẩn Pseudomonas

aruginosa gây ra các bệnh về nhiễm trùng.
Để giải quyết những vấn đề này, chúng tôi thực hiện đề tài: “
Tuyển chọn, cải
biến và nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng xạ khuẩn có khả năng kháng vi
khuẩn Pseudomonas aeruginosa phân lập ở Việt Nam
”.
*/ Mục tiêu của đề tài:
- Phân lập đƣợc vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa từ các mẫu thu thập tại một số
bệnh viện.
- Sàng lọc và tuyển chọn đƣợc chủng xạ khuẩn có khả năng kháng vi khuẩn
Pseudomonas aeruginosa từ bộ sƣu tập các chủng xạ khuẩn phân lập ở Việt Nam


2
- Phân loại và nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của chủng xạ khuẩn đã tuyển
chọn.
- Cải biến đƣợc chủng xạ khuẩn đã tuyển chọn để nâng cao hoạt tính kháng khuẩn
- Bƣớc đầu xác định đƣợc nhóm hoạt chất chính từ chủng xạ khuẩn đã tuyển chọn tác
động lên vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa.
*/ Nội dung
- Phân lập vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa từ các mẫu bệnh phẩm, nƣớc thải, đất
thu thập tại một số bệnh viện.
- Kiểm tra tính mẫn cảm của các chủng Pseudomonas aeruginosa phân lập đƣợc với
một số loại chất kháng sinh
- Kiểm tra hoạt tính kháng sinh của các chủng xạ khuẩn đã phân lập đƣợc với vi
khuẩn Pseudomonas aeruginosa để tuyển chọn ra các chủng có hoạt tính cao.
- Phân loại và nghiên cứu các đặc điểm hình thái, nuôi cấy, sinh lý – sinh hóa của các
chủng xạ khuẩn tuyển chọn.

3
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. GIỚI THIỆU VỀ XẠ KHUẨN
1.1.1. Sự phân bố và ý nghĩa của xạ khuẩn trong tự nhiên
Xạ khuẩn (Actinomycetales) là một nhóm vi khuẩn thật (Bacteria) phân bố rộng
rãi trong tự nhiên: trong đất, trong nƣớc ao hồ, một phần trong bùn và trong các cơ
chất hữu cơ khác, thậm chí trong cả cơ chất mà các vi khuẩn khác và nấm mốc không
phát triển đƣợc [3]. Xạ khuẩn có nhiều nhất trong lớp đất bề mặt, số lƣợng không chỉ
phụ thuộc vào loại đất mà còn phụ thuộc vào mức độ canh tác của đất và khả năng
bao phủ của thực vật. Đất giầu dinh dƣỡng và lớp đất trên bề mặt (đến 40cm) thƣờng
có số lƣợng xạ khuẩn lớn. Số đơn vị sinh khuẩn lạc (CFU- colony forming unit) xạ
khuẩn trong 1g đất canh tác thƣờng đạt tới hàng triệu mầm xạ khuẩn, đất hoang hoá
chỉ có 10-100 nghìn mầm. Số lƣợng xạ khuẩn trong đất cũng thay đổi theo thời gian
trong năm [6, 28].
Xạ khuẩn cũng thƣờng sống trên các cây chết, rơm rạ, thƣờng hoại sinh nhƣng
có thể kí sinh trên thân cây, ở củ và rễ cây. Một số nghiên cứu cũng cho thấy sự có
mặt của xạ khuẩn trong trầm tích biển nhƣ các loài Actinomyces halophila, A.
mortivalis và A. iraquensis, Streptomyces nhƣ S. antibioticus (MU106, MU107) và S.
rimosus (MU114) [15,16, 33] hoặc trong các mẫu nƣớc và bùn ao nuôi trồng thủy sản
đặc biệt là ở lớp bùn, xác các hợp chất hữu cơ lắng đọng nhiều.
Ngoài ra, pH của môi trƣờng cũng ảnh hƣởng đáng kể đến sự phân bố của xạ
khuẩn, thƣờng thì trong môi trƣờng trung tính hoặc hơi kiềm, mật độ xạ khuẩn cao
hơn so với các môi trƣờng có độ pH quá cao hoặc quá thấp. Xạ khuẩn thƣờng hoạt
động ở pH cao hơn so với nấm [6].
Xạ khuẩn đƣợc nghiên cứu một cách sâu sắc vì chúng có ý nghĩa quan trọng
trong tự nhiên: tích cực tham gia vào các quá trình chuyển hoá nhiều hợp chất trong
đất, trong nƣớc, chúng có vai trò rất quan trọng trong chu trình tuần hoàn vật chất
trong tự nhiên. Chúng sử dụng axit humic và các chất hữu cơ khó phân giải khác trong
đất. Bên cạnh đó chúng còn sản sinh nhiều sản phẩm trao đổi chất quan trọng nên đã

4
đƣợc dùng để sản xuất nhiều loại enzim nhƣ proteaza, amilaza, xenlulaza,
glucoizomeraza, vitamin và các axít hữu cơ [3]. Do có các loại enzim này nên chúng
cũng có khả năng phân giải các hợp chất bền vững nhƣ kitin, xenluloza, lignin…. Một
đặc điểm quan trọng của xạ khuẩn là khả năng sinh chất kháng sinh. 60-70% xạ khuẩn
phân lập đƣợc từ đất có khả năng này. Trong số khoảng 8000 chất kháng sinh hiện đã
đƣợc biết đến trên thế giới thì trên 80% là do xạ khuẩn [17]. Chúng sống trên rễ cây
hoặc củ và gây bệnh, nhất là ở vùng đất kiềm, đất cát khi thời tiết khô hạn, làm cho củ
lở loét, sần sùi ngay từ ngoài đồng ruộng. Một số xạ khuẩn (thuộc chi Frankia) có thể
tạo nốt sần trên rễ một số cây không thuộc bộ đậu và có khả năng cố định Nitơ không
khí thành dạng dễ sử dụng cho cây. Các chủng Streptomyces spp. sinh độc tố
phytotoxin ảnh hƣởng lớn tới mùa vụ, do chúng có thể tồn tại trong đất trên 10 năm
[3, 6].
1.1.2. Vị trí của xạ khuẩn trong sinh giới
Trƣớc đây, vị trí phân loại của xạ khuẩn luôn là câu hỏi gây nhiều tranh luận
giữa các nhà vi sinh học do nó có những đặc điểm vừa giống vi khuẩn, vừa giống
nấm. Trƣớc thế kỉ 19, xạ khuẩn đƣợc xếp vào nhóm nấm. Về sau, khi đã nghiên cứu
sâu hơn ngƣời ta đã tìm ra các bằng chứng về mối liên hệ giữa xạ khuẩn và vi khuẩn
nhƣ:
- Một số xạ khuẩn nhƣ các loài thuộc chi Actinomyces và Nocardia rất giống
với các loài vi khuẩn thuộc chi Lactobacillus và Corynebacterium.
- Xạ khuẩn giống vi khuẩn ở chỗ không có nhân thật, chúng chỉ chứa nhiễm sắc
chất phân bố dọc theo các sợi hoặc các tế bào.
- Đƣờng kính của sợi xạ khuẩn và bào tử giống với vi khuẩn. Đồng thời xạ
khuẩn thƣờng không chứa vách ngăn.
- Xạ khuẩn là đích tấn công của các thực khuẩn thể giống nhƣ vi khuẩn, trong
khi đó, nấm không bị tấn công bởi thực khuẩn thể.
- Xạ khuẩn thƣờng nhạy cảm với các kháng sinh có tác dụng lên vi khuẩn
nhƣng lại thƣờng kháng với những kháng sinh tác dụng lên nấm nhƣ các polyen.

5
- Xạ khuẩn chứa chitin, chất có mặt trong sợi và bào tử của nhiều nấm, mà
không có ở vi khuẩn. Đồng thời giống nhƣ phần lớn vi khuẩn, xạ khuẩn không chứa
xenluloza.
- Tƣơng tự với vi khuẩn, xạ khuẩn nhạy cảm với phản ứng axít của môi trƣờng,
đặc điểm này không có ở nấm.
- Các đặc điểm về sợi và nang bào tử lớn (sporangium) của chi Actinoplanes
cho thấy có thể chi này là cầu nối giữa vi khuẩn và các nấm bậc thấp.
Từ những đặc điểm trên (về nhân nguyên thuỷ, kích thƣớc nhỏ bé ) nên ngƣời
ta đã xếp xạ khuẩn vào nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria).
Vị trí của nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) đƣợc xác định nhƣ sau: Năm 1978,
Gibbbens và Murray chia các vi khuẩn nhân nguyên thuỷ thành 4 ngành là ngành
Gracilicutes (gồm các vi khuẩn Gram âm), ngành Tenericute (gồm xạ khuẩn và các vi
khuẩn Gram dƣơng), ngành Mendosicutes gồm các vi khuẩn không chứa
Peptidoglican trong thành tế bào, và ngành Mollicutes gồm các vi khuẩn chƣa có
thành tế bào.
Năm 1977 và 1980, Woese và cộng sự chia vi khuẩn nhân nguyên thuỷ thành 2
giới là giới vi khuẩn thật (Eubacteria) (tƣơng đƣơng với 3 ngành Gracilicutes,
Tenericute, Mollicutes theo Gibbbens và Murray) và giới vi khuẩn cổ
(Archaebacteria) (tƣơng đƣơng với ngành Mendosicutes)[3].
Xạ khuẩn thuộc về nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria), lớp Actinobacteria, bộ
Actinomycetales, bao gồm 10 dƣới bộ, 35 họ, 110 chi và 1000 loài. Hiện nay, 478 loài
đã đƣợc công bố thuộc chi Streptomyces và hơn 500 loài thuộc tất cả các chi còn lại
đƣợc xếp vào nhóm xạ khuẩn hiếm.
1.1.3. Cấu tạo của xạ khuẩn
Xạ khuẩn giống nấm mốc ở chỗ có thể tạo thành hệ sợi, nhƣng lại là cơ thể
đơn bào, không có nhân thực (procariotic) và có kích thƣớc giống vi khuẩn. Cấu trúc
khuẩn lạc xạ khuẩn đƣợc phân biệt ở hƣớng sinh trƣởng trong và ngoài mặt môi

trƣờng thạch tạo thành khuẩn ty cơ chất và khuẩn ty khí sinh. Khuẩn ty cơ chất


6
(substrate mycelium) cắm sâu vào môi trƣờng để lấy nƣớc và thức ăn. Khuẩn ty cơ
chất phát triển một thời gian thì dài ra trong không khí thành khuẩn ty khí sinh (aerial
mycelium). Ngƣời ta gọi khuẩn ty khí sinh là khuẩn ty thứ cấp để phân biệt với khuẩn
ty sơ cấp phát triển từ các bào tử nảy mầm. Nhiều loại chỉ có khuẩn ty cơ chất nhƣng
cũng có loại (nhƣ chi Sporichthya) lại chỉ có khuẩn ty khí sinh. Khuẩn ty khí sinh phát
triển ra ngoài không khí và thƣờng phần cuối các khuẩn ty này biến thành cuống sinh
bào tử. Loại khuẩn ty không mang bào tử gọi chung là khuẩn ty dinh dƣỡng. Khuẩn ty
xạ khuẩn mảnh hơn khuẩn ty nấm mốc, và có đƣờng kính thay đổi trong khoảng từ
0,2-1,0µm đến 2-3µm. Đa số xạ khuẩn có khuẩn ty không có vách ngăn và không tự
đứt đoạn. Một số xạ khuẩn có bao sợi là một bao mỏng bọc bên ngoài khuẩn ty khí
sinh, có thể thấy rất rõ khi phân hoá thành bào tử [3].
* Màng tế bào xạ khuẩn khá phức tạp: gồm có thành tế bào và màng tế bào:
- Thành tế bào xạ khuẩn (CW) có dạng kết cấu lƣới, dày khoảng 10-20nm, có
tác dụng duy trì hình dáng của khuẩn ty và bảo vệ tế bào. Căn cứ vào kết cấu hoá học
ngƣời ta chia thành tế bào xạ khuẩn thành 4 nhóm:
Nhóm CW I: Có chứa L, L-DAP và Glixin (Streptomyces, Streptoverticillium,
Sporichthya, Nocardioides)
Nhóm CW II: Có chứa mezo-DAP và Glixin.
Nhóm CW III: Có chứa mezo-DAP.
Nhóm CW IV: Có chứa mezo- DAP, arbinoza và galactoza [3, 29].
Thành tế bào xạ khuẩn chủ yếu chia thành 3 lớp: lớp ngoài dày 60-120Å, khi
già có thể dày tới 150Å; lớp giữa rắn chắc dầy 50Å và lớp trong dày 50Å. Thành tế
bào cấu tạo chủ yếu từ các lớp glucopeptit gồm các gốc N-axetylglucozamin liên kết
với N-axetylmuzamic bởi liên kết 1,4-glucozit. Khi xử lý bằng lizozim các liên kết
này bị phá vỡ, thành tế bào bị phá huỷ và màng nguyên sinh chất bao bọc phần còn lại
của tế bào tạo thành tế bào trần (protoplast). Cấu trúc sợi cũng mất đi khi xử lý bằng

hỗn hợp eter, clorofoc và các dung môi hoà tan lipit. Điều đó chứng tỏ lớp ngoài


7
thành tế bào xạ khuẩn có cấu tạo bằng lipit. Thành tế bào xạ khuẩn không chứa
xenluloza hay kitin [3, 6, 13].
Đối với xạ khuẩn phân lập từ vùng ngập mặn, chúng có thành tế bào dày và độ
bền cơ học cao để có thể chống chịu với môi trƣờng khắc nghiệt bên ngoài (nồng độ
muối trung bình 3-4%, pH 6,8 - 8,5 và nhiệt độ dao động từ 20-35 C). Ở pH trung
tính và kiềm nhƣ ở biển, so với xạ khuẩn trung tính, thành tế bào của xạ khuẩn chịu
kiềm ngoài peptitdoglycan còn chứa nhiều polyme axit nhƣ là axit galacturonic, axit
gluconic, axit glutamic, axit asparic và axit photphoric. Với điện tích âm tạo bởi thành
phần axit không thuộc peptidoglican, bề mặt tế bào có thể hấp thụ đƣợc ion Na
+
và H
+

trong khi đẩy ion OH
-
. Bên cạnh đó, tuy cấu trúc lớp peptitdoglycan là giống nhau ở
xạ khuẩn trung tính và chịu kiềm nhƣng lại khác nhau về thành phần các hợp chất cấu
thành, xạ khuẩn ƣa kiềm chứa nhiều hesosamin và axit amin [25].
- Màng tế bào chất nằm dƣới lớp thành tế bào, dày 7,5-10,0 nm. Chúng có cấu
trúc và chức năng tƣơng tự nhƣ màng tế bào chất của vi khuẩn: chủ yếu gồm 2 thành
phần là photpholipit và protein; màng chứa nhiều enzym có vai trò đặc biệt quan trọng
trong quá trình vận chuyển và trao đổi chất qua màng [6].
* Thể trung gian (mezoxom) nằm ở phía trong màng tế bào chất, có hình phiến,
hình bọng hay hình ống. Công dụng của thể trung gian là làm tăng diện tích tiếp xúc
của màng tế bào chất và do đó tăng cƣờng hoạt tính enzim, tăng chuyển điện tử [3].
* Các vật thể ẩn nhập nằm trong tế bào chất của xạ khuẩn gồm có các hạt

poliphotphat (hình cầu, bắt mầu với thuốc nhuộm Soudan III), các hạt polisaccarit (bắt
màu với dung dịch Lugol) [3].
Xạ khuẩn là nhóm vi khuẩn Gram (+), “nhân” của xạ khuẩn cùng loại với nhân
của “vi khuẩn”, nhƣng khác với nhóm vi sinh vật không có nhân thực khác là tỉ lệ
G+C cao (>70%) trong khi đó ở vi khuẩn là 25 - 40%.
Một trong những đặc điểm đáng lƣu tâm của xạ khuẩn là chúng không bền
vững về di truyền và thƣờng xảy ra sự sắp xếp lại trong phân tử ADN. Điều này gây


8
ra một số hiện tƣợng kì lạ khác: tạo ra tính đa dạng của hình thái, tính kháng thuốc do
sự xuất hiện các dị vòng [3, 6, 23].
1.1.4. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn
Xạ khuẩn là nhóm vi khuẩn đặc biệt. Trên môi trƣờng đặc xạ khuẩn phát triển
thành những khuẩn lạc khô, kích thƣớc khuẩn lạc thay đổi tùy từng loại và điều kiện
hoàn cảnh. Khuẩn lạc xạ khuẩn không trơn ƣớt nhƣ ở vi khuẩn, nấm men mà thƣờng
có dạng thô ráp, có các nếp toả ra theo hình phóng xạ vì vậy mới có tên gọi là xạ
khuẩn (actinomycetes, tiếng Hi Lạp: Aktis là “tia”, mykes là “nấm”). Khuẩn lạc xạ
khuẩn thƣờng chắc (dùng que cấy không di đƣợc khuẩn lạc của xạ khuẩn vì khuẩn ty
cơ chất bám sâu trong thạch). Mặt khuẩn lạc xù xì, có dạng da, dạng vôi, dạng nhung
tơ hay dạng màng dẻo. Khuẩn lạc của xạ khuẩn không thể lẫn với khuẩn lạc của nấm
vì khuẩn ty của xạ khuẩn thƣờng mảnh hơn của nấm mốc (khuẩn ty cơ chất 0,8µm;
khuẩn ty khí sinh 1,14µm), đƣờng kính khuẩn ty nấm có thể lớn hơn 10 lần đƣờng
kính khuẩn ty của xạ khuẩn [3].
Khuẩn lạc xạ khuẩn thƣờng có 3 lớp: lớp vỏ ngoài là các sợi bện chặt, lớp trong
tƣơng đối xốp và lớp giữa có cấu trúc tổ ong. Khuẩn ty trong mỗi lớp có hoạt tính sinh
học khác nhau. Các sản phẩm trong qúa trình trao đổi chất nhƣ: chất kháng sinh, độc
tố, enzym, vitamin, axit hữu cơ… đƣợc tích lũy trong mỗi lớp khác nhau. Khuẩn lạc
xạ khuẩn có màu sắc khác nhau: đỏ, da cam, vàng, lam, tím tùy thuộc vào loại và điều
kiện ngoại cảnh. Có loại xạ khuẩn có thể tạo sắc tố tan trong môi trƣờng nuôi cấy,

thƣờng gặp các loại mang màu: xanh, tím, đỏ, da cam, vàng, lục, nâu và đôi khi màu
đen. Có sắc tố tan trong nƣớc, có sắc tố chỉ tan trong dung môi hữu cơ [3, 6, 34].


9

Hình 1.1. Khuẩn lạc xạ khuẩn
1.1.5. Sự hình thành bào tử xạ khuẩn
Xạ khuẩn sinh sản bằng cách tạo bào tử. Khuẩn ty khí sinh phát triển ra ngoài
không khí và thƣờng phần cuối các khuẩn ty này biến thành cuống sinh bào tử. Hai
dạng cuống sinh bào tử (sporophore) và cuống sinh nang bào tử (sporangiophorres) có
thể riêng rẽ, có thể phân nhánh.
Cuống sinh bào tử (sporophore) hình thành bào tử trần (conidia hay
conidiospores). Các chuỗi bào tử trần có thể chỉ là 1 bào tử, có thể có 2 bào tử, có thể
là chuỗi ngắn hoặc dài, có thể các bào tử trần nằm trên bó sợi (synnema), tƣơng tự bó
sợi của nấm.
Cuống sinh nang bào tử (sporangiophorres) mang bào tử kín (sporangio-spores)
nằm trong túi (nang) bào và bào tử di động [3].
Hình thái, kích thƣớc của cuống sinh bào tử và bào tử là một đặc điểm quan
trọng nhất trong phân loại xạ khuẩn.
Cuống sinh bào tử thƣờng có dạng thẳng (R) hay hơi cong (F), dạng xoắn lò so
(kí hiệu S) xoắn đơn giản hình móc câu (RA). Cuống sinh bào tử dạng xoắn có chiều
dài và số vòng khác nhau. Cuống sinh bào tử dạng thẳng có thể là dài hoặc ngắn với
các dạng lông cứng hoặc có thể thon lại, uốn cong hay kéo dài. Những đặc điểm này


10
rất quan trọng khi định tên xạ khuẩn. Cuống sinh bào tử xạ khuẩn hình thành bào tử
theo 3 phƣơng thức sau:
- Phƣơng thức phát triển toàn bộ: toàn bộ hay một bộ phận của khuẩn ty hình

thành ra các thành của bào tử.
- Phƣơng thức phát triển trong thành: thành bào tử sinh ra từ tầng nằm giữa
màng nguyên sinh chất và thành khuẩn ty. Trƣờng hợp này gặp ở Planomonospora.
- Phƣơng thức phát triển bào tử nội sinh thật: thành khuẩn ty không tham gia
vào quá trình hình thành bào tử. Trƣờng hợp này gặp ở Thermoactinomycetes [3].
- Hình thái bảo tử cũng là một đặc điểm quan trọng trong định tên xạ khuẩn.
Bào tử trần (conodiospore) của xạ khuẩn có thể có hình tròn, hình bầu dục, hình que,
hình trụ. Bề mặt bào tử xạ khuẩn có dạng trơn nhẵn, xù xì, có vẩy, có gai, có lông.
Bào tử trần là cơ quan sinh sản chủ yếu của xạ khuẩn. Bào tử trần đƣợc hình thành
đồng thời trên tất cả chiều dài của cuống sinh bào tử theo hai phƣơng thức khác nhau:
- Vách ngăn hình thành dần từ phía trong của màng tế bào và tiến dần vào trong
tạo ra những vách ngăn không hoàn chỉnh, sau đó sợi bào tử mới phân cắt thành các
bào tử trần.
- Thành tế bào và màng tế bào đồng thời xuất hiện vách ngăn tiến dần vào phía
trong làm cho sợi bào tử phân cắt, đồng thời tạo thành chuỗi bào tử trần [3].
Muốn kích thích hình thành bào tử, trƣớc hết phải kích thích sự sinh trƣởng của
khuẩn ty khí sinh. Ví dụ khi nghiên cứu 6 chủng S. griseus, Kalakoutski và Agre
(1973) nhận thấy muốn kích thích khuẩn ty khí sinh nên sử dụng các môi trƣờng có bổ
sung pepton, NaCl và glixerin. Một số tác giả khác cho rằng việc bổ sung CaCO
3
và
CaCl
2
vào môi trƣờng cũng kích thích quá trình hình thành bào tử ở xạ khuẩn. Tuy
nhiên việc bổ sung các nguyên tố vào môi trƣờng phải đƣợc nghiên cứu kỹ và chỉ sử
dụng ở nồng độ nhất định. Môi trƣờng nuôi cấy nghèo dinh dƣỡng sẽ kích thích hình
thành bào tử ở xạ khuẩn còn môi trƣờng nuôi cấy giàu dinh dƣỡng thì quá trình sinh
bào tử thƣờng bị kìm hãm. Độ ẩm và nhiệt độ cũng có ảnh hƣởng đến sự hình thành
bào tử [6].

11
Ở các chủng xạ khuẩn sinh chất kháng sinh thuộc chi Streptomyces, khả năng
sinh kháng sinh liên quan đến sự hình thành bào tử đƣợc thể hiện rất rõ. Trong nhiều
trƣờng hợp khi kích thích hình thành bào tử, hiệu suất sinh tổng hợp chất kháng sinh
giảm đi. Khi nghiên cứu đột biến và chọn lọc chủng xạ khuẩn sản xuất oxytetraxylin
và streptomyxin ngƣời ta nhận thấy nếu sự hình thành bào tử kém thì khă năng sinh
tổng hợp kháng sinh lại tăng. Đây cũng là đặc điểm cần lƣu ý khi nghiên cứu chọn lọc
các chủng có hoạt tính cao. Nhƣ vậy, sự hình thành bào tử và khả năng sinh kháng
sinh ở xạ khuẩn có mối quan hệ nghịch [16, 24].

Hình 1.2. Bào tử xạ khuẩn
1.1.6. Sinh tổng hợp chất kháng sinh
Xạ khuẩn là nhóm sinh vật có khả năng sinh kháng sinh cao, 60 - 70% xạ
khuẩn phân lập đƣợc từ đất có khả năng này. Trong số 9000 chất kháng sinh đã đƣợc
biết đến trên thế giới thì trên 80% là do xạ khuẩn sinh ra. Chi Streptomyces là chi
quan trọng nhất trong nhóm xạ khuẩn, với trên 500 loài đã đƣợc miêu tả. Chi này có
nhiều loài có khả năng sinh kháng sinh, một trong số các kháng sinh rất quan trọng là
Streptomycin do S. griseus sinh ra. Khả năng sinh chất kháng sinh là kết quả của quá
trình đối kháng giữa các vi sinh vật và thúc đẩy quá trình tiến hoá của xạ khuẩn [17].


12
Chất kháng sinh là chất trao đổi bậc 2, thông thƣờng đƣợc hình thành ở cuối
pha sinh trƣởng, trong pha cân bằng. Ở xạ khuẩn, sinh tổng hợp chất kháng sinh có
quan hệ nghịch với sự hình thành bào tử. Đó là điểm cần lƣu ý trong khi nghiên cứu
sinh tổng hợp kháng sinh từ xạ khuẩn [12].
Đối với sinh tổng hợp chất kháng sinh ở xạ khuẩn, ngƣời ta thƣờng mô tả hai
pha: pha sinh trƣởng (trophophase): khuẩn ty sơ cấp phát triển nhanh với nguyên sinh
chất đồng nhất làm giảm nguồn cacbon, nitơ và pH; pha sinh tổng hợp (idiophase):

sinh trƣởng chậm lại đôi khi xuất hiện quá trình tự tan của khuẩn ty và sinh tổng hợp
chất kháng sinh mạnh [6, 16]. Cũng có tác giả chia sự phát triển của giống thành 4
hoặc 6 pha theo các đặc điểm sinh hoá tế bào. Trong một số trƣờng hợp quá trình sinh
học này lại diễn ra mạnh mẽ trong pha sinh trƣởng nhƣ trƣờng hợp của chủng xạ
khuẩn Saccharothrix sp. SA 103 phân lập từ Sahara của Algeria, sinh kháng sinh
mutactimycin PR (Anthracycline mới). Quá trình tƣơng tự cũng đã thấy ở chủng
Saccharothrix sp. SA 233 sinh dithiolopyrrolone và chủng S. clavuligerus sinh axit
clavulanic [12,30].
Mặc dù chất kháng sinh có cấu trúc khác nhau và vi sinh vật sinh ra nó cũng đa
dạng nhƣng quá trình sinh tổng hợp chúng dƣờng nhƣ theo một số con đƣờng nhất
định. Các con đƣờng này chỉ là sự cải biên các con đƣờng sinh tổng hợp của tế bào.
Các vật liệu ban đầu của của qúa trình chuyển hoá chất trao đổi bậc hai (chất kháng
sinh) là những chất trao đổi sơ cấp. Chất kháng sinh đƣợc tổng hợp từ 1, 2 hoặc 3 chất
trao đổi bậc nhất, hoặc có thể là trùng hợp các hợp chất bậc nhất rồi biến đổi chúng
bằng các enzim. Mọi con đƣờng sinh tổng hợp chất kháng sinh đều có sự tham gia của
các enzim hoặc hệ thống enzim đặc biệt. Các enzim này đƣợc mã hoá bởi các gen nằm
trong những cụm (cluster) trên nhiễm sắc thể hoặc trên plasmit. Ví dụ tổng hợp
chlotetraxyclin ở S. aureofaciens có 3 hệ thống enzim (hay hệ thống gen) tham gia: hệ
thống 1 với hơn 200 gen mã cho các enzim chuyển glucoza thành axetyl-CoA; hệ
thống 2 chuyển axetyl-CoA thành malonyl-CoA; hệ thống 3 chuyển malonyl CoA


13
thành chlotetracyclin. Tổng số gen ở 3 hệ thống liên quan tới tổng hợp chlotetracyclin
lên tới 2000 gen [16,31,32,35].
Các chất kháng sinh từ xạ khuẩn rất phong phú và đa dạng, nguyên nhân là 1
loại kháng sinh có thể do nhiều loài vi sinh vật khác nhau tổng hợp ra, cũng có khi 1
loại vi sinh vật tạo ra nhiều loại kháng sinh khác nhau [31, 32]. Ví dụ, có tới 27 chủng
xạ khuẩn khác nhau có thể tổng hợp đƣợc kháng sinh oxytetraxyclin, hay
Streptomyces rimosus cùng lúc có thể tổng hợp đƣợc oxytetracylin và rimicidin. Ngày

nay số lƣợng chất kháng sinh đƣợc sản xuất từ xạ khuẩn tăng lên đáng kể, rất nhiều
trong số đó đã đƣợc sản xuất ở quy mô thƣơng mại, có ý nghĩa lớn trong y học và
mang lại nhiều lợi nhuận.
1.2. PHÂN LẬP CÁC CHỦNG XẠ KHUẨN SINH TỔNG HỢP CHẤT KHÁNG
SINH
1.2.1. Phân lập các chủng xạ khuẩn sinh chất kháng sinh
Nhu cầu về các chất kháng sinh sử dụng trong nông nghiệp hiện nay rất lớn do
sự xuất hiện của nhiều tác nhân gây bệnh mới, cùng với hiện tƣợng kháng thuốc
kháng sinh ngày càng phổ biến. Việc tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có khả năng đối
kháng các chủng vi sinh vật gây bệnh trên cây trồng sẽ giúp hạn chế thuốc hóa học mà
vẫn có tính an toàn cao [31,32,33].
Một trong những chính sách nhằm tách và tinh sạch các chất kháng sinh mới
với mong muốn là khám phá các hệ sinh thái đặc biệt, nhƣ ở tầng nƣớc sâu, vùng biển
có nồng độ muối cao hay vùng khí hậu khô cằn. Từ năm 1975 đến 1994, một số loài
xạ khuẩn mới đã đƣợc phân lập và mô tả nhƣ Actinopolyspora halophila,
Actinopolyspora mortivalis và Actinopolyspora. Trong nỗ lực tìm kiếm những chất
kháng sinh mới, gần đây các nhà khoa học đã phân lập đƣợc một chủng xạ khuẩn kí
hiệu Actinopolyspora AH1 ở Alibag, một vùng biển ở phía tây Ấn Độ. Chủng này
thuộc chi Actinopolyspora, có đặc điểm ƣa mặn (sinh trƣởng ở nồng độ muối 8-
15%w/v) và sinh trƣởng tối ƣu ở pH 7,6. Chủng này khác với tất cả các chủng trong
chi Actinopolyspore đã đƣợc mô tả trƣớc đây nên đƣợc coi là một chủng mới [15, 20].


14
Năm 1928, Fleming tình cờ phát hiện ra nấm Penicilium sinh kháng sinh penicilin.
Nhƣng ngày nay, cũng nhƣ các loại vi sinh vật sinh chất kháng sinh khác, xạ khuẩn
đƣợc tìm ra theo quy trình tuyển chọn có hệ thống và cân nhắc kỹ lƣỡng, thƣờng tuân
theo sơ đồ nhất định.
Tuy nhiên, hiếm khi phân loại đƣợc một chủng từ tự nhiên có khả năng sinh
kháng sinh cao đạt yêu cầu cho sản xuất thƣơng mại, do đó công việc tuyển chọn

giống luôn gắn liền với những thành tựu của di truyền học và đặc biệt là các phƣơng
pháp làm đột biến lí hoá, kỹ thuật khuếch đại gen nhờ plasmit. Kết quả của những
nghiên cứu cơ bản này đã giúp cho việc lựa chọn những giống có hoạt lực cao trong
các điều kiện nuôi cấy ổn định và hình thành quy trình công nghệ áp dụng trong sản
xuất có quy mô rộng lớn [1, 9].
1.2.2. Phân loại và định tên xạ khuẩn
Trong số xạ khuẩn đã đƣợc đặt tên thì Actinomyces Hart là loài lâu đời nhất.
Actinomyces israeli đƣợc coi là chủng xạ khuẩn kị khí thuần chủng đầu tiên (1889), vì
trƣớc khi phát triển phƣơng thức giữ giống đông khô thì khó có thể bảo quản vi sinh
vật lâu dài và nhiều chủng giống đã bị thất lạc. Do vậy không có chủng xạ khuẩn nào
đƣợc tìm ra sớm hơn các chủng mà Waksman phát hiện và lƣu trong danh mục Bộ
sƣu tập giống của ông (1916-1919). Cho đến nay, có thêm rất nhiều chủng xạ khuẩn
đƣợc lƣu trong danh mục giống xạ khuẩn [6, 14].
Ba phƣơng pháp phân loại xạ khuẩn là phƣơng pháp phân loại truyền thống,
phƣơng pháp phân loại bằng kỹ thuật phân tử và phân loại số.
a) Phương pháp phân loại truyền thống
Krainski (1914) lần đầu tiên đề ra các chỉ tiêu về đặc điểm sinh lí và coi đó là
mấu chốt trong nguyên tắc phân loại để sơ bộ phân loại 17 chủng thuộc chi
Actinomyces. Waksman và Curtis (1916), Waksman (1919) đã đề cập đến những dạng
trung gian trong mô tả phân loại của mình và coi đặc điểm hình thái của bào tử là đặc
tính quan trọng của các cá thể. Do vậy họ đã đƣa ra một số loài mới có ý nghĩa. Tiếp
đó Millard và Burr (1926) tìm ra 17 loài, Jensen (1930-1931) – 2 loài, Dunche (1934)


15
– 13 loài. Baldacci và cộng sự đã bắt đầu nghiên cứu xạ khuẩn từ năm 1936 và đến
năm 1953 công bố một khoá phân loại chi Streptomyces dựa trên cơ sở màu sắc khuẩn
ty khí sinh, khuẩn ty cơ chất và một số đặc điểm trung gian khác nhau [11]. Năm
1943, Waksman và Henrici đã đƣa ra một số hệ thống phân loại và đến năm 1961 có
sửa đổi [36]. Trong hệ thống này, xạ khuẩn đƣợc xếp thành nhóm gồm 3 họ, chia nhỏ

thành 10 chi và mô tả chi tiết hơn 250 loài thuộc chi Streptomyces. Krassilnikov là
một trong những chuyên gia nổi tiếng về nghiên cứu và phát triển khoá phân loại xạ
khuẩn. Từ năm 1941 đến năm 1949 ông đã phát triển 38 loài mới. Năm 1970, ông lại
công bố hệ thống phân loại mới dựa trên hệ thống đã công bố năm 1949. Trong đó xạ
khuẩn đƣợc phân chia thành 6 họ, gồm 26 chi. Theo ông Actinomyces đƣợc dùng nhƣ
một tên gọi chung cho những loài thuộc chi Streptomyces mà Waksman và Henrici đã
phác hoạ năm 1943 [14].
Một số nhà nghiên cứu ngƣời Đức (Flaig và cộng sự, 1952; Flaig và Kutzner,
1954; Kuster và Geiuz, 1955) cho rằng chi Streptomyces là một nhóm lớn. Lần đầu
tiên họ sử dụng kính hiển vi điện tử để nghiên cứu đặc điểm bào tử của chi này.
Kutzner đã phát triển một khoá phân loại Streptomyces dựa trên cơ sở hình dáng
cuống sinh bào tử, cấu trúc hiển vi điện tử của bào tử, sự tạo thành sắc tố tan, hoạt phổ
kháng khuẩn và một số đặc điểm sinh lí khác [18].
Năm 1957, Gauze và cộng sự đã công bố hệ thống phân loại mới. Hệ thống này
dựa vào màu sắc khuẩn ty khí sinh, khuẩn ty cơ chất, hình dạng bào tử và cuống sinh
bào tử. Hệ thống này cũng đƣợc chỉnh lý và tái bản năm 1983. Số lƣợng hệ thống
phân loại xạ khuẩn ngày một tăng trong những năm gần đây (Praceser, 1968; Kuster,
1972; Pridham, 1974; Arai; 1969; Nonomura, 1974; Szabos, 1965…). Đó là hình thức
phân loại truyền thống dựa trên đặc điểm hính thái và tính chất nuôi cấy. Hình thức
này hiện nay vẫn đang đƣợc sử dụng phổ biến.
b) Phương pháp phân loại sinh học phân tử
Ngày nay nhờ sự phát triển cao của kỹ thuật, phƣơng pháp phân loại phân tử đã
đƣợc sử dụng vào phân loại xạ khuẩn. Trong hệ thống phân loại xạ khuẩn hiện nay


16
ngƣời ta vẫn dùng 3 phƣơng pháp chính: lai ADN, lai ARN và phân tích rARN 16S
[37, 38]. Kết quả đƣợc biểu hiện bằng số phần trăm sự đồng nhất (homology). Hiện
nay, đại đa số các nhà khoa học đồng ý với quan niệm hai chủng đƣợc coi là hai loài
riêng biệt nếu chúng giống nhau dƣới 70% khi tiến hành lai ADN. Phân tích rARN

16S để liệt kê thứ tự các nucleotit đặc trƣng của cá thể và so sánh với bảng liệt kê của
cơ thể khác để xác định mức độ giống nhau của chúng. Keswani và cộng sự đã chứng
minh rằng nếu sự tƣơng đồng giữa hai trình tự rADN 16S là 98.6% thì xác suất để
mức độ giống nhau trong phép lai ADN thấp hơn 70% sẽ là 99%. Vì thế giá trị tƣơng
đồng 98.6% của trình tự rADN 16S đƣợc coi là ngƣỡng để phân biệt hai loài khác
nhau. Tuy nhiên, cũng có nhiều nhà khoa học lấy giá trị này là 98%.
Bằng phƣơng pháp phân loại này, những kiến thức về phân loại cũng có nhiều
thay đổi. Ví dụ các nhà phân loại cho rằng chi Nocardia dị nhân (heterogeneous), nên
về mặt di truyền đã xếp loài Nocardia mediterranci sinh rifamixin vào chi
Streptomyces và mang tên mới là S. mediterranci; hợp nhất hai chi Streptomyces và
Streptoverticillium vào một chi Streptomyces hoặc chuyển loài Nocardia erythropolis
vào chi Mycobacterium (mang tên mới M. rodochrous) [23].
Vì số lƣợng các loài xạ khuẩn mới đƣợc mô tả ngày càng nhiều và để việc phân
loại nhanh, chính xác về di truyền phân tử, ngƣời ta đã sử dụng phƣơng pháp phân
loại số (dùng máy vi tính) cũng nhƣ đƣa thêm các đặc điểm phân loại và phát sinh
chủng loại.
c) Phân loại số (Numerical taxonomy)
Phân loại số đã đƣợc Williams và cộng sự (1983) sử dụng để phân loại chi
Streptomyces và các chi có quan hệ gần gũi. Phƣơng pháp này dựa trên sự đánh giá về
số lƣợng mức độ giống nhau giữa các vi sinh vật theo một số lớn các đặc điểm, chủ
yếu là các đặc điểm hình thái, sinh lý – sinh hoá. Để so sánh các chủng với nhau từng
đôi một, Sneath (1973) đề nghị tính hệ số giống nhau S (similarity) theo phƣơng trình
sau:


17
%S =
ds
s
NN

xN 100

Trong đó: Ns – Tổng số các đặc điểm dƣơng tính của 2 chủng so sánh.
Nd – Tổng số các đặc điểm dƣơng tính của chủng này và âm tính của chủng kia.
Kết quả phân tích số đƣợc biểu diễn bằng sơ đồ nhánh mà trên đó các chủng
tuỳ theo mức độ giống nhau đƣợc nhóm thành từng cụm (Cluster) [26, 27]. Bằng phân
loại số, ngƣời ta chia xạ khuẩn chi Streptomyces thành 21 nhóm lớn, 37 nhóm nhỏ và
13 cụm với những đại diện duy nhất. Trên cơ sở nhận đƣợc, ngƣời ta đƣa ra thuật toán
học để xác định những chủng xạ khuẩn chƣa biết. Mặc dù nguyên tắc là giảm số
lƣợng các đặc điểm, nhƣng cũng còn tới 139 đặc điểm đã đƣợc sử dụng trong phân
loại số [10, 21, 23].
Cả ba phƣơng pháp phân loại trên hiện vẫn đang đƣợc sử dụng độc lập hoặc kết
hợp với nhau để định tên loài một cách chính xác trong phân loại xạ khuẩn hiện nay.
Mỗi phƣơng pháp có một ƣu điểm nhất định, tuy nhiên vì lí do thực dụng, ngƣời ta
vẫn chủ yếu dựa vào phƣơng pháp truyền thống là chủ yếu.
1.3. Chất kháng sinh từ xạ khuẩn
1.3.1. Lịch sử nghiên cứu chất kháng sinh
Theo định nghĩa của Outchinnikov. Chất kháng sinh là chất có nguồn gốc thiên
nhiên và các sản phẩm cải biến của chúng bằng con đƣờng hóa học có khả năng tác
dụng chọn lọc đối với sự phát triển của VSV, tế bào ung thƣ ở ngay nồng độ thấp.
Ngƣời đầu tiên đặt nền móng cho khoa học nghiên cứu CKS là Alexander
Fleming – Nhà sinh vật học ngƣời Anh, đã phát hiện ra penixillin vào tháng 10
năm 1928.
Sau một thập kỷ, nhờ sự nỗ lực hợp tác của các nhà vi sinh học và sinh hóa học
Anh, Mỹ, penixillin đã đƣợc nghiên cứu, sản xuất với số lƣợng lớn và trở thành
“một loại thuốc thần kỳ”. Năm 1945, A.Fleming, E.Chain và H.W.Florey đã đƣợc