Nghiên cứu sử dụng chế phẩm Nano Chitosan Tinh dầu Nghệ trong quá trình bảo quản quả Cam (LV thạc sĩ)

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

NGUYỄN THỊ THANH NGA

NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG CHẾ PHẨM NANO CHITOSAN
TINH DẦU NGHỆ TRONG QUÁ TRÌNH BẢO QUẢN QUẢ CAM

Chuyên ngành
Mã số

: Vi sinh vật học
: 60 42 01 03

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS. PHẠM VIỆT CƢỜNG

Hà Nội – Năm 2014
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN




LỜI CẢM ƠN
Để có thể hoàn thành luận văn thạc sĩ một cách hoàn chỉnh, bên cạnh sự
nỗ lực cố gắng của bản thân còn có sự hướng dẫn nhiệt tình của quý Thầy Cô,
cũng như sự động viên ủng hộ của gia đình và bạn bè trong suốt thời gian học
tập nghiên cứu và thực hiện luận văn thạc sĩ.
Xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS. Phạm Việt
Cường – Phòng Công nghệ Sinh học – Viện Hóa sinh biển, người đã hết lòng

giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi hoàn thành luận văn này.
Đồng thời, tôi xin được gửi lời cảm ơn tới PGS.TS. Nguyễn Thị Kim
Cúc, ThS. Trần Thị Kim Dung cùng các anh chị em trong phòng Công nghệ
sinh học - Viện Hóa sinh Biển đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên
cứu để hoàn thành đề tài luận văn.
Xin chân thành biết ơn đến toàn thể quý Thầy Cô trong bộ môn Vi sinh
vật học đã tận tình truyền đạt những kiến thức quý báu cũng như tạo mọi điều
kiện thuận lợi nhất cho tôi trong suốt quá trình học tập nghiên cứu và cho đến
khi thực hiện đề tài luận văn.
Cuối cùng xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn đến gia đình, bạn bè,
những người đã không ngừng động viên, hỗ trợ và tạo mọi điều kiện tốt nhất
cho tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận văn.
Hà Nội, Ngày 30 tháng 09 năm 2014
Học viên

Nguyễn Thị Thanh Nga
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN




MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN .................................................................................................. 1
MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 4
PHẦN I: TỔNG QUAN ................................................................................. 6
1.1. Nano chitosan ....................................................................................... 6
1.1.1. Chitosan .......................................................................................... 6
112 P

n p

1.1.3. Hoạt tín

p

u

n no

tos n từ chitosan.. ...................... 7

ối kháng vi sinh vật của chitosan ............................. 10

1.1.4. Ứng dụng nano chitosan ............................................................. 11
1.2. Tinh dầu nghệ ..................................................................................... 12
1.2.1. Giới thiệu chung v nghệ ............................................................. 12
1.2.2. Thành phần hóa học .................................................................... 13
1.2.3. Hoạt tính sinh học của tinh dầu nghệ ........................................ 15
124 P

n t ức kháng khuẩn của tinh dầu.................................... 18

1.3. Cây Cam .............................................................................................. 20
1.3.1. Giới thiệu v cây Cam .................................................................. 20
1.3.2. Giá trị d n d ỡng trong 100g quả Cam..................................... 22
1.3.3. Vi sinh vật gây hỏng quả Cam..................................................... 22
1.3.4. Biện pháp bảo quản rau hoa quả t

s u t u oạch ............... 25

1.4. Những nghiên cứu trong nƣớc và thế giới về quá trình bảo quản
Cam ............................................................................................................. 27
1.4.1. Trên th giới ................................................................................. 27
142

ron n ớ ................................................................................... 29

PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................... 31
2.1. Nguyên vật liệu ................................................................................... 31
2.1.1. Đố t ợng nghiên cứu .................................................................. 31
2.1.2. Hóa chất sử dụng ......................................................................... 32
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN




2.1.3. Thi t bị, dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu .............................. 32
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu................................................................... 33
221 Đ n

oạt tính kháng nấm mốc của ch phẩm nano

chitosan k t hợp với tinh dầu nghệ. ...................................................... 33
2.2.2. Nghiên cứu sử dụng ch phẩm nano chitosan – tinh dầu nghệ ể
xử lý C m tr ớc thu hoạch. ................................................................... 34
2.2.3. Nghiên cứu sử dụng ch phẩm nanochitosan - tinh dầu nghệ
trong quá trình bảo quản cam sau khi thu hoạch. ............................... 35
PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................... 38
3.1. Đánh giá khả năng đối kháng nấm mốc gây hỏng quả của chế
phẩm nano chitosan với tinh dầu nghệ in vitro...................................... 38

3.2.Nghiên cứu sử dụng chế phẩm nano chitosan - tinh dầu nghệ xử lý
Cam trƣớc thu hoạch. ............................................................................... 41
3.3. Nghiên cứu sử dụng chế phẩm nano chitosan – tinh dầu nghệ để
bảo quản Cam sau thu hoạch ................................................................... 46
PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................... 55
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 56
PHỤ LỤC: HÌNH ẢNH CAM THÍ NGHIỆM TRƢỚC THU HOẠCH . 64

Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN




1

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT.
ĐC

: Đối chứng.

NCS – TDN

: Nano chitosan kết hợp với tinh dầu nghệ.

NC

: Nanochitosan

TDN

: Tinh dầu nghệ

TD

: Tinh dầu

CS

: Chitosan

CT

: Công thức

CS1

: Chín sớm 1

ĐBSCL

: Đồng bằng sông cửu long

MIC

: Nồng độ ức chế nấm tối thiểu

MFC

: Nồng độ tiêu diệt nấm tối thiểu

BVTV

: Bảo vệ thực vật

Cz

: Czapek – dok

ĐTG

: Độ thường gặp

CV%

: Sai số tương quan (CV% của thí nghiệm trong

phòng phải < 5%, còn thí nghiệm ngoài đồng CV phải < 10%).

Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN




2

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1: Giá trị dinh dƣỡng trong 100 g quả Cam) [58] ......................... 22
Bảng 3.1: Khả năng kháng nấm của các chế phẩm ................................... 39
Bảng 3.2: Một số chỉ tiêu sinh trƣởng của cây Cam CS1 ......................... 42
Bảng 3.3: Ảnh hƣởng của việc phun NCS-TDN lên năng suất và các yếu

tố cấu thành năng suất của cam CS1........................................................... 43
Bảng 3.4: Ảnh hƣởng của việc phun NCS-TDN lên chất lƣợng quả Cam CS1
......................................................................................................................... 44
Bảng 3.5: Ảnh hƣởng của việc phun NCS-TDN lên thành phần sâu bệnh
hại ch nh trên Cam CS1 ............................................................................... 45
Bảng 3.6: Một số chỉ tiêu chất lƣợng đặc trƣng của quả Cam CS1 ......... 46
Bảng 3.7: Ảnh hƣởng thời gian bảo quản lên cam chín sớm CS1 ............ 48
Bảng 3.8: Tỉ lệ quả bị hƣ hỏng, thối mốc trong quá tr nh ảo quản, (%)
......................................................................................................................... 49
Bảng 3.9: Sự biến đổi chất lƣợng cảm quan của Cam CS1 trong quá tr nh
bảo quản ......................................................................................................... 51
Bảng 3.10: Sự biến đổi tỉ lệ nhăn vỏ cam CS1 trong quá trình tồn trữ (%)
......................................................................................................................... 52

Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN




3

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
Hình 1.1: Cấu trúc hóa học của chitosan đƣợc điều chế từ chitin. ............ 6
Hình 1.2: Hình thái cây nghệ ....................................................................... 13
Hình 1.3: Cấu trúc của các hợp chất curcumin trong nghệ...................... 14
Hình 1.4: Cấu trúc của một số hợp chất trong tinh dầu nghệ .................. 14
Hình 1.5: Vị tr và các cơ chế trong tế bào vi khuẩn đƣợc cho là điểm
hoạt tính của tinh dầu:.................................................................................. 18
Hình 1.6: Hình thái Fusarium oxysporum....... Error! Bookmark not defined.
Hình 1.7: Hình thái nấm Aspergillus awamori Nakazawa: ....................... 24

Hình 1.8: Hình thái của Penicillium italicum.............................................. 24
Hình 1.9: Sự phát triển của Penicillium italicum trên môi trƣờng Czapek
có bổ sung chế phẩm ở các nồng độ khác nhau: (a) môi trƣờng không có
chế phẩm, ( ) môi trƣờng có bổ sung kháng sinh Miconazole 20 μg/ml, (c)
môi trƣờng có bổ sung Chitosan 100 μg/ml, (d) môi trƣờng có bổ sung
Tinh dầu nghệ 100 μg/ml, (e) môi trƣờng có bổ sung Nanochitosan 100
μg/ml, (f) môi trƣờng có bổ sung Nanochitosan - tinh dầu100 μg/ml. ..... 65

Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN




4

MỞ ĐẦU
Tinh dầu nghệ được biết đến như là một chất có khả năng chống oxy
hóa và có tính đối kháng vi sinh vật tốt, nhất là ức chế các vi sinh vật có khả
năng gây hỏng quả. Trong khi chitosan là một loại polymer carbohydrate tự
nhiên được tạo ra bằng cách deacetyl hóa chitin, có thể tìm thấy trong nhiều
loài động vật giáp xác, côn trùng và một vài loại nấm. Với nhiều tính năng
như tính tương thích sinh học, phân hủy sinh học, bám dính màng và không
độc hại nên hiện nay nó trở thành nguyên liệu cho nhiều ứng dụng trong dược
sinh học và thực phẩm chức năng. Vì những tính chất ưu việt của nó mà trong
những năm gần đây, chitosan đã được nghiên cứu sử dụng để tạo ra các hạt
nano chitosan. Cùng với tinh dầu nghệ, nano chitosan là chất có khả năng
kháng nấm và vi khuẩn mạnh.
Tinh dầu nghệ còn là một sản phẩm phụ của quá trình tách chiết
curcumin nên việc tận dụng tinh dầu nghệ để tạo hạt nanochitosan tinh dầu
nghệ dùng để bảo quản trái cây sau thu hoạch không những mở ra hướng mới

trong lĩnh vực bảo quản mà còn có giá trị về mặt kinh tế.
Quả tươi và rau rất dễ bị hỏng và mẫn cảm đối với các bệnh sau thu
hoạch, hạn chế thời gian bảo quản và đưa chúng ra thị trường. Ngoài ra, hư
hỏng sau thu hoạch gây thất thu kinh tế đáng kể trên toàn thế giới. Như đã
biết, các loại thuốc diệt nấm tổng hợp được sử dụng từ lâu như phương thức
chính để kiểm soát các bệnh sau thu hoạch. Nhưng hiện người ta lo ngại về
ảnh hưởng của các chất này đến sức khỏe người tiêu dùng cũng như sự xuất
hiện của các nguồn bệnh kháng thuốc. Vì vậy cần có các biện pháp thay thế
để kiểm soát nguồn bệnh sau thu hoạch có hiệu quả, dư lượng thấp, ít độc
hoặc không độc đối với cơ thể và môi trường.

Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN




5

Trong sản phẩm rau hoa quả của Việt Nam, quả Cam đang chiếm vị trí
quan trọng trong xuất khẩu, mang lại hiệu quả kinh tế cao. Nên việc sử dụng
các chất hoạt tính sinh học tự nhiên để bảo quản rau quả đang thu hút được
nhiều sự quan tâm và chú ý.
Vì vậy chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu sử dụng
ch phẩm Nano Chitosan- Tinh dầu Nghệ trong quá trình bảo quản quả
Cam” với hy vọng đóng góp thêm phương pháp bảo quản rau hoa quả mới
vừa an toàn vừa hiệu quả.
Mục tiêu củ


tài:

Thử nghiệm in vitro chế phẩm nano chitosan và tinh dầu nghệ

với vi sinh vật gây hỏng quả Cam.


Thử nghiệm chế phẩm nano chitosan và tinh dầu nghệ trên quả

để kéo dài thời gian bảo quản Cam, đảm bảo Cam còn tươi, không bị vi sinh
vật làm hỏng quả.
Nội dung nghiên cứu:


Đánh giá hoạt tính kháng nấm gây hỏng quả của chế phẩm nano

chitosan kết hợp với tinh dầu nghệ.


Nghiên cứu sử dụng chế phẩm nanochitosan - tinh dầu nghệ để

xử lý Cam trước khi thu hoạch.


Nghiên cứu sử dụng chế phẩm nanochitosan - tinh dầu nghệ để

bảo quản Cam sau khi thu hoạch.

Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN

6

PHẦN I: TỔNG QUAN
1.1. Nano chitosan
1.1.1. Chitosan
Chitosan, được phát hiện bởi Rouget vào năm 1859 [55], là một loại
polymer polysaccharide sinh học quan trọng.Về mặt hóa học, đó là một phân
tử có trọng lượng phân tử cao, polycationic gồm hai monosaccharides, Nacetyl-D-glucosamine và D-glucosamine, liên kết với nhau bởi cầu nối β-(1
→ 4) glycosidic (Hình 1.1). Hàm lượng tương đối của hai monosaccharides
trong chitosan có thể khác nhau, phụ thuộc vào mức độ deacetyl hóa (7595%), khối lượng phân tử (50-2.000 kDa), độ nhớt, giá trị pKa, v.v... [23]. Do
đó, chitosan không thể được định nghĩa là một hợp chất duy nhất, nó chỉ đơn
thuần là họ của các copolymer với các phân số khác nhau của các đơn vị
acetyl.

Hình 1.1: Cấu trúc hóa học của chitosan đƣợc điều chế từ chitin.
Chitosan liên kết (1→4) 2- amino-2-deoxy-ß-D-glucan, đƣợc điều chế từ
chitin qua quá trình thủy phân nhóm N-acetyl- bằng kiềm.
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN




7

Chitosan chủ yếu được sản xuất từ quá trình deacetyl hóa chitin xảy ra
trong môi trường kiềm: Chitin sôi trong kiềm nồng độ cao vài giờ (40-45%
natri hydroxit, 120°C, 1-3h). Trong điều kiện đó N-deacetyl hóa xảy ra không
hoàn toàn, chitosan được xem như là một dẫn xuất một phần N-deacetyl hóa

của chitin.
Chitosan cũng được tìm thấy trong tự nhiên, chẳng hạn như trong thành
tế bào của nấm thuộc lớp Zygomycetes [43], tảo xanh Chlorella sp., nấm men
và động vật nguyên sinh cũng như lớp biểu bì trong côn trùng [ 38]. Gần đây
trong công nghệ lên men cho thấy nấm (Aspergillus niger) có thể cung cấp
một nguồn thay thế chitosan.
1.1 2 P

n p

p

u

n nochitosan từ chitosan.

Công nghệ nano là một công nghệ rất quan trọng trong khoa học, chủ
yếu là do ứng dụng rộng rãi của nó trong một phạm vi rộng lớn bao gồm các
ngành kỹ thuật, y học, hóa học và sinh học. Việc sử dụng các biopolymer như
polysaccharide trong công nghệ nano ngày càng được quan tâm, là trọng tâm
nghiên cứu của các nhà khoa học trên toàn thế giới.
Trong 30 năm qua, kỹ thuật điều chế nano chitosan đã được phát triển
dựa trên công nghệ chitosan vi hạt.Trước kia, người ta dùng sodium sulphate
như chất để tủa. Năm 1994, một số tác giả đã sử dụng glutaraldehyde như
chất liên kết để liên kết chéo các nhóm amino tự do của chitosan, sau đó nhũ
tương hóa (emulsifier), tạo hạt 5-fluorouracil (5-FU) chitosan với kích thước
trung bình 0,8 ± 0,1µm [42]. Phương pháp này hiện vẫn được dùng. Nhìn
chung, kỹ thuật chế tạo hạt chitosan nano (chitosan NP) đã được phát triển
dựa trên kỹ thuật vi hạt chitosan, có ít nhất 4 phương pháp dùng để điều chế
hạt nanochitosan: phương pháp tạo gel ion (ionotropic gelation), vi nhũ tương

(microemulsion), khuếch tán dung môi nhũ tương (emulsification solvent

Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN




8

diffusion) và tổ hợp đa điện phân (polyelectrolyte complex). Hai phương pháp
thường sử dụng là tạo gel ion và tổ hợp đa năng điện phân.[41].
P

n p

p Ionotropic gelation (tạo gel ion)

Nano chitosan chuẩn bị bằng kỹ thuật gel ionotropic lần đầu tiên được
Calvo và cộng sự báo cáo. Cơ chế tạo nanochitosan dựa trên tương tác tĩnh
điện giữa nhóm amine của chitosan và nhóm tích điện âm của polyanion như
tripolyphosphate.Trước tiên, chitosan có thể hòa tan trong acetic acid, có hoặc
không có chất ổn định, sau đó bổ sung anionic polyme. Khuấy ở nhiệt độ
phòng và các hạt nano được tạo thành một cách tự phát. Có thể thay đổi kích
thước và điện tích bề mặt của hạt bằng cách thay đổi tỉ lệ chitosan và chất ổn
định [7]. Hiện tại phương pháp này được sử dụng nhiều nhất, ưu điểm của
phương pháp này là quá trình chuẩn bị đơn giản và không cần phải sử dụng
dung môi hữu cơ hay sử dụng lực nén lớn, do đó phương pháp này được
nghiên cứu rộng rãi trong tổng hợp chất dẫn thuốc và thực phẩm chức năng.
P

n p

p M roemuls on (v n ũ t

n )

Nano chitosan được điều chế bằng kỹ thuật microemulsion lần đầu tiên
được phát triển bởi Maitra và cộng sự [7]. Kỹ thuật này dựa trên sự hình
thành của nano chitosan bên trong giọt micellar đảo ngược và sau đó liên kết
ngang qua glutaraldehyde. Trong phương pháp này, một chất hoạt động bề
mặt được hòa tan trong N-hexane. Sau đó, chitosan trong dung dịch acetic và
glutaraldehyde được thêm vào chất có hoạt tính bề mặt / hỗn hợp hexane,
khuấy liên tục ở nhiệt độ phòng. Hạt nano được hình thành trong sự hiện diện
của chất hoạt động bề mặt. Hệ thống này được khuấy qua đêm để hoàn thành
liên kết ngang, và nhóm amin của chitosan kết hợp với glutaraldehyde. Các
dung môi hữu cơ được lấy ra bằng cách bay hơi dưới áp suất thấp. Sản phẩm
thu được là nano chitosan liên kết ngang và chất hoạt động bề mặt dư thừa.
Chất hoạt động bề mặt dư thừa được lấy ra bằng cách kết tủa với CaCl2 và sau
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN




9

đó được loại bỏ bằng ly tâm. Cuối cùng các hạt nano được thẩm tách và đông
khô (lyophilyzation). Kỹ thuật này cung cấp hạt kích thước nhỏ hơn 100 nm
và kích thước các hạt có thể được kiểm soát bằng cách thay đổi lượng
glutaraldehyde từ đó làm thay đổi mức độ liên kết ngang. Tuy nhiên, phương
pháp có một số nhược điểm như việc sử dụng các dung môi hữu cơ, quá trình

chuẩn bị tốn thời gian, và sự phức tạp trong bước rửa.
P

n p

pk u

t n dun mô n ũ t

n

ó

El-Shabouri báo cáo nano chitosan được điều chế bằng phương pháp
khuếch tán dung môi nhũ tương[7]. Phương pháp này được dựa trên một phần
sự trộn lẫn của dung môi hữu cơ bằng nước. Nhũ tương thu được sau khi trộn
chất hữu cơ vào dung dịch chitosan có chứa một chất ổn định (poloxamer)
khuấy cơ, tiếp theo là đồng nhất áp suất cao. Nhũ tương này sau đó được pha
loãng với một số lượng lớn nước để khắc phục sự trộn lẫn dung môi hữu cơ
trong nước. Sự kết tủa polymer xuất hiện như là kết quả của sự khuếch tán
dung môi hữu cơ vào trong nước, dẫn đến hình thành của các hạt nano.
Phương pháp này phù hợp cho các loại thuốc kỵ nước và cho thấy tỷ lệ ngậm
thuốc cao. Nhưng nhược điểm chính của phương pháp này bao gồm điều kiện
xử lý khắc nghiệt (ví dụ, việc sử dụng các dung môi hữu cơ) và lực cắt cao
được sử dụng khi điều chế các hạt nano.
Ph

n p

p polyelectrolyte complex (PEC)(tổ hợp

ện phân)

Màng polyelectrolyte hoặc tập hợp nhóm polyelectrolyte là một thuật
ngữ để mô tả màng được hình thành bằng cách tự lắp ráp của polyme mang
cation và DNA plasmid. Cơ chế của PEC hình thành liên quan đến việc trung
hòa điện tích giữa cation polymer và DNA dẫn tới phá vỡ phân tử ưa nước.
Một số polyme cation (tức là gelatin, polyethylenimine) cũng có tính chất
này. Nói chung, kỹ thuật này cung cấp phương pháp chuẩn bị đơn giản. Các
hạt nano được hình thành một cách tự nhiên sau khi bổ sung các DNA vào
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN




10

chitosan hòa tan trong dung dịch axit axetic, tiếp theo khuấy cơ học ở nhiệt độ
phòng. Kích thước phức hợp có thể được thay đổi từ 50 nm đến 700 nm. [7]
1.1.3. Hoạt tín

ối kháng vi sinh vật của chitosan

Khả năng đối kháng vi sinh vật của chitosan được sử dụng rộng rãi, tuy
nhiên, cơ chế đối kháng vi sinh vật chính xác của nó cho đến nay vẫn chưa
được định rõ ràng.
Một vài cơ chế tác động kháng khuẩn của chitosan đã được đưa ra: (i)
tạo phức với các nguyên tố vết hoặc các chất dinh dưỡng thiết yếu, như vậy
ức chế sinh trưởng của vi khuẩn; (ii) có thể tương tác với các nhóm anion trên
bề mặt tế bào và tạo ra các phức hợp điện phân với các hợp chất trên bề mặt

vi khuẩn, tạo ra một lớp không thấm quanh tế bào, ngăn cản sự vận chuyển
của các chất hòa tan cần thiết vào trong tế bào.
Kiểm tra bằng kính hiển vi điện tử của chế phẩm chitosan ức chế vi
sinh vật cho thấy, vị trí hoạt động của nó là ở trên bề mặt tế bào vi sinh vật.
Chủng Candida albicans tiếp xúc với chitosan hoặc các dẫn xuất của chitosan
dưới kính hiển vi điện tử thấy tổn thương tế bào ở mức độ khác nhau [31].
Cơ chế đối kháng vi sinh vật của chitosan được cho là do cation của
chitosan tương tác và làm gián đoạn màng tế bào. Có giả định cho rằng bản
chất polycationic của chitosan là tích điện dương do mang nhóm -NH3+ của
glucosamine, có thể là một yếu tố cơ bản góp phần tương tác với các thành
phần tích điện âm trên màng của nhiều loại nấm và vi khuẩn, gây ra thay đổi
bề mặt tế bào, rò rỉ các chất trong tế bào, cuối cùng dẫn đến suy giảm các hoạt
động quan trọng của vi sinh vật [18].
Chitosan được chứng minh có hoạt tính đối kháng nấm như Aspergillus
niger, Alternaria alternata, Rhizopus oryzae, Phomopsis asparagi, và
Rhizopus stolonifer. Có 3 cơ chế được đưa ra cho các cách ức chế của
chitosan. (i) màng plasma của nấm là đích chính của chitosan. Điện tích
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN




11

dương của chitosan tương tác với các thành phần phospholipid tích điện âm
của màng nấm, điều này làm tăng tính thấm của màng làm cho các thành phần
trong tế bào bị thoát ra, dẫn đến tế bào bị chết; (ii) chitosan hoạt động như
một chất kẹp (chelating) bằng cách gắn với các nguyên tố vết, làm cho nấm
không thể sử dụng các chất dinh dưỡng thiết yếu để sinh trưởng bình thường;
và (iii) chitosan có thể thâm nhập vào màng tế bào và gắn với DNA, điều này

sẽ ức chế tổng hợp mRNA và như vậy ảnh hưởng đến việc tạo ra các protein
và enzyme cần thiết. Mặt khác, một số báo cáo cho rằng còn các cơ chế hoạt
động khác, như liên kết với nước, làm bất hoạt enzyme, chọn lọc chelation vi
lượng khoáng cần thiết cho các enzyme của vi khuẩn, có thể sáng tỏ cơ chế
kháng vi sinh vật của chitosan. [29].
Young và cộng sự [36] cho rằng chitosan làm cho ion Ca2+ được giải
phóng từ phức tạo ổn định màng tế bào của Glycine max, kết quả làm mất ổn
định của màng và gây rò rỉ các thành phần tế bào. Tokura và cộng sự [43], đã
quan sát thấy chitosan (MW = 9300) xếp chồng lên nhau trên thành tế bào và
ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn E. coli. Họ cho rằng hoạt tính kháng
khuẩn có liên quan đến việc kìm hãm các hoạt động trao đổi chất của vi khuẩn
bằng cách ngăn chặn cung cấp chất dinh dưỡng qua màng tế bào [43].
1.1.4. Ứng dụng nano chitosan
Các hạt nano chitosan chủ yếu được ứng dụng trong y học như chất
mang và phân phối thuốc. Ở Việt Nam, đã có một số nghiên cứu tạo hạt nano
trên cơ sở polysacarit, đặc biệt là chitosan. Nói chung, những hạt nano này
mới chỉ được khảo sát về tính chất hóa lý và khả năng mang thuốc, được ứng
dụng trong y sinh, cụ thể là ứng dụng dẫn thuốc còn hầu như chưa được
nghiên cứu cho những ứng dụng khác (ngoại trừ nghiên cứu về axit glutamic
ứng dụng cho mục đích làm chất mang thuốc paclitaxel củaViện Hóa học,
Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam)[3].
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN




12

Trên thế giới đã có nhiều công bố ứng dụng hạt nano trong y học. Hạt
có kích cỡ nano có thể được tiêm tĩnh mạch vì đường kính của mao mạch máu

là khoảng 4 mm. Các hạt có đường kính lớn hơn 100 nm nhanh chóng được
hấp thụ bởi hệ thống lưới nội mô (RES) trong gan, lá lách, phổi và xương tủy,
trong khi các hạt có kích cỡ nhỏ hơn có xu hướng lưu thông kéo dài một thời
gian. Thuốc được nghiên cứu rộng rãi là những chất chống ung thư. Sau khi
tiêm tĩnh mạch, nhiều hạt nano chitosan tích tụ trong một số khối u. Nano
chitosan kìm hãm sự phát triển của khối u và nâng cao tỷ lệ sống của chuột có
khối u thực nghiệm sau khi được điều trị [6]. Ngoài ra, hạt nano chitosan có
kích thước nhỏ hơn 100 nm được dùng như thuốc kháng khuẩn, kháng virus,
kháng nấm,và thuốc chống ký sinh trùng[6].
Có giả thuyết cho rằng các hạt nano có thể bảo vệ thuốc không bị phân
giải bởi enzyme trong đường tiêu hóa. Pan và cộng sự báo cáo rằng tác dụng
hạ đường huyết đã được quan sát ở các con chuột mắc bệnh tiểu đường sau
khi uống các hạt nano chitosan [7].
Chitosan là vector chuyển gen hứa hẹn lần đầu tiên được đề xuất bởi
Mumper [16]. Chitosan được chứng minh có hiệu quả trong chuyển gen in
vitro. Hạt nano thường thể hiện tác dụng bổ trợ đáng kể cho vắc-xin. Kích
thước siêu nhỏ của hạt nano cho phép chúng được hấp thụ bởi các tế bào M,
trong mô bạch huyết niêm mạc, kích hoạt các vị trí của phản ứng miễn dịch
mạnh mẽ [30].
1.2. Tinh dầu nghệ
1.2.1. Giới thiệu chung v nghệ
Cây nghệ vàng thuộc họ Zingiberaceae, chi Curcuma, loài Longa. Tên
khoa học của cây nghệ vàng là: Curcuma longa Linaeus (C. longa L.).

Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN




13

Hình 1.2: Hình thái cây nghệ
Nghệ được trồng ở khu vực ấm áp và có mưa nhiều trên thế giới như
Trung Quốc, Ấn Độ, In-đô-nê-xi-a. Tại Ấn Độ, nó được phổ biến và được gọi
là Haldi (Tiếng Hin-ddi). Tại Ma-lay-xi-a, In-đô-nê-xi-a và Ấn Độ, nghệ đã
được nghiên cứu do tầm quan trọng về kinh tế của nó[19].
1.2.2. Thành phần hóa học
Thành phần trong củ nghệ vàng gồm: protein (6,3%), chất béo
(5,1%),khoáng

chất

(3,5%),

carbohydrates

(69,4%)

và

độ

ẩm

(13,1%). Phenolic diketone, curcumin (diferuloylmethane) (3 - 4%) quy định
màu vàng của nghệ, và bao gồm curcumin I (94%), chất curcumin II (6%) và
chất curcumin III (0,3%) (Hình 1.3). Phenolic diketones demethoxycurcumin
và bis-demethoxycurcumin cũng đã được phân lập từ thân rễ Curcuma
longa. Sự có mặt của tumerones (a, b), curdione, curzerenone, mono-và didemethoxycurcumin đã được tìm thấy trong thân rễ. Tinh dầu (5,8%) thu
được bằng cách chưng cất hơi nước, phần thân rễ có chứa thành

phần phellandrene(1%), sabinene (0,6%), cineol (1%), borneol (0,5%),
zingiberene (25%) và sesquiterpines (53% ) [10].

Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN




14

Hình 1.3: Cấu trúc của các hợp chất curcumin trong nghệ
Kelkar và Sanjeev Rao [29] báo cáo rằng tinh dầu nghệ được điều chế
bằng phương pháp chưng cất hơi nước dễ bay hơi chủ yếu là một hỗn hợp
củasesquiterpene xeton và rượu. Malingre [32] báo cáo thành phần chiết của
C.longa gồm p-cymene, b-sesquiphellandrene, turmerone, ar-turmerone và
rượu sesquiterpene (Hình 1.4).

Hình 1.4: Cấu trúc của một số hợp chất trong tinh dầu nghệ
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN




15

Chen và cộng sự [11] so sánh thành phần của các loại dầu dễ bay hơi
của thân rễ và củ nghệ vàng nguồn gốc Trung Quốc C. Longa gồm:
Turmerone (24%), ar-turmerone (8,4%) và curdione (11,58%) (Hình 1.4) là
các hợp chất quan trọng trong cả hai loại dầu. Tuy nhiên, ar-curcumene đã
được tìm thấy trong dầu thân rễ là 12,2%, nhưng nó đã không được báo cáo

trong dầu củ. Gopalan và Ratnambal [20] so sánh các thành phần chính của
dầu nghệ sản xuất từ giống cây trồng khác nhau. Dầu lá nghệ Việt Nam chứa
chủ yếu là α-phellandrene (24,5%), 1,8-cineole (15,9%), p-cymene (13,2%)
và β-pinene (8,9%). Cooray và cộng sự [13] cho biết các thành phần chính
của dầu thân rễ được sản xuất từ một giống nghệ duy nhất được trồng ở Sri
Lanka, và nó đã được báo cáo rằng ar-turmerone (24,7-48,9%) và turmerone
(20-39%) là những hợp chất chính. McCarron và cộng sự đã sử dụng phương
pháp phân tích GC-MS để so sánh hợp chất monoterpene hydrocarbon của
các loại dầu sản xuất từ lá và rễ của C. longa tươi, phát hiện ra rằng
hydrocarbon monoterpene của lá và các loại dầu thân rễ tươi tương ứng là
92,9 và 16,3%. Dầu thân rễ của C. longa nguồn gốc Trung Quốc được phân
tích bằng GC-MS [44]. Dầu này được cho là chứa 17 thành phần hóa học,
trong đó turmerone (24%), ar-turmerone (18%) và germacrone (11%) là các
hợp chất chính.
1.2.3. Hoạt tính sinh học của tinh dầu nghệ
* Hoạt tính chống viêm: Tinh dầu của Curcuma longa có hiệu quả
chống viêm và anti-hyaluronidase. Các tác giả cho rằng hiệu quả chống oxy
hóa của dầu được chứng minh bằng sự ức chế khả năng khuếch tán của
hyaluronidase enzyme. Dầu từ lá Curcuma longa cũng cho thấy hoạt tính
chống viêm ở chuột bạch thực nghiệm. Dịch chiết thân rễ làm giảm sự phát
triển của u hạt và không độc đối với động vật.

Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN




16

* Hoạt tính chống oxy hóa: Scatezzini và cộng sự (2000) đã nghiên

cứu hoạt tính chống oxy hóa của một số thực vật sử dụng trong y học cổ
truyền của Ấn Độ. Nghiên cứu này chỉ ra rằng cây nghệ được sử dụng nhiều
trong quá trình chuẩn bị liệu pháp Ayurvedic cách đây hàng ngàn năm [40].
Lee (2006) phát hiện ra thành phần hủy tiểu cầu ar-turmerone có nguồn gốc từ
thân rễ của cây nghệ Curcuma longaL., ở nồng độ ức chế 50% (IC50) arturmerone ức chế sự tạo khối của tiểu huyết cầu do collagen cảm ứng (IC50,
14,4 μM) và axit arachidonic (IC50 43,6 μM). Xác định được hoạt tính chống
oxy hóa của dịch chiết methanol của thân rễ tươi và khô từ 4 dòng nghệ
(Curcuma longa L.) nuôi cấy in vitro [14]. Đã xác định hoạt tính chống oxy
hóa của dịch chiết dầu nghệ đen trồng ở Việt Nam [5].
* Tác dụng giảm mỡ: Khi sử dụng 1mg dịch chiết nghệ trong 15 ngày,
lượng lipid giảm rõ rệt: lượng cholesterol tổng, triglycerides và LDL giảm từ
55-40% ở động vật thí nghiệm. Ngoài ra, dịch chiết này còn làm giảm nguy
cơ xơ cứng động mạch. Các tác giả cho rằng uống dịch chiết nghệ ức chế oxy
hóa LDL và có hiệu quả giảm cholesterol ở thỏ thí nghiệm [25].
* Chống dị ứng và làm lành v t t

n : Dịch chiết thô của thân rễ nghệ

có hoạt tính ức chế cycloxygenase (COX) tốt trong thử nghiệm sinh học in vitro.
* Antivenom activity (trị nọ

ộc): Phân đoạn có chứa ar-turmerone chiết

từ C. longa trung hòa hiệu quả tính gây chết và hoạt tính xuất huyết của nọc rắn ở
chuột. Trong nghiên cứu này, ar-turmerone có khả năng thủ tiêu hoạt tính xuất
huyết của nọc độc Bothrops và khoảng 70% hiệu quả gây chết của nọc độc
Crotalus. Những nghiên cứu miễn dịch học chứng minh rằng ar-turmerone ức chế
sự tăng sinh và hoạt tính giết tự nhiên của lyphocytes người [17;25].
* Hoạt tính kháng khuẩn: Tinh dầu nghệ được thử với các chủng
Staphylococcus albus, Staphylococcus aureus và Bacillus typhosus, kết quả

cho thấy sinh trưởng của Staphylococcus albus, Staphylococcus aureus bị ức
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN




17

chế ở các nồng độ khác nhau. Đối với vi khuẩn đường ruột, sinh trưởng của
lactobacilis bị ức chế bởi tinh dầu nghệ ở nồng độ 4,5-90μl/100 ml.
Jayaprakasha và cs (2002) báo cáo hoạt tính kháng khuẩn của dầu nghệ được
tách từ dịch mẹ sau khi đã tách lấy curcumin [26]. Dầu nghệ được phân đoạn
bằng chưng cất chân không thu được 2 phân đoạn, các phân đoạn này được
thử với một số chủng nấm như Aspergillus flavus, A. parasiticus, Fusarium
moniliforme và Penicillium digitatum bằng phương pháp nảy mầm bào tử.
Phân đoạn nhận được bằng chưng cất chân không ở 110-120ºC có hiệu quả
hơn. Kết quả phân tích GC/MS cho thấy trong phân đoạn này chủ yếu là
turmerone thơm, turmerone và curlone cùng với các hợp chất oxy hóa khác
[8;42]. Theo Dhingra và cs. (2007), tinh dầu nghệ (Curcuma longa L, ) độc
đối với 7 loại nấm hại nông sản trong kho. Phụ thuộc vào loại nấm, sự ức chế
phát triển của chúng dao động từ 36%-77%, Aspergillus flavus, Fusarium
semitectum, Colletotrichum gloeosporioides và C. musae là những loại mẫn
cảm nhất, bị ức chế sự phát triển trên 70%, ar-turmerone chiếm 87% của hợp
chất dầu kháng nấm và ar-turmerone tinh sạch có hoạt tính kháng nấm tương
tự như dầu thô [16]. Behura và cộng sự thấy trong 5 nguồn bệnh nấm lúa
được xử lý với tinh dầu nghệ, Rhizotonia solani mẫn cảm nhất và F.
moniliforme kháng mạnh nhất với sự phát triển bị giảm 81% và 2,5%, tương
ứng [9]. Tương tự, Saju và cộng sự báo cáo ở nồng độ 1%-5% tinh dầu nghệ,
sự phát triển của C. gloeosporioides, Sphaceloma caradmomi và
Pestdlotiopsis palmarum hoàn toàn bị ức chế, trong khi đó F.solani chỉ bị ức

chế 79% [37]. Phan Minh Giang, Phan Tống Sơn (2000) [35] đã tách
sesquiterpenoids trong dung môi n-hexan của củ nghệ Curcuma
cochinchinensis gagnep được 4 phân đoạn curdione (1), curcumol (2),
isocurcumenol (3) và curcumenol (4). Các tác giả đã nghiên cứu hoạt tính
kháng vi sinh vật của các sesquiterpenoids này. Các hợp chất 1, 2 và 3 trộn
với nhau theo tỉ lệ 2:1: 4 có khả năng ức chế sự phát triển của Staphylococcus
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN




18

aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa,
Candida albicans, Aspergillus niger, Fusarium oxysporum khác nhau. Nồng
độ ức chế tối thiểu của hợp chất 1 lớn hơn 300 μg/ml đối với Staphylococcus
aureus, Bacillus subtilis, Candida

albicans, Aspergillus niger, Candida

albicans mẫn cảm với hợp chất 2+3 và 4 với nồng độ ức chế tối thiểu là 50
μg/ml [35].
* Các tác dụng khác: Chống ung thư, kháng virus, chống nhiễm trùng,
chữa lành vết thương và loại độc của ar-turmerone tách chiết từ Curcuma
longa được chứng minh [17]. Ngoài ra nó còn có tác dụng chống nôn, chống
co thắt, làm giảm táo bón.
124 P

n t ức kháng khuẩn của tinh dầu

Mặc dù có rất nhiều nghiên cứu về thành phần và hoạt tính kháng
khuẩn của tinh dầu thực vật, nhưng cơ chế hoạt tính của chúng chưa được
nghiên cứu tỉ mỉ. Do tinh dầu có rất nhiều nhóm các hợp chất hóa học khác
nhau, nên có lẽ hoạt tính kháng khuẩn của chúng không do một cơ chế đặc
biệt nào mà có một vài đích trong tế bào (hình 1.5).

Hình 1.5: Vị tr và các cơ chế trong tế bào vi khuẩn đƣợc cho là điểm
hoạt tính của tinh dầu: phân hủy thành tế bào; làm hư hại màng tế bào; làm
hỏng protein màng; các thành phần tế bào bị rò rỉ; tủa tế bào chất; và lực đẩy
proton bị suy yếu [39].
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN




19

Một đặc điểm quan trọng của tinh dầu là tính kỵ nước, cho phép chúng
phân cắt lipids của màng tế bào vi khuẩn và mitochondria, làm xáo trộn cấu
trúc và làm chúng dễ bị thẩm thấu hơn. Mặc dù một số lượng chất nhất định
nào đó bị mất đi nhưng tế bào vẫn không bị chết, nhưng khi mất nhiều hoặc
các phân tử quan trọng và ion bị mất đi tế bào sẽ bị chết.
Nhìn chung, tinh dầu thực vật chứa hàm lượng lớn các hợp chất phenol
cao như carvacrol, eugenol và thymol, có hoạt tính kháng nguồn bệnh thực
phẩm cao. Rất có lý khi cho rằng cơ chế hoạt tính của chúng tương tự như các
phenolics khác đó là làm xáo trộn màng tế bào chất, gián đoạn lực đẩy proton,
dòng electron, vận chuyển chủ động và làm tủa các chất trong tế bào.
Cấu trúc hóa học của các thành phần trong từng loại tinh dầu tác động
đến cơ chế hoạt động và hoạt tính của chúng. Tầm quan trọng của sự có mặt
của các nhóm hydroxyl trong các hợp chất phenolic đã được chứng minh. Các

thành phần của tinh dầu cũng tác động lên protein gắn trong màng tế bào chất.
Các enzymes như ATPases được biết nằm trong màng tế bào chất và được
bao quanh bởi các phân tử lipids. Các phân tử lipophilic hydrocacbon có thể
tích tụ trong lớp lipid kép và làm hỏng tương tác lipid-protein; ngoài ra có thể
có sự tương tác trực tiếp của các hợp chất lipophilic với phần kỵ nước của
protein. Một vài tinh dầu kích thích sinh trưởng của pseudomycelia (một loạt
tế bào gắn với nhau do sự phân tách không hoàn thiện của các tế bào mới tạo
thành) của một số nấm men. Điều đó có thể biểu thị tác động của tinh dầu lên
enzyme tham gia vào quá trình điều hòa năng lượng hoặc tổng hợp các thành
phần cấu trúc quan trọng. Tinh dầu dã hương và các thành phần của nó được
chứng minh ức chế axit amino decarboxylases trong Enterobacter aerogenes.
Cơ chế này được cho là do gắn với protein.
Gần đây các nghiên cứu cho thấy điểm hoạt tính của các hydrocacbon
vòng, gồm cả terpene hydrocacbons là màng tế bào. β-pinene làm rò rỉ K+, H+
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN




20

và ảnh hưởng đến hô hấp của nấm men. Tương tự, cyclohexane, limonene và
β-pinene cũng ức chế hô hấp và các quá trình phụ thuộc năng lượng khác liên
quan đến màng tế bào S.cerevisiae. Các hydrocacbon terpenes như α-pinene,
β -pinene, γ-terpinene và limonene được tìm thấy ảnh hưởng tới các đặc điểm
cấu trúc và chức năng của màng nhân tạo, chúng làm cho màng thấm tốt hơn
và phồng lên. Điều này ức chế các enzyme hô hấp, dẫn đến pH gradient và
điện thế bị trục trặc, mà đây là những yếu tố then chốt cho hệ năng lượng
trong tế bào. Phần lớn các terpenoids ức chế quá trình hấp thu oxy và
phosphoryl hóa của vi sinh vật [39;21].

1.3. Cây Cam
1.3.1. Giới thiệu v cây Cam
Quả Cam là một trong những loại trái cây quen thuộc có chứa tinh dầu
mang mùi thơm và nhiều vitamin C, rất mát và bổ dưỡng cho cơ thể. Ngoài
ra, mọi bộ phận của cây Cam từ lá, hạt, vỏ… đều có thể làm thuốc.
Theo y học cổ truyền, cam có vị ngọt, chua, tính hơi mát, công năng sinh tân
giải khát, khai vị, chữa ho, đầy bụng, giải độc cá, cua, giải rượu. Vỏ quả Cam
có vị cay, mùi thơm, tính ẩm, tác dụng tiêu đờm, thông khí trệ, giúp tiêu hoá...
Theo Viện Nghiên cứu nông học quốc gia Pháp, uống nửa lít nước Cam
mỗi ngày có thể cải thiện áp lực máu và tái hoạt động của mạch máu (khả
năng giãn nở). Chúng ta chỉ nhớ đến hàm lượng vitamin C trong Cam chứ ít
biết rằng Cam chứa một số các thành phần tổng hợp khác có ích cho sức
khỏe. Trên thực tế, hàm lượng vitamin C chỉ chiếm khoảng 15-20% trên tổng
số các chất chống oxy hóa trong trái cây này, trong khi những hợp chất khác
lại có khả năng chống oxy hóa cao hơn gấp 6 lần so với vitamin C: hesperidin
từ flavanoid, có nhiều trong lớp vỏ xơ trắng, màng bao múi cam và một ít
trong tép và hạt cam, có khả năng giảm cholesterol xấu (LDL) và tăng
cholesterol tốt (HDL). Cam được xem là một “đồng minh” giúp ngăn ngừa
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN




21

các bệnh tim mạch, viêm nhiễm và cả ung thư, ngoài những tính năng mà
người ta nhận biết qua những nghiên cứu từ trước đến nay như củng cố hệ
miễn dịch, chống cảm cúm, giảm tỷ lệ cholesterol xấu, chống viêm, ức chế
các tế bào ung thư, xoa dịu các cơn đau ruột, dạ dày, gan và thúc đẩy nhanh
quá trình liền sẹo.

Cam cũng chứa rutin (vitamin P), thành phần giúp mạch máu khỏe hơn;
vitamin nhóm B, dưỡng chất không thể thiếu cho hệ thần kinh, các khoáng
chất và chất xơ (hòa tan và không hòa tan).
Khi uống nước Cam đều đặn, chúng ta - đặc biệt là trẻ nhỏ - có thể tận
hưởng những dưỡng chất từ loại trái cây chua này (ít calori, giàu vitamin) và
có thể giúp ngăn ngừa nguy cơ phát triển các bệnh tim mạch ở tuổi trưởng
thành. Tuy nhiên, người ta cũng lưu ý rằng Cam nguyên trái, chín cây và sạch
có chứa nhiều hesperidin hơn, vì qua quá trình vắt ép, thành phần này dễ dàng
bị thất thoát.
Tuỳ theo giống sớm hay muộn mà thời gian thu hoạch khác nhau.Thu
hái đúng độ chín khi 1/3 vỏ quả chuyển màu vàng. Không để quả chín lâu trên
cây vì dễ gây ra hiện tượng xốp quả. Tiến hành thu hoạch vào những ngày trời
nắng ráo. Dùng kéo cắt sát cuống quả, thao tác cần phải nhẹ nhàng, không
được làm dập túi tinh dầu ngoài vỏ quả sẽ dễ bị hỏng khi bảo quản. Quả được
thu hoạch xong đưa vào lán trại để phân loại, lau sạch vỏ, vận chuyển đến nơi
bảo quản hoặc tiêu thụ.

Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN