NGHIÊN cứu KHẢ NĂNG ức CHẾ QUÁ TRÌNH SINH ACID của STREPTOCOCCUS MUTANS từ DỊCH CHIẾT lá SIM

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC HẢI PHÒNG

ĐỖ THỊ HƯNG

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG ỨC CHẾ QUÁ TRÌNH
SINH ACID CỦA STREPTOCOCCUS MUTANS
TỪ DỊCH CHIẾT LÁ SIM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN KÝ THUẬT Y HỌC
KHOÁ 2012 - 2016

HẢI PHÒNG - 2016


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC HẢI PHÒNG

ĐỖ THỊ HƯNG

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG ỨC CHẾ QUÁ TRÌNH
SINH ACID CỦA STREPTOCOCCUS MUTANS
TỪ DỊCH CHIẾT LÁ SIM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Chuyên ngành sinh học phân tử

Hướng dẫn khoa học : Ts. Bạch Thị Như Quỳnh


HẢI PHÒNG - 2016

LỜI CẢM ƠN
Xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới các thầy cô trong Ban giám hiệu,
Phòng đào tạo đại học, các bộ môn của trường Đại học Y Dược Hải Phòng đã
dìu dắt, dạy dỗ tôi trong 4 năm học qua.
Tôi xin trân trọng cảm ơn TS.BS Nguyễn Hùng Cường - chủ nhiệm khoa
Kỹ thuật y học, - phó khoa Kỹ thuật y học cùng các thầy cô trong khoa đã tận
tình dạy dỗ chúng tôi suốt 4 năm học tập.
Xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS. Bạch Thị Như Quỳnh- người đã
hướng dẫn tôi nghiên cứu và hoàn thành khóa luận này. Bước đầu làm quen với
phương pháp nghiên cứu khoa học, thầy đã dạy cho tôi từ những điều cơ bản
nhất. Ở thầy tôi học tập được tính chủ động trong công việc và lòng nhiệt huyết
với nghề. Sự nhiệt tình giúp đỡ của thầy khiến tôi thêm động lực vượt qua
những khó khăn để hoàn thành khóa luận một cách tốt nhất.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc TS. Nguyễn Thị Mai Phương - Viện
công nghệ sinh học, người đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá thực hiện và hoàn
thành các quy trình kỹ thuật trong khóa luận.
Con muốn thể hiện lòng biết ơn tới công lao sinh thành, nuôi nấng của
cha mẹ. Cảm ơn gia đình, những người thân yêu đã luôn sát cánh bên con, quan
tâm, động viên và tạo mọi điều kiện cho con học tập.
Cuối cùng tôi muốn gửi lời cảm ơn tới những người bạn đã giúp đỡ tôi rất
nhiều trong học tập và trong cuộc sống.
Hải Phòng, ngày 30 tháng 5 năm 2016
Sinh viên
Đỗ Thị Hưng


CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIÊT NAM
Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

BẢN CAM ĐOAN
Kính gửi: - Ban giám hiệu trường Đại học Y Dược Hải Phòng
- Hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp khoa Kỹ thuật y học
trường Đại học Y Dược Hải Phòng.
Tôi xin cam đoan những kết quả, số liệu được trình bày trong khóa luận
tốt nghiệp này là hoàn toàn trung thực, khách quan, không sao chép từ bất cứ
một nghiên cứu nào khác.
Hải Phòng, ngày 30 tháng 5 năm 2016
Người viết
Đỗ Thị Hưng


MỤC LỤC
.............................................................................................................................38


DANH MỤC HÌNH


DANH MỤC BẢNG

CHỮ VIẾT TẮT
ADS
DNA
EPS
EtO
FDI
GTF
Gtf
HIV

MeOH
OD
PCR
PTS
TLC
TSA
UV

Arginine deiminase
Deoxyribonucleic acid
Extracellular polysacharides
Acethyl acetate
Federal Dental International
Glucosyltransferase
Glucosyltransferase
Human immunodeficiency virus
Methanol
Optical Density
Polymerase chain reaction
Phosphotransferase system
Thin layerchromatography
Tryptic soy agar
Ultra Violet


8

ĐẶT VẤN ĐỀ
Sâu răng là một trong những bệnh răng miệng phổ biến nhất hiện nay và
đang có xu hướng ngày một tăng lên ở các nước đang phát triển. Tổ chức Y tế

thế giới đã cảnh báo về mức độ phổ biến của bệnh này chỉ sau các bệnh tim
mạch và ung thư [9]. Theo số liệu mới nhất (09/2012) của Hội Răng Hàm Mặt
Việt Nam, thực tế có tới hơn 90% dân số Việt Nam đang đối mặt với các vấn đề
về răng miệng, trong đó phổ biến nhất là sâu răng dẫn đến mất răng [10]. Đây là
tỷ lệ thuộc hàng cao nhất thế giới. Ngay cả ở những nước phát triển như Hoa
Kỳ, tỷ lệ sâu răng hiện nay vẫn còn tới 84% ở lứa tuổi thanh niên. Trong những
năm qua, chi phí cho việc chăm sóc, sửa chữa răng tại Việt Nam đã lên tới nhiều
tỷ đồng. Bệnh sâu răng là do vi khuẩn trên mảng bám răng sử dụng
carbonhydrate để lên men tạo acid, trong đó chủ yếu là lactic. Môi trường acid
sẽ phá vỡ sự cân bằng của hệ vi khuẩn đường miệng. Khi lượng acid đủ lớn sẽ
hòa tan các chất khoáng có trong men răng dẫn đến làm mòn men răng, tạo
thành các hố trên răng và gây ra sâu răng [27].
Streptococcus mutans được xác định là tác nhân gây sâu răng chính ở người.
S. mutans được phát hiện ở tất cả các mảng bám răng, có số lượng rất cao ở
những vùng răng sâu và là nguyên nhân chủ yếu dẫn đến bệnh sâu răng [27]. Do
đó, S. mutans được sử dụng như là đối tượng điển hình cho các nghiên cứu về
sâu răng.
Hàng loạt các biện pháp khác nhau nhằm ngăn chặn bệnh sâu răng đã
được nghiên cứu và ứng dụng như: sử dụng các chất kháng khuẩn, sử dụng chất
thay thế đường; sử dụng liệu pháp thay thế; sử dụng vaccine. Trong đó, biện
pháp sử dụng chất kháng khuẩn để kiểm soát sâu răng vẫn tỏ ra hữu hiệu hơn cả.
Tuy nhiên, việc sử dụng lâu dài các chất kháng khuẩn có bản chất hoá học
thường gây ra những phản ứng phụ không mong muốn như làm đổi màu răng,
tạo chủng kháng chất kháng khuẩn ...như trong trường hợp của fluor hay
chlorhexidine [31]. Vì thế, việc tìm kiếm và sử dụng những chất kháng khuẩn tự


9

nhiên, đặc biệt là các chất có nguồn gốc thực vật đang rất được quan tâm và

chúng có thể là những chất thay thế nhiều triển vọng [5], [6], [26].
Ở Việt Nam, việc nghiên cứu về chất kháng khuẩn sâu răng tự nhiên cũng
đã được quan tâm. Nghiên cứu của Nguyễn Quang Huy và cộng sự [4] cho thấy
dịch chiết từ vỏ Sao đen (Hopea odorata Roxb), lá Sắn thuyền (Syzygium
polyanthum (Wight) Walp đều có tác dụng ức chế quá trình sinh acid, diệt khuẩn
hay kìm hãm hoạt độ các enzyme F-ATPase, PTS của chủng S. mutans GS-5 và
S. mutans H2 phân lập từ người Việt Nam [4].
Trong những năm gần đây, nhóm nghiên cứu của Voravuthikunchai và
cộng sự [28], [29], [30], [35], [36] đã phát hiện thấy dịch chiết lá sim
(Rhodomyrtus tomentosa (Aiton) Hassk) có khả năng ức chế sự hình thành
biofilm của Staphylococcus aureus và Staphylococcus epidermidis tốt hơn cả
khi dùng chất kháng sinh vancomycin. Ngoài ra, dịch chiết này còn gây ức chế
sự sinh trưởng của hàng loạt các vi khuẩn trong đó có S. mutans. Những số liệu
nghiên cứu ban đầu này gợi ý rằng dịch chiết lá sim có chứa chất kháng khuẩn
sâu răng mới và triển vọng.
Xuất phát từ những tồn tại chung, xu hướng nghiên cứu hiện nay, cũng
như để góp phần khai thác nguồn nguyên liệu tự nhiên phong phú của nước ta,
chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu khả năng ức chế quá trình sinh acid
của vi khuẩn streptococcus mutans từ dịch chiết lá sim (Rhodomyrtus
tomentosa (Aiton) Hassk”.
với 2 mục tiêu chính:
- Đánh giá khả năng kháng vi khuẩn S. mutans thông qua khả năng ức
chế sự sinh axit của dịch chiết lá sim.
- Thu nhận phân đoạn có hoạt tính kháng vi khuẩn sâu răng.


10

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

BỆNH SÂU RĂNG VÀ VI KHUẨN STREPTOCOCCUS

MUTANS
1.1.1.
Tình hình sâu răng trên thế giới và Việt Nam
Sâu răng là một bệnh gây phá hủy cấu trúc răng. Nếu không được chữa trị
kịp thời sẽ dẫn đến đau răng, mất răng, nhiễm trùng và các bệnh về răng miệng
nguy hiểm khác.
Bệnh sâu răng có lịch sử phát triển từ rất lâu, những bằng chứng khảo cổ
học cho thấy bệnh này bắt đầu xuất hiện từ thời kỳ trung cổ. Sâu răng phát triển
cùng với sự thay đổi về điều kiện sinh hoạt và chế độ ăn uống của con người và
ngày nay, đã trở thành một trong những bệnh phổ biến nhất trên toàn thế giới
[3]. Theo thống kê, 90% trẻ em trên toàn thế giới và hầu hết những người trưởng
thành đều đã từng có những vấn đề về răng miệng. Sâu răng phổ biến nhất ở
những nước châu Á và châu Mỹ La Tinh, các nước châu Phi là nơi có tỷ lệ
người mắc bệnh này thấp nhất [4].
Ở Hoa Kỳ, sâu răng là một bệnh kinh niên và thường gặp nhất ở trẻ em.
Mức độ phổ biến của bệnh cao gấp 5 lần so với bệnh hen suyễn, vốn cũng là một
bệnh được cả thế giới rất quan tâm bởi tính phổ biến và nguy hiểm của nó. Gần
20% trẻ em từ 2 đến 4 tuổi có xuất hiện những lỗ hổng ở chân răng [5]. Đây
cũng là nguyên nhân cơ bản gây nên sự mất răng ở trẻ em. Không chỉ ở trẻ em,
sâu răng còn là một bệnh phổ biến ở tất cả các lứa tuổi. Theo thống kê của tạp
chí sức khỏe răng miệng WebMD (2008) [6, 7], 80% thanh thiếu niên ở độ tuổi
17 đã xuất hiện những lỗ nhỏ li ti trên bề mặt răng. Khoảng 2/3 những người
trưởng thành từ 35-44 tuổi mất ít nhất một răng và có nhiều lỗ hổng trên răng. Ở
những người trên 75 tuổi, có 50% số người có một hoặc nhiều răng bị sâu ở
chân răng.
Việt Nam được xếp vào nhóm các nước có tỷ lệ trẻ em mắc các bệnh về
răng miệng cao nhất thế giới. Kết quả điều tra sức khỏe răng miệng toàn quốc

[6] do Viện Răng Hàm Mặt Hà Nội và Đại học Adelaide (Ôxtrâylia) tiến hành
gần đây đã cho thấy trên 90% dân số Việt Nam bị sâu răng và mắc các bệnh về
răng, đặc biệt tập trung ở lứa tuổi từ 35-44 (Hình 1). Tỷ lệ sâu răng sữa ở trẻ em


11

từ 6-8 tuổi là 85%, trung bình mỗi trẻ có 6 chiếc răng sâu. Tỷ lệ này tăng dần
theo lứa tuổi, cụ thể là cứ 3 trẻ từ 15-17 tuổi thì có 2 trẻ bị sâu răng vĩnh viễn.
Đặc biệt, từ 45 tuổi trở đi có trên 90% người bị sâu răng và trung bình cứ một
người có trên 8 chiếc răng bị sâu.
Hình 1.1. Sự thay đổi về số răng sâu của một người Việt Nam theo độ
tuổi
Đứng trước tình hình đó, ngay từ năm 1908, liên đoàn Nha khoa Quốc tế
(FDI) đã rất quan tâm đến vấn đề dự phòng sâu răng, tuyên bố ủng hộ nguyên
tắc phòng bệnh hơn chữa bệnh, và từ đó liên tục nghiên cứu, tìm kiếm các biện
pháp

để %

phòng

Tuổi
chống căn bệnh này. Các khuyến cáo về dự phòng sâu răng cũng liên tục được
đưa ra nhằm duy trì thành tựu ở các nước công nghiệp phát triển và ngăn chặn
sự gia tăng bệnh răng miệng ở các nước đang phát triển.

1.1.2.Cơ chế gây sâu răng

12

Bệnh sâu răng là tổn thương tiêu huỷ tổ chức cứng của răng (bao gồm
men răng và ngà răng là tổ chức không có tế bào), tạo nên lỗ hổng trên thân
răng. Sâu răng có thể ở bề mặt thân răng hoặc cổ răng, tổn thương sâu trên thân

răng bắt đầu từ men răng, còn tổn thương trên cổ răng bắt đầu từ men răng hoặc
ngà cổ răng. Bệnh không tự khỏi. Sâu răng là bệnh rất phổ biến, có thể gặp ở
mọi lứa tuổi.
Hình 1.2. Cấu trúc răng và nguyên nhân dẫn đến sâu răng
Quá trình này được bắt đầu từ sự hình thành mảng bám răng (dental
plaque) ở cổ răng và kẽ răng, là một lưới polymer sinh học bao gồm protein của
nước bọt, đường, thức ăn thừa và nhiều loài vi khuẩn khác nhau [8]. Vi khuẩn
dính bám trên bề mặt răng tạo thành nhiều lớp, cùng với thức ăn thừa chúng tạo
ra môi trường cho các vi sinh vật kỵ khí sinh sống [9]. Các vi khuẩn này chuyển
hóa đường có trong thức ăn được giữ lại trong xoang miệng tạo thành các acid
hữu cơ bao gồm acid formic, acid acetic và chủ yếu là acid lactic. Acid tạo
thành làm giảm pH trong mảng bám răng, gây nên sự phân hủy khoáng ở men
răng. Chất khoáng bị phân hủy khuếch tán ra khỏi răng, cuối cùng hình thành
các lỗ hổng trên răng. Tuy nhiên, các lỗ hổng này có thể được lấp đầy trở lại bởi
quá trình “tái khoáng hóa” (remineralization). Đó là sự khuếch tán trở lại vào
răng của canxi, photphat và floride, tạo thành lớp vỏ bọc mới phủ lên phần tinh
thể còn lại của răng trong vùng thương tổn. Lớp tinh thể khoáng mới tạo thành
có khả năng chống chịu tốt hơn trong môi trường acid [10]. Quá trình phân hủy
khoáng và tái tạo khoáng diễn ra song song trong một thời gian dài. Tuy nhiên,
nếu để quá trình phân hủy khoáng diễn ra nhanh hơn quá trình tái tạo khoáng sẽ
làm hỏng men răng và dẫn đến bệnh sâu răng.


13

Như vậy, sâu răng là kết quả của một quá trình tương tác giữa nhiều yếu
tố trong đó, vi khuẩn được coi là tác nhân chủ đạo tạo nên sự vận động của quá
trình này. Các vi khuẩn sinh acid trong mảng bám răng đồng thời là các vi khuẩn
chịu acid, điều này có nghĩa là chúng có thể tồn tại và sinh trưởng tốt hơn trong
môi trường có pH thấp. Trong các mảng bám răng thông thường, vi khuẩn sinh
acid chỉ chiếm 1%, thậm chí ít hơn trong tổng số quần thể vi sinh vật. Khi bệnh
bắt đầu phát triển, môi trường trong mảng bám răng trở nên acid hơn và các vi
khuẩn ưa acid sẽ sống sót và sinh sản, lấn át các vi khuẩn lành tính khác. Sự gia
tăng nhanh chóng về số lượng các vi khuẩn sinh acid sẽ tạo nên một lượng lớn
các acid hữu cơ, làm hòa tan nhanh chóng các chất khoáng của men răng [11].
Acid do vi khuẩn sinh ra còn tấn công cả phần lợi gây nên một số bệnh như
viêm nướu răng (gingivitis) hay viêm quanh răng (periodontal diseases).

1.1.3.Vi khuẩn Streptococcus mutans và khả năng gây sâu răng
Những vi khuẩn có khả năng lên men đường thành acid lactic tồn tại trong
khoang miệng được xem là nguyên nhân gây sâu răng. Chúng chủ yếu thuộc 3
nhóm: Streptococcus, Lactobacillus và Actinomyces. Trong đó, S.mutans được
coi là nguyên nhân chính gây bệnh sâu răng do vi khuẩn này luôn được phát
hiện trong nước bọt, mảng bám răng của người và có số lượng rất cao ở những
vùng răng bị sâu.
Vi khuẩn Streptococcus mutans
S. mutans lần đầu tiên được Clark mô tả vào năm 1924 sau khi phân lập
được nó từ vùng răng bị tổn thương (Hình 1.3). Tuy vậy, phải đến thập niên 60,
vi khuẩn này mới được chú ý đến nhiều khi các nhà khoa học bắt đầu tập trung
nghiên cứu bệnh sâu răng từ giai đoạn sớm.

Hình 1.3. Ảnh

hiển vi điện tử vi

khuẩn
(độ phóng đại
S. mutans

Streptococcus mutans
6500x)
là vi khuẩn Gram (+),

kỵ khí, tồn tại ở

dạng liên cầu khuẩn.

Chính nhờ đặc

điểm hô hấp kỵ khí


14

nên quá trình chuyển hóa các loại đường sẽ đi theo con đường yếm khí tạo ra
sản phẩm là acid lactic. Nhiều nghiên cứu khác nhau đã chỉ ra đây chính là
nguyên nhân hàng đầu dẫn đến bệnh sâu răng.
Ngoài ra, S. mutans còn có khả năng tồn tại trong điều kiện pH rất thấp
-

nhờ các cơ chế thích nghi khác nhau:
Hoạt động của các bơm proton: đặc biệt là bơm F-ATPase nhằm bơm proton ra
ngoài duy trì pH nội sinh (pHi) luôn cao hơn so với pH môi trường. F-ATPase
của S.mutans được phát hiện là có sự thay đổi trong cấu trúc để thích nghi hoạt

-

động tốt ở pH thấp (Sturr và Marquis, 1992).
Các loài vi khuẩn xoang miệng Streptococcus có khả năng sinh NH3 thông qua
các enzyme urease hay arginine deiminase (ADS). Các enzyme này có thể
chuyển hóa lần lượt urea và arginine thành CO 2 và NH3. Các phân tử NH3 tạo
thành sẽ kết hợp với các proton có trong tế bào chất hay được vận chuyển qua
màng tế bào và kết hợp với các proton ở môi trường bên ngoài hình thành NH 4+,

-

nhờ đó làm tăng pH của môi trường nội và ngoại bào [12].
S. mutans có thể sản xuất các polysarcharide ngoại bào (extracellular
polysacharides) có tính chất keo dính, cho phép các vi khuẩn gắn kết được với
nhau để hình thành các liên kết bắc cầu và phát triển mảng bám răng. Đồng thời,
vi khuẩn này cũng có thể sản xuất các polysarcharide nội bào (intracellular
polysacharides). Hợp chất này được huy động để lên men tạo acid lactic khi

-

không có đường từ bên ngoài đưa vào [13, 14].
Ngoài ra, S. mutans còn có một số cơ chế thích nghi acid khác như: tăng cường
tổng hợp các enzym sữa chữa DNA bị tổn thương do acid (Haln và tập thể,
1999) hay thay đổi thành phần lipid của màng tế bào để làm giảm khả năng thẩm
thấu proton (Quivey và tập thể, 2000).
Chính nhờ những đặc điểm này mà S. mutans có khả năng tồn tại, phát
triển và sinh acid mạnh khi pH môi trường giảm xuống dưới 4 và trở thành
nguyên nhân chính dẫn đến bệnh sâu răng ở người.
Mảng bám răng (dental plaque), biofilm sinh học

Mảng bám răng là một lưới polymer sinh học (biofilm sinh học) có chứa các
vi khuẩn đường miệng. Quá trình hình thành mảng bám răng (biofilm) gồm 3
giai đoạn chính được Mash [32] mô tả trong hình 1.4. Sử dụng các phương pháp


15

sinh học phân tử, trong đó có kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction), các nhà
nghiên cứu đã phát hiện tới hơn 500 loài vi khuẩn khác nhau tồn tại trên mảng
bám [32]. Bệnh sâu răng diễn ra khi các vi khuẩn trên mảng bám đồng hóa
carbohydrate thông qua con đường đường phân (glycolysis). Kết quả là các acid
hữu cơ được hình thành làm cho pH trong mảng bám răng giảm xuống thấp,
thậm chí dưới 4,0. Ở điều kiện pH thấp này, lớp men răng bị bào mòn và dẫn
đến sâu răng. Mảng bám răng không chỉ gây ra sâu răng mà còn là nguyên nhân
gây ra các bệnh viêm lợi, viêm quanh răng... Trong trường hợp này, mảng bám
răng được tạo thành dưới lợi, do đó vi khuẩn trên mảng bám răng sẽ tiết ra các
enzyme như các protease của Fusarium nucleatumn có khả năng phân huỷ các
tổ chức mô mềm ở lợi, dẫn tới lợi bị chảy máu và sưng, nếu không được chữa trị
có thể phá huỷ các cấu trúc thiết yếu của răng [32].

A. Vi khuẩn được vận
chuyển đến bề mặt của
răng và bám vào răng
nhờ các lực tĩnh điện
yếu.

B. Các liên kết không C. Sự đồng gắn kết của các
thuận nghịch hình thành cơ thể vi khuẩn vào các tế
do mối tương tác phân tử bào đã định cư trước. Sự
hoá lập thể giữa tế bào vi bùng nổ tăng trưởng để

khuẩn và các receptor hình thành biofilm đồng
trên bề mặt răng.

thời với sự sinh tổng hợp

polymer ngoại bào.
Hình 1.4. Ba giai đoạn chính hình thành mảng bám răng [32]
Các nghiên cứu về biofilm nói chung đã cho thấy nó có các tính chất đặc biệt:
i) Bảo vệ cơ thể vi sinh vật khỏi hệ thống phòng thủ của chính vật chủ hay
của vi sinh vật kẻ thù.
ii) Chống lại sự mất nước.


16

iii) Chống lại các chất kháng khuẩn thông qua việc tạo kiểu hình mới có
tốc độ sinh trưởng giảm, hạn chế sự tiếp xúc và có khả năng bất hoạt hay trung
hoà các chất kháng khuẩn.
iv) Nồng độ các chất dinh dưỡng trong biofilm tăng cao hơn so với môi
trường xung quanh [32].
Chính vì những đặc điểm này mà các vi sinh vật sống trên biofilm
(biofilm cells) thường có khả năng chống chịu cao hơn với các chất kháng
khuẩn (từ hàng trăm tới hàng nghìn lần) so với các tế bào sống tự do (planktonic
cells) [39]. Việc loại bỏ các biofilm bằng con đường truyền thống sử dụng
kháng sinh là không hiện thực vì tính chống chịu cao của các tế bào trên biofilm,
sự thích nghi về trao đổi chất của các tế bào này với kiểu sống trên biofilm và
hơn thế nữa, là có thể làm xuất hiện những chủng vi khuẩn kháng kháng sinh
[24], [25]. Như vậy, các chiến lược hữu hiệu nhằm kiểm soát các bệnh gây ra do
biofilm, trong đó có bệnh sâu răng, hiện nay đang tập trung vào việc tìm kiếm
những chất kháng khuẩn có khả năng làm tổn thương hay can thiệp vào sự hình

thành biofilm của vi khuẩn gây bệnh.
1.2.

CÁC BIỆN PHÁP NGĂN NGỪA SÂU RĂNG
Việc loại bỏ bằng cơ học có thể ngăn chặn hoàn toàn sự tạo mảng bám

răng [32]. Điều này sẽ có hiệu quả hơn nếu kết hợp với việc giảm bớt thói quen
ăn các sản phẩm có đường. Tuy vậy, việc thay đổi thói quen ăn uống và duy trì
vệ sinh răng miệng tốt rất khó thực hiện. Vì vậy hàng loạt các biện pháp khác
nhau nhằm ngăn chặn sâu răng đã được nghiên cứu và ứng dụng.

1.2.1. Sử dụng chất kháng khuẩn
Sử dụng chất kháng khuẩn để chống lại các vi khuẩn gây sâu răng được
coi là một biện pháp hiệu quả và có nhiều triển vọng. Trong những năm qua,
nhiều chất kháng khuẩn như bisbiguanides, enzyme, muối kim loại, tinh dầu
v.v... đã được sử dụng một cách hiệu quả trong các sản phẩm nước súc miệng để
kiểm soát sự tạo thành của mảng bám răng [32]. Các chất này, khi hấp phụ vào
mảng bám răng, sẽ xâm nhập dần vào bên trong, tiếp xúc với vi khuẩn gây bệnh,


17

ức chế quá trình sinh trưởng, trao đổi chất và làm giảm khả năng gắn kết của
chúng với bề mặt răng. Do đó, chúng ngăn được ngừa sự tạo mảng bám răng,
hạn chế sự liên kết bắc cầu và xâm nhập của các vi khuẩn khác.
Các chất kháng khuẩn thường có đặc tính ngăn ngừa sự gắn kết, sự xâm
nhiễm của vi khuẩn hay tác động lên các quá trình trao đổi chất của chúng. Các
chất này đồng thời cũng không tác động lớn đến các quá trình sinh học, không
làm tổn thương lớp màng nhày ở miệng và ít độc. Vì thế, có thể nói sử dụng chất
kháng khuẩn là biện pháp hữu hiệu nhất hiện nay để kiểm soát sâu răng.

Trong số các chất kháng khuẩn đã được sử dụng, fluor tỏ ra là một chất có
hiệu quả cao và đã được sử dụng một cách rộng rãi. Đây là một chất có cơ chế
tác động hai mặt. Một mặt chất này có tác dụng kháng vi khuẩn sâu răng mạnh,
mặt khác nó lại giúp tái tạo lại men răng và vì vậy, có tác dụng làm bền răng
[32]. Chlohexidine gluconate cũng là một chất kháng khuẩn đã được sử dụng
khá phổ biến để điều trị các trường hợp bị sâu răng nghiêm trọng hoặc khi đã sử
dụng các chất kháng khuẩn tự nhiên mà không có kết quả. Chlohexidine
gluconate có tác dụng ức chế hiệu quả sự phát triển của vi khuẩn S. mutans
trong mảng bám răng. Tuy nhiên, chất này lại dường như không có tác dụng
hoặc tác dụng rất yếu đối với các loài Lactobacillus [8]. Các chất kháng khuẩn
như flour và chlohexidine tuy có hiệu quả kháng khuẩn cao song lại gây nên các
phản ứng phụ. Ví dụ: chlohexidine làm đổi màu răng, gây dị ứng lớp màng nhầy
ở miệng, trong khi đó flour lại gây ra hiện tượng bệnh nhiễm flour (fluorisis) khi
sử dụng lâu dài các sản phẩm vệ sinh răng miệng có chứa chất này [18]. Điều
này đã khiến các nhà khoa học phải tiếp tục tìm kiếm các hợp chất mới để thay
thế các hợp chất truyền thống hay sử dụng chúng với nồng độ thấp hơn ở dạng
tổ hợp với nhiều chất kháng khuẩn khác để làm giảm các tác dụng phụ mà vẫn
có hiệu quả chống sâu răng cao. Hàng loạt các chất kháng khuẩn mới, bao gồm
cả các chất tổng hợp và tự nhiên, đã được nghiên cứu và thử nghiệm như các
acid yếu, acid béo, trichlosan, muối kim loại và cả những chất có nguồn gốc từ
thực vật [5], [6], [7], [14], [20]. Trong số này, nhóm các chất có khả năng gây
tổn thương oxi hóa lên vi khuẩn gần đây được chú ý đặc biệt vì có tính kháng vi


18

khuẩn sâu răng rất mạnh. Tuy nhiên, cho đến nay những nghiên cứu sâu về cơ
chế tác dụng của nhóm các chất kháng khuẩn này lên vi khuẩn sâu răng vẫn còn
thiếu vắng. Đặc biệt ở Việt Nam, ngành khoa học nghiên cứu về vi khuẩn xoang
miệng (oral bacteria) cũng như các nghiên cứu sâu theo hướng cơ chế tác động

của các chất kháng khuẩn lên vi khuẩn xoang miệng còn rất mới mẻ. Việc sử
dụng chất kháng khuẩn để kiểm soát mảng bám răng đã được thực hiện trong
nhiều năm qua, chủ yếu là những chất chống tạo mảng bám [32]. Sử dụng nước
súc miệng là cách rất có hiệu quả để đưa các chất kháng khuẩn như là các
bisbiguanides, enzyme, muối kim loại, tinh dầu... tiếp xúc với các vi khuẩn
trong mảng bám răng [32]. Khi hấp phụ vào mảng bám răng, các chất này sẽ
xâm nhập dần vào bên trong mảng bám, ức chế sự phát triển hoặc quá trình trao
đổi chất của vi khuẩn, làm giảm sự gắn kết của vi khuẩn với bề mặt răng vì vậy
ngăn ngừa sự tạo mảng bám, hạn chế quá trình tích tụ hay liên kết bắc cầu vì vậy
ngăn chặn sự xâm nhập của vi khuẩn.
Các đặc tính quan trọng nhất của chất kháng khuẩn là ngăn ngừa sự gắn
kết, sự xâm nhiễm của vi khuẩn và tác động đến quá trình trao đổi chất của
chúng. Các chất kháng khuẩn thường không tác động lớn đến các quá trình sinh
học, không làm tổn thương lớp màng nhày ở miệng và ít độc. Vì thế có thể nói
sử dụng chất kháng khuẩn là biện pháp hữu hiệu nhất hiện nay để kiểm soát sâu
răng. Có 6 nhóm chất kháng khuẩn chính là:
1

Cation: các ion tích điện dương có khả năng làm thay đổi chức năng của
màng, sự gắn kết và sử dụng glucose của vi khuẩn.

2

Anion: các ion tích điện âm có khả năng làm thay đổi chức năng của
màng tế bào hay quá trình trao đổi chất trong quá trình đường phân và
sử dụng glucose.

3

Các tác nhân không phải ion: các ion không tích điện có khả năng ức

chế các enzyme trên màng tế bào, dẫn đến làm giảm sử dụng glucose.

4

Enzyme: một số enzyme có khả năng ngăn chặn sự gắn kết của vi khuẩn
hay làm tăng hoạt tính lysozyme.


19
5

Các đường đa (polyol): có khả năng làm thay đổi quá trình đường phân
hoá của vi khuẩn.

6

Các chất khác: bao gồm các dịch chiết thực vật, các tác nhân tạo phức
càng cua, các acid béo, các tác nhân gây tổn thương oxi hoá (oxidativedamaging agents) [26], [32]. Cơ chế tác động của các chất này rất phức
tạp và vẫn còn đang được nghiên cứu.

1.2.2. Sử dụng chất thay thế đường
Do thói quen sử dụng đường trong cuộc sống hàng ngày nên vi khuẩn trên
mảng bám răng có điều kiện lên men, sinh acid và kết quả là làm mòn men răng,
gây sâu răng. Vì vậy người ta đã nghĩ đến việc sử dụng những chất làm ngọt mà
vi khuẩn không thể tiêu thụ được để thay thế đường. Những chất này không gây
ra sự sinh acid nên không gây sâu răng.
Các loại đường nhân tạo này có khả năng kháng khuẩn nhất định thông
qua việc ức chế sự phát triển của vi khuẩn. Các đường như manitol, sorbitol
không ngọt như sucrose nên được dùng trong công nghiệp chế biến thực phẩm.
Các đường này không bị vi khuẩn tiêu thụ. Tuy nhiên, việc sử dụng thường

xuyên các loại đường này sẽ dẫn đến sự hình thành các chủng vi khuẩn có khả
năng đồng hoá chúng, đặc biệt là các loài S. mutans. Cơ chế tác động của xylitol
lên vi khuẩn S. mutans cũng đã được tìm hiểu. Khi xylitol đi vào tế bào S.
mutans sẽ can thiệp vào quá trình lên men đường của vi khuẩn bằng cách tiêu
thụ PEP và NAD+trong quá trình phosphoryl hoá, đồng thời ức chế cạnh tranh
với enzyme phosphofructokinase nhờ chất trao đổi trung gian xylitol-5phosphate [32]. Chính điều này làm giảm quá trình tạo acid của tế bào, giảm mật
độ S. mutans nên giảm sâu răng ở những người sử dụng xylitol. Nhìn chung,
việc sử dụng các chất thay thế đường có tác dụng khá hiệu quả vì chúng làm mất
đi hay hạn chế tối đa cơ hội phát triển của các vi khuẩn có khả năng sinh và chịu
acid.

1.2.3. Liệu pháp thay thế (replacement therapy)


20

Việc sử dụng các vi khuẩn đối kháng để kiểm soát sâu răng đã được sử
dụng từ nhiều năm nay [32]. Lợi ích của liệu pháp này là có tác dụng bảo vệ
răng lâu dài và ít tốn kém. Tuy nhiên, liệu pháp này chưa được thử nghiệm
nhiều ở người vì tính an toàn của các chủng vi khuẩn đối với người sử dụng
chưa được nghiên cứu kỹ. Liệu pháp này có hai hướng chính là:
i. Hướng tiền nhiễm: Cấy vào mảng bám răng những vi khuẩn có lợi hay
không gây hại trước khi các chủng không mong muốn xâm nhập và định cư trên
mảng bám. Những vi khuẩn tiền nhiễm sẽ loại bỏ những tác nhân gây bệnh
không mong muốn. Các chủng đột biến của Streptococci đã bị làm mất khả năng
tạo glucosyltransferase (Gtf), hoặc polysaccharide nội bào, hoặc không có
lactate dehydrogenase là những đối tượng thường được sử dụng trong liệu pháp
này.
ii. Hướng thay thế các cơ thể tiền nhiễm có mặt trong mảng bám răng:
Cách này có ưu điểm là không phải xử lý loại bỏ những chủng không mong

muốn trước khi gây nhiễm mới. Ví dụ S. salivarius thay thế cho S. mutanstrên
mảng bám răng của chuột đã làm giảm tỉ lệ sâu răng vì nó thay thế chủng S.
mutans có khả năng sinh acid mạnh.


21

1.2.4. Vacxin
Các nghiên cứu cho thấy có thể tạo được các đáp ứng miễn dịch chống lại
vi khuẩn sâu răng. Vì các đột biến của Streptococci là tác nhân chính gây sâu
răng nên người ta nghĩ đến khả năng tạo ra các vacxin bằng việc sử dụng chính
các vi khuẩn này (vacxin) hay các phân tử của các vi khuẩn này (sub-unit
vacxin) để gây miễn dịch [32]. Trên thực tế, hướng nghiên cứu này đã xuất hiện
ở Anh từ hơn 20 năm trước đây. Mặc dù đã thu được một số kết quả khả quan
như làm giảm mật độ tế bào Streptococci, giảm tỉ lệ sâu răng, nhưng lại xuất
hiện các phản ứng phụ cũng như xuất hiện các tổn thương mô.
Các nhà nghiên cứu Mỹ lại sử dụng S. sobrinus trên mảng bám răng chuột
để tạo vacxin. Các vacxin sản xuất theo hướng này nhằm mục đích ức chế
enzyme Gtf, nhờ đó làm giảm khả năng tạo mảng bám răng. Hướng nghiên cứu
này tỏ ra rất có hiệu quả ở chuột nhưng lại không có hiệu quả ở các loài linh
trưởng. Vì vậy người ta nghi ngờ khả năng ứng dụng của nó cho người [32].


22
1.3.

CÂY SIM

1.3.1. Giới thiệu về cây Sim (Rhodomytus tomentosa) [3]
Cây sim còn có tên là Hồng sim,

Đào kim phượng, Dương lê, Co nim
(Thái), Mác nim (Tày), Piếu ním (Dao),
Trợ quân lương thuộc họ Myrtaceae.
Đây là cây bụi cao khoảng 1 - 3m, thân
non màu vàng nâu, có nhiều lông mịn,
thân già màu nâu đen có các đường
nứt chạy dài, tiết diện tròn. Lá đơn,
mọc đối. Không có lá kèm. Cụm hoa
mọc riêng lẻ hay 2 - 3 hoa ở ngọn cành
ngắn. Phiến lá hình xoan, gốc nhọn,
đầu

Hình 1.5. Cây sim
(Rhodomyrtus tomentosa (Aiton)
Hassk)

tròn, dài 5 - 7cm, rộng 3-4cm, bìa phiến nguyên hơi cong xuống phía dưới, lá
già màu xanh lục đậm, nhẵn bóng, mặt dưới màu vàng xanh có nhiều lông mịn,
lá non có lông cả hai mặt. Quả mọng hình trứng ngược mang đài tồn tại ở đỉnh,
màu xanh sát cuống, phía trên màu đỏ nâu nhiều lông mịn, có mùi thơm, đường
kính 1,2 - 1,5 cm, chứa nhiều hạt. Hạt hình thang, màu nâu.
Cây mọc tự nhiên và phổ biến ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới châu Á,
bao gồm Indonesia, Philipin, Ấn độ, Camphuchia, Lào, Việt Nam và một số các
tỉnh phía nam Trung Quốc. Ở Việt Nam sim là loài cây quen thuộc ở khắp các
vùng trung du và núi thấp. Cây đặc biệt ưa sáng và có khả nặng chịu hạn tốt,
thường mọc dải rác hay tập trung trên các đồi cây bụi hay đồng cỏ.
Búp và lá sim non dùng để chữa đau bụng, tiêu chảy, kiết lỵ. Lá còn là
thuốc cầm máu, chữa vết thương chảy máu. Quả sim chín ăn được, dùng chế
rượu, chữa thiếu máu lúc có mang, suy nhược khi mới ốm dậy, lòi dom, ù tai, di
tinh, phụ nữ băng huyết. Rễ sim chữa tử cung xuất huyết cơ năng, đau xương,

lưng gối yếu mỏi, viêm thấp khớp.
1.3.2.

Thành phần hóa học và dược chất


23
-

Các hợp chất thứ cấp từ thực vật là sản phẩm của quá trình trao đổi chất được
sinh ra từ thực vật. Tác dụng sinh học của các hợp chất này rất đa dạng và
phong phú: tác dụng chống oxy hóa, tác dụng kháng khuẩn, chống viêm và thậm

-

chí ức chế sự phát triển của các tế bào ung thư, HIV (Park và tập thể, 2006)
Cây Sim (Rhodomyrtus tomentosa) từ lâu đã được xem là cây thảo dược có lợi
ích từ gốc đến ngọn. Lá Sim chứa chất Rhodomyrtone đã được chứng minh có

-

vai trò như một chất kháng sinh.
Theo nghiên cứu của Trung tâm Nghiên cứu Sản phẩm tự nhiên, Khoa
Y học truyền thống, Khoa khoa học, Đại học Prince of Songkla, Hat Yai,
Songkhla 90112, Thái Lan (2009) thì lá của cây Sim (Rhodomyrtus tomentosa
(Aiton) Hassk.) được nghiên cứu để chiết xuất tạo ra Rhodomyrtone - chất

-

kháng và chống nhiễm trùng.

Maarten van Dijl, Oliver Kayser:” Phytomedicine” (2009), tập 16, vấn đề 6,
trang 645 - 651, giới thiệu chất Rhodomyrtone là một thuốc kháng khuẩn tự

-

nhiên từ cây Sim (Rhodomyrtus tomentosa (Aiton) Hassk.)
Surasak Limsuwan, Anne Hesseling-Meinders, Supayan

Piyawan

Voravuthikunchai, Jan Maarten van Dijl, Oliver Kayse: “Phytomedicine”
(2011), tập 18, vấn đề 11, trang 934 940, giới thiệu tác dụng kháng sinh và
chống nhiễm trùng của Rhodomyrtone từ cây Sim (Rhodomyrtus tomentosa
(Aiton) Hassk.) trên vi khuẩn Streptococcus pyogenes.


24

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
2.1. VẬT LIỆU
2.1.1. Chủng vi sinh vật và điều kiện nuôi cấy
- Chủng vi khuẩn Streptococcus mutans GS-5 được lấy từ bộ sưu tập giống của
phòng thí nghiệm của GS. Robert E. Marquis, Khoa Vi sinh và Miễn dịch học,
Trường Đại học Rochester, Hoa Kỳ. Chủng S. mutans được giữ và cấy chuyển
hàng tuần trên môi trường tryptic soy agar (TSA) của hãng Difco (Hoa Kỳ). Tế
bào được nuôi cấy tĩnh ở 37oC trong môi trường chứa tryptone 3%, dịch chiết
nấm men 0,5% và glucose 1% (TYG).

2.1.2. Nguyên liệu thực vật

- Lá sim được thu ở Quảng Ninh và được GS.TS. Phan Kế Lộc giúp định tên
khoa học là Rhodomyrtus tomentosa. Nguyên liệu được sấy khô trong tủ ấm ở
45oC, sau đó được tán thành bột mịn.

2.1.3. Hóa chất
- Các thành phần môi trường được sử dụng trong việc nuôi cấy vi sinh vật bao
gồm tryptone, dịch chiết nấm men, cao thịt bò, peptone (Difco, Mỹ).
- Bản silica gel tráng sẵn 60 F254 25, tấm nhôm (20 x 20 cm) của hãng Merk
(Đức).
- Silica gel (Grade 7734, 63-200 μm 70-230 mesh) và (Grade 7746, 0.040-0.063
nm, 230-400 mesh) mua từ hãng Merck (Đức).
- Các dung môi dùng trong sắc ký có độ sạch phân tích và có nguồn gốc từ
Trung Quốc.
- Các hoá chất còn lại đều đạt độ tinh khiết cho phân tích.

2.1.4. Trang thiết bị chính
- Máy ly tâm
- Máy đo quang phổ
- Máy đo pH
- Máy soi bản gel sắc ký lớp mỏng
- Box cấy laminare
- Máy quay cất khô chân không
- Kính hiển vi huỳnh quang quét laser


25

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Các phương pháp nghiên cứu tế bào
2.2.1.1. Đo sự phát triển của tế bào vi khuẩn

- Tế bào vi khuẩn được nuôi cấy tĩnh trong môi trường không có (mẫu kiểm
tra) và có chứa chất cần nghiên cứu (mẫu thí nghiệm). Sự phát triển của tế
bào trải qua các pha sinh trưởng chính bào gồm pha tĩnh (lag), pha tăng
trưởng (log) và pha ổn định (stationary). Mật độ tế bào tại những thời điểm
khác nhau được kiểm tra thông qua việc đo mật độ quang học (OD) của
dịch nuôi cấy tại bước sóng 700 nm (A700).
2.2.1.2. Đo mức độ sinh acid của tế bào (pH drop)
- Khả năng sinh acid của tế bào được đánh giá thông qua việc làm giảm pH
của môi trường bên ngoài. Các giá trị pH tại mỗi thời điểm nghiên cứu nhất
định được đo bằng máy đo pH.
- Sau khi thu tế bào bằng cách ly tâm 5000vòng trong 15 phút, tế bào
được rửa 2 lần với dung dịch muối có chứa KCl 50 mM và MgCl 2 1 mM, sau đó
tế bào được hòa trở lại trong dung dịch muối này ở mật độ khoảng 5 x 10 9
CFU/ml, tương đương 2 mg trọng lượng khô tế bào/ml. pH của dịch tế bào được
chỉnh đến 7,2 bằng KOH 1M. Glucose được bổ sung vào để đạt nồng độ 20%,
đảm bảo môi trường dư thừa cơ chất cho quá trình đường phân. Sự giảm pH môi
trường do sự sinh acid trong quá trình đường phân được theo dõi sử dụng máy
đo pH MP225 Mettler Toledo, Đức [8].

2.2.2. Các phương pháp tách chiết phân đoạn thực vật
2.2.2.1. Tách chiết phân đoạn trong các dung môi hữu cơ khác nhau
-

Nguyên liệu được ngâm chiết lần lượt trong các dung môi khác nhau bao
gồm hexan, ethyl acetate, methanol (theo tỉ lệ 1g nguyên liệu : 2 thể tích
dung môi) trong 3 ngày. Mỗi dung môi được chiết 3 lần. Sau đó lượng dịch
tổng được quay cất khô và làm khô chân không để thu các cao chiết hexane,
ethyl acetate và methanol.

-

Dịch chiết ethanol của lá sim được chuẩn bị tương tự cho mục đích sàng lọc
hoạt tính sinh học quan tâm từ thực vật này. Các nghiên cứu trước đây của
Limsuwan [29], [30] đã cho thấy các dịch chiết ethanol và ethyl acetate của
dịch chiết lá sim có hoạt tính kháng khuẩn khá mạnh. Để kiểm tra hoạt tính
kháng khuẩn sâu răng S. mutans, dịch chiết lá sim trong ethanol đã được