Nghiên cứu sự vận tải và phân phối thuốc berberin của màng bacterial cellulose lên men từ nước dừa già định hướng sử dụng qua đường uống

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH-KTNN

ĐẶNG THỊ NGA

NGHIÊN CỨU SỰ VẬN TẢI VÀ
PHÂN PHỐI THUỐC BERBERIN CỦA
MÀNG BACTERIAL CELLULOSE
LÊN MEN TỪ NƯỚC DỪA GIÀ ĐỊNH
HƯỚNG SỬ DỤNG QUA ĐƯỜNG UỐNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật

Người hướng dẫn khoa học
TS. Nguyễn Xuân Thành

HÀ NỘI, 2016
Hà Nội, 2016


LỜI CẢM ƠN
Với lòng trân trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn TS.
Nguyễn Xuân Thành, người thầy đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong
suốt quá trình thực hiện khóa luận.
Tôi cũng xin bày tỏ lời cảm ơn tới các thầy cô tại Trung tâm Hỗ trợ
Nghiên cứu khoa học và Chuyển giao công nghệ trường Đại học Sư phạm Hà
Nội 2 đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận này.
Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn Ban chủ nhiệm khoa Sinh - KTNN,
trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2. Đặc biệt là sự giúp đỡ, động viên của gia
đình, bạn bè tôi trong suốt thời gian làm khóa luận.

Mặc dù đã có nhiều cố gắng để hoàn thành khóa luận một cách tôt nhất.
Tuy nhiên do buổi đầu làm quen với công việc nghiên cứu khoa học cũng như
hạn chế về kiến thức và kinh nghiệm nên không thể tránh khỏi những thiếu
sót, tôi rất mong nhận được sự góp ý của quý thầy, cô giáo để khóa luận hoàn
chỉnh hơn.
Một lần nữa, tôi xin trân trọng cảm ơn!
Hà Nội, ngày tháng 5 năm 2016
Sinh viên

Đặng Thị Nga


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin khẳng định những gì viết trong khóa luận “Nghiên cứu sự vận
tải và phân phối thuốc Berberin của màng Bacterial cellulose lên men từ
nước dừa già định hướng sử dụng qua đường uống” là kết qủa nghiên cứu
của cá nhân tôi dưới sự hướng dẫn trực tiếp của TS. Nguyễn Xuân Thành,
giảng viên khoa Sinh - KTNN trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2. Tất cả
những số liệu đều được thu thập từ thực nghiệm và qua xử lý thống kê, không
trùng với bất cứ tài liệu nào.
Hà Nội, ngày tháng 5 năm 2016
Sinh viên

Đặng Thị Nga


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
LỜI CAM ĐOAN
DANH MỤC BẢNG, HÌNH, SƠ ĐỒ

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1
1. Lý do chọn đề tài ....................................................................................... 1
2. Mục đích nghiên cứu ................................................................................. 3
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu............................................................. 3
4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiến...................................................... 3
5. Nội dung nghiên cứu ................................................................................. 3
6. Phương pháp nghiên cứu........................................................................... 3
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 5
1.1. Giới thiệu tổng quan về đối tượng, lĩnh vực nghiên cứu ....................... 5
1.1.1. Tổng quan về màng BC ...................................................................... 5
1.1.1.1. Vi khuẩn sản sinh BC....................................................................... 5
1.1.1.2. Cấu trúc màng BC ............................................................................ 7
1.1.1.3. Đặc tính của màng BC ..................................................................... 8
1.1.1.4. Chức năng sinh lý của BC................................................................ 8
1.1.2. Thuốc Berberin.................................................................................... 9
1.1.2.1. Tên thuốc .......................................................................................... 9
1.1.2.2. Tính chất........................................................................................... 9
1.1.2.3. Tác dụng của thuốc .......................................................................... 9
1.1.2.4. Chỉ định và chống chỉ định ............................................................ 10
1.2. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước .......................................... 10
1.2.1. Tình hình nghiên cứu về màng BC ................................................... 10
1.2.1.1. Tình hình nghiên cứu trong nước................................................... 10
1.2.1.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới................................................. 11


1.2.2. Tình hình nghiên cứu về BH ............................................................. 11
1.2.2.1. Tình hình nghiên cứu trong nước................................................... 11
1.2.2.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới................................................. 12
1.2.3. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về hường nghiên cứu .... 12

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............. 14
2.1. Vật liệu nghiên cứu .............................................................................. 14
2.1.1. Giống vi khuẩn .................................................................................. 14
2.1.2. Nguyên liệu - hóa chất ...................................................................... 14
2.2. Thiết bị - dụng cụ ................................................................................. 14
2.2.1. Thiết bị .............................................................................................. 14
2.2.2. Dụng cụ ............................................................................................. 15
2.3. Phương pháp nghiên cứu...................................................................... 15
2.3.1. Phương pháp tạo màng BC ............................................................... 15
2.3.2. Phương pháp dựng đường chuẩn ...................................................... 16
2.3.3. Phương pháp xác định lượng thuốc được hấp thụ vào màng BC ..... 18
2.3.4. Phương pháp xác định lượng thuốc giải phóng từ màng BC............ 19
2.3.5. Phương pháp phân tích dược động học giải phóng của BH ............. 20
2.3.6. Phương pháp xử lí thống kê .............................................................. 21
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 22
3.1.Tạo màng BC của A. xylinum trong môi trường nước dừa già ............. 22
3.2. Thu màng BC thô từ môi trường.......................................................... 22
3.3. Tinh chế màng BC ............................................................................... 23
3.4. Màng BC hấp thụ thuốc ....................................................................... 24
3.5. Xác định lượng thuốc BH giải phóng khỏi màng BC .......................... 26
3.6. Dược động học giải phóng thuốc của màng BC .................................. 31
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................... 34
TÀI LỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC BẢNG, HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Thành phần của nước dừa già ........................................................... 7
Bảng 2.1. Môi trường lên men tạo màng BC .................................................. 15

Bảng 2.2. Nồng độ BH và giá trị OD (n = 3) .................................................. 17
Bảng 2.3. Dung dịch đệm đa năng Britton và Robinson ................................ 19
Bảng 3.1. Giá trị OD hấp thụ thuốc của màng BC (n = 3) ............................. 25
Bảng 3.2. Khối lượng BH được hấp thụ, tỉ lệ hấp thụ và cường độ hấp thụ BH
của màng BC (n = 3) ......................................................................... 26
Bảng 3.3. Mật độ quang phổ màng BC đang giải phóng thuốc tại các thời
điểm lấy mẫu (n = 3) ......................................................................... 27
Bảng 3.4. Tỉ lệ thuốc BH được giải phóng tại các thời điểm lấy mẫu............ 29
Bảng 3.5. Hệ số tương quan (R2), tốc độ giải phóng thuốc (k) và trị số mũ giải
phóng (n) đối với các môi trường pH khác nhau (n = 3) .................. 32
DANH MỤC HÌNH, SƠ ĐỒ
Hình 1.1. Công thức cấu tạo của BH ................................................................ 9
Hình 2.1. Đồ thị đường chuẩn BH ở bước sóng 345 nm. ............................... 17
Hình 3.1. Màng BC khi nuôi cấy tĩnh ngày thứ 4 ........................................... 22
Hình 3.2. Màng BC với thời gian nuôi cấy khác nhau ................................... 23
Hình 3.3. Màng BC tinh chế ........................................................................... 24
Hình 3.4. Màng BC đang hấp thụ thuốc ......................................................... 24
Hình 3.5. Đồ thị biểu diễn OD giải phóng thuốc BH của màng BC .............. 28
Hình 3.6. Đường cong biểu diễn tỉ lệ giải phóng BH của màng BC .............. 30
Sơ đồ 2.1. Quy trình nuôi cấy thu nhận BC .................................................... 16


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Tên viết tắt

Tên tiếng anh

Tên tiếng việt

A. xylinum

Acetobacter xylinum

Acetobacter xylinum

BC

Bacterial Cellulose

Cellulose vi khuẩn

BH

Berberine hydrochloride

Berberin hydroclorid

cs

Cộng sự

E. coli

Escherichia coli

Vi khuẩn đại tràng

OD

Optical Density

Mật độ quang phổ

PC

Plant Cellulose

Cellulose thực vật


MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Berberine hydrochloride (BH) là hoạt chất có nguồn gốc thực vật, dễ
kiếm, rẻ tiền, an toàn, là thuốc có hoạt tính kháng sinh chống viêm [1]. Tác
dụng lâm sàng phổ biến nhất của BH là chống tiêu chảy do vi khuẩn, ký sinh
trùng đường ruột [1, 19]. Ngoài ra, thuốc còn có tác dụng chống lại tác hại
của vi khuẩn tả và E. coli ngoại độc tố bền với nhiệt. Khi điều trị các bệnh
nhiễm trùng đường ruột, BH không ảnh hưởng tới sự phát triển bình thường
của hệ vi khuẩn có lợi của ống tiêu hóa. Khi dùng một số thuốc kháng sinh
nếu phối hợp với BH sẽ hạn chế được tác dụng không mong muốn gây ra bởi
các thuốc kháng sinh đối với hệ vi sinh vật đường ruột.
Tuy nhiên thuốc lại có nhược điểm là khó tan trong nước làm giảm sự
hấp thụ thuốc bằng đường uống, sinh khả dụng của thuốc thấp nên đã làm
giảm tác dụng thuốc trong điều trị bệnh [17, 19].
Uống là một trong những đường ưa thích nhất và truyền thống để phân
phối thuốc. So với đường tiêm, đường uống có lợi thế hơn là độ an toàn cao,
đơn giản, tiện lợi và dễ tuân thủ hơn, hiệu quả sử dụng thuốc cao hơn, làm
giảm chi phí và cho phép linh hoạt hơn trong kiểm soát liều lượng thuốc [19].
Trong những năm gần đây các nhà nghiên cứu đã có sự chú ý đặc biệt tới
việc sử dụng các vật liệu sinh học trong chăm sóc sức khỏe vì khả năng tái

tạo, tương thích sinh học và phân hủy sinh học của chúng. Một trong những
vật liệu sinh học được chú ý đến là cellulose. Vật liệu này vượt trội so với các
polymer tự nhiên và tổng hợp khác [16]. Tuy nhiên, hình thái, đặc tính và các
lĩnh vực ứng dụng cụ thể phụ thuộc nhiều vào nguồn gốc, tức là quá trình xây
dựng các loại cellulose.
Bacterial Cellulose (BC) là sản phẩm của một số loài vi khuẩn, đặc biệt
là chủng A. xylinum. BC có cấu trúc và đặc tính rất giống với cellulose thực
1


vật (PC) [7, 9]. BC khác với PC ở chỗ không chứa các hợp chất cao phân tử
như lignin, hemicellulose, pectin và sáp nến do vậy chúng có những đặc tính
vượt trội với độ dẻo dai, bề chắc, độ đàn hồi cao, có khả năng hút nước cao ở
trạng thái ẩm và độ tinh khiết cao, có thể phân hủy sinh học, tái chế hay phục
hồi hoàn toàn, bề mặt tiếp xúc lớn hơn gỗ bình thường, không độc và không
gây dị ứng, có khả năng chịu nhiệt tốt và đặc biệt là khả năng cản khuẩn [3, 6,
7, 9]. Với các đặc tính vượt trội như vậy, màng BC được ứng dụng trong
nhiều lĩnh vực như: công nghệ thực phẩm, công nghệ giấy, công nghệ pin,
dùng làm màng lọc vi khuẩn [9]. Đặc biệt trong lĩnh vực y học, màng BC đã
được ứng dụng làm da tạm thời thay thế da trong quá trình điều trị bỏng, loét
da, làm mạch máu nhân tạo điều trị các bệnh tim mạch, làm ống thông niệu
quản (Wan và Millon 2005) [9], làm mặt nạ dưỡng da cho con người [6, 7, 9].
Ngoài ra, màng BC còn có tác dụng giữ thuốc và kéo dài thời gian giải phóng
thuốc [10]. Bên cạnh đó, các sợi cellulose có cấu trúc mạng sẽ là hệ thống vận
chuyển và phân phối thuốc làm tăng sinh khả dụng của thuốc, nó có thể giúp
thuốc không bị phá hủy trong môi trường acid.
Các nghiên cứu cho thấy màng BC được tạo ra từ các nguyên liệu rẻ
tiền, dễ kiếm, có thể sản xuất trên quy mô công nghiệp. Môi trường nuôi cấy
vi khuẩn A. xylinum rất đa dạng như nước dừa già, rỉ đường, nước mía, …
Trong đó nước dừa già được coi là môi trường kinh điển trong nuôi cấy A.

xylinum [9].
Với mục đích khảo sát khả năng hấp thụ và giải phóng thuốc BH qua
màng BC định hướng sử dụng qua đường uống, đồng thời giúp thuốc BH giải
phóng kéo dài điều này có thể giúp tăng sinh khả dụng của thuốc, chúng tôi
đã chọn đề tài nghiên cứu: “Nghiên cứu sự vận tải và phân phối thuốc
Berberin của màng Bacterial cellulose lên men từ nước dừa già định
hướng sử dụng qua đường uống”.
2


2. Mục đích nghiên cứu
Thiết kế chế tạo hệ thống vận tải và phân phối thuốc BH nhằm tạo ra hệ
thống kéo dài thời gian giải phóng thuốc, điều này có thể giúp tăng lượng
thuốc hấp thụ vào cơ thể, phát huy được tối đa hiệu quả của thuốc trong điều
trị bệnh đường ruột.
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu: Hệ thống vận tải và phân phối thuốc BH dựa trên
màng BC qua đường uống.
Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu invitro.
Địa điểm nghiên cứu: Trung tâm Hỗ trợ Nghiên cứu khoa học và Chuyển
giao công nghệ trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2.
4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiến
Ý nghĩa khoa học: Nghiên cứu này giúp tăng thêm hiểu biết về ứng
dụng của màng BC. Mở ra những hướng nghiên cứu mới về khả năng vận
chuyển và phân phối thuốc của màng BC trên nhiều các loại thuốc khác nhau
nhằm kéo dài thời gian giải phóng và tăng sinh khả dụng của các loại thuốc
đó.
Ý nghĩa thực tiễn: Xây dựng được quy trình tạo màng BC từ chủng A.
xylinum; Từ màng BC đã được tạo ra được dùng làm hệ thống vận tải phân
phối thuốc BH.

5. Nội dung nghiên cứu
Nghiên cứu quy trình nuôi cấy A. xylinum từ các nguyên liệu sẵn có.
Thu sản phẩm BC từ dịch nuôi cấy.
Chế tạo màng BC dùng để hấp thụ thuốc.
Thử nghiệm tác dụng hấp thụ và giải phóng BH của BC.
6. Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp nuôi cấy và thu màng BC từ chủng A. xylinum.

3


Phương pháp dựng đường chuẩn.
Phương pháp xác định lượng thuốc hấp thụ vào màng BC.
Phương pháp xác định lượng thuốc giải phóng khỏi màng BC.
Phương pháp phân tích dược động học giải phóng của BH.
Phương pháp xử lí thống kê.

4


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu tổng quan về đối tượng, lĩnh vực nghiên cứu
1.1.1. Tổng quan về màng BC
1.1.1.1. Vi khuẩn sản sinh BC
BC là sản phẩm của một số loại vi khuẩn, đặc biệt là chủng A. xylinum.
A.

xylinum

thuộc

nhóm

vi

khuẩn

Acetic,

chi

Acetobacter,

họ

Pseudomonadaceae. Là loại hiếu khí bắt buộc, có chu mao và sản xuất
cellulose ngoại bào [9].
Theo khóa phân loại của Bergey, A. xylinum thuộc [9]:
Lớp: Schizomycetes
Bộ: Pseudomonadales
Bộ phụ: Pseudomonadieae
Họ: Pseudomonadaceae
A. xylinum có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, kích thước ngang
khoảng 0,6 - 0,8 µm, dài khoảng 2 - 3 µm, vi khuẩn không sinh bào tử, gram
âm, không di động, sắp xếp riêng rẽ đôi khi xếp thành chuỗi, nhưng khi tế bào
già hay do điều kiện môi trường nuôi cấy, hình dạng có thể bị biến đổi: tế bào
dài hơn, phình to ra, phân nhánh hoặc không phân nhánh [9].
Trong môi trường nuôi cấy rắn, sau khoảng từ 3 - 7 ngày nuôi cấy, sẽ thu
được khuẩn lạc nhỏ rồi lớn dần, đường kính hạt từ 2 - 5 mm, tròn, nhày, rìa
mép trơn, có màu kem, hơi trong. Nhưng sau một tuần khuẩn lạc to, đục, có

màu cafe sữa rồi khô dần [15].
A. xylinum là loài vi khuẩn hiếu khí. Nhiệt độ tối ưu cho vi khuẩn phát
triển từ 25 - 30oC. Ở nhiệt độ 37oC tế bào sẽ bị suy thoái hoàn toàn. Nhiệt độ
thích hợp nhất là 25oC. Vi khuẩn tăng trưởng trong khoảng pH từ 3 - 8, pH tối
ưu để sản xuất cellulose là 5,5 [15].
A. xylinum sử dụng cacbon từ nhiều loại đường khác nhau, tùy thuộc vào
5


chủng mà lượng đường có thể thay đổi, nhưng đường hay được sử dụng và
cho hiệu suất cao là: glucose, fructose, manitol, sorbitol, nguồn đường cho
hiệu suất thấp hơn là glycerol, galactose, sucrose, maltose [8, 9].
A. xylinum có thể tích tụ acid acetic trong môi trường nuôi cấy. Các tế
bào vi khuẩn kháng lại được sự thay đổi pH của môi trường. Trong lúc nuôi
cấy pH môi trường có thể giảm đi từ 1 - 2 đơn vị do sự tạo ra acid acetic, acid
gluconic, do đó, người ta thường bổ sung acid acetic vào môi trường nuôi cấy
để tránh nhiễm các loài vi khuẩn lạ [15].
Vi khuẩn có khả năng oxy hóa ethanol thành acid acetic, phản ứng
catalase dương tính, không tạo sắc tố nâu, có khả năng tổng hợp cellulose,
chuyển hóa glucoso thành acid acetic, chuyển glycerol thành dihydroxyaceton
[9].
Trong môi trường nuôi cấy lỏng, vi khuẩn sử dụng đường để chuyển hóa
thành cellulose tạo lớp màng dày trên bề mặt của môi trường. Sau 36 - 48 giờ
lớp màng dày, trong và đạt đến độ dày nhất định sau 7 - 10 ngày [15].
Môi trường nuôi cấy A. xylinum là môi trường tổng hợp từ các nguồn
dinh dưỡng cần thiết như nguồn cacbon, nito, nguồn sulfur và phospho, các
yếu tố tăng trưởng và các yếu tố vi lượng [9].
A. xylinum là loài có khả năng tổng hợp cellulose từ nguồn
cacbonhydrat. Nguồn cacbonhydrat mà A. xylinum sử dụng là glucose,
fructose, manitol, sorbitol, nếu sử dụng glcerol, galactose, lactose, sucrose

cho hiệu suất thấp hơn, không nên sử dụng mantose, cellobiose, erythriol,
acetate [15].
Nhu cầu sử dụng đường của A. xylinum là rất lớn và giữ vai trò quan
trọng trong quá trình tổng hợp BC nên có rất nhiều nghiên cứu và đề nghị sử
dụng các sản phẩm thứ cấp trong các ngành công nghiệp khác như: rỉ đường,
nước dừa già, nước mía, ... để làm nguyên liệu trong nuôi cấy A. xylinum.
6


Trong đó nước dừa già được xem là môi trường kinh điển trong nuôi cấy A.
xylinum [8, 9, 15]. Thành phần nước dừa già [15] được trình bày trong bảng
1.1.
Bảng 1.1. Thành phần của nước dừa già
Nước (%)

94,99

Đồng (mg/100g)

0,04

Protein (%)

0,72

Mangan (mg/100g)

0,142

Chất béo toàn phần (%)

0,2

Selenium (µg/100g)

1

Carbonhydrat (%)

3,17

Vitamin C (mg/100g)

2,4

Đường (%)

2,16

Thiamin (mg/100g)

0,03

Calcium (mg/100g)

24

Riboflavin (mg/100g)

0,057

Sắt (mg/100g)

0,29

Niacin (mg/100g)

0,08

Magie (mg/100g)

25

Acid Panthenic (mg/100g)

0,043

Phosphorus (mg/100g)

20

Vitamin B6 (mg/100g)

0,032

Kali (mg/100g)

250

Folate (µg/100g)

3

Natri (mg/100g)

105

Kẽm (mg/100g)

0,1

Nước dừa già là môi trường thích hợp để nuôi cấy vi khuẩn vì trong
nước dừa chứa rất nhiều chất dinh dưỡng và chất kích tố tăng trưởng như 1, 3
- diphenyllurea, hexitol, cytolunin, myoinositol, sorbitol, ... Vì vậy A. xylinum
rất phát triển trong môi trường này [9, 15].
Nước dừa sau khi thu hoạch được sử dụng không quá 3 ngày, tránh để
lâu làm cho đường và các chất dinh dưỡng khác giảm đi dẫn đến cho hiệu suất
kém [9].
1.1.1.2. Cấu trúc màng BC
BC được cấu tạo bởi những chuỗi polimer β - 1, 4 glucopyranose mạch
thẳng được tổng hợp từ một số loài vi khuẩn, chủ yếu là A. xylinum. Màng BC
7


do A. xylinum tạo ra có cấu trúc hóa học đồng nhất với PC, tuy nhiên chúng
khác nhau về cấu trúc đại thể [7, 9].
Theo AJ. Brown (1886) [12], BC bao gồm nhiều sợi siêu nhỏ có bản chất
là hemicellulose, đường kính 1,5 nm, kết hợp với nhau thành bó, nhiều bó hợp
thành dãy, mỗi dãy dài khoảng 100 nm, rộng khoảng 3 - 8 nm.
1.1.1.3. Đặc tính của màng BC

Trong nuôi cấy tĩnh, BC tích lũy trên bề mặt môi trường dinh dưỡng
lỏng thành lớp màng mỏng như da, sau khi tinh chế và làm khô tạo thành sản
phẩm tương tự như giấy da với độ dày 0,01 - 0,5 nm. Sản phẩm này có những
tính chất rất đặc biệt như: độ tinh sạch cao, khả năng đàn hồi tốt, độ kết tinh
và độ bền cơ học cao, khả năng thấm hút nước cao, độ polymer hóa lớn,
đường kính sợi nhỏ, có khả năng phục hồi độ ẩm ban đầu, có thể bị phân hủy
bởi enzym, không chứa các hợp chất cao phân tử như lignin, hemicellulose,
pectin và sáp nến, có thể bị phân hủy sinh học, bề mặt tiếp xúc lớn hơn gỗ
thường, không độc và không gây dị ứng, có khả năng chịu nhiệt tốt, đặc biệt
là khả năng cản khuẩn [7, 8, 9].
Với các tính chất này BC được ứng dụng rất nhiều trong các ngành
công nghiệp khác nhau trong đó có y học. BC đã dược sử dụng thành công để
băng vết thương và cho cấy ghép tim mạch [13]. Ở Brazil, màng BC ướt tinh
sạch được sản xuất và bán ra thị trường như một loại da nhân tạo dùng đắp vết
thương [9].
1.1.1.4. Chức năng sinh lý của BC
A. xylinum là vi khuẩn tổng hợp polysaccharid ngoại bào, những tế bào
vi khuẩn này nằm trong mạng lưới polymer giúp tế bào bám chặt vào bề mặt
môi trường và thu nhận chất dinh dưỡng dễ dàng hơn so với tế bào vi khuẩn
không nằm trong mạng lưới polymer [9].

8


BC có các đặc tính như độ bền cơ học cao, tính thấm và tính hút cao,
trạng thái kết tinh giúp A. xylinum kháng lại sự thay đổi của môi trường như
việc thay đổi xuống 1 hay 2 đơn vị pH trong thời gian nuôi cấy hay do lượng
nước bị giảm đi, các chất chuyển hóa được sinh ra [9].
1.1.2. Thuốc Berberin
1.1.2.1. Tên thuốc

Tên quốc tế: Berberine hydrochloride
Công thức hóa học: C20H18NO4Cl.2H2O
Khối lượng phân tử: 371,82 [17]
Công thức cấu tạo:

Hình 1.1. Công thức cấu tạo của BH
Tên khoa học: 5,6 - dihydro - 8,9 - dimethoxyl - 1,3 - dioxa - 6a azoniaindeno (5,6 - a) anthracen clorid dihydrat.
1.1.2.2. Tính chất
BH là một Alcaloid thực vật thuộc nhóm isoquinonlin, dạng tinh thể hay
bột kết tinh màu vàng, không mùi, có vị đắng, ít tan trong nước, độ tan của
BH trong nước là 1 : 500 [17], tan trong nước nóng và ethanol nóng, rất khó
tan trong cloroform, không tan trong ether, nhiệt độ nóng chảy là 145oC [17].
1.1.2.3. Tác dụng của thuốc
Tác dụng lâm sàng phổ biến nhất của BH là chống tiêu chảy do vi khuẩn,
ký sinh trùng đường ruột [1, 17]. Ngoài ra, BH với liều nhỏ có tác dụng kích

9


thích tim, làm giãn mạch vành, với liều lớn gây ức chế hô hấp làm tê liệt
trung khu hô hấp trong khi tim vẫn đập. BH còn có tác dụng hạ nhiệt, gây tê,
lợi mật, kháng lợi niệu, an thần, hạ huyết áp. Các nghiên cứu gần đây đã
chứng minh BH có tác dụng chống bệnh tiểu đường, chống viêm, bảo vệ tim
mạch, bảo vệ thần kinh [19]. Khi điều trị các bệnh nhiễm trùng đường ruột,
BH không ảnh hưởng tới sự phát triển bình thường của hệ vi khuẩn có lợi của
ống tiêu hóa. Khi dùng một số thuốc kháng sinh nếu phối hợp với BH sẽ hạn
chế được tác dụng không mong muốn gây ra bởi các thuốc kháng sinh đối với
hệ vi sinh vật đường ruột.
1.1.2.4. Chỉ định và chống chỉ định
BH được chỉ định trong điều trị nhiễm trùng đường ruột, tiêu chảy, lỵ đại

tràng, hội chứng lỵ - Viêm ống mật.
Chống chỉ định: Dị ứng với các thành phần của thuốc, phụ nữ có thai.
Tác dụng phụ: Táo bón.
1.2. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
1.2.1. Tình hình nghiên cứu về màng BC
1.2.1.1. Tình hình nghiên cứu trong nước
Từ năm 2000, Bộ môn Vi Sinh - Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành
phố Hồ Chí Minh đã bước đầu nghiên cứu dùng màng BC từ A. xylinum phối
hợp với hoạt chất tái sinh mô của dầu mù u điều trị vết bỏng thực nghiệm cho
kết quả tốt [9].
Nguyễn Văn Thanh và cs (2006) [9] đã tiến hành nuôi cấy, tinh chế và
thu màng BC từ A. xylium đạt hiệu cao. Đồng thời nhóm nghiên cứu trên
cũng đã tiến hành thử nghiệm in vivo trong ứng dụng màng BC điều trị bỏng
với 2 loại màng BC gồm cho thêm hoạt chất tái sinh mô và hoạt chất kháng
khuẩn. Kết quả cho thấy màng BC có cho thêm hoạt chất tái sinh mô từ dầu

10


mù u làm gia tăng hiệu quả trị bỏng là ưu điểm mà các loại màng khác trên
thế giới không có.
Năm 2012, Đinh Thị Kim Nhung, Nguyễn Thị Thùy Vân, Trần Như
Quỳnh [7] đã công bố công trình nghiên cứu “Nghiên cứu vi khuẩn
Acetobacter xylinum tạo màng bacterial cellulose ứng dụng trong điều trị
bỏng”, kết quả cho thấy màng BC tạo bởi A. xylinum BNH2 tổng hợ có sợi
cellulose nhỏ, dai, độ bền kéo, độ thấu khí cao; độ hút nước tốt có triển vọng
ứng dụng làm màng trị bỏng.
1.2.1.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Nghiên cứu về màng BC từ vi khuẩn A. xylinum và những ứng dụng
của nó đã được tiến hành ở nhiều nước trên thế giới. Tác giả Brown (1989),

dùng màng BC làm môi trường phân tách cho quá trình xử lý nước, dùng làm
chất mang đặc biệt cho các pin và năng lượng cho tế bào. Brown (1989),
Jonas và Farad, 1998, dùng màng như là một chất để biến đổi độ nhớt, để
làm ra các sợi truyền quang, làm môi trường cơ chất trong sinh học, thực
phẩm [9].
Czaja và cs (2006) sử dụng màng BC đắp lên các vết thương hở, vết
bỏng đã thu được kết quả tốt. Đặc biệt tác giả Wan (Canada) đã được đăng kí
bản quyền về làm màng BC từ A. xylinum dùng trị bỏng. Các tác giả Jonas và
Farad (1998), Czaja và cs (2006) đã dùng màng BC làm da nhân tạo, mặt nạ
dưỡng da cho phụ nữ [9].
1.2.2. Tình hình nghiên cứu về BH
1.2.2.1. Tình hình nghiên cứu trong nước
Vũ Bình Dương, Nguyễn Trọng Diệp, Nguyễn Thị Thùy, Hoàng Văn
Lương [1] (2010), Nghiên cứu bào chế viên nén Berberin giải phóng tại đích
đại tràng, kết quả đã nghiên cứu bào chế viên nén Bereberin clorid 100 mg

11


giải phóng tại đích đại tràng theo cơ chế phân hủy bởi hệ vi sinh vật đại
tràng. Hồ Cảnh Hậu, Hoàng Văn Thêm, Nguyễn Thị Lan Hương, Nguyễn
Văn Thuận, Nguyễn Cẩm Vân, Nguyến Tuấn Quang [2] (2015), Nghiên cứu
định lượng Berberin chlorid trong viên nén đại tràng 105 bằng phương pháp
sắc ký lỏng hiệu năng cao.
1.2.2.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Năm 2009, Jun Yin, Huili Xing, Jianping Ye [14] đã nghiên cứu đề tài
“Hiệu quả của Berberin ở bệnh nhân tiểu đường typ 2”, đề tài cho thấy
Berberin là một tác nhân hạ đường huyết mạnh, ít có tác dụng chuyển hóa
lipid. Có thể coi Berberin như là một ứng cử viên thuốc mới trong điều trị
bệnh tiểu đường loại 2. Năm 2004, Yin Jun, Chen Ming - Dao, Tang Jin Feng [21] đã nghiên cứu đề tài “Ảnh hưởng của Berberin đến quá trình

chuyển hóa glucose và lipid ở động vật”, kết quả cho thấy Berberin giúp hạ
đường huyết ở chuột có lượng chất béo cao.
Năm 2012, Jun Yin, Jianping Ye, Weiping Jia [13] đã công bố công trình
nghiên cứu “Tác dụng và cơ chế của Berberin trong điều trị bệnh tiểu đường”,
kết quả cho thấy Berberin tăng cường sự hấp thu glucose thông qua cảm ứng
của quá trình đường phân, ức chế quá trình hô hấp hiếu khí.
1.2.3. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về hường nghiên cứu
Tính đến cuối năm 2014 trên thế giới chỉ có 18 nghiên cứu ứng dụng BC
trong vận tải và phân phối thuốc đã được báo cáo [10], trong đó có 9 nghiên
cứu với màng BC tinh khiết, 2 nghiên cứu với thể chất biến đổi màng BC và 7
với các vật liệu nanocomposite. Như vậy, trong lĩnh vực này cần tiếp tục được
tiến hành nghiên cứu.
Amin và cs [11] (2012) đã báo cáo việc sử dụng màng BC làm màng
phân phối thuốc bằng cách sử dụng kĩ thuật phun phủ. Kết quả cho thấy màng
BC có thể làm thành một màng phim dẻo, trong suốt để phân phối thuốc, giúp
12


cho thuốc được giải phóng một cách kéo dài làm tăng hiệu quả sử dụng của
thuốc. Gần đây hơn, Lin Huang và cộng sự [17] (2013) nghiên cứu việc sử
dụng màng BC cho việc kiểm soát in vitro của Berberin. Ngoài thẩm thấu qua
da, thí nghiệm kiểm soát sự giải phóng thuốc qua màng BC còn được thử
nghiệm mô phỏng trong dạ dày, ruột. Các kết quả thu được cho thấy rằng
thuốc đã được giải phóng với một tốc độ chậm.
Amineda.I.F và cs [10] (2014) đã nghiên cứu việc sử dụng màng BC làm
hệ thống phân phối thuốc thử nghiệm in vitro trên da, kết quả nghiên cứu cho
thấy BC có thể sử dụng làm hệ thống phân phối thuốc qua da, tuy nhiên vẫn
cần kiểm tra sự tương thích với da trong điều kiện bình thường. Viêc bổ sung
glycerol vào màng BC giúp màng linh động hơn, giúp giữ ẩm cho da.
Ở Việt Nam việc ứng dụng màng BC làm hệ thống phân phối thuốc vẫn

còn là hướng đi mới, cần được nghiên cứu thêm.
Hiện chưa có công trình nào công bố về việc sử dụng BC từ dừa già làm
hệ thống phân phối BH qua đường uống.

13


CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
2.1.1. Giống vi khuẩn
Giống vi khuẩn A. xylinum thuần chủng được cung cấp bởi phòng thí
nghiệm vi sinh trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2.
2.1.2. Nguyên liệu - hóa chất
Nguyên liệu: Nước dừa già.
Hóa chất: BH dạng tinh khiết (98%).
Pepton, đường glucose.
(NH4)2SO4, KH2PO4.
Acid boric, NaOH, HCl.
Nước cất, cồn 960.
CH3COOH, H3PO4.
2.2. Thiết bị - dụng cụ
2.2.1. Thiết bị
Cân phân tích CP 224S.
Cân kĩ thuật TE 412.
Máy đo quang phổ tử ngoại UV - 2450 (Shimadzu - Nhật Bản).
Nồi hấp khử trùng HV - 110/HIRAIAM.
Buồng cấy vô trùng (Haraeus).
Tủ ấm (Biner - Đức).
Khuấy từ gia nhiệt (IKA - Đức).

Máy lắc tròn tốc độ chậm (Orbital Shakergallenkump - Anh).
Bể rung siêu âm S60/H
Bể ổn nhiệt 1013.
Tủ sấy, máy ép màng.
14


2.2.2. Dụng cụ
Hộp nhựa để lên men tạo màng BC, cốc đong 500 ml, 1000 ml, pipet,
bình định mức, bình tam giác, bình xịt cồn, kéo, giấy bạc, giấy thấm, giấy quỳ
tím và một số dụng cụ khác.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp tạo màng BC
Tạo màng BC từ môi trường chuẩn Hestrin - Schramm [19] có cải tiến
bằng cách thay cao nấm men bằng nước dừa già được trình bày trong bảng
2.1.
Bảng 2.1. Môi trường lên men tạo màng BC
Thành phần

Khối lượng

Nước dừa già

1000 ml

Đường glucose

20 g

(NH4)2SO4

3g

KH2PO4

2g

Pepton

4g

Acid acetic

2%

Dịch giống A. Xylinum

10%

Pha môi trường với tỉ lệ như trong bảng 2.1, hấp khử trùng ở 113oC
trong 15 phút sau đó khử trùng bằng tia UV trong 30 phút để nguội môi
trường rồi bổ sung 10% dịch giống và 2% acid acetic, nuôi cấy tĩnh trong 6
ngày ở 26oC thu được sản phẩm màng BC thô [7].
Sau khi nuôi cấy tĩnh từ 6 - 14 ngày ở 26oC màng BC được tách ra rửa
sạch bằng nước cất sau đó tinh chế theo quy trình ở sơ đồ 1 [9].

15


Tách màng BC thô

Ép loại nước
Ngâm trong NaOH 3%
48 giờ, rửa và ép
Ngâm trong HCl 3%
48 giờ, rửa và ép
Ngâm trong nước
48 giờ, kiểm tra tạp
chất
BC tinh chế
Sơ đồ 2.1. Quy trình nuôi cấy thu nhận BC
Tách BC: Trong môi trường nuôi cấy tĩnh BC tạo thành màng dày ở mặt
môi trường nuôi cấy, ép màng loại bỏ môi trường.
Trong màng chứa một lượng lớn vi khuẩn vì vậy ngâm màng trong
NaOH 3% trong 48 giờ để pha vỡ thành tế bào vi khuẩn và giải phóng nội độc
tố của vi khuẩn [9].
Ngâm HCl: Màng sau khi được ngâm NaOH rửa nước rồi ép màng. Sau
đó ngâm với HCl 3% trong khoảng 48 giờ để trung hòa hết NaOH [9].
Ngâm nước: Màng sau khi ngâm HCl rửa nước rồi ép màng. Ngâm nước
đến trung hòa hết acid HCl thời gian khoảng 48 giờ thu được BC tinh chế [9].
BC tinh chế được sấy trong tủ sấy ở 90oC, áp suất thường đến khối lượng
không đổi, ta được khối lượng BC tạo thành [9].
2.3.2. Phương pháp dựng đường chuẩn
Nguyên tắc: Dựa vào mẫu dung dịch chuẩn (7 mẫu):
16


Pha thuốc BH ở các nồng độ là 5%, 4%, 3%, 2%, 1,5%, 1%, 0,5%.
Dùng máy đo quang phổ tử ngoại UV - 2450 để đo mật độ quang phổ
(OD) của các dung dịch chuẩn đã pha ở bước sóng 345 nm [1, 19].
Dựng đồ thị đường chuẩn và lập phương trình chuẩn BH bằng phần mềm

Excel 2010.
Để kết quả đo có độ chính xác cao tiến hành pha dung dịch chuẩn 3 lần
và đo quang phổ 3 lần lấy giá trị trung bình để dựng đường chuẩn.
Kết quả trung bình quang phổ của BH ở bước sóng 345 nm được trình
bày trong bảng 2.2.
Bảng 2.2. Nồng độ BH và giá trị OD (n = 3)
Nồng độ

0,5

1

1,5

2

3

4

5

(mg/ml)
0,342 ± 0,579 ± 0,851 ± 1,15 ± 1,633 ± 2,173 ± 2,713 ±

OD

0,0044

0,0487

0,071

0,0235

0,0573

0,0515

OD345nm
Mật độ quang phổ

3
y = 0,5276x + 0,0674
R² = 0,9997

2,5
2
1,5

OD345nm

1

Linear (OD345nm)

0,5
0
0

2

4

6

Nồng độ BH (mg/ml)
Hình 2.1. Đồ thị đường chuẩn BH ở bước sóng 345 nm.

17

0,0382


Từ đồ thị đường chuẩn ta thu được phương trình đường chuẩn của BH ở
bước sóng 345 nm sau:
y = 0,5276x + 0,0674
R2 = 0,9997
Trong đó: x là nồng độ BH (mg/ml).
y là giá trị OD tương ứng với nồng độ x.
R2 là hệ số tương quan.
2.3.3. Phương pháp xác định lượng thuốc được hấp thụ vào màng BC
Lượng thuốc BH hấp thụ vào màng BC được tiến hành thử nghiệm trên 2
mẫu.
Mẫu 1: Dùng màng BC có độ dày 1 cm.
Mẫu 2: Dùng màng BC có độ dày 0,5 cm.
Cho 2 mẫu màng BC đã sấy khô vào 2 bình tam giác có chứa sẵn 100 ml
dung dịch BH 5%. Sau đó cho vào bể rung siêu âm để ở nhiệt độ 37oC, sau
30 phút, 1 giờ, 2 giờ lấy mẫu ra đo quang phổ để xác định lượng thuốc được
hấp thụ vào màng đến khi giá trị OD không đổi hoặc thay đổi không đáng kể,

lặp lại thí nghiệm 3 lần lấy giá trị trung bình để tính toán.
Lấy giá trị OD thu được thay vào phương trình đường chuẩn ta được
nồng độ BH (C%) trong dung dịch, từ đó tính được khối lượng BH có trong
dung dịch theo công thức số 1 [4]:
C% (w/v) = [mct(mg)/Vdd(ml)] × 100% (1)
Trong đó:

C% là nồng độ phần trăm khối lượng - thể tích chỉ số mg chất

tan có trong 100 ml dung dịch.
mct là khối lượng chất tan (mg).
Vdd là thể tích của dung dịch (ml).
Sau khi tính được lượng thuốc BH có trong dung dịch ta tính được khối
lượng thuốc BH được hấp thụ vào màng BC theo công thức 2:
18