Nghiên cứu sự vận tải và phân phối thuốc curcumin của màng bacterial cellulose lên men từ nước dừa già định hướng sử dụng qua da

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN
===o0o===

DIÊM THỊ THÙY DUNG

NGHIÊN CỨU SỰ VẬN TẢI VÀ
PHÂN PHỐI THUỐC CURCUMIN CỦA
MÀNG BACTERIAL CELLULOSE
LÊN MEN TỪ NƯỚC DỪA GIÀ
ĐỊNH HƯỚNG SỬ DỤNG QUA DA
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật

dẫn khoa học:
TS. Nguyễn Xuân Thành

HÀ NỘI - 2016


TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN
===o0o===

DIÊM THỊ THÙY DUNG

NGHIÊN CỨU SỰ VẬN TẢI VÀ
PHÂN PHỐI THUỐC CURCUMIN CỦA
MÀNG BACTERIAL CELLULOSE
LÊN MEN TỪ NƯỚC DỪA GIÀ
ĐỊNH HƯỚNG SỬ DỤNG QUA DA

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật

Người hướng dẫn khoa học
THS. LÊ THỊ TUYẾT hướng

dẫn khoa học:
TS. Nguyễn Xuân Thành

HÀ NỘI - 2016


LỜI CẢM ƠN
Trong suốt quá trình hoàn thành khóa luận nghiên cứu với đề tài
“Nghiên cứu sự vận tải và phân phối thuốc Curcumin của màng Bacterial
Cellulose lên men từ nước dừa già định hướng sử dụng qua da”, em đã
nhận được sự hướng dẫn, giúp đỡ quý báu của các thầy cô, các anh chị và các
bạn tại Trung tâm Hỗ trợ nghiên cứu khoa học và Chuyển giao công nghệ
trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2. Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc em
xin được bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới:
ThS. Lê Thị Tuyết – Người đã hướng dẫn, quan tâm, giúp đỡ em trong
suốt quá trình hoàn thành khóa luận này.
Em cảm ơn chân thành tới các thầy cô làm việc tại Trung tâm Hỗ trợ
nghiên cứu khoa học và Chuyển giao công nghệ - trường Đại học Sư phạm
Hà Nội 2, các thầy cô và các bạn sinh viên đang học tập và làm việc tại Bộ
môn Sinh lý người và động vật, trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã giúp đỡ
nhiệt tình và tạo mọi điều kiện thuận lợi trong quá trình hoàn thành đề tài
nghiên cứu.
Cuối cùng em xin được cảm ơn gia đình, những người thân, bạn bè đã
quan tâm, động viên, giúp đỡ em trong suốt thời gian qua.

Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 03 tháng 05 năm 2016
Sinh viên

Diêm Thị Thùy Dung


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan những gì viết trong luận văn này đều là sự thật. Đây là
kết quả nghiên cứu của riêng tôi. Tất cả các số liệu đều được thu thập từ thực
nghiệm, qua xử lý thống kê, không có số liệu sao chép hay bịa đặt, không
trùng với kết quả đã công bố. Trong tài liệu này tôi có sử dụng một số tài liệu
của một số tác giả, tôi xin phép tác giả để bổ sung cho luận văn của mình.
Nếu sai tôi hoàn toàn chịu trách nhiệm.
Hà Nội, ngày 03 tháng 05 năm 2016
Sinh viên

Diêm Thị Thùy Dung


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ................................................................................................... 1
1. Lý do chọn đề tài................................................................................ 1
2. Mục tiêu nghiên cứu .......................................................................... 3
3. Nhiệm vụ nghiên cứu ......................................................................... 3
4. Vật liệu và phạm vi nghiên cứu ......................................................... 3
5. Ý nghĩa ............................................................................................... 3
6. Phương pháp nghiên cứu ................................................................... 4
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ....................................................... 5
1. TỔNG QUAN VỀ BC ......................................................................... 5

1.1. Vị trí phân loại của Acetobacter xylinum ....................................... 5
1.2. Đặc điểm của A. xylinum ................................................................ 5
1.3. Cấu trúc đặc tính của màng BC tạo bởi A. xylinum ........................ 6
1.4. Tính chất độc đáo của BC ............................................................... 6
1.5. Sinh tổng hợp BC............................................................................ 7
1.6. Môi trường nuôi cấy A. xylinum ..................................................... 7
1.7. Các phương pháp sản xuất BC từ A. xylinum ................................. 8
1.8. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng màng BC trong lĩnh vực vận tải
và phân phối thuốc qua da ............................................................................. 9
2. TỔNG QUAN VỀ TINH CHẤT CUR............................................... 11
2.1. Sơ lược về thuốc CUR .................................................................. 11
2.2. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng của thuốc CUR ..................... 14
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............. 16
2.1. Vật liệu nghiên cứu ....................................................................... 16
2.2. Nội dung nghiên cứu..................................................................... 16
2.3. Phương pháp nghiên cứu .............................................................. 16
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................. 24


3.1. Độ dày màng BC trong các điều kiện nuôi cấy ............................ 24
3.2. Tinh chế màng BC ........................................................................ 25
3.3. Màng BC nạp CUR ....................................................................... 26
3.4. Khả năng hấp thụ CUR của màng BC .......................................... 27
3.5. Khả năng giải phóng thuốc CUR .................................................. 28
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................ 34
4.1. Kết luận ......................................................................................... 34
4.2. Kiến nghị....................................................................................... 34
TÀI LIỆU THAM KHẢO....................................................................... 35
PHỤ LỤC ................................................................................................ 39

DANH MỤC HÌNH ẢNH, SƠ ĐỒ, BIỂU ĐỒ

Hình 1.1: Cấu trúc CUR 1,7-bis (4-hydroxy-3-metoxyphenyl) -1,6-heptadien3,5-dione .............................................................................................................. 11
Hình 2.1: Phổ UV của CUR với dung môi là etanol........................................... 19
Hình 2.2: Phương trình đường chuẩn của CUR .................................................. 20
Hình 3.1: Màng BC thô thu được sau 6 ngày. .................................................... 25
Hình 3.2: Màng BC sau khi tinh chế................................................................... 26
Hình 3.3: Màng BC sau khi loát thuốc................................................................ 26
Hình 3.4: Màng BC – CUR 0,3 cm sau khi sấy .................................................. 27
Hình 3.5: Phương trình hồi quy của mẫu CUR................................................... 29
Biểu đồ 3.1: Mật độ quang của màng BC – CUR ở độ dày khác nhau .............. 30
Biểu đồ 3.2: Tỉ lệ giải phóng thuốc từ màng BC – CUR theo giờ...................... 32
Sơ đồ 2.1: Quy trình tinh chế màng BC .............................................................. 18


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1: Thành phần của nước dừa già............................................................. 8
Bảng 2.1: Môi trường nuôi cấy A. xylinum tạo màng BC ................................... 18
Bảng 2.2: Mật độ quang của dung dịch CUR ở các nồng độ (mg/ml) khác
nhau (n = 3) ......................................................................................................... 20
Bảng 2.3: Môi trường đệm PBS với pH 7,4........................................................ 21
Bảng 3.1: Kết quả thu màng BC tươi (n = 3). ..................................................... 24
Bảng 3.2: Tỉ lệ hấp thụ thuốc của CUR vào màng BC (n = 3) ........................... 27
Bảng 3.3: Khối lượng hấp thụ CUR vào màng BC ở các độ dày khác nhau
(n=3) .................................................................................................................... 28
Bảng 3.4: Độ hấp thụ quang của Curcumin tại các nồng độ (µg/ml) khác nhau
(n = 3) .................................................................................................................. 28
Bảng 3.5: Mật độ quang của dung dịch CUR tại các độ dày màng khác nhau
theo giờ (n = 3) .................................................................................................... 29

Bảng 3.6: Tỉ lệ giải phóng dược chất của màng BC – CUR ở độ dày khác
nhau trong môi trường đệm pH 7,4 theo thời gian (n = 3) ................................. 31
Bảng 3.7: Hệ số tương quan R2, tốc độ giải phóng thuốc (k) và trị số mũ giải
phóng (n) trong môi trường pH 7,4 ở độ dày màng khác nhau (n = 3) .............. 32


MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Trong những năm gần đây đã có sự chú ý đặc biệt về việc sử dụng các
vật liệu sinh học trong các sản phẩm chăm sóc sức khỏe vì khả năng tái tạo,
tương thích sinh học và phân hủy sinh học của chúng. Một trong những vật
liệu sinh học có những đặc tính trên được chú ý là cellulose. Vật liệu này vượt
trội so với các polyme tự nhiên và tổng hợp khác [15]. Trong đó, Bacterial
Cellulose hay màng sinh học (BC) là đối tượng của nhiều nghiên cứu ứng
dụng của các nhà khoa học trong nước cũng như nước ngoài. Đây là một loại
nguyên liệu mới, được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như thực phẩm, y học,
mỹ phẩm, ...Theo kết quả nghiên cứu cho thấy màng BC được tạo nên từ các
nguyên liệu rẻ tiền, dễ kiếm, có thể sản xuất trên quy mô công nghiệp. Về mặt
tính chất, BC có độ tinh sạch lớn hơn rất nhiều so với các loại cellulose khác,
có thể phân hủy sinh học, tái chế hay phục hồi hoàn toàn. Ngoài ra, BC còn có
độ bền tinh thể cao, sức căng lớn, trọng lượng thấp, ổn định về kích thước và
hướng. BC còn là một mạng polyme sinh học có khả năng giữ nước rất lớn,
có tính xốp, ẩm độ cao, có thể chịu được một thể tích đáng kể trên bề mặt (lực
bền cơ học cao) [5].
Ngoài ra, màng BC còn là hàng rào cản oxi và các sinh vật khác, ngăn
cản sự phân hủy các cơ chất ở trong tế bào và sự tác động của UV, có tiềm
năng cao cho các ứng dụng trong các hệ thống vận chuyển thuốc, cho cả thẩm
thấu qua da, qua đường miệng và mô - kỹ thuật, và một số ứng dụng y sinh
học khác [5, 6, 9, 28],…
Gần đây, một số nghiên cứu trên thế giới về việc ứng dụng màng BC làm

hệ thống phân phối và vận chuyển thuốc qua da với một số loại thuốc có hiệu
quả rõ rệt, khắc phục được nhược điểm của thuốc ở dạng thông thường. Lợi
thế lớn nhất từ việc sử dụng màng BC nạp thuốc là khả năng chữa lành vết

1


thương, đặc tính bảo vệ, khả năng hấp thu dịch tiết với việc giải phóng các
loại thuốc trị liệu có liên quan. Hầu hết các chế phẩm đắp qua da được sản
xuất bởi các vật liệu khác nhau. Do đó, một hệ thống nạp thuốc có khả năng
giải phóng thuốc kéo dài có ít lớp, hoặc thậm chí một lớp duy nhất có thể đơn
giản hóa quy trình sản xuất và giảm chi phí [5, 26].
Curcumin (CUR) có nguồn gốc từ các gia vị nghệ - thực phẩm phổ biến
được sử dụng trong nhiều thế kỷ như một phương thuốc cho nhiều bệnh.
Nghiên cứu khoa học rộng lớn trong thập kỷ qua đã thể hiện khả năng của
hợp chất này để điều chỉnh nhiều mục tiêu của tế bào và do đó có giá trị
phòng ngừa và điều trị chống lại một loạt các bệnh.
Trong những năm gần đây, các tác dụng dược lý tiềm năng của CUR
trong các bệnh viêm, bệnh tim mạch, ung thư, bệnh Alzheimer và các chứng
rối loạn thần kinh đã được chứng minh. Tuy nhiên, các ứng dụng lâm sàng
của CUR hạn chế do nhược điểm chính của nó như sự bất ổn, độ hòa tan thấp,
khả dụng sinh học kém và quá trình chuyển hóa nhanh chóng [27].
CUR - một hợp chất polyphenolic sở hữu tác dụng dược lý khác nhau
bao gồm chống viêm, chống oxy hóa, chống tiền tăng sinh và các hoạt động
chống tạo mạch. Mặc dù hiệu quả và độ an toàn của nó đã được chứng minh,
hạn chế sinh khả dụng CUR tiếp tục được nhấn mạnh như là một mối quan
tâm chính. Nồng độ CUR trong huyết thanh và mô thấp, không phân biệt
đường dùng, quá trình chuyển hóa nhanh chóng và loại trừ những yếu tố quan
trọng làm giảm bớt khả năng sinh khả dụng của CUR [8].
Thử nghiệm lâm sàng đã chỉ ra rằng chất CUR là an toàn ngay cả ở liều

cao (12 g/ngày) ở người nhưng biểu hiện sinh khả dụng kém. Lý do chính hấp
thu vào mức độ huyết tương và mô thấp của CUR là do kém hấp thu, chuyển
hóa nhanh chóng, và loại bỏ hệ thống nhanh chóng. Để cải thiện sinh khả
dụng của CUR, nhiều phương pháp đã được thực hiện [8].

2


Từ các nghiên cứu về màng BC và một số hạn chế của CUR trong quá
trình điều trị, xét thấy đây là hướng nghiên cứu mới và triển vọng. Đó là lí do
chúng tôi đã chọn đề tài: “Nghiên cứu sự vận tải và phân phối thuốc
Curcumin của Bacterial Cellulose lên men từ nước dừa già định hướng sử
dụng qua da”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
- Nghiên cứu tiềm năng của màng BC trong việc hấp thu và giải phóng
thuốc kéo dài định hướng sử dụng qua da nhằm khắc phục hạn chế của thuốc.
- Kết quả nghiên cứu thu được có thể khắc phục các nhược điểm của
CUR và tăng hiệu quả sinh khả dụng của thuốc thông qua việc sử dụng màng
BC làm hệ thống vận tải và phân phối thuốc qua da.
3. Nhiệm vụ nghiên cứu
- Tạo màng và xử lí màng BC.
- Thiết kế, chế tạo màng BC nạp CUR.
- Khảo sát khả năng vận tải và phân phối thuốc của BC – CUR in vitro.
4. Vật liệu và phạm vi nghiên cứu
- Vật liệu nghiên cứu: Màng BC làm từ môi trường nước dừa già; thuốc
CUR tinh khiết 95%.
- Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu khả năng vận tải và phân phối thuốc
CUR dựa trên màng BC định hướng qua da in vitro.
5. Ý nghĩa
* Ý nghĩa khoa học

Tiếp tục nghiên cứu tiềm năng của màng BC trong việc vận tải và phân
phối thuốc định hướng qua da. Việc nghiên cứu ứng dụng màng BC nhằm
nâng cao hiệu quả của thuốc CUR.
* Ý nghĩa thực tiễn
Sử dụng màng BC làm hệ thống vận tải và phân phối thuốc nhằm tạo hệ

3


thống vận tải và phân phối thuốc kéo dài có thể khắc phục những hạn chế của
thuốc CUR.
6. Phương pháp nghiên cứu
- Chuẩn bị màng BC;
- Phương pháp dựng đường chuẩn;
- Chuẩn bị bộ đệm;
- Chế tạo màng BC nạp CUR;
- Xác định lượng CUR nạp vào màng BC;
- Xác định lượng thuốc giải phóng của màng BC đã nạp thuốc CUR;
- Phương pháp xử lý thống kê.

4


Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1. TỔNG QUAN VỀ BC
1.1. Vị trí phân loại của Acetobacter xylinum
Acetobacter xylinum (A. xylinum)

thuộc nhóm vi khuẩn Acetic, chi

Acetobacter, họ Pseudomonadaceae, là loại hiếu khí bắt buộc, có nhu mao và
sản xuất cellulose ngoại bào [5].
Theo khóa phân loại của Bergey [20], A. xylinum thuộc:
Lớp: Schizomycetes
Bộ: Pseudomonadales
Bộ phụ :Pseudomonadieae
Họ: Pseudomonadaceae
1.2. Đặc điểm của A. xylinum
* Đặc điểm hình thái:
A. xylinum có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, kích thước ngang
khoảng 0,6 – 0,8 µm, dài khoảng 2 – 3 µm, vi khuẩn không sinh bào tử, gram
âm, không di động, sắp xếp riêng rẽ đôi khi xếp thành chuỗi, nhưng khi tế bào
già hay do điều kiện môi trường nuôi cấy, hình dạng có thể bị biển đổi: tế bào
dài hơn, phình to ra, phân nhánh hoặc không phân nhánh [5].
* Đặc điểm sinh lí và sinh hóa của A. xylinum:
Vi khuẩn có khả năng oxy hóa ethanol thành acid acetic, phản ứng
catalase dương tính, không tăng trưởng trên môi trường Hoyer, không tạo sắc
tố nâu, có khả năng tổng hợp cellulose, chuyển hóa glucose thành acid,
chuyển hóa glycerol thành dihydroaceton.
A. xylinum có thể sử dụng nhiều nguồn đường khác nhau và tùy thuộc
vào chủng mà nguồn đường nào được sử dụng tốt nhất.
Nhiệt độ tối ưu để A. xylinum phát triển là từ 25 - 30°C; vi khuẩn tăng
trưởng trong khoảng pH từ 3 – 8, pH tối ưu để sản xuất cellulose là 5,5 [5, 20].

5


1.3. Cấu trúc đặc tính của màng BC tạo bởi A. xylinum
- Màng BC cấu tạo bởi những chuỗi polimer β-1,4-glucopyranose không
phân nhánh. Những nghiên cứu đã cho thấy cấu trúc hóa học cơ bản của BC

giống cellulose của thực vật, tuy nhiên chúng khác nhau về cấu trúc đại thể
[13, 28].
- Theo AJ. Brown (1886), BC gồm nhiều sợi siêu nhỏ có bản chất là
hemicellulose, đường kính 1,5 nm, kết hợp với nhau. Các sợi này kết hợp với
nhau thành bó, nhiều bó hợp thành dãy, mỗi dãy dài khoảng 100nm, rộng
khoảng 3 – 8 nm.
- Đặc tính cấu trúc của BC phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện nuôi cấy:
+ Khi nuôi cấy theo phương pháp tĩnh (S - BC: Static-Bacterial
Cellulose), A. xylinum tạo ra cellulose nhiều hơn và tạo thành màng dày trên bề
mặt môi trường. Màng BC thu được dẻo dai, dày, có màu trắng trong hơi ngả
màu vàng.
+ Khi nuôi cấy động (A - BC: Agitated-Bacterial Cellulose), một lượng
nhỏ cellulose được hình thành dưới dạng hyền phù phân tán trong đó chuỗi β1,4-glucan xếp một cách ngẫu nhiên. BC được tạo ra bằng phương pháp nuôi
cấy động dưới dạng các hạt nhỏ, các sợi rối rắm, cong và không trật tự do sự
dao động của môi trường nuôi cấy.
+ Lượng BC được sinh ra giữa hai phương pháp nuôi cấy động và tĩnh
cũng khác nhau: khối lượng màng khô của phương pháp nuôi cấy động nhỏ
hơn so với nuôi cấy tĩnh [5, 24].
1.4. Tính chất độc đáo của BC
- Độ tinh khiết cao: BC là cellulose sinh học duy nhất được tổng hợp
không có chứa lignin hay hemicellulose. Do đó BC có thể bị vi khuẩn phân
hủy hoàn toàn và là nguồn nguyên liệu tái sinh [30].
- Độ bền dai cơ học lớn: cellulose có độ bền dai cao, chịu lực kéo cao,
trọng lượng nhẹ, độ bền đáng kể [6, 30].
6


- Khả năng hút nước cực cao ở trạng thái ẩm: khả năng giữ nước đáng kể,
lực ẩm cao. Màng BC có khả năng giữ nước rất lớn, nó có thể hút khoảng 200
lần trọng lượng của nó (Patel & Suresh 2008; Wippermann et al. 2009) [33].

1.5. Sinh tổng hợp BC
Các vị trí tổng hợp cellulose của A. xylinum là những lỗ nằm trên bề mặt
tế bào, có đường kính 3,5 nm sắp xếp song song trên đường thẳng trục dọc
của vi khuẩn. Mỗi lỗ bao phủ một tiểu phần 10 nm chứa các enzym có chức
năng trong sự polyme hóa để tổng hợp cellulose và các protein hỗ trợ liên
quan đến các chức năng khác [5].
A. xylinum hấp thu đường glucose vào trong tế bào, kết hợp với một
acid béo tạo thành tiền chất nằm ở màng tế bào, sau đó tiền chất này được tiết
ra ngoài tế bào cùng với enzym để thực hiện quá trình polyme hóa tạo
cellulose. Các sợi siêu nhỏ 1,5 nm tạo nên các dãy glucan tạo thành các sợi,
sau đó kết hợp với nhau thành bó sợi nhỏ. Các bó sợi này sẽ được phun vào
môi trường nuôi cấy [5].
1.6. Môi trường nuôi cấy A. xylinum
Môi trường nuôi cấy A. xylinum là môi trường tổng hợp từ các nguồn
dinh dưỡng cần thiết như nguồn cacbon, nitơ, nguồn sulfur và phospho, các
yếu tố tăng trưởng và các yếu tố vi lượng [5].
A. xylinum là loài có khả năng tổng hợp cellulose từ nguồn
cacbonhydrat. Nguồn cacbonhydrat mà A. xylinum sử dụng là glucose,
fructose, maninol, sorbitol nếu sử dụng glycerol, galactose, lactose, sucrose
cho hiệu suất thập hơn, không nên sử dụng mannose, cellobiose, erythriol,
acetate. Việc sử dụng các loại đường cũng như nồng độ các loại đường trong
môi trường còn phụ thuộc vào những chủng A. xylinum khác nhau [5].
Nhu cầu sử dụng đương ở A. xylinum rất lớn và giữ vai trò quan trọng
trong quá trình tổng hợp BC nên có rất nhiều nghiên cứu và đề nghị sử dụng

7


các sản phẩm: rỉ đường, chất thải trong công nghiệp sản xuất khoai tây và pho
mát, nước dừa già và nước mía... để làm nguyên liêu nuôi cấy A. xylinum.

Trong đó nước dừa già được xem là môi trường kinh điển trong nuôi cấy A.
xylinum [5].
Trong nước dừa chưa rất nhiều chất dinh dưỡng và chất kích thích tố
tăng trưởng như hexitol, cytolunin, sorbitol, … Vì vậy A. xylinum rất thích
hợp phát triển trong môi trường này. Nước dừa sau khi thu hoạch được sử
dụng không quá 3 ngày, tránh để lâu làm cho đường và các chất dinh dưỡng
khác giảm dẫn đến hiệu suất kém [5, 11]. Thành phần dinh dưỡng của nước
dừa được trình bày trong bảng 1.1 [5].
Bảng 1.1: Thành phần của nước dừa già.
Nước (%)

94,99 Kẽm (mg/100g)

0,1

Protein (%)

0,72 Đồng (mg/100g)

0,04

Chất béo toàn phần (%)

0,72 Mangan (mg/100g)

0,142

Carbonhydrat (%)

3,17 Selenium (µg/100g)

1

Đường (%)

2,16 Vitamin C (µg/100g)

2,4

24 Thiamin (mg/100g)

0,03

0,29 Riboflavin (mg/100g)

0,057

Calcium (mg/100g)
Sắt (mg/100g)
Magie (mg/100g)

25 Niacin (mg/100g)

Phosphorus (mg/100g)

20 Acid Pathenic (mg/100g)

Kali (mg/100g)

250 Vitamin B6 (mg/100g)

Natri (mg/100g)

105 Folate (µg/100g)

0,08
0,043
0,032
3

1.7. Các phương pháp sản xuất BC từ A. xylinum
1.7.1. Lên men tĩnh
Môi trường dinh dưỡng để lên men A. xylinum được cho vào các khay lên
men có bề mặt thoáng rộng. Trong quá trình lên men các khay được đậy bằng

8


giấy báo có độ xốp, giúp tạo độ thông khí giữa môi trường lên men và môi
trường bên ngoài nhưng vẫn tránh được khả năng nhiễm khuẩn. Nhiệt độ thích
hợp cho quá trình lên men 28 - 30ᴼC. Sợi cellulose mới được tổng hợp sẽ di
chuyển lên bề mặt của môi trường nuôi cấy tạo thành lớp màng cellulose nằm ở
mặt phân cách giữa môi trường lỏng và không khí. Cellulose tiếp tục được tổng
hợp bám lên màng cellulose bên trên. Sau 7-10 ngày có thể thu BC [5, 24].
1.7.2. Lên men động
Vi khuẩn A. xylinum thường được nuôi cấy trong môi trường nuôi cấy lắc.
Cấy dịch huyền phù vi khuẩn đã được hoạt hóa vào môi trường nuôi cấy đã
chuẩn bị sẵn trong các bình erlen rồi đem đi lắc trong các máy lắc ổn nhiệt ở
28-30ᴼC, 180-200 vòng/phút. BC được tạo ra từ môi trường lắc có dạng hạt
nhỏ, hạt hình sao và các sợi dài, chúng phân tán rất tốt trong môi trường.

Lượng O2 hòa tan trong môi trường ảnh hưởng lớn đến sự sinh trưởng và khả
năng tổng hợp BC của vi khuẩn A. xylinum. Do đó, quá trình lên men đạt hiệu
quả cao, các reactor có sục khí thường xuyên được sử dụng để lên men [5, 24].
1.8. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng màng BC trong lĩnh vực vận tải
và phân phối thuốc qua da
1.8.1. Trên thế giới
Tính đến cuối năm 2014 trên thế giới chỉ có 18 nghiên cứu ứng dụng BC
trong vận tải và phân phối thuốc đã được báo cáo [6], trong đó có 9 nghiên
cứu với màng BC tinh khiết, 2 nghiên cứu với thể chất biến đổi màng BC và 7
nghiên cứu với các vật liệu nanocomposite. Như vậy, trong lĩnh vực này cần
tiếp tục được tiến hành nghiên cứu.
Một số nghiên cứu trên thế giới về việc ứng dụng màng BC làm hệ
thống phân phối và vận chuyển thuốc qua da với một số loại thuốc đã cho
thấy có hiệu quả rõ rệt, khắc phục được nhược điểm của thuốc ở dạng thông
thường. Nghiên cứu của Wei B. và cộng sự (2011) cho thấy màng khô BC thu

9


được sau khi ngâm trong benzalkonium chloride (một tác nhân kháng khuẩn;
Merck KGaA, Darmstadt, Đức) có khả năng giải phóng thuốc trên mỗi đơn vị
diện tích bề mặt đã được tìm thấy là 0,116 kg/cm2, và tác dụng của thuốc kéo
dài ít nhất 24h chống lại hoạt động của S. aureus và B. Subtilis [31]. Nghiên
cứu khác cho thấy việc sử dụng nanocomposites bạc với BC đã cho hiệu quả
kháng khuẩn cao [21].
Tiềm năng vận tải và phân phối thuốc của màng BC qua da đã được
nghiên cứu bằng cách tải tetracycline trong chùm electron mẫu chiếu xạ và
không được chiếu xạ. BC không chiếu xạ cho phép giải phóng thuốc nhanh
hơn so với ảnh hưởng của BC chiếu xạ. Kết quả nghiên cứu này cho thấy
màng BC không chỉ có khả năng vận tải mà còn đề xuất một mô hình cho giải

phóng thuốc qua màng [6]. Việc sử dụng màng BC cho việc thẩm thấu qua da
của nhiều thuốc, cụ thể là ibuprophen [33], caffeine [24], diclofenac [25] và
sulfadiazine bạc [16] cho kết quả tích cực. Các kết quả nghiên cứu cho thấy
việc bổ sung glycerol vào màng BC giúp màng linh động hơn và tạo điều kiện
giữ ẩm cho bề mặt da. Tất cả các loại thuốc trên đã được thử nghiệm in vitro
cho thẩm thấu qua da [17] và so sánh với cách thức thông thường. Kết quả
cho thấy ibuprofen là chất ưu mỡ thấm qua màng BC cao hơn gần ba lần
những quan sát trong gel hoặc các giải pháp PEG400; lidocaine hydrochloride
thẩm thấu qua màng chậm hơn ibuprofen, do màng BC có cấu trúc mạng
không gian ba chiều phức tạp đã làm cho sự khuếch tán của thuốc được kéo
dài và làm giảm tỉ lệ giải phóng thuốc khi so sánh với các cách thức thông
thường, đây là một lợi thế cho việc điều trị dài hạn của thuốc mà không gây
tình trạng quá mẫn [33]. Luan J. et al. (2012) [16], đã nghiên cứu màng BC
cho băng vết thương nạp sulfadiazine bạc, một loại thuốc phổ biến được sử
dụng trong điều trị vết thương nhiễm khuẩn do bỏng. Nó đã được chứng minh
rằng sau khi sử dụng màng BC ngâm tẩm bạc sulfadiazine, hoạt động kháng

10


khuẩn đối với P. aeruginosa, E. coli và S. aureus đạt hiệu quả tốt hơn dạng
kem bôi thông thường.
1.8.2. Tại Việt Nam
Nguyễn Văn Thanh và cộng sự (2006) [5] đã tiến hành nuôi cấy, tinh
chế và thu màng BC từ A. xylium đạt hiệu cao. Đồng thời nhóm nghiên cứu
trên cũng đã tiến hành thử nghiệm in vivo trong ứng dụng màng BC điều trị
bỏng với 2 loại màng BC gồm cho thêm hoạt chất tái sinh mô và hoạt chất
kháng khuẩn. Kết quả cho thấy tác dụng của màng có thêm hoạt chất tái sinh
mô tốt hơn hẳn.
2. TỔNG QUAN VỀ TINH CHẤT CUR

2.1. Sơ lược về thuốc CUR
2.1.1. Công thức
+ Tên IUPAC: (1E, 6E) -1,7-bis (4-hydroxy-3-metoxyphenyl) -1,6heptadien- 3,5-dione (Anand et al 2007) [2].
Cấu trúc CUR được trình bày trong hình 1.1.
Công thức phân tử: C21H20O6 (CUR I).
+ Phân tử khối: 368,38 g/mol.

Hình 1.1: Cấu trúc CUR 1,7-bis (4-hydroxy-3-metoxyphenyl) -1,6heptadien- 3,5-dione.
+ Hiện tại người ta tìm thấy CUR tồn tại ở 4 dạng hợp chất:
11


- CUR chính thức ( còn gọi là CUR I) chiếm 60% tổng lượng CUR.
- Demethoxycurcumin ( CUR II ) chiếm 24% tổng lượng CUR.
- Bis-demethoxycurcumin ( CUR III ) chiếm 14% tổng lượng CUR.
- Và một hợp chất mới xuất hiện là cyclocurcumin chiếm khoảng 1%
[1, 2, 3, 8].
2.1.2. Nguồn gốc và tính chất
* Nguồn gốc:
CUR là hoạt chất được chiết xuất từ cây Nghệ vàng Curcuma longa L., họ
gừng Zingiberaceae, chiếm 0,3% khối lượng khô của cây Nghệ vàng [3, 7, 18].
Thành phần hóa học của nghệ gồm: nhóm chất màu curcuminoid, tinh
dầu và các hợp chất khác [3].
* Tính chất:
+ Tinh thể nâu đỏ, ánh tím [18].
+ Nhiệt độ nóng chảy: 183ᴼC [1, 2].
+ Độ tan: không tan trong nước , CUR tan trong ethanol [14].
+ Độ hấp thụ: 427 nm [22].
+ CUR có thể tồn tại dưới các dạng đồng phân tương hỗ enol hoặc keto.
Đồng phân ceto tồn tại ở dạng rắn còn đồng phân enol tồn tại trong dung dịch,

dạng keto chiếm ưu thế trong các giải pháp có tính axit và trung tính và dạng
enol ổn định trong môi trường kiềm [14, 32].
2.1.3. Dược động học và tác dụng
2.1.3.1. Dược động học
Sự hấp thu, sinh khả dụng, nghiên cứu sự trao đổi chất, và loại bỏ các
chất CUR có, không may, chỉ hiển thị kém hấp thu, chuyển hóa nhanh chóng,
và loại bỏ CUR là lý do chính cho khả dụng sinh học kém của hợp chất
polyphenolic thú vị này. Những lý do để giảm sinh khả dụng của thuốc trong
cơ thể là do hấp thu kém, tỉ lệ trao đổi chất cao, các sản phẩm trao đổi chất

12


không hoạt động hoặc giải phóng nhanh chóng ra khỏi cơ thể. Các nghiên cứu
cho đến nay đã gợi ý một hoạt động nội tại mạnh mẽ và, do đó, hiệu quả của
chất CUR như một đại lý trị liệu cho các bệnh khác nhau [22].
Các nghiên cứu trong ba thập kỷ qua liên quan đến sự hấp thu, phân bố,
chuyển hóa và bài tiết chất CUR đã tiết lộ khả năng hấp thu kém và chuyển
hóa nhanh chóng của chất CUR mà giảm bớt nghiêm trọng sinh khả dụng của
nó. Trong phần này, các vấn đề khả dụng sinh học của CUR như độ thấp
trong huyết thanh, phân phối mô hạn chế, quá trình chuyển hóa nhanh chóng
rõ ràng và ngắn nửa cuộc sống được mô tả chi tiết [32].
Rào cản lớn khiến thuốc nghệ CUR chưa được ứng dụng rộng rãi là do
CUR không tan trong nước (độ tan 0,001%), sinh khả dụng thấp [23]. Vì vậy,
khi dùng theo đường uống, CUR hòa tan một phần rất nhỏ vào các dịch thể
của ống tiêu hóa, chỉ 7 – 10% CUR được hấp thụ vào máu, lại bị chuyển hóa
nhanh qua gan, làm cho sinh khả dụng thực tế của CUR chỉ đạt 2-3% [22].
Các nghiên cứu dược động học ở động vật đã chứng minh rằng 40 - 85
phần trăm của liều uống CUR đi qua đường tiêu hóa không thay đổi, với hầu
hết các phức flavonoid hấp thu chuyển hóa ở niêm mạc ruột và gan [23].

2.1.3.2. Tác dụng
CUR có tác dụng chống oxy hóa, chống viêm, kháng virus và kháng
nấm. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng chất CUR là không độc hại đối với con
người. CUR gây sức hoạt động chống viêm bằng cách ức chế một số phân tử
khác nhau mà đóng một vai trò quan trọng trong viêm. Củ nghệ có hiệu quả
trong việc giảm viêm sau phẫu thuật. Củ nghệ giúp ngăn ngừa xơ vữa động
mạch bằng cách làm giảm sự hình thành của máu làm các khối [22].
CUR ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn Helicobacter pylori gây viêm
loét dạ dày và đã được liên kết với ung thư dạ dày. CUR có thể gắn với các
kim loại nặng như cadmium và chì, do đó làm giảm độc tính của các kim loại
nặng. Thuộc tính này của CUR giải thích hành động bảo vệ của nó đến não.
13


CUR hoạt động như một chất ức chế cho cyclooxygenase, 5-lipoxygenase và
glutathione S-transferase [14].
2.2. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng của thuốc CUR
2.2.1. Trên thế giới
Các tài liệu khoa học trong 20 năm qua trên curcumin cho thấy chất
curcumin có thể là một ứng cử viên mong muốn trong phòng ngừa và điều trị
bệnh ung thư. Số liệu hiện tại (theo cơ sở dữ liệu SciFinder, ngày 23 tháng 8
năm 2011) cho thấy tổng cộng có 12.903 lượt truy cập vào "curcumin". Trong
số đó, 60 tài liệu tham khảo là các thử nghiệm lâm sàng, 1094 tài liệu tham
khảo trong một hình thức xem xét và tham khảo 1.515 trên các ứng dụng bằng
sáng chế. Có tổng cộng 56 thử nghiệm lâm sàng (giai đoạn I và giai đoạn II)
trên CUR được liệt kê trên trang web của Viện y tế Quốc gia Hoa Kỳ. Trong
số đó, 16 thử nghiệm đã được hoàn thành, ba thử nghiệm đã được chấm dứt,
một người bị thu hồi và phần còn lại của các nghiên cứu đang được thực hiện
[26].
Nghiên cứu năm 2011 của Bambang Kuswandi và các cộng sự [10] về

CUR / BC trong việc phát hiện sự hư hỏng của tôm. Công trình này sử dụng
thuốc nhuộm tự nhiên của chất CUR như chất cảm biến để phát hiện các biến
động vô cơ và hữu cơ được sản xuất trong quá trình tăng trưởng của vi khuẩn
trong mẫu tôm. CUR được sử dụng như là thuốc thử cảm biến tự nhiên , là cố
định trên BC sử dụng hấp thụ như một phương pháp đơn giản cho phép khối
lượng sản xuất của bộ cảm biến chi phí thấp. Như vậy, tất cả các vật liệu cảm
biến có thể ăn được và phù hợp cho các ứng dụng thực phẩm. Các chất CUR /
BC đã được sử dụng thành công như một cảm biến nhãn dán trên gói cho một
phát hiện hình ảnh của tôm hư hỏng [10].
Nghiên cứu năm 2012 của Min Sun, Xun Su, Buyun Ding, Xiuli He,
Xiuju Liu, Aihua Yu, Hongxiang Lou, Guangxi Zhai về những tiến bộ trong

14


hệ thống phân phối cho chất CUR dựa trên công nghệ nano [27]. Bài viết này
đánh giá các hệ thống phân phối thuốc mới tiềm năng cho CUR bao gồm các
liposome, hạt nano polyme, hạt nano lipid rắn, mixen, nanosuspensions, dạng
nhũ tương nano, cụm, trong đó cung cấp các kết quả đầy hứa hẹn cho CUR để
cải thiện hoạt động sinh học của nó. Tóm lại, hệ thống phân phối thuốc mới
làm sáng tỏ về sự phát triển của các công thức mới, trong khi đó, nghiên cứu
sâu rộng hơn nên được thực hiện trong tương lai để giải quyết các vấn đề
dược phẩm và ngộ độc [27].
2.2.2. Tại Việt Nam
Tại Việt Nam, đã có rất nhiều công trình nghiên cứu liên quan đến CUR
nhưng chủ yếu là các công trình nghiên cứu liên quan đến tách chiết và chế
tạo vật liệu Nano CUR. Tại Hội thảo khoa học “Định hướng phát triển khoa
học và công nghệ vật liệu tiên tiến tại Đại học Quốc gia Hồ Chí Minh”, TS.
Dương Minh Tâm cho biết Trung tâm Nghiên cứu triển khai Khu Công nghệ
cao TP.HCM đã chế tạo thành công vật liệu nano CUR ở dạng hòa tan trong

dung dịch nước (nồng độ 8% khối lượng) nhằm hướng tới ứng dụng trong
thực phẩm chức năng [4].
Tuy nhiên chưa có công trình nào nghiên cứu sử dụng màng BC để vận
tải và phân phối thuốc CUR để làm tăng sinh khả dụng của thuốc.

15


Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
- Thuốc CUR (95%) có nguồn gốc từ Ấn Độ.
- Etanol 96º có nguồn gốc Việt Nam.
- Màng BC (99% hàm lượng nước) được sản xuất bằng cách sử dụng vi
khuẩn A. xylinum (Phòng thí nghiệm Vi sinh, Trường ĐHSP Hà Nội 2) lên
men từ nước dừa già.
- Máy đo quang phổ UV – 2450 (Shimadzu – Nhật Bản); Cân phân tích
(Sartorius – Thụy Sỹ); Nồi hấp khử trùng HV-110/HIRAIAMA; Buồng cấy
vô trùng (Haraeus); Tủ sấy, tủ ấm (Binder - Đức); Khuấy từ gia nhiệt (IKA –
Đức); Máy rung siêu âm TCP 280; Tủ lạnh Daewoo, tủ lạnh sâu và nhiều
dụng cụ hóa sinh thông dụng khác.
- Vật liệu làm môi trường nuôi cấy vi sinh vật tạo màng BC: Glucose,
Pepton, KH2PO4, (NH4)2SO4, Nước dừa, Axit acetic, HCl, NaOH, … đạt tiêu
chuẩn phân tích.
2.2. Nội dung nghiên cứu
+ Nghiên cứu qui trình nuôi cấy A. xylinum với các nguyên liệu có sẵn.
+ Thu sản phẩm BC từ dịch nuôi cấy và quá trình xử lý.
+ Chế tạo màng sinh học nạp thuốc CUR.
+ Khảo sát khả năng hấp thụ của thuốc CUR vào màng BC.
+ Khảo sát khả năng giải phóng thuốc từ màng BC - CUR trong môi
trường đệm pH 7,4.

2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Chuẩn bị màng BC
- A. xylinum được nuôi cấy để tạo màng BC trong môi trường cải biên
từ môi trường chuẩn Hestrin – Schramm [19] được trình bày trong bảng 2.1.

16


Bảng 2.1: Môi trường nuôi cấy A. xylinum tạo màng BC.
Hóa chất

Khối lượng

Nước dừa

1000 ml

Glucose

20 g

Pepton

4g

(NH4)2SO4

3g

KH2PO4

2g

Acid acetic

2%

Dịch giống A. xylinum

10%

- Dùng máy khuấy từ để khuấy đều môi trường nuôi cấy (môi trường
chưa có acid acetic và dịch giống) cho đến khi bão hòa.
- Cho dung dịch vào nồi hấp thanh trùng ở 113ᴼC trong 15 phút để diệt
khuẩn và nấm mốc.
- Đặt môi trường tạo màng trong buồng cấy vô trùng, để dưới đèn tím 30
phút. Khi môi trường đã nguội hoặc ở nhiệt độ khoảng 30 - 35ᴼC.
- Sau đó cho dịch giống vào môi trường (10% thể tích của môi trường);
thêm vào môi trường 2% acid axetic để hạn chế nấm.
- Cho dung dịch vào hộp đựng có nắp đậy và đậy kín lại hoặc sử dụng
vải xô để đậy nắp hộp.
* Thực hiện quá trình nuối cấy tĩnh
- Để khay đựng môi trường tạo màng vào nơi thoáng khí, có nhiệt độ ổn
định và không di chuyển dung dịch trong khay từ 6 - 14 ngày để dung dịch
lên màng.
- Trong quá trình nuôi cấy tĩnh cần mở nắp hộp đựng mỗi ngày một
khoảng thời gian để giảm lượng khí CO2 trong hộp đựng. Nếu sử dụng vải xô
để đậy nắp hộp thì không cần mở mỗi ngày.
17