Nghiên cứu quy trình nhân giống cây thanh long bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH – KTNN
********************

ĐỖ THỊ THU PHƯỢNG

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG CÂY
THANH LONG BẰNG KĨ THUẬT NUÔI CẤY MÔ
TẾ BÀO THỰC VẬT

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật

HÀ NỘI, 2016


TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH – KTNN
********************

ĐỖ THỊ THU PHƯỢNG

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG CÂY
THANH LONG BẰNG KĨ THUẬT NUÔI CẤY
MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật

Người hướng dẫn khoa học
PGS.TS. NGUYỄN VĂN MÃ

HÀ NỘI, 2016


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn Văn Mã và
TS. La Việt Hồng – Khoa Sinh KTNN Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã
tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Tôi xin cảm ơn tới Ban Giám hiệu trường ĐHSP Hà Nội 2, Ban Chủ
nhiệm khoa Sinh – KTNN trường ĐHSP Hà Nội đã tạo mọi điều kiện để tôi
hoàn thành khoá luận này.
Trong thời gian thực hiện đề tài tôi cũng nhận được sự giúp đỡ tận tình
của cô Mai Thị Hồng – Phòng thí nghiệm Sinh lý thực vật đã giúp đỡ, đóng
góp ý kiến để tôi hoàn thành đề tài khoá luận, nhân đây tôi cũng xin giử lời
cảm ơn.
Tôi cũng xin trân thành cảm ơn tập thể cán bộ Phòng thí nghiệm Sinh lý
Thực vật – trường ĐHSP Hà Nội 2 đã tạo điều kiện thuận lợi về thiết bị,
phương tiện để tôi có thể hoàn thành khoá luận này.
Cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên, góp ý cho tôi trong quá
trình học tập và hoàn thành đề tài.
Hà Nội, 10 tháng 04 năm 2016
Sinh Viên

Đỗ Thị Thu Phượng


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu,
kết quả nghiên cứu trong khoá luận là trung thực và chưa được ai công bố.
Hà Nội, 10 tháng 04 năm 2016

Sinh viên

Đỗ Thị Thu Phượng


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
LỜI CAM ĐOAN
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1
1. Lý do chọn đề tài ....................................................................................... 1
2. Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu ............................................................. 2
3. Ý nghĩa lý luận và thực tiễn ....................................................................... 3
NỘI DUNG ....................................................................................................... 4
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 4
1.1. Giới thiệu về cây Thanh long ................................................................. 4
1.2. Đặc điểm sinh học .................................................................................. 5
1.2.1. Sinh thái............................................................................................ 5
1.2.2. Thực vật học ..................................................................................... 5
1.3. Giá trị sử dụng ........................................................................................ 6
1.4. Tình hình sản xuất và tiêu thụ Thanh long ở nước ta ............................. 7
1.5. Một số nghiên cứu về cây Thanh long ................................................... 8
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................ 10
2.1. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................... 10
2.2. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm ............................................................. 10
2.2.1. Dụng cụ .......................................................................................... 10
2.2.2. Thiết bị ............................................................................................ 10
2.3. Môi trường nuôi cấy ............................................................................. 10

2.4. Điều kiện nuôi cấy in vitro ................................................................... 11
2.5. Phương pháp nghiên cứu ...................................................................... 11


2.5.1. Sơ đồ nghiên cứu ............................................................................ 11
2.5.2. Phương pháp phân tích thống kê dữ liệu thực nghiệm .................. 14
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 15
3.1. Tạo vật liệu khởi đầu ............................................................................ 15
3.2. Nhân nhanh chồi in vitro cây Thanh long ............................................ 17
3.3. Tạo cây hoàn chỉnh: Ra rễ cho cây Thanh long in vitro....................... 20
3.4. Rèn luyện cây Thanh long in vitro thích nghi với điều kiện tự
nhiên............................................................................................................. 22
SƠ ĐỒ QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG THANH LONG IN VITRO ............... 24
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................. 25
4.1. Kết luận ................................................................................................. 25
4.2. Kiến nghị............................................................................................... 25
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 26
PHỤ LỤC ........................................................................................................ 29


DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1: Tạo vật liệu in vitro cây Thanh long từ đốt thân............................ 12
Bảng 2.2. Công thức thí nghiệm ảnh hưởng của BAP và NAA đến sự tái
sinh và nhân nhanh chồi in vitro từ đốt thân cây Thanh long ........ 13
Bảng 2.3. Công thức thí nghiệm ảnh hưởng của NAA đến sự hình thành
rễ của chồi Thanh long in vitro ...................................................... 13
Bảng 2.4. Công thức thí nghiệm ảnh hưởng của giá thể đến sự sinh
trưởng và phát triển của cây Thanh long in vitro........................... 14
Bảng 3.1: Kết quả tạo vật liệu khởi đầu từ đốt thân cây Thanh long ............. 16

Bảng 3.2. Ảnh hưởng của BAP và NAA đến sự tái sinh và nhân nhanh
chồi in vitro từ đốt thân cây Thanh long ........................................ 18
Bảng 3.3: Ảnh hưởng của NAA đến sự hình thành rễ của chồi Thanh
long in vitro ..................................................................................... 21
Bảng 3.4: Ảnh hưởng của giá thể đến sự thuần hoá cây Thanh long in
vitro ................................................................................................. 22


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Cây Thanh long trồng ngoài tự nhiên ............................................. 12
Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu............................................................................ 18
Hình 3.2. Ảnh hưởng của BAP và NAA đến sự tái sinh và nhân nhanh
chồi in vitro từ đốt thân cây Thanh long ......................................... 27
Hình 3.3. Ảnh hưởng của NAA đến sự hình thành rễ của chồi Thanh
long in vitro ..................................................................................... 30
Hình 3.4. Thanh long trồng ngoài vườn ươm trên các giá thể khác

nhau(100% đất, đất: cát (1:1), đất: xơ dừa (1:1)Error! Bookmark not defined


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

NAA

Napthlacetic acid

BAP

6- Benzyl amino purin

MS

Murashige và Skoog

ĐC

Đối chứng

CT

Công thức

Nxb

Nhà xuất bản

Tp. HCM

Thành phố Hồ Chí Minh


MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Thanh long (tên tiếng Anh là Pitahaya, hay còn gọi là Dragon fruit)
thuộc họ Xương rồng (Cactaceae), có nguồn gốc ở các vùng sa mạc thuộc
Mehico và Colombia [1], [13]. Thanh long đang dần trở thành trái cây ưa
thích của nhiều người bởi tính mát, mềm và chứa nhiều khoáng chất, vitamin.
Hoạt chất lycopene trong Thanh long có khả năng chống ung thư, chống lão
hóa, điều trị các bệnh về mắt, vô sinh nam, viêm và loãng xương, quản lý
bệnh tiểu đường và bảo vệ gan. Giảm nồng độ homocysteine và cholesterol,

ngăn ngừa bệnh tim mạch vành. Làm tăng hệ thống miễn dịch, giúp tiêu hóa
và tuần hoàn máu. Giúp kiểm soát các áp lực tinh thần và vô hiệu hóa các chất
độc trong cơ thể [18].
Thanh long được du nhập vào nước ta từ lâu, tuy nhiên trái Thanh long
mới được quan tâm đến trong những năm gần đây. Diện tích trồng Thanh long
phát triển nhanh, không những ở các tỉnh miền Nam, miền Trung mà miền
Bắc cũng đã có nhiều nơi trồng Thanh long cho kết quả tốt. Do nhu cầu xuất
khẩu ngày càng tăng cùng với hiệu quả kinh tế mà cây Thanh long mang lại
đã giúp người nông dân nâng cao, cải thiện cuộc sống, diện tích trồng Thanh
long đang được tăng lên đáng kể. Song song với sự phát triển đó, cây Thanh
long có thể sẽ mất dần những đặc tính ưu việt và có khả năng giống cây
Thanh long sẽ dần bị thoái hóa, đi cùng với vấn đề thiếu cây giống, mất dần
sự đồng nhất về chất lượng. Do đó, việc duy trì nguồn giống sạch bệnh để có
thể đáp ứng được nhu cầu cây giống chất lượng đồng nhất và cây sạch bệnh
cho thị trường đòi hỏi ứng dụng các tiến bộ khoa học kĩ thuật. Thông thường,
Thanh long được nhân giống bằng phương pháp giâm cành. Tuy nhiên, tỷ lệ
nhân là rất thấp và rất khó để có đủ vật liệu trồng vì cần kích thước lớn
(khoảng 50cm) của hom. Hơn nữa, nhân giống theo phương pháp truyền
1


thống không đảm bảo được cây sạch bệnh. Mặc dù hạt Thanh long có tỷ lệ
nảy mầm khá cao (71-83%) [15] nhưng giống có nguồn gốc từ hạt thường
sinh trưởng chậm, cần thời gian dài để ra hoa cho quả, trì hoãn sản xuất trái
cây trong nhiều năm [3].
Phương pháp nuôi cấy mô giúp sản xuất cây Thanh long với số lượng
lớn có chất lượng cao (sạch bệnh) [8]. Về phương diện hệ số nhân giống,
nhân giống in vitro là phương pháp không gì có thể sánh kịp, kể cả phương
pháp nhân giống bằng hạt. Thí dụ: Mai Thị Tân và cộng sự đã đạt được hệ số
nhân 532 trong vòng một năm đối với cây khoai tây bằng phương pháp này [9].

Bằng phương pháp nhân nhanh in vitro, người ta có thể cung cấp được
500000 cây con giống hệt nhau trong vòng một năm [20].
Trên thế giới, nhiều nghiên cứu về nhân giống in vitro cây Thanh long
đã được thực hiện như Dahanayake và Ranawake (2011) [14], Qing-Jie Fan
(2013) [17]... Ở Việt Nam, cũng có một số nghiên cứu về nhân giống cây
Thanh long bằng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào như nghiên cứu gần đây của Tô
Thị Nhã Trầm và các cộng sự (2014) [3]; Đặng Văn Tùng, Nguyễn Trần
Đông Phương (2014) [2].... Tuy nhiên, các nghiên cứu này đều sử dụng hạt
Thanh long đã khử trùng làm vật liệu nghiên cứu. Vì vậy, xuất phát từ lý do
trên, đề tài này được thực hiện nhằm hoàn thiện quy trình nhân giống in vitro
cây Thanh long từ đốt thân, góp phần sản xuất cây giống sạch cung cấp cho
thị trường.
2. Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu
2.1. Mục tiêu
Nghiên cứu quy trình nhân giống in vitro cây Thanh long từ đốt thân,
góp phần sản xuất cây giống với số lượng lớn và chất lượng tốt cung cấp cho
thị trường.

2


2.2. Nhiệm vụ nghiên cứu
- Tạo vật liệu in vitro từ đốt thân cây Thanh long.
- Nhân nhanh chồi: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều tiết sinh
trưởng đến khả năng tái sinh và tạo đa chồi của cây Thanh long.
- Tạo cây hoàn chỉnh: Ra rễ cho cây Thanh long in vitro.
- Rèn luyện cây Thanh long in vitro thích nghi với điều kiện tự nhiên.
3. Ý nghĩa lý luận và thực tiễn
3.1. Ý nghĩa lý luận
- Nhằm bổ sung vào nguồn tư liệu khoa học cho nghiên cứu kỹ thuật

nuôi cấy mô cây Thanh long.
3.2. Ý nghĩa thực tiễn
- Cung cấp nguồn giống cây trồng sạch bệnh với số lượng lớn.

3


NỘI DUNG
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu về cây Thanh long
1.1.1. Phân loại
Thanh long tên khoa học: Hylocereus undatus (Haw.) Britton & Rose
Họ: Xương rồng (Cactaceae)
Bộ: Cẩm chướng (Caryophyllales)
Phân lớp: Cẩm chướng (Caryophyliidae)
Lớp: Ngọc lan (Magnolyopsida)
Loài này được (Haw.) Britton & Rose mô tả khoa học đầu tiên năm 1918
(trong tác phẩm Fl. Bermuda 256 1918) [23], [13].
1.1.2. Nguồn gốc
Thanh long có nguồn gốc ở các vùng sa mạc thuộc Mehico và Colombia.
Thanh long được người Pháp đem vào trồng ở Việt Nam trên 100 năm nay,
nhưng mới được đưa lên thành hàng hoá từ thập niên 1980. Cây phân bố tập
trung tại Bình Thuận, còn lại là Long An, Tiền Giang, TP.HCM, Khánh Hoà
và một số nơi khác [1].

Hình 1.1. Cây Thanh long trồng ngoài tự nhiên [22]
4


1.2. Đặc điểm sinh học

1.2.1. Sinh thái
Là cây có nguồn gốc nhiệt đới, chịu hạn giỏi, nên được trồng ở những
vùng nóng. Một số loài chịu được nhiệt độ từ 50oC tới 55oC. Nhưng nó không
chịu được giá lạnh. Chúng thích hợp khi trồng ở các nơi có cường độ ánh
sáng mạnh, vì thế hễ bị che nắng thân cây sẽ ốm yếu và lâu cho quả. Cây mọc
được trên nhiều loại đất khác nhau như đất xám bạc màu (Bình Thuận), đất
phèn (TP.HCM), đất đỏ …; nó có khả năng thích ứng với các độ chua (pH)
của đất rất khác nhau. Khi trồng Thanh long nên chọn các chân đất có tầng
canh tác dày tối thiểu 30 - 50 cm và để có năng suất cao nên tưới và giữ ẩm
cho cây vào mùa nắng [1].
1.2.2. Thực vật học
Rễ cây
Khác hẳn với chồi cành, rễ Thanh long không mọng nước nên nó không
phải là nơi tích trữ nước giúp cây chịu hạn.
Cây Thanh long có hai loại rễ: địa sinh và khí sinh.
Rễ địa sinh phát triển từ phần lồi ở gốc hom. Sau khi đặt hom từ 10 - 20
ngày thì từ gốc hom xuất hiện các rễ tơ màu trắng, số lượng rễ tăng dần và
kích thước của chúng cũng tăng dần theo tuổi cây, những rễ lớn đạt đường
kính từ 1 - 2 cm. Rễ địa sinh có nhiệm vụ bám vào đất và hút các chất dinh
dưỡng nuôi cây. Rễ phân bố chủ yếu ở tầng đất mặt (0 - 15 cm). Khi đất khô
các rễ sợi sẽ chết đi, các rễ cái lớn hơn sẽ hóa bần làm giảm sự dẫn nước
khoảng 10 lần để ngăn chặn sự mất nước vào đất thông qua rễ. Khi đất ẩm rễ
lại mọc trở lại một cách dễ dàng.
Rễ khí sinh mọc dọc theo thân cây phần trên không, bám vào cây chống
(choái) để giúp cây leo lên giá đỡ. Những rễ khí sinh nằm gần đất sẽ đi dần
xuống đất [1].
5


Thân, cành

Thanh long (một loại xương rồng) trồng ở nước ta có thân, cành trườn bò
trên trụ đỡ, trong khi ở một số nước trồng loại xương rồng thân cột. Thân
chứa nhiều nước nên nó có thể chịu hạn một thời gian dài. Thân, cành thường
có ba cánh dẹp, xanh, hiếm khi có 4 cánh. ở các nước khác có thứ 3, 4, 5
cánh. Mỗi cánh chia ra làm nhiều thùy có chiều dài 3 - 4cm. Đáy mỗi thùy có
từ 3 - 5 gai ngắn [1].
Hoa
Thanh long là cây ngày dài (trường quang kỳ). Tại Nam bộ hoa xuất hiện
sớm nhất vào trung tuần tháng 3 dương lịch và kéo dài tới khoảng tháng 10
dương lịch, rộ nhất từ tháng 5 dương lịch tới tháng 8 dương lịch. Trung bình
có từ 4 - 6 đợt ra hoa rộ mỗi năm.
Hoa lưỡng tính, rất to, có chiều dài trung bình 25 - 35 cm, nhiều lá đài và
cánh hoa dính nhau thành ống, nhiều tiểu nhị và 1 nhụy cái. Mùa ra hoa rộ là
từ giữa tháng 5 tới cuối tháng 8 [1].
Quả và hạt
Quả Thanh long hình bầu dục có nhiều tai lá xanh (do phiến hoa còn lại),
đầu quả lõm sâu tạo thành “hốc mũi”. Khi còn non vỏ quả màu xanh, lúc chín
chuyển qua đỏ tím rồi đỏ đậm. Thịt quả màu trắng cho đại đa số Thanh long
trồng ở miền Nam Việt Nam [1].
1.3. Giá trị sử dụng
Thanh long là một loại cây ăn quả có giá trị xuất khẩu, hiệu quả kinh tế cao
và đang có nhu cầu rất lớn ở trong và ngoài nước. Đặc biệt, Thanh long ruột đỏ
được dùng làm thực phẩm, thuốc, mỹ phẩm vì có nhiều khoáng chất, năng
lượng, vitamin, và một số chất có hoạt tính sinh học [6]. Hoạt chất lycopene
trong Thanh long có khả năng chống ung thư, chống lão hóa, điều trị các bệnh
về mắt, vô sinh nam, viêm và loãng xương, quản lý bệnh tiểu đường và bảo vệ
6


gan. Giảm nồng độ homocysteine và cholesterol, ngăn ngừa bệnh tim mạch

vành. Làm tăng hệ thống miễn dịch, giúp tiêu hóa và tuần hoàn máu. Giúp kiểm
soát các áp lực tinh thần và vô hiệu hóa các chất độc trong cơ thể [21].
Betacyanin là hợp chất tự nhiên làm giảm đáng kể nồng độ hormoncysteine
(đồng phân của acid amine cysteine) trong cơ thể của chúng ta [19].
Bên cạnh đó Thanh long còn được xem là loại trái cây có thành phần
chất xơ khá cao so với các loại trái cây khác giúp điều hoà hoạt động tiêu hoá,
có khả năng làm giảm các chất béo, cholesterol…
Trái Thanh long có thể ăn tươi, làm rượu, dùng làm các món cocktail,
chè… giải nhiệt cho mùa hè nóng nực.
1.4. Tình hình sản xuất và tiêu thụ Thanh long ở nước ta
Sản xuất cây ăn quả xuất khẩu đang là vấn đề quan tâm không chỉ đối
với các nhà chuyên môn, mà cả đối với người dân. Thanh long ở miền Nam,
đang có mặt ở nhiều thị trường trên thế giới và có hầu hết ở các vùng trên cả
nước. Việt Nam có 35.665 ha diện tích trồng Thanh long với tổng sản lượng
đạt khoảng 614.246 tấn. Thanh long hiện đang được trồng trên 32 tỉnh/thành
phố, nhưng phát triển mạnh thành các vùng chuyên canh quy mô lớn tập trung
ở các tỉnh như Bình Thuận, Tiền Giang và Long An (Vinafruits, 2014) [11].
Diện tích Thanh long của ba tỉnh này chiếm 93% tổng diện tích và 95% sản
lượng của cả nước. Theo đánh giá của trung tâm thông tin (Bộ Thương mại),
Thanh long ở tỉnh Bình thuận đứng đầu cả nước về năng suất và sản lượng.
Trong 10 năm gần đây, sản lượng Thanh long ở đây tăng bình quân 33-38%/
năm. Tỉnh Bình Thuận, thu được kim ngạch xuất khẩu gần 9 triệu USD từ
Thanh long với lượng xuất khẩu 25.000 tấn. Tuy nhiên điều này chưa thực sự
phát huy hết thế mạnh của cây trồng, vì sản lượng Thanh long mỗi năm ở
Bình Thuận lên tới 95.000 tấn do có nhiều mặt hạn chế như chất lượng sản
phẩm chưa được an toàn, sản phẩm chưa được đồng đều… [10].
7


Trái cây Việt Nam nói chung và Thanh long nói riêng được xuất khẩu

sang khoảng 40 quốc gia và vùng lãnh thổ khác nhau. Kim ngạch xuất khẩu
chính ngạch của trái cây tươi nói chung của Việt Nam là 307 triệu USD, trong
đó Thanh long chiếm 61,4%. Ngoài các thị trường truyền thống xuất khẩu
Thanh long như Trung Quốc, Thái Lan, Indonesia, Malaysia, Hà Lan và Đài
Loan; Thanh long còn được xuất sang các thị trường khó tính như Mỹ, Ý,
Nhật, Singapore và đang thâm nhập một số thị trường mới như Ấn Độ, New
Zealand, Úc và Chi Lê (VinaFruit, 2013) [11].
1.5. Một số nghiên cứu về cây Thanh long
Trong nước
Theo nghiên cứu của Tô Thị Nhã Trầm và các cộng sự (2014): Vật liệu
sử dụng ban đầu là hạt Thanh long đã qua khử trùng. Sau 90 ngày nuôi cấy,
kết quả cho thấy môi trường MS có bổ sung BAP 0,5 mg/l thích hợp cho sự
tái sinh chồi từ mô sẹo (đạt 11,84 chồi, chiều cao chồi 3,66 cm). Môi trường
MS có bổ sung 0,5 mg/l NAA cho thời gian xuất hiện rễ sớm nhất là 10 ngày
sau cấy, số rễ đạt 3,84 rễ cũng như chiều dài rễ cao nhất là 1,81 cm. Ở giá thể
vườn ươm, giá thể tốt nhất cho sự sinh trưởng và phát triển của cây Thanh
long là đất và xơ dừa phối trộn theo tỷ lệ 1:1 [3].
Đặng Văn Tùng và các cộng sự (2014), “Nhân giống in vitro cây Thanh
long ruột đỏ”: Hạt được khử trùng bằng javel 10% trong 10 phút. Cụm chồi
được tạo thành cây con cao 1cm trên môi trường MS + BAP 1 mg/l là tốt
nhất. Rễ hình thành tốt nhất trên môi trường MS + 0,5 mg/l. Chất trồng để
ươm cây gồm 10% tro trấu, 85% cát và 5% phân bò ủ hoai [2].
Thế giới
Chaturani G.D.G (2005), nghiên cứu khả năng nảy mầm của Thanh long
ở trong ống nghiệm và ngoài tự nhiên. Kết quả cho thấy, trong ống nghiệm tỷ
lệ hạt Thanh long nảy mầm cao hơn (98,5% trong môi trường MS), so với
8


các điều kiện ngoài tự nhiên (50% trong giấy lọc, 45% trong cát, 35% trong

xơ dừa) [15].
El Obeidy A.A. (2006), nghiên cứu về các nhân tố ảnh hưởng đến nhân
giống cây Thanh long bằng hom và hạt. Kết quả nghiên cứu cho rằng cắt 5cm
chiều dài hom Thanh long, sau đó nhúng vào dung dịch IBA (10mM) trong
10s có thể cho hiệu quả nhân giống. Tính khả thi là 83%. Sự nảy mầm của hạt
từ 71- 83% tuỳ thuộc vào nhiệt độ, bắt đầu sau 6 ngày ở 24- 28o C, cường độ
chiếu sáng ở 1000- 2000 LX giảm số lượng hạt nảy mầm [16].
Dahanayake N. and Ranawake A.L. (2011), đã kiểm tra khả năng tái sinh
trực tiếp của chồi Thanh long, từ lá và thân cây giâm hom thu được từ trong
ống nghiệm khi cho nảy mầm cây giống. Môi trường MS có bổ sung 2,5 mg/l
BAP và 0,01 mg/l NAA là môi trường thích hợp nhất cho sự tái sinh của chồi
từ lá và thân cây Thanh long. Sự hình thành rễ cao nhất trên môi trường MS
có bổ sung 0,01 mg/l NAA [14].
Theo Qing-Jie Fan và cộng sự (2013), môi trường tốt nhất để nhân nhanh
chồi Thanh long là môi trường MS có bổ sung 2 mg/l BAP và 0,5 mg/l NAA
cho hệ số nhân chồi cao nhất đạt 8,2 chồi/mẫu. Sau một tháng, những chồi
phát triển tốt được chuyển sang môi trường lỏng có chứa 1 mg/l NAA, tỷ lệ ra
rễ đạt 100%. Trong 3 tuần nuôi cấy, có 6-10 rễ/chồi, chiều dài rễ 5-8 cm. Rửa
sạch thạch bám vào rễ trong vòi nước chảy và chuyển sang chậu có chứa hỗn
hợp đất: cát với tỷ lệ 1:1 [17].

9


CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
Cây Thanh long do Phòng thí nghiệm Sinh lý thực vật (Khoa SinhKTNN, trường ĐHSP Hà Nội 2) cung cấp.
2.2. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm
2.2.1. Dụng cụ
Dao cấy, khay cấy, kéo, túi nilon, bình tam giác, đèn cồn, bình xịt cồn, vỉ

xốp nuôi cấy,…
2.2.2. Thiết bị
Các thiết bị sử dụng trong nuôi cấy mô thực vật: Cân kĩ thuật (Sartorius,
Đức), tủ lạnh sâu (FRIGO), máy đo pH (HM30G/TOA, Đức), Nồi hấp khử
trùng (HV – 110/HIRAYAMA, Nhật), Tủ lạnh Hitachi (31AG5D, Thái lan),
Máy cất nước hai lần (Hamilton, Mỹ), Buồng cấy vô trùng (AV –
110/TELSTAR), Máy khuấy từ gia nhiệt (ARE/VELP, Italia), Cân phân tích
(Sartorius, Đức).
2.3. Môi trường nuôi cấy
- Các thí nghiệm nuôi cấy in vitro đều sử dụng môi trường dinh dưỡng
cơ bản là MS (Murashige và Skoog, 1962) [12].
- Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật được sử dụng là BAP (6Benzyl amino purin), NAA (Napthlacetic acid).
- Các thành phần khác:
Đường saccarose: 30g/l
Agar: 7g/l
pH môi trường: 5,8
Môi trường được khử trùng trong nồi hấp khử trùng ở nhiệt độ 117oC
trong 15 phút.

10


2.4. Điều kiện nuôi cấy in vitro
Các thí nghiệm đều được thực hiện trong điều kiện nhân tạo.
Thời gian chiếu sáng: 16 giờ sáng/ 8 giờ tối.
Nhiệt độ: 25 ± 2o C
Độ ẩm: 50 – 60%
Cường độ chiếu sáng là 1.800- 2000 lux.
2.5. Phương pháp nghiên cứu
2.5.1. Sơ đồ nghiên cứu

Các thí nghiệm được bố trí theo sơ đồ sau:
Chồi Thanh long ngoài tự nhiên
Cồn, javel
Cây Thanh long in vitro
+ BAP, NAA

Nhân nhanh Thanh long
+ NAA
Tạo cây Thanh long in vitro hoàn chỉnh
Đất, cát, xơ dừa
Rèn luyện cây in vitro ngoài môi trường tự
nhiên
Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu
11


Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi công thức
được nhắc lại 3 lần, 3 mẫu/ công thức.
2.5.1.1. Tạo vật liệu khởi đầu
Tiến hành thu mẫu đốt thân cây Thanh long, xử lý sơ bộ bằng cách: rửa
xà phòng dưới vòi nước chảy, rửa lại bằng nước cất khử trùng trong buồng
cấy vô trùng, lắc mẫu trong etanol 70%(v/v)/ 5 phút + nước cất khử trùng 2-3
lần. Đốt thân của cây Thanh long đã khử trùng sơ bộ được sử dụng làm vật
liệu khởi đầu trong nuôi cấy in vitro.
Bảng 2.1. Tạo vật liệu in vitro cây Thanh long từ đốt thân
Công thức

Chất xử lý/ thời gian

ĐC

Xử lý sơ bộ

CT1

Xử lý sơ bộ + javel 5%(v/v)/3 phút

CT2

Xử lý sơ bộ + javel 5%(v/v)/5 phút

CT3

Xử lý sơ bộ + javel 5%(v/v)/7 phút

CT4

Xử lý sơ bộ + javel 10%(v/v)/3 phút

CT5

Xử lý sơ bộ + javel 10%(v/v)/5 phút

CT6

Xử lý sơ bộ + javel 10%(v/v)/7 phút

Đánh giá thí nghiệm sau 15 ngày theo dõi dự trên các chỉ tiêu:
- Tỷ lệ mẫu nhiễm (%): (Tổng số mẫu nhiễm/ Tổng số mẫu cấy vào) x 100.
- Tỷ lệ mẫu sống (%): (Tổng số mẫu sống/ Tổng số mẫu cấy vào) x 100.

- Tỷ lệ mẫu chết (%): ( Tổng số mẫu chết/ tổng số mẫu cấy vào) x 100.
2.5.1.2. Nhân nhanh chồi
Chồi sau khi được tái sinh từ đốt thân cây Thanh long được cấy chuyển
sang môi trường MS có bổ sung BAP và NAA theo bảng 2.2.

12


Bảng 2.2. Công thức thí nghiệm ảnh hưởng của BAP và NAA đến sự tái
sinh và nhân nhanh chồi in vitro từ đốt thân cây Thanh long
Công thức

CĐHST bổ sung (mg/l)
BAP

ĐC

0,0

CT1

0,5

CT2

1,0

CT3

1,5

CT4

2,0

CT5

0,5

CT6

1,0

CT7

1,5

CT8

2,0

NAA

0,00

0,02

Đánh giá chỉ tiêu thí nghiệm sau 8 tuần và 12 tuần nuôi cấy gồm chỉ tiêu:
số chồi/mẫu, đặc điểm hình thái của chồi.
2.5.1.3. Tạo cây in vitro hoàn chỉnh

Các chồi thu được từ thí nghiệm trên được cấy sang môi trường tạo rễ là
môi trường MS có bổ sung NAA ở các nồng độ khác nhau.
Bảng 2.3. Công thức thí nghiệm ảnh hưởng của NAA đến sự hình thành rễ
của chồi Thanh long in vitro
Công thức

Chất

CT1

MS cơ bản

CT2

NAA 0,3

CT3

NAA 0,5

Đánh giá chỉ tiêu thí nghiệm sau 8 tuần nuôi cấy gồm chỉ tiêu: số rễ/chồi,
chiều dài rễ (cm).
13


2.5.1.4. Rèn luyện cây Thanh long in vitro thích nghi với điều kiện tự
nhiên
Những cây sinh trưởng tốt và có bộ rễ sinh trưởng đồng đều thu được từ
nuôi cấy in vitro được chuyển ra ngoài vườn ươm và trồng các loại giá thể
khác nhau được phối trộn theo tỷ lệ như sau:

Bảng 2.4. Công thức thí nghiệm ảnh hưởng của giá thể đến sự sinh trưởng
và phát triển của cây Thanh long in vitro
Công thức

Giá thể

CT1

100% đất

CT2

Đất : xơ dừa (1:1)

CT3

Đất : cát (1:1)

Đánh giá chỉ tiêu thí nghiệm sau 60 ngày nuôi cấy gồm chỉ tiêu: tỷ lệ
sống sót, chiều cao cây.
2.5.2. Phương pháp phân tích thống kê dữ liệu thực nghiệm
Số liệu thu thập được phân tích thống kê bằng chương trình Excel 2010
theo các tham số giá trị trung bình, độ lệch chuẩn của Nguyễn Văn Mã và
cộng sự, 2013 [5].

14


CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tạo vật liệu khởi đầu

Môi trường nuôi cấy mô thực vật có chứa đường, muối khoáng và
vitamin, thích hợp cho các loài nấm, vi khuẩn phát triển. Do tốc độ phân chia
tế bào của nấm và vi khuẩn lớn hơn rất nhiều so với tế bào thực vật. Nếu môi
trường nuôi cấy bị nhiễm vài bào tử nấm hoặc vi khuẩn thì sau vài ngày đến
một tuần toàn bộ bề mặt môi trường nuôi cấy và mẫu cấy sẽ phủ đầy nấm,
khuẩn. Thí nghiệm đó phải loại bỏ vì trong điều kiện này mô cấy không thể
phát triển và chết dần. Khác với thí nghiệm vi sinh có thể kết thúc trong vài
ngày, mức độ vô trùng trong thí nghiệm nuôi cấy mô thực vật đòi hỏi rất cao
mới có hi vọng thành công. Đây là bước quan trọng trong nuôi cấy mô.
Mẫu thu ngoài tự nhiên thường mang yếu tố gây bệnh bám bề mặt. Việc
tạo vật liệu khởi đầu là bước khó khăn nhất trong quy trình nhân giống bằng
kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật. Có nhiều chất được sử dụng để khử
trùng bề mặt mẫu thực vật, phổ biến nhất là: cồn (dùng để xử lý sơ bộ),
NaClO và HgCl2. Trong nghiên cứu này, mẫu được khử trùng bề mặt bằng
dung dịch javel.
Thí nghiệm này là tìm ra nồng độ javel và thời gian xử lý tốt nhất từ đó để
tạo ra nguồn nguyên liệu cho các thí nghiệm sau. Kết quả thể hiện ở bảng 3.1.

15


Bảng 3.1. Kết quả tạo vật liệu khởi đầu từ đốt thân cây Thanh long
Tỷ lệ mẫu
Công thức
ĐC
CT1

CT2

CT3

CT4

CT5

CT6

Tỷ lệ mẫu

Tỷ lệ mẫu

sống (%)

chết (%)

100,0

0,0

0,0

67,0

33,3

0,0

53,8

46,2

0,0

69,3

30,7

0,0

0,0

100,0

0,0

46,1

30,7

23,2

22,2

34,2

43,6

nhiễm (%)

Xử lý sơ bộ

Xử lý sơ bộ + javel
5% (v/v)/3 phút
Xử lý sơ bộ + javel
5% (v/v)/5 phút
Xử lý sơ bộ + javel
5% (v/v)/7 phút
Xử lý sơ bộ + javel
10% (v/v)/3 phút
Xử lý sơ bộ + javel
10% (v/v)/5 phút
Xử lý sơ bộ + javel
10% (v/v)/7 phút

Mẫu sạch

Theo bảng 3.1 cho thấy mẫu khử trùng ở CT đối chứng (xử lý sơ bộ)
không cho hiệu quả khử trùng mẫu in vitro, các mẫu bị nhiễm sau 3-5 ngày
nuôi cấy trên môi trường MS. Các công thức khác, cho thấy javel có tác dụng
khử trùng với mẫu in vitro. Tuy nhiên có sự khác nhau về hiệu quả, CT4 (xử lý
sơ bộ+ javel 10% (v/v)/3 phút) cho hiệu quả khử trùng tốt nhất đạt 100%. Kết
quả này cho thấy, sự gia tăng nồng độ javel sử dụng cũng đưa lại hiệu quả tạo
mẫu sạch, nhưng mang lại tác dụng phụ đó là tỷ lệ mẫu sạch nhưng không thể
sống được trong môi trường in vitro cũng tăng lên. Có thể do javel nồng độ cao
thì ngoài tác dụng diệt khuẩn, bào tử nấm còn gây chết cho tế bào thực vật.
16