Nghiên cứu chuyển gen tạo rễ tơ sâm ngọc linh (panax vietnamensis ha et grushv ) làm vật liệu cho nuôi cấy sinh khối

14

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT
NAM
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

TRỊNH THỊ HƯƠNG

NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN TẠO RỄ TƠ SÂM
NGỌC LINH (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)
LÀM VẬT LIỆU CHO NUÔI CẤY SINH KHỐI

Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật
Mã số:

62 42 01 12

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội - 2017


24
Công trình được hoàn thành tại Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên
và Viện Công nghệ Sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ
Việt Nam

Người hướng dẫn khoa học:
1. PGS.TS. Dương Tấn Nhựt
Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên
2. PGS.TS. Chu Hoàng Hà

Viện Công nghệ Sinh học
Phản biện 1:
Phản biện 2:
Phản biện 3:

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp Nhà
nước tại: Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công
nghệ Việt Nam, 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội
Vào hồi
ngày tháng
năm 2017

Có thể tìm hiểu luận án tại:

•
•

Thư viện Quốc gia Việt Nam
Viện Công nghệ Sinh học


34

•

Trang web của Bộ GDĐT


4
MỞ ĐẦU

Tính cấp thiết của đề tài
Sâm ngọc linh là cây dược liệu quý và đặc hữu cho vùng sinh thái
nhất định. Thời gian sinh trưởng của cây chậm, cần tới 6 năm mới có
thể bắt đầu thu hoạch và 7 - 10 năm mới thu được củ sâm chất lượng tốt.
Trong khi đó, việc khai thác bừa bãi và không có phương pháp quản lý
hiệu quả đã dẫn đến không đủ đáp ứng nhu cầu cung cấp nguyên liệu
cho các ngành dược liệu, mỹ phẩm,...
Những năm gần đây, cùng với xu hướng chung trên thế giới, ở nước
ta hướng nghiên cứu công nghệ sinh khối tế bào thực vật để sản xuất các
sản phẩm thứ cấp đã bắt đầu được quan tâm đầu tư phát triển. Tuy
nhiên, trong quá trình nuôi cấy tạo sinh khối tế bào thực vật cần phải bổ
sung các chất điều hòa sinh trưởng thực vật vào môi trường nuôi cấy.
Vấn đề này là một trong những trở ngại lớn cho các nhà nghiên cứu, do
tồn dư của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong sinh khối tế bào
nuôi cấy ảnh hưởng trực tiếp đến sản phẩm và sức khỏe người sử dụng.
Vấn đề này hoàn toàn có thể khắc phục trong nuôi cấy sinh khối từ rễ t ơ
vì rễ tơ có thể sinh trưởng tốt trên môi trường không cần bổ sung các
chất điều hòa sinh trưởng thực vật. Hơn nữa, các rễ tơ có khả năng sinh
trưởng nhanh, phân nhánh cao; có thể nuôi cấy tạo sinh khối liên tục và
không bị ảnh hưởng của dư lượng chất điều hòa sinh trưởng thực vật,
điều này có ý nghĩa trong dây chuyền sản xuất các hợp chất thứ cấp hay
các dược phẩm sinh học tái tổ hợp. Ngoài ra, rễ tơ có thể sản xuất một
lượng lớn các hợp chất thứ cấp và là cơ quan biệt hóa nên nuôi cấy rễ tơ
có sự di truyền ổn định hơn nuôi cấy huyền phù tế bào và mô sẹo. Xuất
phát từ các ưu điểm của rễ tơ và do những hợp chất dược liệu quý của
sâm ngọc linh chủ yếu thu được từ rễ nên chúng tôi tiến hành đề tài:
“Nghiên cứu chuyển gen tạo rễ tơ sâm ngọc linh (Panax vietnamensis
Ha et Grushv.) làm vật liệu cho nuôi cấy sinh khối”.
Mục tiêu của đề tài
Thu nhận được các dòng rễ tơ chuyển gen sâm ngọc linh có khả năng

sinh trưởng nhanh, ổn định và chứa hàm lượng saponin thiết yếu của
sâm.


5
Ý nghĩa khoa học
Kết quả nghiên cứu của đề tài cho thấy có khả năng chuyển gen
mong muốn vào cây sâm ngọc linh, loài cây dược liệu quý hiếm và rất
khó nhân giống. Mặt khác, kết quả của đề tài cũng tạo ra được nguồn
dược liệu quý, giúp giảm khai thác trong tự nhiên và góp phần bảo tồn
nguồn gen quý hiếm của loài sâm quý giá này.
Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả nghiên cứu của đề tài mở ra triển vọng ứng dụng công nghệ
nuôi cấy rễ tơ thu nhận hoạt chất saponin, cung cấp nguyên liệu cho các
cơ sở nghiên cứu ứng dụng, các công ty mỹ phẩm và dược phẩm, bào
chế và sản xuất mỹ phẩm, thực phẩm chức năng, thuốc phục vụ sức
khỏe cộng đồng.
Những đóng góp mới của luận án
Nghiên cứu đã tạo được nguồn vật liệu mới cho nuôi cấy sinh khối
để thu nhận hợp chất saponin, đó là các dòng rễ tơ sâm ngọc linh sinh
trưởng nhanh, ổn định làm vật liệu cho nuôi cấy sinh khối rễ để thu nhận
hợp chất saponin. Nghiên cứu cũng mở ra triển vọng mới đầy tiềm năng
là nuôi cấy sinh khối rễ tơ ở quy mô thương mại để thu nhận nguồn
nguyên liệu cho sản xuất thực phẩm chức năng, mỹ phẩm và dược
phẩm.
Kết cấu của luận án
Luận án gồm 154 trang (kể cả tài liệu tham khảo) chia thành các
phần: Phần mở đầu 2 trang; Chương 1: Tổng quan tài liệu, 31 trang;
Chương 2: Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu, 20 trang;
Chương 3: Kết quả, 52 trang; Chương 4: Bàn luận kết quả nghiên cứu,

23 trang; Kết luận và đề nghị, 2 trang; Các công trình đã công bố liên
quan đến luận án, 1 trang; Summary, 4 trang; Phần tài liệu tham khảo,
19 trang với 169 tài liệu tham khảo bằng tiếng Việt và tiếng Anh. Luận
án có 31 bảng, 34 hình.


6
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Những thành tựu nghiên cứu về cây sâm ngọc linh (Panax
vietnamensis Ha et Grushv.)
1.1.1. Giới thiệu về cây sâm ngọc linh
Cây sâm ngọc linh (hay sâm Việt Nam) có tên khoa học là Panax
vietnamensis Ha et Grushv. là cây thuốc giấu của đồng bào dân tộc Xê
Đăng sống trên vùng núi cao thuộc hai tỉnh Kon Tum và Quảng Nam.
Loài sâm này xuất hiện ở độ cao 1.500 m trở lên so với mực nước
biển. Từ 1.700 - 2.000 m, cây mọc tập trung thành quần thể dọc bờ suối,
có độ ẩm trên 80%, đất nhiều mùn hữu cơ, dưới tán rừng hỗn giao giữa
lá rộng và lá kim.
Theo các nghiên cứu khoa học, sâm ngọc linh có tác dụng chống
trầm cảm, kích thích hệ miễn dịch, chống lão hóa, phòng chống ung thư,
bảo vệ tế bào gan, tăng thị lực, sức đề kháng, nâng cao huyết áp ở người
bị huyết áp thấp,... Phân tích các hợp chất hóa học cho thấy sâm ngọc
linh có chứa tới 52 saponin (sâm Triều Tiên có khoảng 25 saponin),
trong đó có 26 saponin có cấu trúc đã biết.
1.1.2. Tình hình của loài sâm ngọc linh hiện nay
Sâm ngọc linh là loài sâm đặc hữu, chỉ sinh trưởng trong những vùng
sinh thái nhất định. Thêm vào đó là thời gian nuôi trồng sâm kéo dài,
thường cần tới 6 năm mới có thể thu hoạch và 7 - 10 năm mới thu được
củ sâm có chất lượng tốt, đã dẫn tới xảy ra tình trạng sâm bị khai thác
trộm trước thời gian được phép thu hoạch. Nhiều chương trình di thực

sâm ngọc linh đã được tiến hành từ nhiều năm nay nhưng kết quả vẫn
còn những hạn chế nhất định. Do vậy, các chế phẩm từ sâm ngọc linh
cũng được sản xuất rất ít, thậm chí ngưng sản xuất vì thiếu nguồn
nguyên liệu.
Hiện nay, nuôi cấy sinh khối từ rễ tơ có nguồn gốc từ vi khuẩn
Agrobacterium rhizogenes đang được xem là một giải pháp tạo nguồn
dược phẩm sạch phục vụ sức khoẻ cộng đồng. Rễ tơ có thể sinh trưởng,
phát triển tốt trên môi trường không cần bổ sung chất điều hoà sinh
trưởng thực vật. Hơn nữa, các rễ tơ có khả năng sinh trưởng nhanh,
phân nhánh cao, kỹ thuật nuôi cấy, chuyển gen dễ dàng, có thể nuôi cấy


7
tạo sinh khối liên tục và có sự ổn định di truyền hơn so với nuôi cấy
huyền phù tế bào và mô sẹo. Vì vậy, nuôi cấy rễ tơ sâm ngọc linh có thể
xem như là một giải pháp để thu nhận nguồn nguyên liệu sâm sạch. Do
đó các nghiên cứu về chuyển gen thu nhận rễ tơ và nhân nhanh sinh
khối rễ tơ cây sâm này là rất cần thiết.
1.2. Agrobacterium rhizogenes và ứng dụng trong nuôi cấy tạo rễ tơ
để thu nhận các hợp chất thứ cấp ở thực vật
1.2.1. Agrobacterium rhizogenes và cơ chế chuyển gen
Agrobacterium rhizogenes thuộc chi Agrobacterium, là vi khuẩn đất
hình que, gram âm, gây ra hội chứng rễ tơ, được đặc trưng bởi sự xuất
hiện các rễ tại vị trí vết thương của cây bị nhiễm bệnh. A. rhizogenes
mang Ri plasmid (Root-inducing), và plasmid này đã được xác định là
tác nhân gây bệnh rễ tơ ở các mô tế bào thực vật bị xâm nhiễm (Chilton
et al., 1982). Khi tế bào thực vật bị thương tiết ra các polyphenol hấp
dẫn các vi khuẩn, tại đây nó chuyển một đoạn T-DNA (transfer DNA)
từ Ri-plasmid vào hệ gen của tế bào vật chủ. Ri-plasmid là phân tử
DNA mạch vòng, sợi kép có trọng lượng phân tử lớn từ 200 - 800 kp

gồm 2 vùng chính là T-DNA và vùng vir (virulence).
Các chủng A. rhizogenes khác nhau cũng khác nhau về khả năng
chuyển T-DNA từ vi khuẩn vào bộ gen thực vật và các rễ tơ do các
chủng khác nhau đó gây ra cũng biểu hiện các hình thái khác nhau (Giri
et al., 2001). Chủng A. rhizogenes thuộc dạng agropine là chủng có độc
tính mạnh, được đặc trưng bởi các Ri-plasmid: pRiA4, pRi1855 hoặc
pRiLBA9402 (Veena, Taylor, 2007), và các chủng này được sử dụng
chủ yếu trong các nghiên cứu tạo rễ tơ ở thực vật. Chúng có thể tích hợp
một cách độc lập hai vùng T-DNA riêng biệt vào hệ gen thực vật. Một
vùng mang các gen rol chịu trách nhiệm về các kiểu hình rễ tơ (gọi là
vùng biên trái, TL-DNA), trong khi đó, vùng còn lại mang gen aux1-2
mã hóa các enzyme kiểm soát sự tổng hợp auxin (gọi là vùng biên phải,
TR-DNA). TR-DNA đóng vai trò hỗ trợ cho quá trình cảm ứng khởi tạo
rễ vì nó mang gen aux1-2, ngoài ra TR-DNA cũng mang gen mã hóa
tổng hợp opine. Trình tự của T L-DNA bao gồm 18 khung đọc mở
(ORFs), trong đó có 4 loci 10, 11, 12 và 15 tương ứng mã hóa cho các
gen rolA, B, C và D. Các chủng A. rhizogenes khác bao gồm dạng
mannopine, cucumopine và mikimopine tương ứng với các Ri-plasmid


8
là pRi8196, pRi2659 và pRi1724, thì chứa vùng T-DNA đơn có cấu trúc
giống như vùng TL-DNA của các chủng thuộc nhóm agropine nhưng
khuyết gen rolD, tuy nhiên chúng cũng có khả năng cảm ứng hình thành
các rễ tơ bởi các gen rol (Britton, Escobar, 2008).
1.2.2. Ứng dụng Agrobacterium rhizogenes trong nuôi cấy tạo rễ tơ để
thu nhận hợp chất thứ cấp ở thực vật
Hiện nay, nuôi cấy rễ tơ có nguồn gốc từ vi khuẩn A. rhizogenes đã
được nghiên cứu rộng rãi để sản xuất in vitro các chất chuyển hóa thực
vật, hàm lượng chất chuyển hoá thu được tương tự hoặc cao hơn hàm

lượng chất chuyển hoá có mặt trong rễ cây hoang dại hoặc trong cây
trồng (Caspeta et al., 2005). Sự ổn định di truyền của rễ tơ đáp ứng
được cho sản xuất ổn định các chất chuyển hóa thứ cấp của chúng.
Tương tự như vậy, các chất chuyển hóa thứ cấp có trong loài hoang dại
thường được bảo tồn trong rễ tơ.
Ở nước ta, các nghiên cứu chuyển gen để tạo rễ tơ đã được tiến
hành thành công trên một số loài cây có giá trị. Tuy nhiên, các nghiên
cứu về rễ tơ trong nước cũng chỉ mới dừng lại ở quy mô phòng thí
nghiệm, mà chưa được ứng dụng rộng rãi để sản xuất các sản phẩm
thương mại hoá.
1.3. Ứng dụng elicitor trong nghiên cứu sinh tổng hợp các hợp chất
biến dưỡng thứ cấp ở thực vật
1.3.1. Khái niệm về elicitor
Elicitor là các nhân tố sinh học hay hóa học từ các nguồn khác nhau
có thể dẫn đến các biến đổi hình thái thực vật. Theo nghĩa rộng, đối với
thực vật, elicitor có liên quan đến các hợp chất có thể khởi động các
phản ứng hình thái và sinh lý dẫn đến sự tích tụ của phytoalexin.
1.3.2. Ứng dụng elicitor để kích thích tăng tích luỹ các hợp chất thứ
cấp trong nuôi cấy tế bào thực vật
Elicitor có thể được sử dụng như là một trong những công cụ quan
trọng để sản xuất các sản phẩm thứ có cấp hoạt tính sinh học với năng
suất cao hơn và giảm chi phí sản xuất (Hussain et al., 2012). Có nhiều
báo cáo cho thấy rằng elicitor đã giúp tăng sản xuất các phytoalexin
isoflavonoid, phytoalexin serquiterpenoid, coumarin, podophyllotoxin,


9
azadirachtin, terpenoid, hypericin (hypericin và pseudohypericin) và
hyperforin, capsaicinoid, vascicine (Gao et al., 2011, Coste et al., 2011,
Gururaj et al., 2012, Bhambhani et al., 2012).

Mặt khác, elicitor cũng đã được sử dụng để làm sáng tỏ các con
đường chuyển hóa phức tạp (Moreno et al., 1996), để mô tả sự tương tác
giữa các phản ứng stress sinh học và phi sinh học ở mức độ phân tử
(Atkinson, Urwin, 2012). Ngoài ra còn có các nghiên cứu đã được công
bố để đánh giá sự ảnh hưởng của elicitor tới enzyme trao đổi chất thứ
cấp (Zenk, 1991), các phân tử tín hiệu quan trọng làm trung gian của các
phản ứng kháng ở thực vật (Bux et al., 2012), nổ oxy hoá (Davis et al.,
1993), tín hiệu dẫn truyền phytoalexin (Preisig, 1994) và các kênh anion
(Zimmermann et al., 1998). Bên cạnh đó, elicitor có thể được sử dụng
để nghiên cứu các tính chất hóa học và con đường truyền tín hiệu của
các chất tự nhiên tiết ra bởi vi sinh vật, động vật ăn cỏ và thực vật trong
thời gian nhiễm bệnh, ăn cỏ, cộng sinh và tương tác allelopathic (Maffei
et al., 2012) .
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu
2.1.1. Vật liệu thực vật
Nguyên liệu thực vật được sử dụng trong nghiên cứu tạo rễ bất định
là các mẫu lá, cuống lá, củ, mô sẹo của cây sâm ngọc linh nuôi cấy in
vitro.
Nguyên liệu thực vật được sử dụng trong nghiên cứu chuyển gen là
các mẫu lá, cuống lá, củ, mô sẹo, phôi, rễ bất định của cây sâm ngọc
linh nuôi cấy in vitro.
Nguyên liệu thực vật được sử dụng trong nghiên cứu nhân nhanh rễ
tơ và các thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của elicitor tới khả tăng tích
luỹ hoạt chất saponin là dòng rễ tơ chuyển gen có khả năng sinh trưởng
nhanh và ổn định.
2.1.2. Các chủng vi khuẩn
Chủng Agrobacterium rhizogenes ATCC15834 mang vector

10
PTN289, mang gen chỉ thị là gen gus được sử dụng để tối ưu hoá quy
trình chuyển gen.
Chủng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes ATCC15834 dạng dại
được sử dụng để chuyển gen thu nhận các dòng rễ tơ sâm ngọc linh.
Cả hai chủng vi khuẩn đều do phòng Công nghệ tế bào thực vật –
Viện Công nghệ sinh học cung cấp.
2.2. Các phương pháp nghiên cứu và kỹ thuật sử dụng
2.2.1. Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật
2.2.2. Phương pháp chuyển gen tạo rễ tơ vào sâm ngọc linh thông qua
Agrobacterium rhizogenes
2.2.3. Phương pháp kiểm tra sự có mặt của gen rol ở các dòng rễ tơ
2.2.4. Phương pháp chiết xuất và xác định các hoạt chất chính từ khối tế
bào sâm
2.2.5. Phương pháp giải phẫu hình thái tế bào thực vật
2.3. Bố trí thí nghiệm
2.3.1. Nuôi cấy thu nhận nguồn vật liệu sâm ngọc linh in vitro
2.3.1.1. Nghiên cứu nuôi cấy thu nhận mô sẹo
2.3.1.2. Nghiên cứu nuôi cấy thu nhận rễ bất định
2.3.2. Nghiên cứu quy trình chuyển gen tạo rễ tơ ở sâm ngọc linh
2.3.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn tới hiệu quả chuyển
gen
2.3.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nhiễm khuẩn tới hiệu quả
chuyển gen
2.3.2.3. Khảo sát ảnh hưởng của các nồng độ acetosyringone (AS) tới
hiệu quả chuyển gen


11
2.3.2.4. Khảo sát ảnh hưởng của nguồn mẫu thực vật tới hiệu quả

chuyển gen
2.3.2.5. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả
chuyển gen
2.3.2.6. Ảnh hưởng của các nhóm kháng sinh diệt khuẩn lên sự sinh
trưởng phát triển của mô sâm ngọc linh
2.3.3. Chuyển gen và thu nhận các dòng rễ tơ chuyển gen
2.3.3.1. Chuyển gen và thu nhận các dòng rễ sâm ngọc linh
2.3.3.2. Đánh giá kết quả chuyển gen bằng phương pháp PCR
2.3.4. Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến khả năng nhân
nhanh các dòng rễ tơ chuyển gen sâm ngọc linh
2.3.4.1. Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng khoáng lên khả năng nhân
nhanh rễ tơ
2.3.4.2. Khảo sát ảnh hưởng của độ pH của môi trường lên khả năng nhân
nhanh rễ tơ
2.3.4.3. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy lên khả năng nhân
nhanh rễ tơ
2.3.4.4. Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng đường lên khả năng nhân
nhanh rễ tơ
2.3.4.5. Khảo sát ảnh hưởng của giá thể nuôi cấy lên khả năng nhân
nhanh rễ tơ
2.3.4.6. Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đặc và lỏng lắc lên
sự sinh trưởng của rễ tơ
2.3.5. Nghiên cứu một số elicitor có tác dụng làm tăng tích lũy hoạt
chất trong quá trình nuôi cấy rễ tơ chuyển gen sâm ngọc linh
2.3.5.1. Khảo sát ảnh hưởng của methyl jasmonate (MeJA) lên khả năng
sinh trưởng và tích luỹ saponin của rễ tơ
2.3.5.2. Khảo sát ảnh hưởng của salicylic acid (SA) lên khả năng sinh


12

trưởng và tích luỹ saponin của rễ tơ
2.3.5.3. Khảo sát ảnh hưởng của abscisic acid (ABA) lên khả năng sinh
trưởng và tích luỹ saponin của rễ tơ
2.3.6. So sánh cấu trúc hình thái giải phẫu, khả năng sinh trưởng và
tích luỹ saponin giữa rễ tơ và rễ bất định
2.3.6.1. So sánh cấu trúc hình thái bên ngoài và hình thái giải phẫu giữa
rễ tơ và rễ bất định
2.3.6.2. So sánh khả năng sinh trưởng và tích luỹ saponin của rễ tơ và rễ
bất định
2.4. Điều kiện nuôi cấy
Tất cả các thí nghiệm nuôi cấy được tiến hành ở nhiệt độ phòng: 25
± 2oC; ẩm độ trung bình 55 - 60%, thí nghiệm nuôi cấy cây sâm ngọc
linh và mô sẹo được đặt ở điều kiện chiếu sáng khoảng 2.500 lux, thí
nghiệm nuôi cấy tái sinh rễ bất định và rễ tơ được trong điều kiện tối
hoàn toàn.
2.5. Địa điểm nghiên cứu
Các nghiên cứu được thực hiện tại: Phòng thí nghiệm Công nghệ tế
bào thực vật - Viện Công nghệ sinh học; Phòng Sinh học phân tử và
Chọn tạo giống cây trồng - Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên;
Trung tâm sâm và dược liệu Tp. HCM.
2.6. Xử lý thống kê
Mỗi thí nghiệm được thực hiện với 3 - 5 lần lặp lại. Các số liệu thu
nhận được xử lý bằng phần mềm Excel và phần mềm phân tích thống kê
SPSS 16.0 theo phương pháp Duncan với α ≤ 0,05 (Duncan, 1995).
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Kết quả nuôi cấy thu nhận nguồn vật liệu sâm ngọc linh in vitro
3.1.1. Nuôi cấy thu nhận mô sẹo
Các nguồn mẫu lá, cuống lá và củ của sâm ngọc linh được nuôi cấy
trên môi trường MS có bổ sung 1,0 mg/l 2,4-D; 0,2 mg/l TDZ; 30 g/l

13
sucrose; 8 g/l agar; pH = 5,8. Sau 8 tuần nuôi cấy, kết quả thu được cho
thấy nguồn mẫu thích hợp nhất cho sự phát sinh mô sẹo là củ của sâm
ngọc linh (tỷ lệ tăng sinh đạt 9,71 lần).
3.1.2. Nuôi cấy thu nhận rễ bất định sâm ngọc linh
Các nguồn mẫu lá, cuống lá, củ và mô sẹo của sâm ngọc linh được
nuôi cấy trên môi trường SH có chứa 30 g/l sucrose; 8 g/l agar; pH = 5,8
và bổ sung thêm một trong ba loại auxin riêng lẻ (IAA, IBA, NAA) ở
các nồng độ khác nhau: 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 mg/l.
Sau 8 tuần nuôi cấy, kết quả thu được cho thấy, nồng độ IAA, IBA,
NAA tối ưu nhất bổ sung vào môi trường nuôi cấy cho sự tái sinh rễ bất
định lần lượt là 5 mg/l IAA; 5 mg/l IBA, 3 mg/l NAA. Trong 3 loại
auxin sử dụng, thì IBA (5 mg/l) cho hiệu quả tái sinh rễ cao nhất. Nguồn
mẫu thích hợp nhất cho sự tái sinh rễ bất định là mẫu lá với kích thước
1,5 x 1,5 cm.
3.2. Kết quả tối ưu quy trình chuyển gen tạo rễ tơ ở sâm ngọc linh
3.2.1. Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn tới hiệu quả chuyển gen
Các mẫu mô sâm ngọc linh được lây nhiễm trong môi trường huyền
phù vi khuẩn với mật độ OD 600 = 0; 0,3; 0,5; 0,7; 0,9. Thời gian lây
nhiễm là 20 phút. Sau đó các mảnh cấy được chuyển lên môi trường
đồng nuôi cấy trong 2 ngày. Sau khi đồng nuôi cấy, tiến hành đánh giá
sự biểu hiện tạm thời của gen gus được biến nạp vào trong tế bào. Kết
quả thu được cho thấy, nồng độ vi khuẩn thích hợp nhất cho chuyển gen
tạo rễ tơ sâm ngọc linh là OD600 = 0,5.
3.2.2. Ảnh hưởng của thời gian biến nạp đến hiệu quả chuyển gen
Các khoảng thời gian biến nạp khác nhau: 10, 20, 30 phút được
chúng tôi khảo sát. Kết quả thu được cho thấy, 20 phút là khoảng thời
gian biến nạp thích hợp nhất cho chuyển gen.
3.2.3. Ảnh hưởng của nồng độ Acetosyringone (AS) đến hiệu quả

chuyển gen
AS được bổ sung vào môi trường lây nhiễm ở các nồng độ khác
nhau: 0, 50, 100, 150, 200 μM để gia tăng hiệu quả chuyển gen. Trong
đó, nồng độ AS thích hợp nhất là 100 μM.


14
3.2.4. Ảnh hưởng của nguồn mẫu đến hiệu quả chuyển gen
Các mẫu lá, cuống lá, mô sẹo, phôi sinh dưỡng, rễ bất định và lát cắt
củ in vitro được sử dụng làm vật liệu nhận gen chuyển. Kết quả thu
được cho thấy, sự biểu hiện tạm thời gen gus ở các loại mẫu mô là khác
nhau. Các mẫu mô sẹo có sự biểu hiện gen gus (86%) cao hơn so với
các vật liệu chuyển gen còn lại. Tỷ lệ mẫu biểu hiện gen gus ở mô rễ là
thấp nhất (27%).
Khi đánh giá khả năng ra rễ tơ của các nguồn vật liệu chuyển gen,
chúng tôi nhận thấy mẫu mô sẹo và mẫu phôi có khả năng tạo rễ cao
hơn các mẫu còn lại, trong đó mẫu mô sẹo tạo rễ nhiều nhất. Mẫu rễ bất
định sau khi khi lây nhiễm với vi khuẩn thì không có sự tạo thành rễ
mới. Ba loại mẫu còn lại là cuống lá, lá và lát cắt củ có sự phát sinh rễ,
tuy nhiên các rễ có nguồn gốc từ lá và cuống lá sâm ngọc linh không
phát triển tiếp sau khi tạo thành. Vì vậy, mô sẹo là nguồn vật liệu thích
hợp nhất để chuyển gen tạo rễ tơ ở sâm ngọc linh.
3.2.5. Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả chuyển
gen
Các khoảng thời gian đồng nuôi cấy khác nhau: 1 ngày, 2 ngày và 3
ngày được khảo sát. Kết quả thu được cho thấy, thời gian đồng nuôi cấy
thích hợp là 2 ngày.
3.2.6. Ảnh hưởng của các nhóm kháng sinh diệt khuẩn lên sự sinh
trưởng và phát triển của mô sâm ngọc linh
Sau thời gian đồng nuôi cấy, các mẫu mô sâm được đặt vào các môi

trường SH + 30 g/l sucrose + 8 g/l agar, pH = 5,8 và có bổ sung các loại
kháng sinh riêng lẻ hoặc kết hợp với nồng độ khác nhau: vancomycin
(100 mg/l), carbenicilin (200, 400 mg/l), cefotaxime (250, 300, 500
mg/l). Đối chứng là môi trường không bổ sung kháng sinh. Kết quả thu
được cho thấy, cefotaxime với nồng độ 500 mg/l là thích hợp nhất cho
các thí nghiệm chuyển gen tạo rễ tơ sâm ngọc linh.
3.3. Kết quả chuyển gen và thu nhận các dòng rễ tơ chuyển gen
3.3.1. Kết quả chuyển gen và thu nhận các dòng rễ sâm ngọc linh


15
Dựa trên kết quả thí nghiệm tối ưu hóa quy trình chuyển gen thông
qua vi khuẩn A.rhizogenes mang vector PTN289 ở nội dung 3.2, chúng
tôi đã tiến hành 8 lô thí nghiệm chuyển gen với chủng ATCC 15834
dạng dại, sử dụng vật liệu thực vật là mô sẹo.
Kết quả thu được cho thấy, các mô sẹo cảm ứng tạo rễ tơ sau 4 - 6
tuần chuyển gen. Tỷ lệ tạo rễ tơ trung bình của 8 lô thí nghiệm là
39,81%, trong đó tỷ lệ tạo rễ tơ ở mỗi lô thí nghiệm cao nhất là 45%
và thấp nhất là 33,75%.
3.3.2. Kết quả đánh giá các dòng rễ tơ bằng phương pháp PCR
Tỷ lệ mẫu dương tính với gen rolB và rolC ở các lô thí nghiệm đạt
được thấp nhất là 8,61% và cao nhất là 15%. Tỷ lệ mẫu mẫu dương
tính với gen rolB và rolC trung bình của cả 8 lô thí nghiệm là
11,90%.
3.4. Kết quả nghiên cứu điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến khả năng
nhân nhanh các dòng rễ tơ chuyển gen sâm ngọc linh
3.4.1. Ảnh hưởng của hàm lượng khoáng lên sự sinh trưởng của rễ tơ
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của hàm lượng khoáng khác nhau lên khả năng sinh
trưởng của rễ tơ
Môi trường

khoáng
SH½
½SH
SH
SH + 2VTM

Khối
lượng tươi
(mg)
54,00b*
50,70b
77,30a
71,70ab

Khối lượng
khô (mg)

Số lượng rễ
(rễ/mẫu)

Chiều dài
rễ (cm)

6,10c
5,60d
8,80a
8,10b

5,00b
5,00bf

9,00a
5,33b

2,00a
2,50a
2,80a
2,50a

*Các chữ cái khác nhau (a, b, c…) trong cùng một cột biểu diễn sự khác nhau có ý nghĩa với α ≤
0,05 trong phép thử Duncan

Môi trường khoáng thích hợp nhất là SH.
3.4.2. Ảnh hưởng của pH lên sự sinh trưởng của rễ tơ
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của pH lên sự sinh trưởng của rễ tơ
Độ pH
4,1

Khối lượng
tươi (mg)
44,00cd*

Khối lượng
khô (mg)
5,20e

Số lượng rễ
(rễ/mẫu)
3,33c

Chiều dài rễ

(cm)
1,13c


16
4,8
5,1
5,8
6,1
6,8
7,1

48,30cd
62,30bc
79,30ab
87,30a
50,70cd
38,70d

5,50d
6,80c
8,20b
9,40a
5,10e
4,30f

4,67bc
5,33bc
7,33ab
8,67a

4,00bc
4,00bc

1,17c
2,20ab
2,90a
2,80a
1,70bc
1,30c

pH thích hợp cho sự sinh trưởng của các dòng rễ tơ là trong khoảng
từ 5,8 – 6,1.
3.4.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự sinh trưởng của rễ tơ
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự sinh trưởng của rễ tơ sâm ngọc
linh chuyển gen
Nhiệt độ
22°C
25°C
28°C

Khối lượng
tươi (mg)
74,30b*
102,30a
81,00b

Khối lượng
khô (mg)
8,10c
12,70a

8,70b

Số lượng rễ
(rễ/mẫu)
6,67b
11,33a
6,00b

Chiều dài
rễ (cm)
1,87b
3,33a
2,33b

Nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng của rễ tơ sâm ngọc linh là 25oC.
3.4.4. Ảnh hưởng của hàm lượng đường lên sự sinh trưởng của rễ tơ
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của hàm lượng đường lên sự sinh trưởng của rễ tơ
Sucrose
(g)
0
10
20
30
40
50
60

Khối lượng
tươi (mg)
33,33d*

41,70d
66,00c
81,33ab
86,33a
96,33a
70,30bc

Khối lượng
khô (mg)
4,00g
4,60f
7,10e
8,20c
9,30b
10,50a
7,60d

Số lượng rễ
(rễ/mẫu)
2,00b
2,67b
7,67a
8,33a
8,00a
9,00a
7,67a

Chiều dài
rễ (cm)
1,67c

2,20bc
2,47bc
2,67ab
2,67ab
3,30a
2,33bc

Nồng độ sucrose thích hợp cho sự sinh trưởng của rễ tơ là 50 g/l.
3.4.5. Ảnh hưởng của giá thể nuôi cấy lên sự sinh trưởng của rễ tơ
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của giá thể nuôi cấy lên sự sinh trưởng của rễ tơ
Giá thể

Khối lượng

Khối lượng

Số lượng rễ

Chiều dài


17
Agar
Gelrite
Bông gòn

tươi (mg)
80,00a*
73,30a
57,30b

khô (mg)
9,10a
8,00b
5,40c

(rễ/mẫu)
8,00a
4,67b
3,33b

rễ (cm)
2,93a
2,07b
1,80b

Agar là giá thể thích hợp cho sự sinh trưởng của rễ tơ.
3.4.6. Sự sinh trưởng của rễ tơ ở tổ hợp các điều kiện nuôi cấy tối ưu
trên môi trường đặc và môi trường lỏng lắc
Quan sát về mặt hình thái và tốc độ sinh trưởng của các dòng rễ tơ
trong thời gian cấy chuyền ở môi trường nhân nhanh tối ưu, chúng tôi
ghi nhận được sự phát triển mạnh nhất của 4 dòng rễ tơ có kiểu hình đặc
trưng như ở hình 3.1.

Hình 3.1: Hình thái của 4 dòng rễ tơ sâm ngọc linh điển hình sau 12 tuần nuôi cấy. a:
Dòng 1: rễ tơ dạng mảnh, phát triển theo chiều dài, phân nhánh chủ yếu ở dọc rễ chính;
b: Dòng 2: rễ tơ dạng nhỏ, phân nhánh nhiều, phát triển mạnh; c: Dòng 3: rễ tơ dạng
hình răng lược phân nhánh kém, phát triển chậm; d: Dòng 4: rễ tơ dạng sợi ngắn, phân
nhánh ít, phát triển chậm.

Sau đó, rễ tơ tiếp tục được nhân nhanh trên môi trường thạch và môi
trường lỏng lắc. Kết quả thu được cho thấy, rễ tơ nuôi cấy trên môi
trường đặc không bị đứt gãy, trong khi nuôi cấy lỏng lắc, rễ tơ có thể bị
đứt gãy trong quá trình chuyển động. Do đó, rễ tơ nuôi cấy trên môi
trường thạch có tính ổn định di truyền hơn so với nuôi cấy lỏng lắc, nên
môi trường đặc thích hợp để duy trì sự sinh trưởng và bảo tồn các dòng
rễ tơ gốc làm nguyên vật liệu cho các nuôi cấy thu nhận sinh khối.
Ngược lại, rễ tơ cảm ứng tăng sinh nhanh và mạnh ở môi trường lỏng
lắc, nên môi trường lỏng lắc thích hợp để nuôi cấy thu nhận sinh khối rễ
tơ.
3.5. Kết quả nghiên cứu một số elicitor có tác dụng làm tăng tích lũy
hoạt chất trong quá trình nuôi cấy rễ tơ chuyển gen sâm ngọc linh


18
3.5.1. Ảnh hưởng của methyl jasmonate (MeJA) lên sự sinh trưởng và tích
luỹ saponin của rễ tơ
Khi bổ sung MeJA vào môi trường nuôi cấy rễ tơ sâm ngọc linh đã
ức chế sự sinh trưởng của rễ. Tuy nhiên, bổ sung MeJA vào môi trường
nuôi cấy lại gia tăng khả năng tích luỹ hoạt chất của rễ tơ, và đạt cao
nhất là 150 µl/l MeJA. Tại nghiệm thức 150 µl/l MeJA tổng hàm lượng
saponin chính thu được cao nhất và cao gấp 2 lần so với đối chứng
(Bảng 3.7), tuy nhiên khối lượng khô của rễ thu được lại giảm 2,2 lần so
với đối chứng (Bảng 3.6), nên nếu xét về tổng hàm lượng saponin chính
thu được trên toàn bộ sinh khối chất khô rễ tơ sâm thu được thì việc bổ
sung MeJA vào môi trường nuôi cấy là không hiệu quả.
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của MeJA lên khả năng sinh trưởng của rễ tơ
Nồng độ
MeJA (µl/l)
0

50
100
150
200
250

Khối lượng
tươi (mg)
247,33a*
203,33b
165,67c
137,33d
106,00e
82,67f

Khối lượng khô
(mg)
63,33a
43,00b
33,67c
29,33d
22,00e
19,33f

Đặc điểm rễ
Trắng
Vàng nhạt
Vàng nhạt
Vàng
Vàng đậm

Vàng đậm

Bảng 3.7. Ảnh hưởng của MeJA lên khả năng tích lũy saponin của rễ tơ
Nồng độ
MeJA (µl/l)
0
50
100
150
200
250

Rg1 (‰)

Rb1 (‰)

MR2 (‰)

0,162560
0,291539
0,261945
0,615370
0,410978
0,374705

0,062567
0,061573
0,040760
0,096196
0,072151

0,073269

4,633008
7,511306
7,332454
9,033344
3,771409
3,357971

Tổng saponin
chính (‰)
4,858135
7,864417
7,635159
9,744910
4,254538
3,805945

3.5.2. Ảnh hưởng của salicylic acid (SA) lên sự sinh trưởng và tích luỹ
saponin của rễ tơ
Tương tự như MeJA, khi bổ sung SA vào môi trường nuôi cấy cũng
ức chế sự sinh trưởng của rễ tơ sâm ngọc linh, nhưng lại gia tăng khả
năng tích luỹ hoạt chất của rễ. Tại nghiệm thức 20 µl/l SA, tổng hàm
lượng saponin chính đạt được cao nhất và cao gấp 4,7 lần so với nghiệm


19
thức đối chứng (Bảng 3.9). Nếu xét về tốc độ sinh trưởng của rễ tơ tại
nghiệm thức 20 µl/l SA, thì khối lượng khô của rễ thu được tại nghiệm
thức này chỉ giảm 2,3 lần so với đối chứng (Bảng 3.8). Do đó, nếu tính

toán hàm lượng saponin chính thu được trên toàn bộ sinh khối khô của
rễ thì việc bổ sung SA vào môi trường nuôi cấy ở nồng độ 20 µl/l giúp
tăng tích luỹ hoạt chất lên gấp 2 lần so với đối chứng.
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của SA lên khả năng sinh trưởng của rễ tơ
Nồng độ SA
(µ/l)
0
10
20
30
40
50

Khối lượng tươi
(mg)
247,33a*
174,00b
145,00c
118,67d
96,67d
71,33e

Khối lượng khô
(mg)
63,33a
32,00b
27,33c
24,33d
21,00e
20,00e

Đặc điểm rễ
Trắng
Vàng nhạt
Vàng nhạt
Vàng nhạt
Vàng
Vàng đậm

Bảng 3.9. Ảnh hưởng của SA lên khả năng tích lũy saponin của rễ tơ
Nồng độ
SA (µl/l)
0
10
20
30
40
50

Rg1 (‰)

Rb1 (‰)

MR2 (‰)

0,162560
0,282477
0,394336
0,886188
0,288974

0,413222

0,062567
0,137013
0,081438
0,053910
0,048578

4,633008
8,707754
22,202239
20,078275
6,660902
5,513122

Tổng saponin
chính (‰)
4,858135
8,990231
22,733588
21,045901
7,003786
5,974923

3.5.3. Ảnh hưởng của abscisic acis (ABA) lên sự sinh trưởng và tích
luỹ saponin của rễ tơ
Bổ sung ABA vào môi trường nuôi cấy rễ tơ sâm ngọc linh cũng ức
chế sự sinh trưởng của rễ, nhưng thúc đẩy mạnh mẽ khả năng tích luỹ
saponin ở rễ nuôi cấy.
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của ABA lên khả năng sinh trưởng của rễ tơ

Nồng độ ABA
(mg/l)
0
1

Khối lượng
tươi (mg)
247,33a*
217,00b

Khối lượng khô
(mg)
63,33a
51,67b

Đặc điểm rễ
Trắng
Trắng


20
2
3
4
5

195,67c
153,00d
113,33e
87,67f

39,33c
34,67d
28,00e
24,33f

Vàng nhạt
Vàng nhạt
Vàng
Vàng

Bảng 3.11. Ảnh hưởng của ABA lên khả năng tích lũy saponin của rễ tơ
Nồng độ
ABA (mg/l)
0

Rg1 (‰)

Rb1 (‰)

MR2 (‰)

0,162560

0,062567

1

0,554781

0,061413

2
3
4
5

0,682291
0,392558
0,732950
0,265778

0,081027
0,033090
0,070097
0,061413

4,633008
22,27585
2
8,414319
8,452148
8,518925
3,727937

Tổng saponin
chính (‰)
4,858135
22,892046
9,177637

8,877796
9,321972
4,055129

Tại nghiệm thức môi trường nuôi cấy có bổ sung 1 mg/l ABA, khối
lượng khô của rễ thu được giảm 1,2 lần (Bảng 3.10), nhưng hàm lượng
saponin chính thu được lại tăng gấp 4,7 lần so với đối chứng (Bảng
3.11). Do đó, nếu tính tổng hàm lượng saponin chính thu được trên toàn
bộ sinh khối khô của rễ, thì bổ sung 1 mg/l ABA vào môi trường nuôi
cấy giúp gia tăng tích luỹ hoạt chất lên 3,9 lần.
3.6. Kết quả so sánh hàm lượng saponin và cấu trúc hình thái giữa
rễ tơ và rễ bất định
3.6.1. So sánh cấu trúc hình thái bên ngoài và hình thái giải phẫu
giữa rễ tơ và rễ bất định
Rễ tơ và rễ bất định sâm ngọc linh có nhiều điểm tương đồng nhau
về hình thái và cấu trúc giải phẫu và tương tự với rễ thông thường, tuy
nhiên chúng cũng có những đặc trưng riêng. Rễ tơ phân nhánh nhanh,
mạnh và mật độ phân nhánh dày đặc. Ở rễ tơ có hiện tượng phân nhánh
đối xứng nhau qua trục và tính hướng động bất thường. Hệ mạch ở rễ
chính của rễ tơ xốp và có nhiều lỗ rỗng. Trong khi đó, ở rễ bất định
không có các đặc điểm này.
3.6.2. So sánh khả năng sinh trưởng và tích luỹ saponin của rễ tơ và
rễ bất định
Khả năng tích luỹ saponin của rễ tơ và bất định là tương đương nhau.


21
Tuy nhiên, tốc độ sinh trưởng của rễ tơ cao hơn rễ bất định 1,34 lần, nên
dẫn tới hàm lượng saponin chính thu được từ toàn bộ sinh khối khô của
rễ tơ cao hơn rễ bất định 1,3 lần.

Bảng 3.12. So sánh khả năng sinh trưởng và tích luỹ saponin của rễ tơ
và rễ bất định

0,3040
0,0140
0,2010
0,5010

Phần thân rễ
và rễ củ sâm
tự nhiên*
5,29
2,00
1,40
8,69

Rễ tơ/rễ
bất định
(lần)
0,97

557,40

415,20

-

1,34

2,7067

2,0802

-

1,30

Chỉ tiêu theo dõi

Rễ tơ

Rễ bất
định

MR2 (%)
Rb1 (%)
Rg1 (%)
Tổng saponin chính (%)
Khối lượng khô của
rễ/bình nuôi cấy (mg)
Tổng saponin chính/bình
nuôi cấy (mg)

0,2906
0,0320
0,1630
0,4856

* Trần công luận (2003)
Ngoài ra, chúng tôi cũng nhận thấy, rễ tơ vẫn tiếp tục sinh trưởng

mạnh sau hơn 12 tuần nuôi cấy, ngược lại rễ bất định thì bắt đầu có hiện
tượng hoá nâu và ngừng tăng sinh. Mặt khác, quá trình nuôi cấy rễ bất
định cần thiết phải bổ sung auxin ngoại sinh (5 mg/l IBA), trong khi đó
rễ tơ có khả năng sinh trưởng trên môi trường không cần bổ sung chất
điều hoà sinh trưởng nên môi trường nuôi cấy rễ tơ không cần bổ sung
auxin. Điều này sẽ dẫn tới giảm đi lo ngại về tồn dư của chất điều hoà
sinh trưởng thực vật trong sinh khối rễ tơ sâm ngọc linh thu được. Do
vậy, rễ tơ là nguồn vật liệu thích hợp cho các nghiên cứu nuôi cấy thu
nhận sinh khối rễ bằng các hệ thống bioreactor, để tạo ra nguồn dược
phẩm sạch phục vụ sức khoẻ.
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
4.1. Một số yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển gen tạo rễ tơ ở
sâm ngọc linh
4.1.1. Mật độ vi khuẩn, thời gian biến nạp và thời gian đồng nuôi cấy


22
Park và Facchini (2000) báo cáo rằng chủng vi khuẩn và mật độ vi
khuẩn có ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu quả chuyển gen ở các cây dược
liệu. Mật độ tế bào vi khuẩn lớn khả năng xâm nhiễm mạnh, khả năng
chuyển gen cao. Ngược lại mật độ vi khuẩn thấp thì hiệu quả chuyển
gen thấp. Tương tự như vậy, khi thời gian lây nhiễm ngắn nồng độ
khuẩn xâm nhập vào mẫu biến nạp sẽ thấp dẫn đến tỷ lệ chuyển gen
thấp, thời gian lây nhiễm dài thì vi khuẩn có nhiều thời gian để xâm
nhập vào mô tế bào thực vật nên khả năng chuyển gen vào tế bào càng
lớn. Ngoài ra, đồng nuôi cấy cũng là giai đoạn để vi khuẩn xâm nhập và
chuyển đoạn T-DNA vào bộ gen của thực vật. Nếu thời gian đồng nuôi
cấy quá ngắn thì quá trình biến nạp có thể chưa xảy ra hoặc hiệu quả
biến nạp thấp, ngược lại thời gian đồng nuôi cấy dài thì vi khuẩn sẽ xâm
nhập vào mô nhiều làm khó diệt khuẩn dẫn tới mẫu dễ bị nhiễm lại và

chết.
Mặc dù hiệu quả biến nạp gia tăng tỷ lệ thuận với nồng độ vi
khuẩn, thời gian lây nhiễm và thời gian đồng nuôi cấy. Tuy nhiên các
yếu tố này gia tăng quá mức, thì số lượng khuẩn xâm nhập vào mẫu biến
nạp nhiều, điều này sẽ gây ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng sống sót và
phát triển của mô thực vật. Ngoài ra, số lượng khuẩn xâm nhập vào mẫu
biến nạp nhiều sẽ gây ảnh hưởng đến khả năng diệt khuẩn sau này cũng
như sự phát triển của mô thực vật.
4.1.3. Nồng độ acetosyringone
Acetonsyringone (AS) có bản chất là phenolic, có tác dụng dẫn dụ vi
khuẩn xâm nhập, và có vai trò như một chất kích hoạt vùng gen vir
thuộc Ti-plasmid kích thích cho sự cắt đoạn T-DNA (tại vùng bờ trái và
bờ phải) để gắn vào genome thực vật, từ đó giúp gia tăng khả năng khả
năng chuyển gen vào tế bào (Stachel et al., 1985). Vì vậy, AS thường
được bổ sung vào môi trường lây nhiễm để gia tăng hiệu quả biến nạp.
4.1.4. Nguồn mẫu
Do đặc tính sinh lý khác nhau của mỗi loại mẫu nên khả năng nhận
gen và khả năng ra rễ của từng loại mẫu khác nhau là khác nhau. Mẫu
mô sẹo sâm ngọc linh nuôi cấy in vitro cho hiệu quả chuyển gen là cao
nhất. Theo nghiên cứu của Britton và đồng tác giả (2008), gen rolB,
rolC là một trong những gen đóng vai trò quan trọng nhất trong quá
trình cảm ứng tạo rễ tơ và kiểu hình rễ tơ ở thực vật lại rất được cảm


23
ứng bởi auxin. Do vậy, khi sử dụng vật liệu chuyển gen là mô sẹo, hàm
lượng auxin vẫn được tích luỹ trong mô sẹo từ quá trình nuôi cấy phát
sinh và nhân nhanh mô sẹo, nên khả năng tạo rễ tơ là cao hơn so với
nguồn vật liệu chuyển gen khác.
4.1.6. Nhóm kháng sinh diệt khuẩn

Việc sử dụng kháng sinh nhằm loại trừ các vi khuẩn Agrobacterium
dùng trong chuyển gen ra khỏi môi trường và mô thực vật nuôi cấy là
rất cần thiết. Tuy nhiên, bổ sung kháng sinh vào môi trường nuôi cấy lại
làm chậm sinh trưởng và có thể gây độc mô và tế bào thực vật. Vì vậy
cần phải xác định được chất kháng sinh với nồng độ phù hợp, mà tại đó
mẫu mô thực vật không bị tổn thương nhiều mà kháng sinh vẫn có tác
dụng đối với vi khuẩn. Trong nghiên cứu này, nồng độ kháng sinh thích
hợp là 500 mg/l cefotaxime.
4.2. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến sự sinh trưởng của các
dòng rễ tơ chuyển gen sâm ngọc linh
4.2.1. Hàm lượng khoáng
Các yếu tố khoáng đóng một vai trò quan trọng trong việc điều hoà
sự sinh trưởng và sinh khối của rễ tơ (Sivakumar et al., 2005). Ở cây
sâm ngọc linh, các nghiên cứu của Dương Tấn Nhựt và đồng tác giả
(2009, 2010a,b, 2012a,b) cũng chỉ ra rằng, môi trường SH được báo cáo
là thích hợp cho sự sinh trưởng, phát triển của các mô và cây sâm ngọc
linh. Vì vậy, ở thí nghiệm này chúng tôi lựa chọn môi trường SH để
khảo sát hàm lượng khoáng. Kết quả thu nhận được cho thấy, không chỉ
có thành phần khoáng mới đóng vai trò quan trọng tới sự phát triển của
rễ tơ, mà tỷ lệ khoáng trong môi trường dinh dưỡng cũng có ảnh hưởng
tới sự sinh trưởng của rễ.
4.2.2. pH
Giá trị pH của môi trường được đo dựa vào nồng độ ion H + trong môi
trường; pH ảnh hưởng đến khả năng hòa tan của các ion trong môi trường
khoáng, khả năng đông tụ agar và sự tăng trưởng của tế bào (Skirvin et al.,
1986). Giá trị pH của môi trường nuôi cấy thay đổi ảnh hưởng đến sự hấp
thu dinh dưỡng của tế bào nuôi cấy, ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh trưởng
của tế bào (Nguyễn Quang Thạch et al., 2009). Kết quả của nghiên cứu này
cho thấy, rễ tơ sinh trưởng kém trong môi trường có pH được điều chỉnh

24
trong khoảng từ 4,1 - 4,8 và cao hơn 6,1 thì các chỉ tiêu theo dõi này giảm
xuống. Điều này có thể là do pH môi trường quá thấp hoặc quá cao sẽ làm
giảm khả năng hấp thụ chất dinh dưỡng của tế bào từ môi trường, dẫn đến
rễ tăng trưởng chậm. Do đó, pH được điều chỉnh trong khoảng từ 5,8 đến
6,1 là phù hợp nhất cho quá trình sinh trưởng và phát triển của rễ tơ sâm
ngọc linh và được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
4.2.3. Nhiệt độ
Nhiệt độ có ảnh hưởng đến quá trình chuyển gen tạo rễ tơ vào thực
vật và tác động đến quá trình sinh lý, sinh hóa ở của rễ tơ các giai đoạn
nuôi cấy tiếp theo (Muller et al., 2014). Trong nghiên cứu này, nhiệt độ
phù hợp cho sự sinh trưởng của rễ tơ sâm ngọc linh là 25oC.
4.2.4. Hàm lượng đường
Đường là nguồn cung cấp carbohydate trong nuôi cấy mô thực vật.
Mặt khác, nồng độ đường trong môi trường còn ảnh hưởng đến áp suất
thẩm thấu và khả năng hút các chất dinh dưỡng và nước ở thực vật. Các
nguồn carbohydrate, đặc biệt là sucrose, ngoài là nguồn cung cấp năng
lượng và carbon quan trọng cho hầu hết các dòng rễ tơ còn ảnh hưởng
đến các sản phẩm trao đổi chất thứ cấp trong nuôi cấy rễ tơ (Kochan et
al., 2014). Kochan và đồng tác giả (2014) cũng đã báo cáo về tốc độ
tăng trưởng cũng như khối lượng tươi và khô của rễ tơ P. quinquefolium
đạt cao nhất ở môi trường bổ sung 50 g/l sucrose. Kết quả này cũng
tương tự với nghiên cứu của chúng tôi. Trong một số nghiên cứu về rễ
bất định sâm ngọc linh, nồng độ đường sử dụng trong nuôi cấy rễ bất
định thường là 30 g/l sucrose (Nhut et al., 2012a; Nhut, Huy, 2012).
Như vậy, rễ tơ dường như cần nhiều năng lượng hơn rễ không chuyển
gen (rễ bất định) vì sự cân bằng hormon trong rễ tơ thay đổi bởi sự biểu
hiện của Ri-T-DNA khi tích hợp vào hệ gen của thực vật (White et al.,
1985).

4.2.5. Giá thể nuôi cấy
Giá thể agar có chứa một số chất vô cơ như Ca, Mg, K, Na,… là các
yếu tố cần thiết cho sự tăng sinh rễ [Nguyễn Đức Lượng, Lê Thị Thủy
Tiên, 2006]. Bên cạnh đó, môi trường thạch sử dụng agar có cấu trúc
xốp, thông thoáng khí lại tiết kiệm được chi phí. Vì vậy agar là giá thể
thích hợp cho nuôi cấy rễ tơ.


25
4.3. Ảnh hưởng của một số chất kích thích (elicitor) lên khả năng
sinh trưởng và tích lũy hoạt chất trong quá trình nuôi cấy rễ tơ
chuyển gen sâm ngọc linh
Elicitor có thể được sử dụng như là một trong những công cụ quan
trọng để sản xuất các sản phẩm thứ cấp có hoạt tính sinh học với năng
suất cao hơn và giảm chi phí sản xuất (Hussain et al., 2012).
MeJA, SA và ABA đều là những elicitor thuộc nhóm kích thích tăng
tích luỹ hoạt chất nhưng ức chế sinh trưởng, dó đó kết quả thu được
trong nghiên cứu của chúng tôi cũng cho thấy, cả ba loại elicitor này đều
không phù hợp với sự sinh trưởng và phát triển của rễ tơ sâm ngọc linh
chuyển gen; tuy nhiên, các loại elicitor này đều giúp gia tăng khả năng
tích lũy hoạt chất thứ cấp.
Mặt khác, mức độ ức chế sự sinh trưởng của rễ nuôi cấy cũng như
khả năng giúp tăng tích luỹ hoạt chất của ba elicitor này cũng khác
nhau. So với MeJA, thì SA và ABA có tác động mạnh mẽ hơn lên sự
tích lũy hoạt chất ở rễ tơ sâm ngọc linh. Ở nồng độ 20 µ/l SA và 1 mg/l
ABA, sự sinh trưởng của các mẫu rễ tuy có giảm nhưng không có hiện
tượng chết mẫu, khả năng tích lũy hoạt chất của rễ lại đạt cao nhất. Tính
toán hàm lượng saponin tổng số thu được trên toàn bộ sinh khối khô của
rễ tơ nuôi cấy, thì bổ sung 20 µ/l SA và 1 mg/l ABA vào môi trường
nuôi cấy giúp tăng khả năng tích luỹ hoạt chất lên tương ứng là 2 lần và

3,9 lần. Tại nghiệm thức 150 µl/l MeJA hàm lượng saponin tổng thu
được là cao nhất và cao gấp 2 lần so với đối chứng, tuy nhiên khối
lượng khô của rễ thu được lại giảm 2,2 lần so với đối chứng, nên nếu xét
về hàm lượng saponin tổng số thu được trên toàn bộ sinh khối chất khô
rễ tơ sâm thu được thì việc bổ sung MeJA vào môi trường nuôi cấy là
không hiệu quả.
4.4. Rễ tơ – nguyên liệu tiềm năng cho nuôi cấy sinh khối
Khả năng tích luỹ saponin của rễ tơ và rễ bất định là tương tự nhau
(tỷ lệ saponin tổng giữa rễ tơ/rễ bất định là 0,97 lần), nhưng tốc độ sinh
trưởng của rễ tơ cao hơn rễ bất định (1,34 lần). Mặt khác, môi trường
nuôi cấy rễ bất định cần thiết phải bổ sung auxin ngoại sinh (5 mg/l
IBA); trong khi đó, rễ tơ có thể sinh trưởng, phát triển tốt trên môi
trường không cần bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng thực vật, do