TỐI ưu điều KIỆN SINH TỔNG hợp NATTOKINASE THEO PHƯƠNG PHÁP lên MEN CHÌM ở QUY mô PHÒNG THÍ NGHIỆM

Luận văn thạc sĩ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
=======* & *======

PHẠM THỊ QUỲNH

TỐI ƯU ĐIỀU KIỆN SINH TỔNG HỢP
NATTOKINASE THEO PHƯƠNG PHÁP LÊN
MEN CHÌM Ở QUY MÔ PHÒNG THÍ NGHIỆM
LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT
CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Phạm Thị Quỳnh

11


Luận văn thạc sĩ

Hà Nội - 2014
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
=======* & *======

PHẠM THỊ QUỲNH

TỐI ƯU ĐIỀU KIỆN SINH TỔNG HỢP
NATTOKINASE THEO PHƯƠNG PHÁP LÊN
MEN CHÌM Ở QUY MÔ PHÒNG THÍ NGHIỆM

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT

HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. NGUYỄN LAN HƯƠNG

Phạm Thị Quỳnh

22


Luận văn thạc sĩ

Hà Nội – 2014
LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học mà bản thân
tôi đã trực tiếp thực hiện. Tất cả các số liệu và kết quả thu được trình bày
trong khóa luận là hoàn toàn khách quan trung thực và chưa từng được ai
công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Các tài liệu đã trích dẫn của các
tác giả đều được liệt kê đầy đủ, không sao chép bất cứ tài liệu nào mà
không có trích dẫn.
Hà Nội, ngày 26 tháng 08 năm 2014
Học viên

Phạm Thị Quỳnh

Phạm Thị Quỳnh

33

Luận văn thạc sĩ

Phạm Thị Quỳnh

44


Luận văn thạc sĩ

LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành được luận văn này, ngoài sự cố gắng nỗ lực của bản thân, tôi đã
nhận được sự ủng hộ, giúp đỡ tận tình của thầy cô giáo, gia đình và bạn bè.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn Lan Hương - Viện
Công nghệ sinh học & Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội đã
tận tình chỉ bảo tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn này.
và tôi xin cảm ơn TS. Phạm Tuấn Anh đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện cho
tôi trong suốt thời gian thí nghiệm tại Phòng Kỹ thuật lên men, trung tâm Nghiên
cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học (TTCNSH), thuộc Viện Công nghệ Sinh
học & Công nghệ Thực phẩm, trường Đại học Bách khoa Hà Nội đã cho phép và
tạo điều kiện thuận lợi cho tôi học tập và nghiên cứu tại phòng.
Tôi xin chân thành cảm ơn tới các thầy cô giáo thuộc Viện Công nghệ sinh học &
Công nghệ thực phẩm – Trường Đại học Bách khoa Hà Nội đã giảng dạy và giúp đỡ
tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè và đã tạo điều kiện, quan tâm, động
viên và góp ý cho tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn.
Hà Nội, ngày 26 tháng 08 năm 2014
Học viên

Phạm Thị Quỳnh

Phạm Thị Quỳnh

55


Luận văn thạc sĩ

GIẢI THÍCH CHỮ VIẾT TẮT

NK

Nattokinase

Enzym nattokinase

pI

Point isoelectric

Điểm đẳng điện

t-PA

tissue

Tiền tố kích thích plasminogen

Plasminogen

Activator
FU

Fibrin unit

Tris - HCl

Tris

Đơn vị fibrin

(hydroxymethyl)

aminomethane
TCA

Trichloacetic acid

Axít tricloaxêtic

Fed–batch

Fed–batch fermentation

Lên men bổ sung cơ chất

Phạm Thị Quỳnh

66

Luận văn thạc sĩ

DANH MỤC HÌNH

DANH MỤC BẢNG

Phạm Thị Quỳnh

77


Luận văn thạc sĩ

MỤC LỤC

Phạm Thị Quỳnh

88


Luận văn thạc sĩ

MỞ ĐẦU
Đột quy hay còn gọi là tai biến mạch máu não (TBMMN) là tình trạng bệnh lý
biểu hiện bởi các triệu chứng thần kinh xảy ra đột ngột, vì một lý do nào đó, mạch máu
não bị bít tắc lại, lập tức phía sau của vùng bị bít tắc, các tế bào thần kinh bị hủy hoại
một cách nhanh chóng, chỉ trong khoảng 1 phút có thể sẽ mất đi 2 triệu tế bào [20, 41].
Điều đó tương ứng với tổn thương cục bộ hệ thần kinh trung ương do rối loạn tuần
hoàn não.

Hàng năm, thế giới có khoảng 5 triệu người bị TBMMN, Việt Nam có khoảng
200.000 người mắc mới – là nguyên nhân gây tàn phế hàng đầu và là cấp cứu thường
gặp nhất trong chuyên khoa thần kinh. Tỉ lệ tử vong của đột quỵ đứng hàng thứ 3 sau
tai biến tim mạch và ung thư [40]. Một bệnh nhân bị đột quỵ dù không tử vong nhưng
có thể bị tàn phế suốt đời và trở thành gánh nặng cho gia đình và xã hội. Những dấu
hiệu của bệnh này thường được ít người biết đến và chúng khó để nhận biết hoặc
không có biểu biện rõ rệt. Chính vì lẽ đó, việc ngăn ngừa phòng bệnh này sẽ giúp mỗi
chúng ta và những người thân tránh gặp những trường hợp và hậu quả đáng tiếc.
Quá trình nghiên cứu, sản xuất các loại thuốc và thực phẩm chức năng có tác
dụng phòng ngừa TBMMN đã được tiến hành trong nhiều thập niên qua. Nattokinase
là enzym được sử dụng nhiều trong các chế phẩm sinh học, các loại thực phẩm chức
năng phòng ngừa TBMMN. Đây là một loại enzym có tính an toàn cao, được tìm thấy
trong lên men đậu tương, có tác dụng làm tan các cục máu đông giúp ngăn ngừa bệnh
TBMMN.
Nattokinase được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn Bacillus subtilis khi lên men đậu
tương – một loại hình lên men có truyền thống lâu đời. Đậu tương từ xa xưa đã được
biết đến là một thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao, giàu protein, lipid và các vitamin.
Từ đậu tương có thể chế biến nhiều sản phẩm giàu dinh dưỡng và có lợi cho sức khỏe.
Khô đậu tương là một phụ phẩm của quá trình ép đậu tương thu dầu thường được sử
dụng làm thức ăn gia súc, tuy nhiên, với hàm lượng protein cao và giá thành rẻ hơn so
với đậu tương, khô đậu tương là một phụ phẩm có triển vọng trong lên men sinh tổng
hợp nattokinase.
Quá trình lên men sinh tổng hợp nattokinase từ B. subtilis ngày càng được
Phạm Thị Quỳnh

99


Luận văn thạc sĩ
nghiên cứu và hoàn thiện. Hiện có 2 phương pháp lên men sinh tổng hợp nattokinase

được sử dụng. Phương pháp lên men bề mặt có ưu điểm là đơn giản, không đòi hỏi chi
phí đầu tư thiết bị cao nhưng có nhược điểm là khó khống chế điều kiện vô trùng tuyệt
đối trong phòng lên men khi triển khai ở quy mô sản xuất. Bên cạnh phương pháp lên
men bề mặt, lên men chìm đã được tiến hành nghiên cứu. Ưu điểm nổi bật của công
nghệ này là có thể dễ dàng tự động hóa điều khiển được quá trình lên men và có thể
triển khai ở quy mô công nghiệp. Công nghệ này cũng cho phép quá trình thu hồi
enzym được dễ dàng hơn so với lên men bề mặt.
Với định hướng có thể tận dụng và nâng cao giá trị của khô đậu tương chúng tôi
đã sử dụng nguyên liệu này làm nguồn cơ chất cho lên men sinh tổng hợp nattokinase
theo phương pháp lên men chìm. Để có thể làm chủ được quá trình lên men ở quy mô
phòng thí nghiệm tôi đã tham gia nghiên cứu đề tài: “Tối ưu điều kiện sinh tổng hợp
nattokinase theo phương pháp lên men chìm ở quy mô phòng thí nghiệm”
Nội dung nghiên cứu của đề tài bao gồm:
1. Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng sinh tổng hợp nattokinase từ
khô đậu tương
2. Tối ưu điều kiện lên men chìm ở quy mô phòng thí nghiệm

Phạm Thị Quỳnh

10
10


Luận văn thạc sĩ
3. Lựa chọn kỹ thuật lên men phù hợp sinh tổng hợp nattokinase của chủng B. subtilis

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Enzym nattokinase
1.1.1. Lịch sử
Natto đã trở thành một đề tài nóng khi tiến sĩ Sumi Hiroyuki tung ra những kết

quả bất ngờ về hiệu quả của natto trong việc làm tan các huyết khối trong động mạch.
Vào năm 1980, trong bữa cơm tại nhà ăn của trường đại học Y khoa Chicago, tiến sĩ
Sumi Hiroyuki lấy một mẫu natto – một món ăn quen thuộc của ông, đặt vào khay
thủy tinh có cục máu đông thì 18 giờ sau, cục máu đông này tan rã dễ dàng, điều đó
gợi ý rằng natto có thể có một (hay nhiều) hoạt chất fibrinolytic enzym, có thể phân
hủy huyết khối nhờ thủy phân sợi fibrin [6].
Năm 1986, Sumi Hiroyuki công bố toàn bộ kết quả nghiên cứu về tác dụng của
nattokinase (NK) sau khi thử nghiệm gần 200 loại thực phẩm khác nhau để so sánh,
xác định NK là một loại enzym có khả năng phân hủy huyết khối một cách hữu hiệu
và mạnh mẽ nhất trong các loại enzym, gấp 4 lần plasmin – enzym nội sinh làm tan
máu đông, đồng thời tuyệt đối an toàn cho cơ thể khi hấp thụ qua đường tiêu hóa [26].
1.1.2. Tính chất
1.1.2.1. Cấu trúc
Nattokinase (E.C.3.4.21.62) thuộc vào họ protease serine subtilisin với 275 axit
amin và có khối lượng phân tử 27,27 kDa [26], enzym này bền trong dải pH từ 4 đến
11, tối ưu ở pH = 8, hoạt động tốt trong dải nhiệt độ từ 30 0C đến 500C, tối ưu ở 400C
[35, 37].

Phạm Thị Quỳnh

11
11


Luận văn thạc sĩ

Hình 1.2. Cấu trúc của enzym nattokinase [26]
1.1.2.2. Cơ chất của Nattokinase
Fibrin là một protein dạng sợi được polyme hóa để tạo thành dạng lưới bao
quanh vết thương và có tác dụng cầm máu. Fibrin được tạo thành từ chất tạo tơ huyết

hay còn gọi là fibrinogen nhờ sự hoạt động của thrombin. Khi đó, fibrin được tạo
thành sẽ liên kết với nhau bởi nhân tố VIII (yếu tố chống bệnh hemophilia- bệnh rối
loạn đông máu) để tạo thành cục máu. Ngoài ra, fibrin còn tham gia vào một số quá
trình sinh học trong cơ thể như: truyền tín hiệu, đông tụ máu trong mạch máu và
polyme hóa protein [1, 28].
Fibrinogen là một loại glycoprotein 340-HD được sinh tổng hợp ở gan và có
nồng độ khoảng 1,5 ÷ 4,0 g/l trong huyết tương. Do đó, đối với những người bệnh suy
gan hoặc mắc các bệnh về di truyền liên quan đến gen ở nhiễm sắc thể số 4 có thể dẫn
đến việc giảm nồng độ và chất lượng fibrinogen gây ra bệnh nguy hiểm về máu.
Fibrinogen đóng vai trò chính trong việc tạo cầu nối các sợi tơ huyết bằng việc kết hợp
các protein bề mặt GbIIb/IIa của chúng lại với nhau và hình thành fibrin để cầm máu
[1].
Fibrinogen có cấu trúc đối xứng 6 cặp chuỗi polypeptit (chuỗi alpha, beta và
gramma). Trên chuỗi alpha và beta có một trình tự peptid ngắn được gọi là
fibrinopeptid, chính các chuỗi peptid ngắn này cản trở việc fibrinogen bị polyme hóa
bởi chính nó một cách tùy tiện [1].
Thrombin cắt các fibrinogen của chuỗi alpha và để lộ ra một mặt của vùng
domain E, vùng này có thể được kết hợp với đầu cacbon cuối của chuỗi gamma. Việc
Phạm Thị Quỳnh

12
12


Luận văn thạc sĩ
cắt chuỗi beta diễn ra từ từ hơn và tạo ra các sợi của fibrinogen. Đây chính là quá trình
chuyển hóa fibrinogen thành fibrin [1].
1.1.2.3. Quá trình đông máu và hòa tan cục máu
Quá trình đông máu và hòa tan cục máu đông là hai quá trình tồn tại song song
đồng thời trong cơ thể người. Khi một cục máu đông bắt đầu được hình thành thì một

loạt các bước sau diễn ra nhằm ngăn cản sự hoàn thành việc hình thành các cục máu
đông. Điều này giúp bảo vệ cơ thể, ngăn chặn các cuộc tấn công tim và các sự cố tim
mạch. Nhưng một khi hai quá trình này bị rối loạn thì sẽ dẫn đến toàn bộ các quá trình
khác cũng bị rối loạn. Ví dụ, khi mà các cục máu đông hình thành và chưa được làm
tan hết, chúng sẽ bám vào thành mạch máu và tích tụ dần dần gây ra nghẽn mạch; điều
đó là rất nguy hiểm khi không có thuốc điều trị kịp thời [1].
 Quá trình đông máu
Khi cơ thể con người bị tổn thương hoặc do những biến đổi trong cơ thể, sẽ dẫn
đến việc hình thành các tiền thrombin rất phức tạp, rồi sau đó sẽ hình thành các
thrombin, thrombin sẽ tác dụng với các fibrinogen để tạo thành fibrin.
Trong quá trình đông máu, ion Ca 2+ có ảnh hưởng lớn đến quá trình hình thành
tiền thrombin và thrombin. Do đó, khi cơ thể thiếu Ca 2+ rất nguy hiểm bởi nó dẫn đến
sự rối loạn trong hệ cân bằng, kéo theo nhiều nguy cơ mắc bệnh về máu và tim mạch.
 Quá trình hòa tan máu đông
Trong huyết tương có một euglobulin gọi là plasminogen hoặc fibrinnolysin, khi
được hoạt hóa sẽ chuyển thành plasmin. Plasmin là một enzym phân hủy protein,
chúng có tác dụng làm tan các sợi fibrin và làm tan các chất khác trong máu ở xung
quanh như fibrinogen, prothrombin. Do đó, khi plasmin được hình thành bên trong cục
máu đông, nó có thể làm tan cục máu đông, đồng thời làm giảm khả năng đông máu.
Vì vậy, quá trình này cho phép làm sạch những cục máu đông hình thành ở các mô
trong ngày. Tuy nhiên, cũng làm cho các vết thương của mạch máu đã được bịt bằng
máu đông lại mở miệng [1].
Trong cơ thể người có hơn 20 loại enzym gây đông máu, nhưng chỉ có một loại
duy nhất có khả năng phá vỡ các cục máu đông này là plasmin. Ngoài ra, với sự có
mặt của vi khuẩn, virus, nấm mốc và các độc tố trong máu cũng tạo ra những liên kết
chồng chéo fibrin, gây ra sự quá tải cho hệ thống plasmin. Khi không có những hiện
Phạm Thị Quỳnh

13
13

Luận văn thạc sĩ
tượng mất máu hoặc là vết thương hở, các sợi fibrin liên kết chéo này sẽ luân chuyển
trong máu và dính vào thành mạch máu. Điều này góp phần tạo nên các cục máu đông,
làm giảm sự vận chuyển lưu thông máu, đồng thời làm tăng độ nhớt của máu, gây ra
huyết áp cao. Các cục máu đông trong tim người làm cản trở sự vận chuyển máu tới
các mô cơ tim, nếu dòng máu bị chặn lại, khả năng cung cấp oxy tới các mô này sẽ
giảm một cách cục bộ gây ra hiện tượng thiếu máu cục bộ, dẫn tới các cơn đau thắt tim
hoặc nhồi máu cơ tim. Nếu hiện tượng này kéo dài có thể dẫn tới tử vong [1].
Như vậy, quá trình chuyển đổi fibrin trong cơ thể người thành các sản phẩm phân
hủy fibrin phụ thuộc rất nhiều vào khả năng tạo ra các chất kích thích như t-PA và uPA trong gan. Do những chất này làm nhân tố chính kích thích sự tạo nên enzym
plasmin. Tuy nhiên, sự có mặt của plasmin chưa đảm bảo cho việc phân giải fibrin
cũng như các cục máu đông đạt hiệu quả bởi có rất nhiều các chất kìm hãm, chất ức
chế xung quanh nó. Đặc biệt, đối với những người nhiều tuổi, khi các chất kích thích
cho quá trình chuyển hóa tạo plasmin thì ít mà các chất ức chế hoạt động của plasmin
thì nhiều, điều này cũng giải thích vì sao bệnh tim mạch thường gặp ở người lớn tuổi
[1].
1.1.2.4. Cơ chế tác dụng của nattokinase
Nattokinase có tác dụng làm tan fibrin theo 3 con đường:
 Theo con đường 1, NK trực tiếp thủy phân fibrin tạo ra các sản phẩm
thủy phân có thể hòa tan trong máu.
 Ở con đường 2, nó kích thích quá trình tạo enzym urokinase từ tiền tố
pro-urokinase, từ đó hình thành các phân tử plasminogen và hình thành
nên plasmin.
 Đối với con đường 3, NK có tác dụng kích thích các tiền tố t - PA là tác
nhân hoạt hóa plasmin.

Phạm Thị Quỳnh

14
14


Luận văn thạc sĩ

Hình 1.3. Cơ chế tác dụng của nattokinase [25]
1.2. Vi sinh vật tổng hợp nattokinase
Vi sinh vật là những tác nhân quan trọng trong việc hình thành các enzym làm
tan cục máu đông. Streptokinase từ Streptocuoccus hemolyticus và staphylokinase từ
Streptococcus aureus đã được phát hiện từ sớm trong việc điều trị các chứng bệnh về
huyết khối [13]. Trong nhiều năm qua, các loại enzym thủy phân fibrin cho hiệu quả
cao hơn từ nhiều loại vi sinh vật khác nhau đã tiếp tục được phát hiện như nattokinase
từ Bacillus natto và subtilisin DJ-4 từ Bacillus amyloliquefaciens [17, 29].
Bacillus là loài được tìm thấy trong nhiều loại thức ăn lên men từ đậu tương và
có khả năng sinh NK. Chúng có hình que, đứng đơn lẻ, ít khi xếp chuỗi, kích thước:
chiều rộng 0,7 ÷ 0,8 µm, chiều dài 2 ÷ 3 µm, là vi khuẩn gram dương, catalase dương
tính, nhóm vi khuẩn này thường được tìm thấy trong môi trường có độ pH biến động
cao, sinh trưởng dưới điều kiện hiếu khí hoặc kị khí không bắt buộc. Chúng có khả
năng tạo bào tử khi gặp điều kiện khắc nghiệt như thiếu chất dinh dưỡng, nhiệt độ cao,
… Bào tử hình oval có khuynh hướng phình ra ở một đầu. Thường thì người ta quan
sát thấy quần thể của giống sinh vật này rất rộng lớn, có hình dạng bất định và đang
phát triển lan rộng [7].

Phạm Thị Quỳnh

15
15

Luận văn thạc sĩ
1.3. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men chìm sinh tổng hợp
nattokinase
1.3.1. Ảnh hưởng của nguồn cacbon
Trong nghiên cứu của Liu và cộng sự (2005), khi tối ưu hóa điều kiện dinh
dưỡng để sinh tổng hợp NK bởi Bacillus natto NLSSE, đã sử dụng 5 nguồn cacbon là:
glucose, saccarose, maltose, xylose, glycerol với hàm lượng 20 g/l [22]. Kết quả được
thể hiện ở hình 1.4.

Hình 1.4. Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến khả năng tổng hợp nattokinase [22]
Hình 1.4.1a cho ta thấy, B. subtilis NLSSE sinh tổng hợp NK có hoạt lực cao
trên môi trường sử dụng nguồn cacbon là maltose, saccarose và glucose. Xylose và
glycerol không thích hợp và hầu như không có hoạt tính.
Một nghiên cứu khác về tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy nhằm tăng hoạt lực NK
sinh tổng hợp bởi Bacillus natto được tiến hành bởi tác giả Wang và cộng sự (2009)
khi sử dụng 6 nguồn cacbon khác nhau là: crystal sugar, maltose, saccarose, glycerol,
bột đậu tương và glucose với hàm lượng 20g/l. Kết quả được thể hiện ở hình 1.5 [36].

Phạm Thị Quỳnh

16
16


Luận văn thạc sĩ

Hình 1.5. Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến khả năng tổng hợp nattokinase [36]
Hình 1.5 cho ta biết maltose là nguồn cacbon thích hợp nhất để Bacillus natto
sinh tổng hợp NK, tiếp đến là glucose, glycerol, saccarose, crytal sugar và bột đậu
tương.

Qua những nghiên cứu điển hình trên, ta nhận thấy rằng nguồn cacbon tốt nhất để
vi khuẩn Bacillus sử dụng là maltose, sau đó đến glucose. Trong điều kiện phòng thí
nghiệm, đã lựa chọn nguồn cacbon bổ sung là glucose để tiến hành các nghiên cứu.
1.3.2. Ảnh hưởng của nguồn nitơ
Khảo sát sự ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh tổng hợp NK của B.
natto NLSSE, Liu và cộng sự (2005) sử dụng môi trường có glucose 10 g/l, bổ sung
K2HPO4.3H2O 1,0 g/l và MgSO4.7H2O 0,5 g/l, với nguồn nitơ dùng để khảo sát là:
(NH4)2SO4 3,5 g/l, NaNO3 10 g/l, sodium glutamate 21 g/l, casein 10 g/l, bột đậu tương
20 g/l, peptone đậu tương10 g/l. Kết quả được thể hiện ở hình 1.6.

Phạm Thị Quỳnh

17
17


Luận văn thạc sĩ

Hình 1.6. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng tổng hợp nattokinase [22]
Hình 1.6 cho thấy, nguồn nitơ thích hợp để B. natto NLSSE sinh tổng hợp NK là
pepton đậu tương cho hoạt lực enzym 208,3U/ml, sau đó đến casein, sodium
glutamate, bột đậu tương. Khi sử dụng nguồn nitơ vô cơ, hoạt lực enzym thu được rất
thấp so với nguồn nitơ hữu cơ [22].
Khi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của các nguồn nitơ đến khả năng sinh tổng
hợp NK của Bacillus lichniformis B4, AI-Juamily và cộng sự (2012) cũng đã chỉ ra kết
quả tương tự như trên hình 1.7.

Hình 1.7. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng tổng hợp nattokinase [7]
Hình 1.7 cho thấy, pepton đậu tương, pepton và casein là 3 nguồn nitơ ảnh hưởng
nhiều nhất đến khả năng tổng hợp NK của Bacillus lichniformis B4 với hoạt lực

Phạm Thị Quỳnh

18
18


Luận văn thạc sĩ
enzym sau lên men khoảng 50 U/ml, tiếp đến là các muối vô cơ có chứa nitơ: NH 4Cl,
NH3PO4, KNO3.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng nguồn nitơ là pepton để khảo sát ảnh
hưởng của hàm lượng nitơ bổ sung vào môi trường lên men đến khả năng tổng hợp
NK của B. subtilis.
1.3.3. Ảnh hưởng của tỷ lệ giống
Theo nghiên cứu của AI-Juamily và cộng sự (2012) tỉ lệ giống ảnh hưởng đến
khả năng sinh enzym của Bacillus lichniformis B4 trong điều kiện lên men lỏng sử
dụng môi trường có thành phần: nitơ và cacbon là 10 g/l, bổ sung thêm K 2HPO4.3H2O
1 g/l, MgSO4.7H2O 0,5 g/l, lên men 24h, 370C, nuôi lắc 180rpm. Kết quả được thể hiện
ở hình 1.8.

Hình 1.8. Ảnh hưởng của tỉ lệ giống đến hoạt lực enzym [7]
Hình 1.8 cho thấy ở mật độ tế bào là 10 5 CFU/ml thì hoạt lực NK thu được cao
nhất đạt 19,185 U/ml [7].
1.3.4. Ảnh hưởng của pH ban đầu
Bacillus sinh trưởng thích hợp trong khoảng trung tính (pH = 7).
Điểm đẳng điện của enzym NK là 8,6 và enzym này bền ở pH 7÷8 [23].
Tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng pH ban đầu đến quá trình lên men lỏng với
chủng Bacillus lichniformis B4 tác giả AI-Juamily và cộng sự (2012) đã đưa ra kết quả
hình 1.9.

Phạm Thị Quỳnh

19
19


Luận văn thạc sĩ

Hình 1.9. Ảnh hưởng của pH đến khả năng tổng hợp nattokinase [7]
Hình 1.9 đã chỉ ra rằng, pH thích hợp nhất để vi khuẩn Bacillus lichniformis B4
tổng hợp NK cho hoạt lực cao là pH = 7,2 [7].
1.3.5. Ảnh hưởng của thời gian lên men
Al-Juamily và cộng sự (2012) cũng đã tiến hành khảo sát ảnh hưởng của thời
gian lên men đến hoạt lực NK. Kết quả được thể hiện ở hình 1.10.

Hình 1.10. Ảnh hưởng của thời gian lên men đến hoạt lực nattokinase [7]
Hình 1.10 cho thấy, hoạt lực NK sau lên men đạt 10,819 U/ml sau ngày thứ nhất
và cao nhất tại tời điểm 2 ngày là 15,766 U/ml, rồi giảm dần ở các ngày tiếp theo [7].
1.4. Khô đậu tương
Khô đậu tương, phụ phẩm của quá trình ép dầu từ đậu tương. Hầu hết khô đậu
tương được sản xuất trong nước cũng như nhập khẩu đều được sử dụng trong ngành
công nghiệp thức ăn chăn nuôi và thủy sản. Năm 2013, lượng tiêu thụ khô đậu tương
được ước tính là 3,8 triệu tấn, tăng 7% so với vụ trước [42].
Phạm Thị Quỳnh

20
20


Luận văn thạc sĩ

Hình 1.1. Số lượng tiêu thụ khô đậu tương của Việt Nam [42]
Dù đã bắt đầu sản xuất khô đậu tương trên quy mô công nghiệp từ năm 2011,
nhưng lượng khô đậu tương sử dụng ở nước ta vẫn phải nhập khẩu. Ba triệu tấn khô
đậu tương đã được nhập khẩu trong năm 2012-2013, tăng 13% so với cùng kì năm
trước. Theo ước tính thì lượng khô đậu tương tiêu thụ ở nước ta vẫn tiếp tục tăng trong
những năm tiếp theo [42].
Hiện nay khô đậu tương được sản xuất bằng 2 phương pháp. Phương pháp thứ
nhất chiết rút chất béo bằng dung môi hexane. Hạt đậu tương thường được bỏ vỏ, hấp
chín bằng hơi nước nóng rồi cán thành các mảnh dẹt, sau đó ngâm trong dung môi
hexane để chiết rút dầu đậu tương. Sau đó bã đậu tương được ép và xử lý nhiệt để loại
bỏ hexane và goi là khô đậu tương. Phương pháp này được coi là phương pháp hiện
đại và được sử dụng rộng rãi ở các nước tiên tiến. Khô đậu tương sản xuất theo
phương pháp này có hàm lượng protein rất cao (46-48%) và hàm lượng chất béo còn
lại rất thấp (1%). Phương pháp thứ 2 là ép dầu bằng phương pháp cơ học. Đậu tương
được hấp chín, nghiền nhỏ và ép dầu bằng thiết bị cơ học. Nhưng phương pháp ép dầu
bằng cơ học tỷ lệ dầu thu được thường không cao, lượng chất béo còn lại trong khô
dầu tới 7-10%. Từ năm 2011, hai nhà máy nghiền công nghiệp bắt đầu hoạt động đã
làm thay đổi mạnh mẽ ngành hạt có dầu và chăn nuôi gia súc tại Việt Nam. Sản lượng
khô đậu tương trong nước tiếp tục thay thế một lượng đáng kể khô đậu tương nhập
khẩu, ước tính đạt 732 nghìn tấn năm 2013, giảm 6% so với năm 2012 [42].
Thành phần hóa học của khô đậu tương được chỉ ra ở bảng 1.1 cho thấy hàm
lượng protein của khô đậu tương khá cao, trong khi hàm lượng chất béo khá thấp, bên
Phạm Thị Quỳnh

21
21


Luận văn thạc sĩ
cạnh đó giá thành chỉ bằng 1/3 -1/2 lần so với giá thành của đậu tương. Chính vì vậy

khô đậu tương có thể thay thế cho đậu tương trong một số ứng dụng trong công
nghiệp, đặc biệt thay thế đậu tương sử dụng làm môi trường lên men cho vi sinh vật.

Bảng 1.1. Thành phần hoá học của khô đậu tương [40]
Thành phần hóa học

% khối lượng

Protein

43,5 - 48,1

Chất béo

1,24 - 1,70

Chất xơ

2,88 - 5,89

Độ ẩm

12

1.5. Các phương pháp lên men sinh tổng hợp nattokinase
Để thu nhận được nattokinase, người ta thường sử dụng hai phương pháp lên
men chính là lên men bề mặt và lên men chìm, mỗi phương pháp có những ưu, nhược
điểm khác nhau.
1.5.1. Phương pháp lên men bề mặt
Samruan và công sự (2012) lên men rắn đậu tương. Đậu tương được rửa sạch và

làm ẩm bằng cách ngâm trong nước 250C trong 12h. Sau đó, đậu tương được vớt ra, để
ráo nước và được chia nhỏ vào các túi, mỗi túi chứa 500g đậu, thanh trùng ở 121 0C
trong 15 phút. Sau khi được làm nguội, mỗi túi được bổ sung 1ml canh trường có chứa
bào tử B. subtilis SB-MYP-1 và lên men ở 370C trong 72h. Đậu tương sau lên men
được sấy đông khô, đóng gói bằng cách hút chân không và bảo quản ở 4 0C, phương
pháp lên men này hướng tới sản phẩm có thể dùng trực tiếp như một loại thực phẩm
[31].
Chang và cộng sự (2012) khi tiến hành lên men rắn để thu nhận enzym chế
phẩm, đậu tương được làm ẩm đến 60 ÷ 70%, thanh trùng ở 121 0C trong 15 phút.
Được làm nguội sau đó được trải ra các khay với độ dày lớp đậu khoảng 2 ÷ 3 cm và
cấy giống với tỉ lệ 1:10 (v/wt), lên men 370C trong 24h [9].
 Ưu điểm
-

Đơn giản, dễ tiến hành

-

Dễ xử lý khi bị nhiễm cục bộ

Phạm Thị Quỳnh

22
22


Luận văn thạc sĩ
 Nhược điểm
-

Tốn nhân công

-

Tốn diện tích

-

Khó tự động hóa

-

Quy mô sản xuất nhỏ

1.5.2. Phương pháp lên men chìm
Saxena và cộng sự (2010) khi tiến hành lên men chìm thu nhận NK sử dụng môi
trường với thành phần (wt/v): glucose 10,0%, bột đậu tương 10,0%, K 2HPO4 5,0%,
MgSO4.7H2O 0,5%, NaCl 0,5% và CaCl2 0,5%. Lên men bởi chủng Bacillus sp. trong
24h ở 370C với tốc độ lắc 120rpm sau đó li tâm thu dịch và xác định hoạt lực được 330
U/ml [32].
Zhou và cộng sự (2008) lên men chìm nhằm lựa chọn điều kiện thích hợp thu
nhận NK sử dụng môi trường với thành phần (wt/v): bột đậu tương 6%, dextrose 2%,
CaCl2 0,06%, MgSO4 0,07%. Lên men trong 48h ở 380C cho hoạt lực NK đạt 306,46
IU/ml [38].
Hiện nay có rất nhiều nghiên cứu nhằm tối ưu hóa thành phần môi trường lên
men lỏng để thu được enzym có hoạt lực cao nhất như Kwon và cộng sự (2011) [19],
Li và cộng sự (2011) [21] và còn nhiều nghiên cứu khác [17, 22, 29].
 Ưu điểm
-

Dễ tự động hóa và sản xuất ở quy mô công nghiệp

-

Tốn ít diện tích xây dựng và lắp đặt dây chuyền

 Nhược điểm
-

Chi phí ban đầu cao

-

Dễ nhiễm trùng toàn bộ

-

Đòi hỏi công nhân phải có trình độ cao

1.6. Kỹ thuật lên men có bổ sung cơ chất (fed-batch) trong sinh tổng hợp
nattokinase
Bên cạnh những phương pháp tối ưu điều kiện môi trường theo quy hoạch thực
nghiệm, một số nghiên cứu đã đi theo hướng lựa chọn kỹ thuật lên men. Lên men theo
mẻ có bổ sung cơ chất (fed-batch) là phương thức lên men trung gian giữa lên men
theo mẻ và lên men liên tục. Trong quá trình lên men cơ chất được bổ sung liên tục vào
Phạm Thị Quỳnh

23
23

Luận văn thạc sĩ
trong thiết bị lên men, nhưng sản phẩm đưa ra ngoài gián đoạn . Lên men fed-batch
được bắt đầu tương tự lên men theo mẻ, đến một thời điểm nhất định cơ chất được bổ
sung vào môi trường bắt đầu quá trình fed-batch (hình 1.11). Tùy theo cách thức bổ
sung cơ chất vào môi trường mà lên men fed-batch được chia thành một số loại sau:
-

Substrate stat: cơ chất được cấp vào môi trường với tốc độ hoặc hàm lượng
ổn định trong một khoảng thời gian

-

pH stat: sử dụng tín hiệu pH để cấp cơ chất vào môi trường sao cho pH luôn
ổn định

Dựa vào tín hiệu pH để cấp cơ chất vì trong môi trường có đường, chủng vi khuẩn
sử dụng đường chuyển thành axit hữu cơ tích lũy trong cơ thể. Khi môi trường hết
đường thì chủng sử dụng axit hữu cơ này đồng thời sử dụng các protein trong môi
trường tạo ra NH3 làm cho pH tăng. Vì vậy tín hiệu pH cho thấy khi nào trong môi
trường hết đường thì bổ sung vào.
-

DOT stat: sử dụng hàm lượng oxi hòa tan trong dịch lên men làm tín hiệu để
bổ sung cơ chất vào môi trường

Hình 1.11. Động học của quá trình lên men fed-batch
Ưu điểm của phương pháp lên men này là thích hợp với các quá trình lên men sử
dụng mật độ tế bào cao, cơ chất được bổ sung dần dần trong quá trình lên men nên
không ức chế vi sinh vật, trong quá trình lên men có thể điều khiển tốc độ phát triển

của vi sinh vật, do đó lên men fed-batch thường cho hiệu suất tạo sản phẩm cao hơn so
với lên men gián đoạn.

Phạm Thị Quỳnh

24
24


Luận văn thạc sĩ
Trong các nghiên cứu đã được công bố về sản xuất nattokinase, các tác giả tập
trung nhiều trong các nghiên cứu tối ưu hóa thành phần lên men sử dụng kỹ thuật lên
men trong bình tam giác hoặc lên men theo mẻ trong các thiết bị lên men. Các công
trình nghiên cứu về kỹ thuật lên men fed-batch nhằm tăng cường khả năng sinh tổng
hợp nattokinase không nhiều.
Cho và cộng sự, 2010 đã sử dụng phương pháp pH stat để lên men fed-batch,
chủng B. subtillus trong quá trình lên men có mật độ tế bào tăng 2,5 lần so với lên men
theo mẻ và hoạt lực nattokinase thu được cũng tăng 2,1 [12].
Kwon và cộng sự, 2011 sử dụng cùng phương pháp pH stat fed-batch, glucose và
pepton được đồng thời đưa vào môi trường lên men với tỉ lệ thay đổi từ 0,2 đến 5 g
glucose /g pepton. Tác giả đã nhận thấy ở tỉ lệ 0,33 giữa glucose và pepton được cung
cấp vào môi trường lên men theo tín hiệu pH hoạt lực nattokinase tăng 4,3 lần so với
quá trình lên men theo mẻ [19]. Theo Unrean và cộng sự (2012), khi lên men fed-batch
đối với chủng B. subtilis K-C3 hoạt lực nattokinase tăng 20 lần so với lên men theo mẻ
[39].
1.7. Tình hình nghiên cứu và sản xuất nattokinase ở trong nước
Nguyễn La Anh và Đặng Thu Hương (2006) đã tách chiết enzym nattokinase từ
B. subtilis NT5, trọng lượng phân tử khoảng 27kDa, pI 7,04, nhiệt độ tối ưu 60 0C và
pH tối ưu 7,5; các điều kiện ổn định enzym là Ca 2+ và Mg2+ với nồng độ 5-10mM, pH
7-7,8; fibrinase đã được áp dụng làm thực phẩm chức năng làm tan tơ huyết bệnh lý

thử nghiệm trên 24 đối tượng và cho kết quả khả quan [1].
Nguyễn Lan Hương và cộng sự (2011) cũng đã lựa chọn được chủng B. subtilis
M1 và D sinh tổng hợp natokinase cao từ các sản phẩm lên men truyền thống từ đậu
tương [2], tìm ra môi trường tối ưu cho phương pháp lên men chìm thu nhận
nattokinase. Môi trường lên men có hàm lượng bột đậu tương 4%, 0,5% pepton,
0,01% CaCl2 bổ sung giống 4% trong điều kiện không điều chỉnh pH, lên men trong
22h ở 37oC, lắc 170 vòng/phút thì cho hoạt lực enzym sau lên men cao nhất là 242
FU/ml [3]. Với mong muốn nâng cao hoạt lực sinh tổng hợp nattokinase nhóm nghiên
cứu đã sử dụng phương pháp lên men fed-batch. Kết quả cho thấy hoạt lực nattokinase
trong canh trường fed-batch gấp 7 lần so với hoạt lực trong canh trường lên men theo
mẻ [4].
Phạm Thị Quỳnh

25
25