KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÂY CÀNH GIAO EUPHORBIA TIRUCALLI L. THU HÁI Ở TỈNH BÌNH THUẬN

Header Page 1 of 161.
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA HÓA HỌC
BỘ MÔN HÓA HỌC HỮU CƠ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC
CÂY CÀNH GIAO EUPHORBIA TIRUCALLI L.
THU HÁI Ở TỈNH BÌNH THUẬN

GVHD : TS. Bùi Xuân Hào
ThS. Dương Thúc Huy
SVTH : Lê Thị Kim Dung

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2016

Footer Page 1 of 161.


Header Page 2 of 161.
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA HÓA HỌC
BỘ MÔN HÓA HỌC HỮU CƠ
---

---

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC

CÂY CÀNH GIAO EUPHORBIA TIRUCALLI L.
THU HÁI Ở TỈNH BÌNH THUẬN

GVHD : TS. Bùi Xuân Hào
ThS. Dương Thúc Huy
SVTH : Lê Thị Kim Dung
MSSV : K38.201.015

Tp. Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2015

Footer Page 2 of 161.


Header Page 3 of 161.
NHẬN XÉT CỦA HỘI ĐỒNG
.................................................................................................................................................................
.................................................................................................................................................................
.................................................................................................................................................................
.................................................................................................................................................................
.................................................................................................................................................................
.................................................................................................................................................................
.................................................................................................................................................................
.................................................................................................................................................................
.................................................................................................................................................................
.................................................................................................................................................................
.................................................................................................................................................................
.................................................................................................................................................................
.................................................................................................................................................................
.................................................................................................................................................................
.................................................................................................................................................................

.................................................................................................................................................................
.................................................................................................................................................................
.................................................................................................................................................................
.................................................................................................................................................................
.................................................................................................................................................................
.................................................................................................................................................................
.................................................................................................................................................................
.................................................................................................................................................................
.................................................................................................................................................................

Footer Page 3 of 161.


Header Page 4 of 161.
LỜI CẢM ƠN

Bằng tất cả sự trân trọng và biết ơn sâu sắc, em xin chân thành gửi lời cảm ơn
Thầy Bùi Xuân Hào và thầy Dương Thúc Huy đã theo sát, nhiệt tình giảng dạy,
hướng dẫn, quan tâm, giúp đỡ và động viên em trong quá trình làm khóa luận tốt nghiệp.
Tất cả quý thầy cô Khoa Hóa, đặc biệt quý thầy cô Bộ môn Hóa hữu cơ đã tận tình
dạy dỗ, truyền thụ cho em nhiều kiến thức khoa học quý báu trong suốt bốn năm qua.
Các bạn trong phòng thí nghiệm đã giúp đỡ, chia sẻ những vui buồn trong quá trình
làm khóa luận.
Ba, Mẹ và những người thân trong gia đình là chỗ dựa tinh thần vững chắc nhất giúp
em vượt qua mọi khó khăn, tạo mọi điều kiện tốt nhất để em hoàn thành tốt khóa luận này.

Footer Page 4 of 161.

-i-

Header Page 5 of 161.
MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................................ i
MỤC LỤC ............................................................................................................................. ii
DANH MỤC CÁC CHỮ KÍ HIỆU VÀ VIẾT TẮT ......................................................... iv
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, SƠ ĐỒ, BẢNG BIỂU.................................................... v
DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC ............................................................................................ vi
LỜI MỞ ĐẦU .................................................................................................................. - 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ........................................................................................... - 2 1.1

ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT CÂY CÀNH GIAO[1] ................................................... - 2 -

1.1.1.

Mô tả chung[1] ............................................................................................... - 2 -

1.1.2 Vùng phân bố ................................................................................................... - 2 1.2

CÁC NGHIÊN CỨU VỀ DƯỢC TÍNH ................................................................ - 3 -

1.2.1 Dược tính theo y học cổ truyền ........................................................................ - 3 1.2.2 Nghiên cứu về dược tính .................................................................................. - 4 1.2.3 Độc tính ............................................................................................................ - 4 1.2.4 Ứng dụng khác ................................................................................................. - 4 1.3

CÁC NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HOÁ HỌC ......................................... - 5 -

CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM .................................................................................... - 10 2.1.

HOÁ CHẤT, THIẾT BỊ ......................................................................................- 10 -

2.1.1.

Hoá chất ...................................................................................................... - 10 -

2.1.2.

Thiết bị ........................................................................................................ - 10 -

2.2.

NGUYÊN LIỆU ..................................................................................................- 10 -

2.2.1.

Thu hái nguyên liệu..................................................................................... - 10 -

2.2.2.

Xử lý mẫu nguyên liệu ................................................................................ - 11 -

2.3.

ĐIỀU CHẾ CÁC LOẠI CAO .............................................................................- 11 -

Footer Page 5 of 161.

-ii-


Header Page 6 of 161.
2.4

CÔ LẬP CÁC HỢP CHẤT HỮU CƠ TRONG CAO ETHYL ACETATE ........ - 11 -

2.4.1 Sắc kí cột silica gel trên cao ethyl acetate ...................................................... - 11 2.4.2 Sắc kí cột sillica gel trên phân đoạn HA.1.6 .................................................. - 12 2.4.3 Sắc kí cột sillica gel trên phân đoạn HA.1.6.12 ............................................. - 12 2.4.4 Sắc kí cột sillica gel trên phân đoạn HA.2.4 .................................................. - 12 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ - THẢO LUẬN .................................................................... - 14 3.1

KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT G.B1 ....................................................... - 14 -

3.2

KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT G.C2 ....................................................... - 17 -

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN – ĐỀ XUẤT ....................................................................... - 19 4.1.

KẾT LUẬN .........................................................................................................- 19 -

4.2

ĐỀ XUẤT ...........................................................................................................- 19 -

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................ - 20 PHỤ LỤC

Footer Page 6 of 161.

-iii-


Header Page 7 of 161.
DANH MỤC CÁC CHỮ KÍ HIỆU VÀ VIẾT TẮT

Ký hiệu,

Tiếng Anh

Tiếng Việt

chữ viết tắt
Proton (1) Nuclear Magnetic

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của

Resonance

proton (1)

Carbon (13) Nuclear Magnetic

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của

Resonance

carbon (13)

AcOH

Acetic acid

Axit axetic

C

Chloroform

Cloroform

Bu

Butanol

Butanol

d

Doublet

Mũi đôi

dd

Doublet of doublets

Mũi đôi đôi

ddd

Doublet of doublet of doublets

Mũi đôi đôi đôi

EA

Ethyl Acetate

Etyl axetat

Et

Ethanol

Etanol

H

n-Hexane

n-Hexan

HMBC

Heteronuclear Multiple Bond

Phổ tương tác dị hạt nhân qua

Coherence

nhiều liên kết

Me

Methanol

Metanol

ppm

Par per million

Một phần một triệu

s

Singlet

Mũi đơn

1

H-NMR

13

C-NMR

SKC

Sắc ký cột

SKLM

Sắc ký lớp mỏng

UV

Ultra Violet

Tia cực tím

W

Water

Nước

Footer Page 7 of 161.

-iv-


Header Page 8 of 161.
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, SƠ ĐỒ, BẢNG BIỂU
 HÌNH ẢNH
Hình 1.1.

Cây cành giao ......................................................................................... 2

Hình 1.2.

Các hợp chất cô lập được từ E.tirucalli ................................................. 7

Hình 3.1.

Cấu trúc vòng A của hợp chất G.B1 .................................................... 15

Hình 3.2.

Cấu dạng và tương quan HMBC của G.B1 .......................................... 15

Hình 3.3.

Công thức cấu tạo và tương quan HMBC của G.C2............................ 18

Hình 4.1.

Hai hợp chất cô lập được từ cao ethyl acetate ...................................... 19

 SƠ ĐỒ
Sơ đồ 2.1.

Quá trình ly trích và cô lập từ cây cành giao ....................................... 13

 BẢNG BIỂU
Bảng 1.1.

Hoạt tính trên nhựa cây và cao chiết của cây ......................................... 4

Bảng 1.2.

Đa dạng hóa học trên các bộ phận của cây ............................................ 6

Bảng 2.1.

Kết quả sắc ký cột cao ethyl acetate ..................................................... 11

Bảng 3.1.

Dữ liệu phổ của hợp chất G.B1 ............................................................ 16

Bảng 3.2.

Dữ liệu phổ của hợp chất G.C2............................................................ 18

Footer Page 8 of 161.

-v-


Header Page 9 of 161.
DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC
Phụ lục 1.

Phổ 1H-NMR của hợp chất G.B1

Phụ lục 2.

Phổ 13C-NMR của hợp chất G.B1

Phụ lục 3.

Phổ 13C-NMR giãn rộng của hợp chất G.B1

Phụ lục 4.

Phổ HMBC của hợp chất G.B1

Phụ lục 5.

Phổ 1H-NMR của hợp chất G.C2

Phụ lục 6.

Phổ 13C-NMR của hợp chất G.C2

Phụ lục 7.

Phổ HMBC của hợp chất G.C2

Footer Page 9 of 161.

-vi-


Header Page 10 of 161.
LỜI MỞ ĐẦU

Việt Nam là một nước nhiệt đới có nhiều điều kiện thuận lợi cho các loài thực vật có
giá trị phát triển. Từ xa xưa, con người đã biết sử dụng cây cỏ để làm thuốc chữa bệnh, từ
đó tìm ra được nhiều phương thuốc có thể chữa được một số bệnh nan y như ung thư, sốt
rét… Ngày nay, ngành hóa học các hợp chất tự nhiên kết hợp với ngành y dược học, sinh
học không ngừng nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các dược thảo
có trong các phương thuốc cổ truyền để ứng dụng vào việc chữa bệnh. Tuy nhiên nhiều cây
thuốc chỉ được sử dụng theo kinh nghiệm dân gian, chưa được nghiên cứu một cách có hệ

thống, trong đó có cây cành giao.
Cây cành giao mọc hoang tại nhiều vùng ở Việt Nam. Tuy nằm trong từ điển cây
thuốc Nam nhưng hiện nay chưa có nghiên cứu hóa sinh học về cây cành giao được thực
hiện. Những nghiên cứu đi trước về Euphorbia tirucalli L. cho thấy cây cành giao là loại
cây có nhiều tiềm năng.
Xuất phát từ những ứng dụng y học quý giá, chúng tôi tiến hành khảo sát thành phần
hóa học của cây cành giao với mong muốn tìm ra những hợp chất có hoạt tính sinh học góp
phần nâng cao giá trị của các dược thảo Việt Nam.

Footer Page 10 of 161.

-1-


HeaderKhóa
Pageluận
11tốt
ofnghiệp
161.

Lê Thị Kim Dung
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT CÂY CÀNH GIAO[1]
Tên thông thường: Cành giao
Tên gọi khác: lục ngọc thụ, xương khô, bút chì, thanh san hô, san hô xanh, nọc rắn.
Thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae).
Tên khoa học: Euphorbia tirucalli L.

Hình 1.1 Cây cành giao

1.1.1. Mô tả chung[1]
Cây cành giao có thể cao 4-7 m, thân có thể có đường kính bằng cổ tay, cành nhiều,
mọc so le hay hơi vòng, màu xanh, gầy.
Lá nhỏ, hình mác hẹp, hơi dày, rất chóng rụng, phiến lá dài 12-16 mm, rộng 2 mm.
Hoa tập trung ở những chỗ phân nhánh hoặc tận cùng ở đầu cành. Quả nang, hơi có
lông, có 3 mảnh vỏ. Hạt hình trái xoan, nhẵn.
1.1.2 Vùng phân bố
Cành giao có nguồn gốc ở đảo Mangat (châu Phi). Phát hiện thấy ở Việt Nam từ
năm 1970.[1]
Cây cành giao có mặt ở hầu hết các châu lục, đặc biệt các vùng có khí hậu nhiệt đới
hoặc khô như châu Phi, châu Á và Nam Mỹ. Cây cành giao được xác định bởi Linnaeus
vào năm 1973.[7]

Footer Page 11 of 161.

-2-


HeaderKhóa
Pageluận
12tốt
ofnghiệp
161.

Lê Thị Kim Dung

1.2 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ DƯỢC TÍNH
1.2.1 Dược tính theo y học cổ truyền
Toàn cây cành giao có vị cay, hơi chua, tính mát, hơi có độc, có tác dụng thúc sữa,
sát trùng, khử

phong, tiêu viêm, giải độc. Dân gian thường dùng cành giao để trị đau nhức, côn
trùng đốt, chấn thương…
Theo Schmelzer, Gurib-Fakim (2008) và Van Damme (1989) thì ở Đông Phi, mủ
của cành giao được sử dụng để chống liệt dương, mụn cóc, động kinh, đau răng, trĩ, rắn
cắn. Ở Malaysia, rễ hoặc thân cành giao được dùng để chữa trị loét mũi, trĩ và các chỗ
sưng. Các mảnh rễ trộn với dầu dừa chữa đau dạ dày. Ở Ấn Độ, Kumar (1999) ghi lại rằng
cành giao là loại cây không thể thiếu trong vườn nhà và được sử dụng như là một phương
thuốc cho các bệnh như: phì lá lách, hen suyễn, bệnh phù, bệnh phong, huyết trắng, khó
tiêu, vàng da, đau bụng, các khối u, sỏi bàng quang. Duke (1983) và Van Damme (1989)
đề cập rằng tại Brazil, cành giao được sử dụng chống lại bệnh ung thư, u dạng ung thư, ung
thư biểu mô, bướu thịt, các khối u và mụn cóc mặc dù vẫn còn tranh cãi về cơ sở khoa học
về hợp chất chống ung thư của cây. Ở Malabar (Ấn Độ) và Moluccas, mủ được sử dụng
như thuốc gây nôn và trị giang mai. Ở Indonesia, dịch của rễ được sử dụng trị đau nhức
xương trong khi thuốc đắp của rễ hoặc lá cây được sử dụng điều trị loét mũi, trĩ. Nước sắc
từ thân cây để chữa bệnh phong và tê liệt tay chân sau khi sinh con (Duke, 1983). Ở Java,
mủ được sử dụng để chữa trị các bệnh về da và gãy xương.[15]
Một số bài thuốc theo y học cổ truyền:
Chữa viêm xoang, viêm mũi dị ứng: dùng khoảng 15 đốt cành cây cành giao, cắt
nhỏ từng đoạn 5 mm, cho vào túi nilon đập nát rồi cho vào ấm có vòi với lượng nước vừa
đủ, đun sôi, dùng giấy cuộn thành ống lắp vào đầu vòi, cho vào mũi để hít hơi nước, hơi
thuốc vào mũi, thỉnh thoảng hít cả vào miệng. Thời gian xông 10-15 phút. Xông liên tục 35 ngày, bệnh nặng có thể xông 7-10 ngày. Cần chú ý không dùng cho phụ nữ có thai.[22]
Chữa côn trùng, ong đốt, rắn cắn, bò cạp đốt…: dùng cành cây cành giao giã nhỏ,
đắp lên vết thương.[22]
Chữa mụn cơm: dùng nhựa mủ cây cành giao đắp lên mụn cơm.[22]

Footer Page 12 of 161.

-3-

HeaderKhóa
Pageluận
13tốt
ofnghiệp
161.

Lê Thị Kim Dung

1.2.2 Nghiên cứu về dược tính
Cao chiết các bộ phận của cây được thử nghiệm các loại hoạt tính sinh học và dược
học, được mô tả trong bảng 1.1
Bảng 1.1 Hoạt tính trên nhựa cây và cao chiết của cây
Hoạt tính
Kháng virus

Nguồn
Nhựa cây

Kháng ung thư và điều trị AIDS
Kháng viêm
Miễn dịch

Cao chiết cây
Nhựa cây
Cao chiết cây

Kháng khuẩn
Kháng oxi hóa và chức năng bảo vệ gan
Chất diệt côn trùng và sinh vật gây hại:
Brevicoryne brassicae

Aedes aegypti và Culex quinquefasciatus
Biomphalaria gabrata
Lymneae natalensis

Cao chiết cây
Cao chiết cây
Nhựa cây

Tài liệu trích dẫn
Ramesh 2009[16]
Avelar 2011[2]
Betancur-Galvis 2002[3]
Dias 2006[4]
Santana 2014[17]
Valadares 2006[19]
Lirio 1998[11]
Jyothi 2008[9]
Mwine J., Van Damme
2011[15]

1.2.3 Độc tính
Các loài Euphorbia đều chứa nhựa nhưng nhựa cây cành giao được xem độc nhất.
Cây cành giao có nhiều diterpenoid loại phorbol gây độc tuy không gây chết người nhưng
làm tổn thương nặng da và mắt. Nhựa của cây cành giao có thể làm phồng da và xung
huyết da, gây nôn mửa với liều lớn nhưng nó lại là thuốc tẩy với liều nhỏ và chữa trị đau
răng, đau tai, thấp khớp, mụn cóc, ho, thần kinh và bọ cạp cắn.[5][6]
1.2.4 Ứng dụng khác
Nguồn năng lượng thay thế: Nhựa cây chứa hàm lượng lớn triterpenoid có 30
carbon có thể thực hiện cắt mạch để cho xăng có chỉ số octane cao.[15]
Nguồn cao su: Nhựa cây chứa nhiều terpene và resin có thể chuyển hóa thành cao su

với giá thành thấp. Trong suốt chiến tranh thế giới thứ II, nhựa cây được sử dụng ở Nam
Phi.[15]

Footer Page 13 of 161.

-4-


HeaderKhóa
Pageluận
14tốt
ofnghiệp
161.

Lê Thị Kim Dung

Nông lâm nghiệp: Với đặc tính chống hạn cây được sử dụng ở các vùng đất bán hạn
hán để bảo vệ đất.[15]
1.3 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HOÁ HỌC
Euphorbia tirucalli có chứa chất nhựa màu trắng như sữa trong toàn cây khi cắt
ngang. Nhựa cây có thể chiếm tới 28% trọng lượng khô, trong đó gồm 21-27% các hợp
chất tan trong nước, 59-63% resin và 12-14% các hợp chất như cao su.[15]
Cho đến nay, số lượng nghiên cứu về thành phần hóa học của Euphorbia tirucalli L.
tương đối ít và thành phần hóa học chính chủ yếu là các hợp chất phytosterol, tritepene,
diterpene, polyphenol…(Uchida Hidenobu Y.H. và cộng sự, 2009; Lin S.-J. và cộng sự,
2001; Yoshida T. và cộng sự, 1991).[11][18][21] Nhựa của Euphorbia tirucalli L. cũng được
nghiên cứu riêng cho thấy thành phần chính gồm các diterpene thuộc khung sườn ingenane
và tigliane (Fuerstenberger G. và cộng sự, 1985; Fuerstenberger G., 1977).[5][6]
Năm 1977, Fuerstenberger G. và Hecker E. cô lập được 4 hợp chất mới từ mủ của
cây Euphorbia tirucalli. Đó là các hợp chất 12,13,20-tri-O-acetylphorbol (1), phorbol (2),

3,5,20-tri-O-acetylingenol (3) và ingenol (4).[5]
Năm 2001, Lin S.-J. đã cô lập được 14 hợp chất, đó là 3,3',4-tri-O-methyl-4-Orutinosyl ellagic acid (22), gallic acid (23), 1-O-galloyl-β-D-glucoside (24), 1,2,3-tri-Ogalloyl-β-D-glucoside (25), corilagin (26), pedunculagin (27), casuariin (28), quercitrin
(29), putranjivain B (30), putranjivain A (31), 2,3-(S)-hexahydroxydiphenoyl-Dglucopyranoside (32) và 5-desgalloylstarchyurin (33).[10]

Footer Page 14 of 161.

-5-


HeaderKhóa
Pageluận
15tốt
ofnghiệp
161.

Lê Thị Kim Dung

Bảng 1.2 Đa dạng hóa học trên các bộ phận của cây [15]
Hợp chất hóa học
4-Deoxyphorbol di-ester (5)

Nguồn
(bộ phận)
Nhựa cây

Tài liệu trích dẫn
Kinghorn 1979

Campesterol (7), stigmasterol (8),
β-sitosterol (9), isofucosterol (10),

cycloartenol (11) (sterol)
Cycloeuphordenol (12) (triterpene)

Toàn cây

Uchida và cộng sự 2010

Nhựa cây

Khan 2010

Cyclotirucanenol (13) (triterpene)

Nhựa cây

Khan và Ahmed 1988

Diterpene ester

Nhựa cây

Khan và Malik 1990

Euphol (14) và β-amyrin (15)
(triterpenoid)

Toàn cây

Uchida và cộng sự 2010

Euphorbin A (polyphenol)

Thân cây

Yoshida và Yokoyama 1991

Euphorcinol (16) (pentacyclic triterpene)

Vỏ thân cây Khan 1989

Euphorbol (17)

Nhựa cây

Furstenberger và Hecker 1977

Serine protease

Nhựa cây

Lynn và Clevett 1985

Steroid

Nhựa cây

Nielson và cộng sự 1979

Taraxerane triterpene (18)

Vỏ thân cây Rasool 1989

Tirucalicine (6) (diterpene)

Nhựa cây

Khan 2010

Tirucallin A (19) (tannin)

Thân cây

Yoshida và Yokoyama 1991

Tirucallin B (20) và euphorbin F (21)
(dimer)

Thân cây

Yoshida và Yokoyama 1991

Trimethylellagic acid

Nhựa cây

Chatterjee và cộng sự 1977

Footer Page 15 of 161.

-6-

HeaderKhóa
Pageluận
16tốt
ofnghiệp
161.

Lê Thị Kim Dung

HO
H

OAc

HO
H
HH

O

H

OH

OAc

OH

O

HH

O
HO

HO

HO HO
HO

CH2OH
Phorbol (2)

OAc
12,13,20-tri-O-acetylphorbol (1)

3,5,20-tri-O-acetylingenol (3)
O

HO
H

H
H

OH

AcO
O

HH

O

Ingenol (4)

OAc

MeO

CH2OH
4-Deoxyphorbol (5)

CH2OAc

OAc

H

H
AcO HO
AcO

CH2OH

OH

H
O

H
H

Tirucalicine (6)

H
H

H

H

H

H
H
H

H
H

H
H

HO

HO

HO

b -Sitosterol (9)

Stigmasterol (8)

Campesterol (7)

H

H
H
H

H
H

H
H
H

HO

HO

HO
�Isof ucosterol (10)

Cycloeuphordenol (12)

Cycloartenol (11)

H

H

H
H

H
H
HO

Cyclotirucanenol (13)

HO

HO

H

H
b -Amyrin (15)

Euphol (14)

Hình 1.2 Các hợp chất cô lập từ E. tirucalli

Footer Page 16 of 161.

-7-

HeaderKhóa
Pageluận
17tốt
ofnghiệp
161.

Lê Thị Kim Dung
H

H

H

H

HO

OH
Euphorcinol (16)
OH HO

HO

H
Taraxerane (18)

H
Euphorbol (17)

OH

OH

OH
OH

HO

O

OH
O OO
O O
O

O

O

OH

O

O

O

HO

OH

HO

OH

O

O O

OH
OH

OH

O

OH

O O
O
O
O

O

O
OH

OH

O

OH

OH

H O
O

OH
OH
OH

HO

OH OH
Tirucallin A (19)

HO

O
O

OH

O

O

H

HO

OH

HO
OH HO

OH

O

OHHO

HO

O

O

O

OH

O

HO

H

H

H

H

HO

HO
OH
OH
Tirucallin B (20)

O
O

HO

O

O

HO

O

O

O

O

O

OH

O

OH
OHHO

O

HO
OH
HO

OH

OH
HO
OH
HO

HO

O

O
OH

HO HO

H

OH

OH
b

O

O
O

O
CO

CO

OH

O

HO
Euphorbin F (21)

MeO

OH
O

CO

OH

H

O

MeO

O

OH

OO
O

OH

O

OH
OH

O
OH
HO

OH

OH
3,3',4-tri-O-methyl-4'-O-rutinosyl ellagic acid (22)

Hình 1.2 Các hợp chất cô lập từ E. tirucalli (tiếp)

Footer Page 17 of 161.

OMe O

OH

O

OH
OH
O a

O

OH

O
CO

HO

O

-8-

HeaderKhóa
Pageluận
18tốt
ofnghiệp
161.
COOH

HO

Lê Thị Kim Dung
HO

HO
HO
O
OH

OH
OH

O
OH

O

HO
O galloyl
O

O
a
o
g ll yl
galloyl

O galloyl

1-O-galloyl-β - D-glucoside (24)

Gallic acid (23)

OH

O

O

OH

galloyl =

OH

1,2,3-tri-O-galloyl-β - D-glucoside (25)

HO

OH

OH HO

OH

HO
HO

OH

CO

HO

OCH2

HO

COO

O
CO

HO

O

OH
OH
Casuariin (28)

OH

HO
O

O

OH
HO

O

OH

OH
CO
O CH2

O

H
HO
H
OH
O

OH
O

OH

OO

HO

OH

HO

OH

OH H

HO
O

O

HO

O

O

O

H

O

O

HO

HO

O
CO O

CO
OOC

OH
CO

OH
O

O HO

Putranjivain B (30)

OH

Putranjivain A (31)

OH

CH2OH
O

O

HO

OH

HO

OH
HO

OH
HO

OH

OH

O
C

HO
HO

C
O

HO

2,3-(S )-hexahydroxydiphenoyl-D-glucopyranoside (32)

OH

H

-9-

OH

H
C
O

O

H
O
H
O
H
OH
O CH2
5-desgalloylstarchyurin (33)

Hình 1.2 Các hợp chất cô lập từ E. tirucalli (tiếp)

Footer Page 18 of 161.

OH

O C

OH O
CO

OH

OH

OH

O

HO

HO

OH

HO

Quercitrin (29)

OC

OH

HO

O

HO
HO

O
OH

HO O

O

HO

OH

O
HO

OH
OH

O O

OH

HO
OH

OH

O

HO
OH
OH HO
Pedunculagin (27)

HO HO

OH
O

O

H

CO

HO

O
O

H
H

O

HO
OH

HO
O

OH


HeaderKhóa
Pageluận
19tốt
ofnghiệp
161.

Lê Thị Kim Dung
CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM

2.1.

HOÁ CHẤT, THIẾT BỊ

2.1.1. Hoá chất
 Silica gel 0.04-0.06 mm, Himedia dùng cho cột sắc kí.
 Sắc kí bảng mỏng loại Kieselgel 60F

254

(20×20), Merck.

 Dung môi dùng cho quá trình thí nghiệm gồm: n-hexane, ethyl acetate, acetic
acid, chloroform, acetone, methanol, ethanol, butanol và nước cất.

 Thuốc thử hiện hình các vết chất hữu cơ trên bản mỏng: sử dụng
vanillin/H 2 SO 4 .
2.1.2. Thiết bị
 Các thiết bị dùng để giải ly, dụng cụ chứa mẫu.
 Các cột sắc kí.
 Máy cô quay chân không.
 Bếp cách thuỷ.
 Đèn soi UV bước sóng 254 nm và 365 nm.
 Cân điện tử.
 Các thiết bị ghi phổ 1H-NMR (500 MHz), 13C-NMR (125 MHz) và HMBC
trên máy Bruker, tại phòng Phân tích Trung tâm trường Đại học Khoa học Tự nhiên
thành phố Hồ Chí Minh, số 227, Nguyễn Văn Cừ, Quận 5, thành phố Hồ Chí Minh.
2.2. NGUYÊN LIỆU
2.2.1. Thu hái nguyên liệu
Mẫu được dùng trong nghiên cứu khoá luận là thân cây cành giao Euphorbia
tirucalli L. được thu hái tại huyện Hàm Thuận Bắc, tỉnh Bình Thuận vào tháng 3 năm
2015.

Footer Page 19 of 161.

- 10 -


HeaderKhóa
Pageluận
20tốt
ofnghiệp
161.

Lê Thị Kim Dung

2.2.2. Xử lý mẫu nguyên liệu
Mẫu nguyên liệu được rửa sạch, loại bỏ phần sâu bệnh, phơi khô rồi xay thành bột
mịn. Sau đó tiến hành đun hoàn lưu với ethanol và phân lập các hợp chất.
2.3.

ĐIỀU CHẾ CÁC LOẠI CAO

Bột cây 3.5 kg được trích kiệt với ethanol mỗi lần 10 lít và lặp lại hai lần theo
phương pháp đun hoàn lưu trong vòng 7 giờ, lọc, cô quay thu hồi dung môi. Trong quá
trình cô quay thu hồi dung môi, thấy kết tủa xuất hiện, lọc riêng phần tủa ethanol thô
(250.4 g) và phần dịch ethanol thô Et1 (290.3 g). Tiếp tục hòa phần tủa ethanol thô với
ethanol đun nóng, thu được phần dịch Et2 (101.2 g) và phần tủa còn lại (149.2 g). Cao
ethanol Et1, Et2 được chiết lỏng-lỏng lần lượt với các dung môi n-hexane, ethyl acetate và
butanol thu được các cao tương ứng như minh họa trong sơ đồ 2.1.
2.4 CÔ LẬP CÁC HỢP CHẤT HỮU CƠ TRONG CAO ETHYL ACETATE
2.4.1 Sắc kí cột silica gel trên cao ethyl acetate
Sắc ký cột cao ethyl acetate - EA1, EA2 trên silica gel pha thường sử dụng hệ dung
hexane: ethyl acetate với độ phân cực tăng dần từ 50% đến 100% ethyl acetate. Dịch giải ly
qua cột được hứng vào các lọ. Theo dõi quá trình giải ly bằng sắc kí lớp mỏng (SKLM).
Những lọ cho kết quả SKLM giống nhau được gộp chung thành một phân đoạn.
Bảng 2.1 Kết quả sắc ký cột cao ethyl acetate
Tên

Phân

Sắc kí lớp mỏng

Ghi chú

đoạn

EA1

EA2

EA1

EA2

EA1

EA2

1

HA.1.1 (1.58 g)

HA.2.1 (0.37 g)

Nhiều vết

Vệt dài

Chưa khảo sát

Chưa khảo sát

2

HA.1.2 (2.76 g)

HA.2.2 (3.14 g)

Vệt dài

Nhiều vết

Chưa khảo sát

Đã khảo sát

3

HA.1.3 (1.15 g)

HA.2.3 (2.12 g)

Nhiều vết

Nhiều vết

Chưa khảo sát

Chưa khảo sát

4

HA.1.4 (2.48 g)

HA.2.4 (4.21 g)

Nhiều vết

Nhiều vết

Chưa khảo sát

Đã khảo sát

5

HA.1.5 (2.35 g)

HA.2.5 (2.69 g)

Vệt dài

Nhiều vết

Chưa khảo sát

Chưa khảo sát

6

HA.1.6 (2.50 g)

HA.2.6 (3.15 g)

Nhiều vết

Nhiều vết

Đã khảo sát

Chưa khảo sát

7

HA.1.7 (1.95 g)

HA.2.7 (1.84 g)

Nhiều vết

Nhiều vết

Đã khảo sát

Chưa khảo sát

8

HA.1.8 (0.24 g)

HA.2.8 (0.89 g)

Nhiều vết

Vệt dài

Đã khảo sát

Chưa khảo sát

Footer Page 20 of 161.

- 11 -


HeaderKhóa
Pageluận
21tốt
ofnghiệp
161.

Lê Thị Kim Dung

2.4.2 Sắc kí cột sillica gel trên phân đoạn HA.1.6
Phân đoạn HA.1.6 cho SKLM nhiều vết nên phân đoạn HA.1.6 được thực hiện SKC
sillica gel với hệ dung môi rửa giải H-EA (1:4). Dịch giải ly qua cột được hứng vào các lọ.
Theo dõi quá trình giải ly bằng SKLM. Những lọ cho kết quả SKLM giống nhau được gom
chung thành một phân đoạn. Kết quả thu được 12 phân đoạn (HA.1.6.1-HA.1.6.12), được
trình bày trong sơ đồ 2.1.
2.4.3 Sắc kí cột sillica gel trên phân đoạn HA.1.6.12
Phân đoạn HA.1.6.12 cho SKLM nhiều vết, tách rõ nên phân đoạn HA.1.6.12 được
thực hiện SKC sillica gel với hệ dung môi rửa giải H:EA:Et:AcOH (5:1:0.2:0.1). Dịch giải
ly qua cột được hứng vào các lọ. Theo dõi quá trình giải ly bằng SKLM. Những lọ cho kết
quả SKLM giống nhau được gom chung thành một phân đoạn. Kết quả thu được 15 phân

đoạn (HA.1.6.12.1-HA.1.6.12.15).
Phân đoạn HA.1.6.12.11 có sắc kí lớp mỏng cho vết rõ đẹp màu cam ẩn dưới vết dơ
kéo thành đuôi dài. Từ phân đoạn HA.1.6.12.11 (356.0 mg), tiếp tục SKC nhiều lần với hệ
dung môi C:Me:W (4:0.38:0.02) thu được hợp chất kí hiệu là G.C2 (6.5 mg) có dạng bột
màu trắng. Quá trình thực hiện được tóm tắt theo sơ đồ 2.1.
2.4.4 Sắc kí cột sillica gel trên phân đoạn HA.2.4
Phân đoạn HA.2.4 cho SKLM nhiều vết, tách rõ và xuất hiện kết tủa. Lọc thành 2
phần tủa và dịch. Lấy phần tủa rửa nhiều lần bằng acetone thu được hợp chất kí hiệu là
G.B1 (10.3 mg) có dạng bột màu trắng. Quá trình thực hiện được tóm tắt theo sơ đồ 2.1.

Footer Page 21 of 161.

- 12 -


Header
Page
of 161.
Khóa
luận 22
tốt nghiệp

Lê Thị Kim Dung
Bột cành giao khô (3.5kg)
Đun hoàn lưu với ethanol, lọc,
cô quay thu hồi dung môi.
Phần cao tủa ethanol
250.4 g

Et1

290.3 g

Cao H1
94.2 g
HA.1.1-5
10.32 g

Cao EA1
61.8 g
HA.1.6
2.5 g

Cao Bu1
27.0 g
HA.1.7+8
2.19 g

Cao H2
50.2 g

HA.1.6.12
548 mg

HA.1.6.1-11
1.8 g

HA.1.6.12.11
356 mg

Cao EA2

32.0 g

HA.2.1-3
5.63 g

SKC/A
HA.1.6.12.1-10
150 mg

HA.1.6.12.12-15
42 mg

Rửa bằng acetone

G.C2
6.5 mg

GB1
10.3 mg

Sơ đồ 2.1. Quá trình ly trích và cô lập từ cây cành giao

- 13 -

Cao Bu2
10.5 g

HA.2.4
HA.2.5-8
8.57 g

4.21g
Lọc

Tủa

SKC/B

Footer Page 22 of 161.

Cao tủa ethanol
149.2 g

Et2
101.2 g

Dịch
Hệ dung môi A
H:EA:Et:AcOH (5:1:0.2:0.1)
Hệ dung môi B
C:Me:W (4:0.38:0.02)


HeaderKhóa
Pageluận
23tốt
ofnghiệp
161.

Lê Thị Kim Dung
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ - THẢO LUẬN

3.1

KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT G.B1
Hợp chất G.B1 (10.3 mg) thu được được từ phân đoạn HA.2.4 của cao ethyl acetate

với các đặc điểm như sau:
 Chất bột vô định hình màu trắng.
 Không hấp thu UV, hiện hình với thuốc thử vanillin/H 2 SO 4 cho vết màu xanh
dương khi hơ đun nóng.
 Phổ 1H-NMR (Acetone-d 6 ): Phụ lục 1.

 Phổ 13C-NMR (Acetone-d 6 ): Phụ lục 2, 3.
 Phổ HMBC (Acetone-d 6 ): Phụ lục 4.
Biện luận cấu trúc
Phổ 13C-NMR cho thấy sự hiện diện của ba mươi carbon, trong đó có hai tín hiệu
carbon olefin ở vùng từ trường thấp tại δ C 145.0 (loại carbon >C=) và δ C 122.9, có độ dịch
chuyển hóa học đặc trưng của nối đôi C=C tại C-12 và C-13 của hợp chất olean-12-ene,
giúp xác định hợp chất G.B1 là một triterpene có khung sườn olean.
So sánh số liệu phổ 13C-NMR của hợp chất G.B1 và oleanolic acid

[20]

, nhận thấy

các tín hiệu của G.B1 và oleanolic acid giống nhau, ngoại trừ các tín hiệu của vòng A. Qua
đó giúp xác định G.B1 có cấu trúc giống oleanolic acid ở các vòng B, C, D, E.
Trên vòng A, phổ 1H-NMR cho thấy sự hiện diện của tín hiệu cộng hưởng tại vị trí
δ H 3.56 (1H, d, J = 10.5 Hz) ghép cặp với proton ở vị trí δ H 3.28 (1H, d, J = 10.5 Hz), cùng
với dữ liệu phổ HMBC giúp xác định chúng là hai proton của nhóm methylene không

tương đương liên kết trực tiếp với oxygen. Ngoài ra phổ 1H-NMR còn có tín hiệu cộng
hưởng của hai nhóm oxymethine H-2 (1H, ddd, J = 11.5, 9.5, 4.5 Hz) và H-3 (1H, d, J =
9.5 Hz). Phân tích hằng số ghép của hai proton này chứng tỏ chúng ghép cặp lẫn nhau với J
= 9.5 Hz giúp xác định vị trí axial của chúng.
So sánh hợp chất G.B1 và oleanolic acid, cho thấy G.B1 mất đi một nhóm methyl –
CH 3 ở vị trí 23, thay vào đó là sự hiện diện của nhóm hydroxylmethylene H 2 -23. Phổ

Footer Page 23 of 161.

- 14 -


HeaderKhóa
Pageluận
24tốt
ofnghiệp
161.

Lê Thị Kim Dung

HMBC của G.B1 cho thấy tương quan giữa H 2 -23 với C-3, C-4, C-5 và C-24 giúp xác
định nhóm -CH 2 OH ở vị trí 23. Đồng thời, proton H-3 có tương quan HMBC với C-2 và
C-24 giúp xác định vị trí lân cận của H-2, H-3 và H 3 -24.
Cấu trúc vòng A của G.B1 đề nghị:
25

25

1

HO

24

2

10

2

A

1

HO
5

3

A

HO
3

4

4

HO

5
23

23
24

OH

OH

Hình 3.1 Cấu trúc vòng A của hợp chất G.B1
Từ các dữ liệu trên, kết hợp với so sánh dữ liệu phổ 13C-NMR của arjunolic acid [12],
thấy dữ liệu phổ của G.B1 và arjunolic acid có sự tương đồng, nên cấu trúc của hợp chất
G.B1 được đề nghị như hình 3.2. Arjunolic acid lần đầu tiên được cô lập từ cây cành giao.
30
29

20

.

19

12
11

25

C

18

10

A

16
15

10

COOH HOHO
HO

28

8
4

14

8

B
5

3

17

D
14

9
2

COOH
22

17

26

1

HO

13

21

E

7

27

6
4

HO
23

24

OH

Hình 3.2 Cấu dạng và tương quan HMBC của hợp chất G.B1

Footer Page 24 of 161.

- 15 -

20


Header
Page
of 161.
Khóa
luận 25
tốt nghiệp

Lê Thị Kim Dung
Bảng 3.1 Dữ liệu phổ của hợp chất G.B1

G.B1a
N

δ H (ppm) , J (Hz)

1

Oleanolic acida
δ C (ppm)

δ C (ppm)

Arjunolic acidb

G.B1a

δ C (ppm)

N

δ H (ppm), J
(Hz)

δ C (ppm)

Oleanolic acida

Arjunolic acidb

δ C (ppm)

δ C (ppm)

47.4

39.3

47.1

16

23.9

23.8

23.9

2

3.67 (ddd, 11.5, 9.5, 4.5)

68.9

28.1

68.9

17

46.9

46.9

47.0

3

3.39 (d, 9.5)

78.5

78.8

78.7

18

42.2

42.3

43.5

4

43.4

39.4

43.5

19

46.8

46.8

46.3

5

48.2

56.2

48.4

20

31.3

31.3

30.7

6

18.7

19.1

18.6

21

34.5

34.5

34.2

7

33.1

33.7

33.1

22

33.4

30.1

33.0

8

40.2

40.2

40.1

23

67.1

28.7

67.2

3.56 (d, 10.5)
3.28 (d, 10.5)

9

48.5

48.5

48.5

24

0.73 (s)

13.8

16.3

14.0

10

38.7

37.8

38.5

25

1.02 (s)

17.5

15.8

17.6

11

24.2

24.1

23.8

26

0.80 (s)

17.7

17.6

17.2

122.9

123.0

122.5

27

1.17 (s)

26.4

26.3

26.1

13

145.0

144.9

144.1

28

178.9

178.9

178.6

14

42.6

42.5

42.4

29

0.92 (s)

33.4

33.4

32.9

15

28.4

28.5

28.3

30

0.94 (s)

23.7

23.9

23.7

12

a

5.25 (dd, 7.0, 3.5)

ghi phổ trong acetone-d6; b trong pyridine-d5

Footer Page 25 of 161.

- 16 -