CÁC PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT DNA, enzyme, protein...

CÁC

PHƯƠNG

PHÁP

TÁCH

CHIẾT

DNA VÀ RNA
DNA chứa thông tin di truyền của sinh vật. Do đó mọi nghiên cứu và ứng dụng sinh học phân
tử đều bat đầu bằng việc thu nhận một lượng nucleic acid (NA) đủ lớn và đủ tinh sạch đế tiến
hành các thí nghiệm kế tiếp. DNA gồm các loại: DNA bộ gen, DNA ty thế, DNA lục lạp, DNA
plasmid, DNA phage. Tuỳ kích thước DNA, loại tế bào mà chọn phương pháp tách chiết khác
nhau đê đám bảo chiết được DNA tinh khiết và có hiệu suất cao. Mối quan tâm hàng đầu của
các kĩ thuật tách chiết NA là thu nhận được các phân tử này ở trạng thái nguyên vẹn tối đa
không bị phân huỷ bởi các tác nhân cơ học (phân tử bị gẫy do nghiền, lắc mạnh) hay hoá học
(phân tử bị thuỷ giải bởi các enzyme nội bào giải phóng ra môi trường khi tế bào bị phá vỡ).
Các NA cần được tách chiết trong điều kiện nhiệt độ thấp đê ức chế hoạt động của các enzyme
nội bào (DNase, RNase).
A.Dung cu và hoá chất:
A.1 Dụng cụ:
Eppendorí: là ống đựng nhỏ bằng
nhựa polyethylen hay polypropylen chịu được nhiệt độ
khử trùng (latm, 121°c, 20 phút), nhiệt độ thấp (-20°C)
và một số dung môi hữu cơ, thường có dung tích 0.2,
0.3, 0.5, 1.5, 2ml. (hãng Eppendorí, hãng BioRađ...)
Micropipet (pipetman): là loại pipet
có thể chinh được thể tích cần lấy
dùng đế hút dung dịch thế tích nhỏ, độ chính xác cao.

Micropipet có nhiều cỡ:
Loại Micropipet
Đầu tip tương ứng
0.1->10 (màu trắng)
10->100, 10->200

10->200 (màu vàng)
100->1000 (màu xanh)

-

1-

cấu tạo micropipet thay đổi tuỳ theo kiếu thiết kế nhưng nhìn chung gồm: cần
bơm, ngàm tựa, bộ phận đấy tip, bộ phận điều chỉnh thế tích, sổ chỉ thế tích
được chọn, đầu hút (nơi gắn tip).
Khi sử dụng cần chú ý:
- Phải gắn chặt tip vào đầu hút nếu không sẽ bị mắc sai sổ.
- Không đế pipet tiếp xúc với dung môi hữu cơ, hoá chất.


-

Không đế pipet gần đèn cồn.
Không điều chỉnh dưới ngường thế tích tối thiêu và trên ngường thê tích
tối đa.
Các đầu tip cần cho vào hộp giá (rack), đậy nắp và hấp cao áp tiệt trùng
và chỉ được sử dụng một lần đế tránh sự tạp nhiềm.

A.2 Trang thiết bi thông dung:

-I3 Bồn U nhiêt, tú đinh ôn: sử dụng trong các phản ứng cần nhiệt độ ổn định thường có bộ
phận điều chỉnh nhiệt độ, cài đặt thời gian.
-í3 Tủ hút khí đỏc: dùng trong các thí nghiệm có hóa chất bay hơi độc như: phenol,
chloroíbrm, ethidium bromide...

2-

-


i3 TÙ cấv vô trùng:
sử dụng trong các phản ứng cần có sự
vô trùng. Tủ phải luôn được giữ sạch,
khử trùng bề mặt bằng cồn, trước và
sau khi sử dựng tủ cần được thanh
trùng bên trong bằng đèn tử ngoại

(UV) ít nhất 15 phút.

Nồi hấp tiêt trùng: dùng đê khử
trùng các hoá chất và dụng cụ cần thiết.
Tù lanh: gồm có tủ mát và tủ âm sâu
(-20°c và -70°C) dùng đế bảo quản hoá chất, mẫu.
Máv đo PH: dùng xác định pH của các dung dịch.
Máy Vortex: dùng đế đồng nhất hoá mẫu hoặc dung dịch.
$ Máv ly tâm (ccntriíugc): dùng đe phân tách và thu nhận các phần tử khác nhau trong cùng
một dung dịch. Khi sử dụng khối lượng mẫu phải đồng đều và đặt đổi xứng qua trục máy. Chỉ
mở nắp khi máy ngưng hoàn toàn.
Nguyên tấc: các phần tử khác nhau trong một dung dịch sè lắng với vận tổc khác nhau khi chịu
tác động của lực li tâm. Tuỳ thuộc vào khối lượng và tỉ trọng của các phân tử vật chất mà

ngưới ta chia làm 2 loại ly tâm:
Ly tâm phân đoan: dùng phân tách các phần tử vật chất khác nhau dựa vào khối lượng của
chúng. Vận tốc lắng của các phần tử phụ thuộc vào lực ly tâm, khối lượng, tỷ trọng và lực ma
sát của các phần tử với dung dịch ly tâm. Đe phân tách thành công các phân tử có trong một
dung dịch cần phải có lực ly tâm và thời gian ly tâm thích hợp.
Ly tâm đắng tỷ trong: phân tách các phần tử vật chất dựa vào tỷ trọng của chúng. Phương pháp
này rất hiệu quả, cho các phân đoạn phân tách thuần khiết. Ống ly


tâm chứa một cột dung dịch có tỷ trọng tăng dần từ trên xuống đáy ổng tạo nên gradient tỉ
trọng.
Các phần tử sẽ lắng trong quá trình ly tâm và nằm
trong vùng dung dịch có tỷ trọng tương đương với
nó.
Saccharose và Glycerol được dùng khi phân tách các
bào quan, Cesium chloride (CsCl) được dùng để
phân tách protein và NA.
A.3 Hoá chất:
$ Nhũng điều cần chủ ý:
- Tất cả các dung dịch hoá chất và nước cần phải được tiệt trùng bằng nồi
hấp hoặc lọc qua màng lọc vi khuân. Neu cần cũng nên báo quản đông
lạnh bởi vì vi khuân và nấm phát triên là nguyên nhân phát sinh
nuclease. (tuỳ theo khuyến cáo mà các hoá chất được bảo quản ở nhiệt
độ phòng, tủ lạnh (4°C) hay tủ âm sâu (-20°C).
- Đe đề phòng tạp nhiễm giữa các nguyên liệu và các dung dịch hoá chất
nên sử dụng đầu pipet và ổng nghiệm một lần rồi vứt bỏ.
- Hoá chất ở dạng các dung dịch nếu bảo quản ở dạng kéo dài hoặc lặp đi
lặp lại việc giải đông thường biến tính. Vì vậy, nên chia thành lượng
nhỏ sử dụng hết trong một, hai ba lần và bào quán ở -20°c hoặc -70°c.
Ví dụ dithiothreitol,...

- Người thao tác phải mang găng tay khi tiếp xúc bình đựng hoá chất.
- Một vài dung dịch đệm được sử đụng trong các thí nghiệm với cùng
thành phần có trong dung dịch đó nhưng với những nồng độ khác nhau,
vì vậy cần phải chuân bị nhùng dung dịch gốc đậm đặc đe có thê pha
loãng khi cần.
$ Dung dieh gốc:
Tris-HCl IM (pH 7.5): hoà tan 121.1 g trong nước cất. Thêm
nước đê được 1 lít dung dịch. Điều chỉnh pH đến 7.5, phân
phối vào lọ và hấp khử trùng.
4-

-


Chú ý: nếu màu dung dịch đã chuyển sang màu vàng ta nên bỏ đi và chuân bị hoá chất mới.
- NaCỈ 5M: hoà tan 292.2g NaCl trong nước cất. thêm nước đế được 1 lit
dung dịch. Phân phổi vào lọ và hấp khử trùng.
- EDTA 0.5M (Ethylene diamin tetra acetat (pH 8.0): hoà tan 186.1g
EDTA.2EẸO vào nước cất, vừa khuấy từ vừa thêm NaOH tinh thế đế
điều chỉnh pH đến 8.0 rồi thêm nước đế được 1 lít dung dịch. Phân phổi
vào lọ và hấp khử trùng.
Chú ý: EDTA sè không hoà tan vào dung dịch nếu pH không đạt ở mức 8.0
- SDS 10% (Sodium dodecyl sulfate): hoà tan lOOg SDS trong nước cất.
Nung nóng đến 68°c đc hoà tan dung dịch. Điều chỉnh pH đến 7.2 bằng
cách thêm HC1. Thêm nước đê được 1 lít dung dịch.
Chủ ý: sử dụng khâu trang khi cân SDS và dọn dẹp khu vực đã cân cùng với cái cân sau khi sử
dụng vì tinh thế SDS khuếch tán rất dễ dàng. Không cần phải khử trùng SDS 10%.
- NaOH 10N: hoà tan 200gNaOH trong 500 ml nước cất. Bảo quản trong
lọ chất dẻo.
- Sodium acetate 3M (pH 5.2): hoà tan 81.62g trisodium acetate vào 200

ml nước cất. Dung dịch sẽ có pH 5.2
- Kalium acetate 5M pH 4,8: lấy 29.5 ml acid acetic băng, thêm KOH
đậm đặc để chỉnh đến pH 4.8, thêm nước vừa đủ 100 ml. Không hấp
tiệt trùng, bảo quản ở nhiệt độ phòng.
- Sarkosyl 20%(w/v) (N-lauroysarkosyl): hoà tan 20g N- lauroysackosyl
trong nứơc cất (tăng nhiệt độ để giúp hoà tan). Thêm nước đến lOOml
và hấp khử trùng báo quản ở nhiệt độ phòng. Dung dịch có màu vàng
nhạt.
-RNase lOmg/ml: hoà tan lOmg/ml RNase trong TE, đun sôi 10 đế diệt DNase. Chia thành các
thánh phần nhở và bảo quản ở -20°c.
Phenol dẽm:

5-

-


•

Đun khoảng lOOg phenol (tinh khiết, mới) trên bếp cách thuỷ 65°c cho
cháy. Rót thận trọng phenol đã chảy vào becher 250ml có chứa sẵn

1 OOmg
8-hydroxyquinoline, thêm lOOml Tris-base 50mM (không chính pH).
• Đậy bằng giấy nhôm, khuấy nhẹ trên máy khuấy từ khoảng 10 phút ở
nhiệt độ phòng. Đe yên cho phân lớp. Loại bở pha trên (pha nước, lưu ý
pha hữu cơ chứa phenol có màu vàng) càng nhiều càng tốt.
• Thêm 500ml Tris-HCl 50mM, pH 8, và lặp lại bước trên đến khi pha
phenol đạt đến pH 8 (đo bằng giấy).
• Thêm 100 ml Tris-HCl 50mM, pH 8 hoặc đệm TE.

• Bảo quản ở 4°c được 2 tháng trong chai nâu hay chai bọc giấy nhôm.
• Sử dụng: trộn với chloroíòrm với tỷ lệ 1/1 hoặc với chloroíbrm -iso
amyl alcol theo tỷ lệ 25/24/1.
• Chủ Ỷ: phenol và chloroíòrm đều có tính rất độc. cần mang bao tay và
tránh hít hơi bay ra. Phenol dễ cháy và làm phỏng da tay. cần giữ lại tất
cả những dụng cụ có dính phenol và vứt bỏ an toàn.
- Ethidium bromide 1000X (5mg/mp: 0.1 g Ethidium bromide trong 20
ml nước cất. Bảo quản ở nhiệt độ phòng trong lọ bọc giấy nhôm đê
tránh ánh sáng.
Chú ý: hoá chất này rất độc có thế gây ung thư. Phải mang găng tay khi thao tác và pha chế
trong tủ hút khí độc. Bảo quản ở nhiệt độ phòng.
- Lysozyme: 20mg/ml trong nước cất. Lọc tiệt trùng và chia thành các
phần nhỏ (250ul), bảo quán ở -20°c.
- Protein K 20mg/ml. Pha dung dịch mẹ 20mg/ml trong dung dịch gồm
Tris-HCl pH7.5 10mM vàNaCl lOmM.
B Nguyên tắc chung:
Quá trình tách chiết DNA trái qua 3 giai đoạn:
•


Giai đoan 1: phá vỡ tế bào bằng phương pháp vật lí hay hóa học. Tuỳ từng loại tế bào, có
cấu tạo thành và và màng tế bào khác nhau, chọn phương pháp áp dụng thích hợp, riêng lẽ hay
phối hợp.
Ví du: đổi với tế bào thực vật thường ta nghiền tế bào trong nitơ lỏng đế phá vỡ vách tế bào
hoặc dùng các chất tây đế phá màng tế bào. Còn đổi với tế bào vi khuân người ta thường dùng
lyzozyme và EDTA đế phân giải màng.
Giai đoan 2: loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu (protein, lipit,
polysaccharide...) chủ yếu là protein. Mầu được lắc thật mạnh trong một dung dịch phenol
hoặc phenol/chloroíbrm (1:1) sau đó bằng chloroíbrm hoặc chloroíbrm-isoamyl alcolhol (24:1).
Dung dịch này có tác dụng làm biến tính protein, đồng thời không hoà tan NA vì thế sau khi ly

tâm protein sẽ tủa thành một lớp nằm giũa pha nước có chứa NA và pha phenol/chloroíbrm.
Pha nước có chứa NA sẽ được thu nhận lại.

Chiết xuất bằng phenol:
Nguyên lý của việc sử dụng phenol trong chiết suất DNA nhu sau:
- Tuy ở nhiệt độ thường phenol ở dạng tinh thế rắn (tan chảy ở 80°C)
nhưng khi lẫn với 20% nước (v/v) thì phenol ở dạng nhũ tương gồm các
phân tử phenol ở giữa và các phân tử nước vây quanh.
- Khi pha hồn hợp này với dịch tế bào, các phân tử phenol có tính kị thuỷ
nên có khuynh hướng liên kết vào vùng kị thuỷ của protein ở bên trong
cấu trúc của các phân tử này, kết cục làm protein trương phồng lên và lộ
xuất nhóm bên kị thuỷ (của gốc amino acid) ra ngoài. Các nhóm kị thuỷ
này của protein khi đó kết hợp


với nhau tạo thành búi kết tủa gồm nhiều phân tử protein khác nhau. Trong khi đó DNA vẫn là
chất tan trong nước và có thê hút sang ổng chứa khác.
Phenol có ưu điếm có thể tan trong nước (ở mức độ nhất định) nên không cần khuấy trộn
nhiều cũng có thể làm biến tính protein (vì khuấy trộn nhiều có thế làm đứt gẫy DNA). Trong
khi đó sử dụng chloroíòrm hoặc chloroíbrm-isoamyl alcolhol thì phải trộn đảo kĩ vì các chất
này không tan trong nước. Tuy nhiên nhiều lúc cần phái loại bỏ hoàn toàn phenol khởi dung
dịch, khi đó cần phải lặp lại việc chiết xuất bằng chloroíbrm hoặc ether. Sử dụng cả hai loại
dung môi hữu cơ thường cho hiệu quả cao hơn. Pha thêm chloroform vào phenol làm tính kị
thuỷ của phenol tăng lên và làm tăng hiệu quả biến tính protein.
Giai đoan 3: tủa NA.
Mục đích của việc tủa là nhằm thu nhận NA dưới dạng cô đặc, một mặt nhàm báo vệ chúng
khỏi sự phân huỷ của các enzyme, mặt khác đế có thế hoà tan chúng lại trong dung dịch theo
nồng độ mong muốn. Hai cách tủa thông dụng là:
&Tiía trong ethanol: việc tủa này được thực hiện trong môi trường có lực ion cao (nồng độ
muối cao), và nồng độ ethanol cao (2.5:1), nhiệt độ thấp tạo thuận lợi cho việc tủa. Hầu như

toàn bộ NA đều tủa trong các điều kiện nêu trên.
&Tủa trong isoproỊĩanol: diêm khác biệt so với phương pháp tủa trong ethanol là không cần
sự hiện diện của muối (1:1). Các phân tử DNA có trọng lượng phân tử thấp không bị tủa, do đó
chúng bị loại ra.
Trong cả hai phương pháp, NA sê được thu nhận lại bàng li tâm. Sau đó cặn tủa phải được
rứa trong ethanol 70% để loại bỏ các muối hoặc các dấu vết của isopropanol còn dính lại trên
mầu. Tiếp theo nó sẽ được hoà tan trong nước khử ion hoặc dung dịch đệm đế bảo quản.
Ket tua bằnií ethanol:
- Cho 2.5 lần ethanol vào dung dịch DNA có chứa sodium acetate và NaCl nồng độ 0.2M trở
lên, trộn đều rồi cho vào buồng lạnh -20 hoặc -70°c đế kết tủa. Có thế thay NaCl bằng sodium
phosphate với lượng rất nhỏ cũng có thế kết tủa DNA.Tuy nhiên nếu dùng muối này thì cần
phải thâm tích đế loại bỏ muối này.


Duy trì nhiệt độ thấp (khoảng 10-15 phút ở -70°c, hoặc khoảng l-12giờ
ở -20°c.
- Quay ly tâm ở 15 phút ở 4°c với tốc độ 15000 v/ph đế tâp trung kết tủa.
Trước khi ly tâm có thế thấy kết tủa trắng trong ống nghiệm, khi đó chỉ
cần ly tâm nhẹ 3000 v/ph ở 4°c trong vòng lOphút cũng đủ tập trung
kết tủa. Thậm chí có thể dùng móc thuỷ tinh móc riêng phần tủa DNA
dưới dạng sợi trắng khỏi dịch ethanol nếu hàm lượng DNA đú lớn.
- Bỏ nước mặt, để loại bó muối, cần thêm (khoảng hai lần thể tích mẫu)
ethanol 70% vào ổng, lại ly tâm rót bỏ ethanol. Neu nhiều DNA thì có
thể nhúng móc mang DNA vào lọ chứa ethanol 70% một ít phút, lượng
muối trong DNA sẽ giảm.
- Sấy khô hoặc hong khô ống chứa DNA rồi thêm dung dịch đệm TE
hoặc nước cất đế có dung dịch DNA với nồng độ thích hợp.
Chủ ý: có thế thay ethanol bằng isopropanol với lượng nhở hơn (lượng tương đương với dịch
DNA) khi cần kết tủa DNA trong dịch khá lớn với ống không thế thêm 2.5 lần thê tích ethanol.
Tuy nhiên sau đó nên kết tủa lại với ethanol vì khó làm khô isopropanol, ít hoà tan muối và chỉ

dùng isopropanol khi thật cần thiết vì có mùi khó chịu.
Kết túa bằnu butanol:
Thêm vào dịch DNA một lượng tương đương n-butanol, trộn đều rồi ly tâm nhẹ. Hút bỏ
butanol rồ thêm vào lượng butanol khác và lặp lại thao tác trên.
Hút bỏ butanol rồi thêm vào một lượng tương đương ethyl ether so với lượng dịch còn lại.
Quay ly tâm rồi hút bỏ ether (ether sẽ chiết xuất butanol khỏi dịch).
Loại bỏ vết ether còn lại bằng cách bơm không khí (tốt hơn là nitơ) qua ống hút Pasteur vào
trong ống nghiệm đế làm khô mẫu. Cũng có thế dùng buồng áp suất thấp (buồng chân không)
đc làm bay hơi ether.
Hoà tan DNA vào TE hoặc nước cất.
Phươnti pháp sử dung côt (DEAE-cellulose column)
-


Cột DEAE- cellulose có thế được chế từ pipet loại 1 ml hoặc ống hút Pasteur. Trước tiên lấy
một ống sạch, nhét vào chồ thắt của ống một lượng nhỏ bông đã loại dầu mỡ, hấp cao áp tiệt
trùng.
Cho lên lớp bông khoảng 0.2 ml Sephađex50 đã tiệt trùng, rồi cho lên đó khoảng
1. 1 ml DE 52 cũng đã tiệt trùng (hai chất liệu được hoà riêng trong nước
rồi hấp cao áp).
Cho dịch DNA chảy qua ổng đế hấp phụ DNA , dịch qua lần đầu được rót cho đi qua cột lần
nữa.
Rửa cột bằng dung dịch đệm với một lượng gấp mấy lần thê tích cột, chứa Tris- HC1 (pH 7.5)
lOmM, NaCl 50mM và EDTA lmM.
Dung xuất bằng dung dịch đệm nêu trên nhưng với nồng độ NaCl cao hơn, chứa Tris-HCl (pH
7.5) lOmM, NaCl 1.0M và EDTA lmM. Kết tủa bằng ethanol. Thầm tích
Ngâm ống thẩm tích (túi thẩm tích, có thể mua được từ một số hãng) trong nước chứa EDTA
khoảng 50mM rồi đun sôi trong 10 phút.
Thay nước cất mấy lần, quấy đế rửa sạch.
Đe nước cất vậy mà hấp khử trùng 10 phút, rồi bảo quản ở 4°c. Tuyệt đối không để màng

(ống) thẩm tích bị khô nước.
Thực hiện thâm tích. Cho mẫu dịch nguyên liệu vào ống thâm tích, kẹp chặt hoặc buộc chặt
hai đầu, cho vào bình (chậu) chứa khoảng 500-1000 lần thê tích dung dịch đệm. Ngoại dịch
này có thế cần phải thay trong trường hợp thấm tích phenol trong DNA trong khi cần kéo dài
thời gian thấm tích đến 48 giờ. Neu thâm tích CsCl khỏi DNA plasmid thì cần khoảng 4 giờ.
c. Phưong pháp ly trích DNA ỏ’ thưc vât:
Nguyên tấc:
Chiết tách DNA bộ gen từ các mô thực vật có vấn đề khó
khăn là phải phá vách tế bào rất cứng và phải loại các
polisaccharide. Việc tách chiết DNA thực vật có nguyên tắc
chung đó là:

-

10 -


Nghiền các mô, tế bào bằng biện pháp cơ học (nghiền mô trong đá khô,
nitơ lỏng bằng cối, chày, sứ) để phá vờ thành cellulose, giái phóng các
thành phần bên trong tế bào.
- Sử dụng đệm có chất tẩy (CTAB) đế phá vỡ màng nhân, giải phóng
DNA.
- Sử dụng các hoá chất (phố biến là EDTA) đế bảo vệ DNA khỏi sự phân
huỷ bởi các enzyme nuclease nội bào.
- Sử dụng các hoá chất như chloroíbrm, isoamyl alcohol, phenol...đế loại
protein và các tạp chất ra khỏi DNA.
- Thu hồi DNA bằng cách kết tủa DNA trong cồn, hoặc isopropanol, sau
đó li tâm thu lấy kết tủa DNA.
- Hoà tan DNA bằng nước cất hoặc dung dịch đệm.
- Loại bỏ RNA bàng cách sử dụng men RNase

Thực tế, những phức hợp polysaccharides và phenol khác nhau ở nhiều dạng thực vật, vì thế sè
có những phương pháp ly trích khác nhau phù hợp cho từng dạng đó. Ví dụ, mô thực vật có
một lượng lớn phức hợp của phenol thì ta sẽ thêm vào dung dịch ly trích những tác nhân làm
giảm hoặc hoà tan phức hợp đó.
PhưoTig pháp dùng CATB:
Là phương pháp ly trích sử dụng chất có hoạt tính bề mặt là cation CTAB. Đây là phương pháp
đơn giản nhất thường được sử dụng nhất khi ly trích DNA từ thực vật cho phép thu được một
lượng DNA tinh sạch lớn, DNA có thế được tách ra từ trong những thành phần có nhiều phức
hợp polysaccharide và protein bàng sự thay đôi nồng độ muối trong dung dịch.
Nguyên tắc
Ly trích DNA sử dụng CTAB (cyltrimethylammornium bromide), dung dịch đệm có thành
phần chính là Tris - HCL, EDTA, CTAB và NaCl.
Vai trò của các chất sử dụng:
- DNA ốn định khi tính acid của dung dịch ở pH 8.0. Do trong mẫu có
nhiều acid hữu cơ trong không bào và giữa các khe hở tế bào, vì thế các
acid đó làm thay đối
-


pH dung dịch gây tổn hại đến phân tử DNA. Dung dịch Tris-HCl sê đáp ứng đế ngăn chặn sự
giảm nhanh pH.
- Ngoài ra, Mg2' sê kích hoạt men DNase làm phân huỷ DNA, vì thế sẽ
làm giảm lượng DNA trong mẫu. EDTA là một chelate và hấp thụ
những ion dương đó bằng cách tạo phức.
- CTAB là một ion dương có hoạt tính bề mặt, nó sè tạo phức với DNA là
ion âm trong dung dịch. Khi nồng độ muối trong dung dịch lớn hơn
0.7M, phức hợp DNA-CTAB được hoà tan trong dung dịch. Và khi
nồng độ muối trong dung dịch nhỏ hơn 0.7M thì phức họp DNA-CTAB
sẽ được tủa. NaCl thêm vào để điều khiến nồng độ muối trong dung
dịch. Và như thế, mercaptoethanol và PVP thường thêm vào dung dịch

ly trích đế bảo vệ DNA.
- Hơn thế nừa, phenol và chloroíorm được thêm vào đế biến tính các
phần tử tạp như protein và sắc tổ. ĩsoamylalcohol loại bỏ bọt và ngăn
cản sự tạo bọt trong dung dịch khi trộn và ôn định 2 pha nước và phenol
hoặc chloroíbrm sau ly tâm. Khi mẫu được ly tâm, trong eppendorf sẽ
phân tách thành ba lớp. Lớp thứ nhất là dung dịch DNA, lớp giữa là
những cặn bã và protein, lớp cuối cùng là phenol hoặc chloroíòrm.
- Isopropanol thêm vào để phân tách thu nhận DNA. Vì đặc tính của
DNA thường tủa trong dung dịch isopropanol hoặc ethanol khi có sự
tồn tại của những ion dương Na+, K+. Trong trường hợp này, RNA
không được tủa do nó bị thoái hoá thành nucleoside triphosphate. DNA
tủa được rửa bằng dung dịch ethanol 70% đê loại bỏ CTAB và NaCl.
Bởi vì, DNA không hoà tan được trong ethanol nên nó được giữ ở trạng
thái kết tủa. Sodium acetate, potassium acetate hoặc ammonium acetate
được thêm vào đế tủa và hồi tính lại DNA.
- Sơ dồ:


D.

Phuong pháp jỵ trích DNA từ nấm:

Mục đích - Ỷ nghĩa
Đa số các loài nấm thường được phân biệt dựa vào hình thái phát triển, hình dạng đặc
trưng, kích thước bào tử, môi trường chọn lọc hay tính chất sinh hoá. Ngày nay, kỳ thuật sinh
học phân tử cho phép xác định chính xác tên loài, những đặc điểm di truyền của cá thế và quần
thế. Trên cơ sở đó tạo nên tiền đề cho phương pháp định danh bàng phân tử, các nghiên cún sâu
hơn về gen, hệ enzyme hay protein. Từ những mục đích đó, vật liệu ban đầu không thê thiếu
được đó là ly trích được DNA tông sổ của nấm. Sau đây là phương pháp ly trích DNA từ nấm
đơn gián và thường sử dụng trong phòng thí nghiệm.

Phuong pháp
Nghiền mẫu
Mầu được nghiền trong nitơ lỏng thật mịn, và trong quá trình nghiền nitơ được bố sung
liên tục. Mầu nghiền tránh tạp nhiễm và phải đồng nhất nhau về lượng đê thuận tiện trong quá
trình ly trích. Mầu nghiền xong cho vào eppendorí 1.5 ml (1/2 thê tích), eppendorf đựng mẫu
phải giữ trong nitơ lỏng hay trong tủ 80°c.
Qui trình ly trích

-

13-


Phần bột nấm được cho vào eppenđorf 1.5 ml (1/2 thế tích) và thêm vào
đó 500 ul lysis buffer. Trộn đều bằng máy vortex, đem mẫu ủ trong bồn
warter bath ở 65°c khoảng 1 - 2 giờ.
3. Lấy mẫu ra và thêm 300 ul dung dịch phenol/chloroform/isoamyl
alcohol (25:24:1), trộn đều nhẹ bằng máy vortex khoảng 30 giây. Ly
tâm mẫu 13500 vòng/10 phúƯ4°C.
4. Hút khoáng 450 ul phần dịch nổi bên trên cho vào eppendorí 1.5 ml mới.
Lặp lại bước 2, nhưng thay bằng dung dịch chloroíbrm / isoamyl
alcohol(24:l).
5. Thêm 0.6 thế tích isopropanol và 0.03 thố tích sodium acetate vào
eppendorf 1.5 ml trên, đảo eppenđorf thật nhẹ nhàng khoảng 8-10 lần.
Đem mẫu ủ ở -20°c trong 30 phút.
6. Ly tâm mầu 13500 vòng/5 phút/ 4°c.
7. Loại bỏ phần dung dịch bên trên, thu lấy phần kết tủa bên dưới và rửa lại
kết tủa bằng ethanol 70%, ly tâm 13500 vòng/5 phút/4°c.
8. Làm khô mẫu tủa ở điều kiện nhiệt độ phòng. Hoà tan phần tủa trong
100 ul dung dịch TE 1X. Trừ mẫu ở 4°c.

Mỏt số điều cần lưu ý Chú ý trong thao tác
Các chất sử dụng phải được vô trùng , bàn thí nghiệm và tay luôn được giữ sạch. Tránh
thao tác mạnh có thế làm tổn hại đến DNA. Chú ý: SDS và ammonium acetate không được khử
trùng trong nồi hấp.
Lưọng mẫu ly trích
So sánh lượng mầu trong Protocol với lượng mẫu thực tế, nếu lượng mầu thực tế lớn gấp
đôi thì phải tăng thế tích các chất lên gấp đôi, thòi gian ly tâm và thời gian ủ không thay đổi.
Tuy nhiên, khi làm với lượng mẫu nhiều thì ảnh hưởng đến quá trình ly tâm, thao tác cân thận
và mức độ trộn của dung dịch kém.
Tuổi mẫu
2.


Mầu sử dụng cho ly trích tốt nhất ở giai đoạn còn trẻ, có nghĩa là tế bào đang ở giai đoạn
trướng thành, các quá trình sinh lý, sinh hóa hoàn chính.
Nghiền mẫu
- Cân thận khi thao tác với nitơ lỏng
- Mầu phải được nghiền thật mịn
- Tránh tạp giữa các mẫu trong quá trình nghiền
- Mầu nghiền được lấy và trữ trong tủ âm sâu không quá 2 tuần Tốc độ
và thòi gian ly tâm
Không cần điều chỉnh tốc độ và thời gian ly tâm chính xác sau khi trộn mầu với
chloroíbrm và isoamylalchohol hoặc hồi tính lại DNA tủa. Ngoài ra, không cần thiết ly tâm ở
tổc độ cao khi ở tốc độ ấy không có sự phân tách.
Sản lưọng DNA thu đưọc
- Phụ thuộc vào đối tượng ly trích Phụ thuộc vào thao tác thí nghiệm
- Phụ thuộc vào phương pháp ly trích
E. Phương pháp jỵ trích DNA ở đỏng vât:
Nguvcn tắc:
Có the tách chiết DNA từ các nguyên liệu khác nhau như máu, nước bọt, mô cơ, lông, tóc (còn

nguyên chân tóc, chân lông) và các loại mô khác. Có nhiều phưong pháp tách chiết khác nhau.
Tuy vậy tách chiết DNA có một nguyên tắc chung là:
- Tách tế bào có nhân ra khỏi vật mang.
- Phá vỡ tế bào, màng và phân huỷ protein, giải phóng DNA ra khỏi nhân.
- Tách DNA ra khỏi đệm và bảo quản DNA ở 4°c.
Các bước tiến hành:
Tuỳ theo các nguyên liệu khác nhau mà ta có thê áp dụng một số bước tiến hành khác nhau:
a) Tách chiết DNA từ mỏ dông vât:


Bước 1: Cắt mô thành từng miếng nhỏ. Nghiền mô trong nitơ lỏng đế thành bột mịn. Cho mẫu
vào ổng nghiệm chờ nitơ bay hết. Cho khoảng lOOmg mẫu vào ống eppendorĩ loại 1.5ml.
Bước 2: thêm 500ul đệm STE (0.1M NaCl, 0.05M Tris-HCl (pH 7.5), 0.001 M EDTA). Hoà
trộn nhẹ nhàng. Bố sung 12ul protease K (nồng độ lOmg/ml) và 37ul SDS 10%. Trộn đều hồn
hợp, ủ ở 55°c trong 2 giờ, thỉnh thoảng lắc nhẹ.
Bước 3: thêm 1 lượng dung dịch PCI (phenol: chloroíbrm: isoamyl alcohol với tỷ lệ 25:24:1)
bằng thế tích mẫu, trộn nhẹ, đê ở nhiệt độ phòng 5 phút. Ly tâm 9000 vòng/5 phút.
Bước 4: chuyến phần dịch nối phía trên sang ống eppendorf sạch. Lặp lại bước 3 và 4 một lần
nữa.
Bước 5: thêm một lượng dung dịch CI (chloroíorm: isoamyl alcohol với tỷ lệ 24: l)bằng thế
tích mẫu, trộn nhẹ, đô ở nhiệt độ phòng 5 phút. Ly tâm 9000 vòng/5 phút. Chuyên phần dịch
nôi sang ổng eppendorf sạch.
Bước 6: thêm một lượng Sodium acetate 3M (NaOAc) bằng 1/10 lượng mẫu và một lượng cồn
ethylic 95% bằng 2.5 lần lượng mẫu ở -20°c ít nhất trong 2 giờ, hoặc qua đêm. Ly tâm 9000
vòng/10 phút.
Bước 7: rửa sạch bằng cồn ethylic 70%. Hút sạch ethylic.
Bước 8: hoà tan kết tủa bằng 500ul dung dịch TE IX, bảo quản ở 4°c.
b) Tách chiết DNA từ máu bang chelex:
Bước 1: lấy lOOul máu tươi, hoặc 1 miếng giáy thấm, hoặc vài đã thấm máu, kích thước 0.5 X
0.5cm cho vào ống eppendorf.

Bước 2: thêm lml đệm chiết PBS (137mM NaCl; 2.7mM KC1; lOmM Na 2HP04; 2mM
KH2PO4) lắc đều, sau đó đế yên ở nhiệt độ phòng trong 30 phút. Ly tâm 14000 vòng/5 phút.
Thu kết tủa.
Lặp lại bước 2 khoảng 2-3 lần.
Bước 3: Thêm 150ul Chelex, bảo quản ở nhiệt độ 4°c đến -20°c.
c) Tách chiết DNA từ máu nhờ muối:


Bước 1: lấy khoảng 0.1 ml máu tĩnh mạch cho vào eppendorí có chứa 25 ul EDTA
1. 4M, lắc đều.
Bước 2: thêm vào eppendorf đệm phá hồng cầu (lmM NH4HCO3, 115mM NH4CI). Ly tâm
500 vòng/ phút. Thu kết tủa, loại bỏ phần dịch nối phía trên.
Bước 3: thêm vào ống 200ul đệm phá bạch cầu (lOOmM Tris-HCl pH 7.6; 40mM EDTA;
50mM NaCl; 0.2% SDS; 0.05% Sodium azide). Lắc đều.
Bước 4: thêm 20ul protein K (lOmg/ml). ủ ở 50°c trong 2 giờ.
Bước 5: thêm 80ul NaCl bão hoà 6M. Lắc mạnh bằng vortex. Ly tâm 5000 vòng/10 phút, thu
dịch nối phía trên cho vào eppendorf sạch.
Bước 6: kết tủa DNA bằng cồn Ethanol tuyệt đối.
Bước 7: hoà tan kết tủa bằng dung dịch TE 1X. Bảo quản ở 4°c đến -20°c.
F. Phưong pháp lv trích DNA từ vi khuần:
DNA vi khuẩn gồm 3 loại:
Total cell DNA: là DNA tống thể tù’ việc nuôi cấy vi khuẩn.
DNA plasmid: việc chuân bị DNA plasmid từ nuôi cấy vi khuân theo những bước tương tự
cơ bản như việc tinh khiết total cell DNA, nhưng điếm quan trọng là tại vài giai đoạn, DNA
plasmid phái được phân chia từ một so lượng lớn DNA tế bào cùng tồn tại trong tế bào.
DNA phage: được sử dụng trong kỷ thuật cloning phage. DNA phage nhìn chung được
chuân bị từ các hạt bacterriophage hơn từ việc ly trích từ tế bào nhiềm. Tuy nhiên, cần có
những kỹ thuật đặc biệt đế phá vỡ lớp vỏ phage. Một ngoại lệ là dạng sao mã mạch đôi của
M13 được chuân bị từ các tế bào E.coỉi dường như giong với plasmid vi khuân.
Viêc chuẩn bi total ceH DNA.

Quy trình của sự chuân bị DNA total từ việc nuôi cây tế bào vi khuân có thê được phân chia
thành 4 giai đoạn
2. Nuôi cấy tế bào vi khuân tăng sinh khối và thu hoạch
3. Phá vỡ tế bào đê giải phóng các thành phần bên trong.
4. Phần trích của tế bào được xử lý đế rút các thành phần, thu nhận DNA


Cô đặc dung dịch DNA thu được L Tăng sinh khối và thu hoach vi
khuân:
Hầu hết các vi sinh vật có thế tăng trưởng trong môi trường lỏng (môi trường canh) không
quá khó khăn. Môi trường nuôi cấy phải cung cấp một hỗn hợp cân bằng chất dinh dưỡng thiết
yếu trong dung dịch quy định cho phép vi khuân sinh trướng và phân chia hiệu quả.
2. Ch nân bi dich trích tế bào:
Te bào vi khuân được bọc bên trong lớp màng cytoplasmic và bao xung quanh bởi thành te
bào cúng, ơ nhiều loài, như E.coli, thành tế bào là lớp màng bên ngoài thứ hai. Đe giải phóng
các thành phần tế bào phải phá hủy tất cả các lớp chắn bên ngoài.
Kỹ thuật phá vờ tế bào vi khuân có thê chia thành 2 phương pháp cơ bản, cơ học và hóa
học.
Phá vỡ tế bào được tiến hành bằng việc phơi sáng cho các tác nhân hóa học tác động lên
toàn bộ các lớp bảo vệ. Phương pháp hóa học cùng thường xuyên được sử dụng với các tế bào
vi khuân.
Việc sử dụng các hóa chất phụ thuộc vào loại vi khuân, nhưng với E.coli và các vi khuân có
quan hệ gần, việc làm suy yếu thành tế bào được tiến hành bằng lysozyme hay EDTA hoặc là
phức hợp của cả hai. Lysozyme là enzyme có trong lòng trắng trứng và trong chất tiết như nước
mắt, nước bọt, nó thuỷ phân các thành phần trùng họp của màng tế bào. Mặt khác, EDTA, tạo
phức với ion Mg là yếu tổ cần thiết bảo quản cấu trúc bên ngoài của màng tế bào, cũng như
ngăn chặn enzyme nuclease có the phân hủy DNA. Trong nhiều trường hợp, chỉ với EDTA hay
lysozyme là đủ đế phân giải tế bào vi khuân, nhưng thông thường người ta còn thêm vào đó
chât tây như sodium dodecyl sulphate (SDS). Chât tây tham gia vào quá trình thông qua việc
rút các phân tử lipid và vì vậy gây ra sự phá hủy màng tế bào.

5.


Thu hoạch tế bào vi khuấn bàng máy ly tâm.
Chuân bị dịch trích tế bào. a) Phá hủy tế bào.
Dịch
Dịch
vi trích
khuân tế

bào

Phân hủy màng tế

Máy ly tâm
(Ọuay ở 8000 r.p.m trong
bào 3
10 phút)

►

Lớp lắng tế
bào vi khuấn

____________________________________________________
b) Ly tâm dịch trích tế bòa đế tách các cặn không hòa tan được.

Khi đã có nhũng tế bào bị phá hủy, bước cuối cùng của việc chuân bị dịch
chiết tế bào là loại bỏ các mảnh không hòa tan. Các thành phần như các mánh
vờ của thành tế bào được chiết lắng qua ly tâm, còn lại dịch chiết tế bào sạch.

3. Tinh khiết DNA từ dich chiết tế bào:
Ngoài DNA, dịch chiết tế bào vi khuân còn chứa protein và RNA.
Đe loại protein từ dịch chiết tế bào ta cho phenol hoặc hồn hợp tỉ lệ 1:1 phenol và
cloroíòrm.
Với nhiều dịch chiết tế bào, thành phần protein quá nhiều đến nồi việc trích chiết bằng
phenol không đủ đê tinh sạch hoàn toàn NA. vấn đề này được giải


quyết bàng việc xử lý phenol nhiều lần nhưng có điều không mong muốn là sau mỗi lần
trộn và các bước ly tâm sẽ gây đút gãy các phân tử DNA. Phương pháp xử lý dịch chiết tế bào
là dùng protease như Pronase hay Proteinase K trước khi xử lý phenol. Các enzyme này phá
gãy các polypeptide thành những đơn vị nhỏ hơn, đê dễ dàng hơn trong phân tách phenol.
Sau đó ta dùng enzyme ribonuclease phân hủy nhanh chóng các phân tử RNA thành các
đơn vị nhỏ ribonucleotide.
4. Cô đăc mẫu DNA:
Thông thường sự chuân bị thành công thường tạo ra được dung dịch đặc DNA mà không
cần phải tiến hành cô đặc thêm. Tuy nhiên, khi thu được dịch loãng, điều quan trọng là tìm
phương pháp để cô đặc DNA.
Phương pháp cô đặc DNA được sử dụng phố biến là sự kết tủa bằng ethanol. Trong môi
trường muối (chính xác là các cation hóa trị I như Na +), tại nhiệt độ -20°c hoặc thấp hơn.
Ethanol nguyên chất kết tủa một cách hiệu quả các NA khi ly tâm ở tốc độ cao. Với dịch đặc
DNA, ethanol được tách lớp ở phần trên của mẫu, các phân tử DNA tủa ở mặt tiếp xúc. Người
ta thường sử dụng đũa thủy tinh nhúng xuyên qua dịch ethanol và dung dịch DNA, khuấy đũa
trong dung dịch, các phân từ DNA sẽ bám chặt vào đũa và được kéo ra khỏi dung dịch ở dạng
sợi dài. Sau đó hòa tan lại vào trong một dung tích nước hoặc dung dịch đệm thích hợp. Tủa
ethanol có một tiến bộ là tách rời dung dịch và các thành phần NA.
Thu hồi DNA nhờ tủa Ethanol.

-20 -

Ethanol nguyên chất được tách lớp lên phần trên của dịch cô đặc DNA.
Các sợi DNA được tách ra từ đũa thủy tinh.
b) Đế dịch cô đặc ít nhất, ethanol được thêm vào (với ti' lệ 2,5 thế tích
ethanol nguyên chất trong một thế tích dung dịch DNA) và thu DNA tủa
bằng phương pháp ly tâm.
3
J Chuẩn bi DNA plasmid:
Việc tinh sạch các plasmid từ dịch vi khuân gôm các bước tương tự như việc chuân bị total
cell DNA. Dịch tế bào có chứa plasmid tăng trưởng trong môi trường lỏng, thu hoạch và chuẩn
bị dịch trích tế bào. Dịch trích được xử lý đế loại protein, RNA và tủa DNA bằng phương pháp
tủa Ethanol.
Tuy nhiên, có một diêm khác nhau cơ bản giữa tinh sạch plasmid và chuân bị total cell
DNA là: trong chuấn bị plasmid, phải tách DNA plasmid từ một lượng lớn DNA NST vi khuân
cùng tồn tại trong tế bào.
Việc phân tách hai loại DNA rất khó khăn nhưng rất cần thiết đối với các plasmid được sử
dụng trong kỳ thuật cloning. Sự hiện diện một lượng ít nhất DNA NST tạp nhiễm trong kỳ
thuật cloning cũng dễ dàng dẫn đến một kết quả không mong muốn.
Có nhiều phương pháp đe loại bỏ DNA NST trong quá trình tinh sạch plasmid, và việc sử
dụng từng phương pháp riêng lẽ hay kết hợp các phương pháp với nhau đều có thể phân lập
được DNA plasmid rất tinh sạch.
Các phương pháp đó dựa trên những đặc điếm khác nhau cơ bản giữa DNA plasmiđ và
DNA vi khuân,chủ yếu là dựa vào kích cỡ. Plasmid lớn nhất chỉ bằng 8% kích cờ của DNA
NST E.coli. Do đó, các kỹ thuật phân tách các phân tử DNA nhỏ từ các phân tử lớn vì vậy mà
tinh sạch các DNA plasmid một cách hiệu quả.
Ngoài kích cờ, DNA NST và plasmid còn khác nhau vê hình thê. Các plasmid của tế bào vi
khuan có dạng vòng, nhưng trong quá trình chuân bị dịch trích tế bào, DNA plasmid bị bẻ gãy
thành các mảnh dạng sợi. ứng dụng phương pháp phân tách các plasmid dạng vòng tù’ các
phân tử dạng sợi sẽ thu được các phân tử plasmid tinh sạch.
a)

Sir phân chia dua vào kích thước:
Xử lý bằng EDTA và lysozyme với sự có mặt của đường sucrose. Te bào bị mất vách
nhưng vẫn còn màng tế bào. Sự phân giải màng tế bào được kích ứng bằng cách thêm vào
những chất tây không mang ion như Triton X-100 (những chất tây ion như SDS sè làm DNA
NST bị gãy). Với phương pháp này sổ lượng DNA bị gãy sè ít vì thế sự ly tâm sẽ tạo dịch tan
trong suốt bao gồm toàn bộ plasmiđ. Vì nhừng đoạn DNA NST này rất lớn, lớn hơn nhiều so
với plasmid, và dính vào màng tê bào vi khuân sau đó có thê loại bỏ cùng với những mảnh vờ
tê bào bằng ly tâm.Tiến trình này được thực hiện đối với E.coli và những loài thân thuộc với
nó.
Dịch tan này vẫn còn 1 ít DNA tế bào. Hơn nữa nếu plasmid là phân tử lớn, nó có thế hòa
tan với mảnh vỡ tế bào. Sự phân chia theo kích thước sè bị thiếu DNA plasmid. Vì thế ta cần
quan tâm đến những phương pháp khác nhau đế loại bỏ sự nhiễm DNA vi khuân.
b) Sư phân tách dưa trên cấu hình:
Phương pháp này quan tâm tới sự khác nhau giữa cấu hình của plasmid và DNA NST. Sự
khác nhau này được dùng đế phân tách 2 loại DNA này. Ta cần nhìn nhận chặt chẽ hơn về
toàn bộ cấu hình plasmid. Sẽ không chính xác khi nói plasmid có cấu hình dạng vòng, bởi vì
vòng DNA này có the bị biến đôi bởi nhân tố nào đó tạo thành một dạng hoàn toàn khác.
Hầu hết plasmid tồn tại trong tế bào dưới dạng siêu xoắn. Dạng siêu xoắn này được biến
đôi từ DNA sợi đôi, bền vững trong suốt quá trình sao chép của plasmid nhờ enzyme
topoisomerase. cấu hình xoắn này chỉ được duy trì nếu cả hai sợi polynucleotide vẫn còn
nguyên vẹn, dạng này được gọi là covalently- closed-circular (ccc) DNA. Neu 1 trong 2 sợi
bị gãy, dạng siêu xoắn sẽ trở lại dạng bình thường, dạng linh hoạt, gọi là open-circular. Như
vậy plasmid có cấu hình thay đối.
a)


Dạng siêu xoắn quan trọng trong việc chuân bị plasmiđ bởi vì phân tử siêu xoắn có thế
được phân tách dễ dàng từ DNA sợi đôi bình thường. Đế làm điều này hai phương pháp được

dùng phố biến .
Cả hai phương pháp có thế tinh sạch DNA plasmid từ chất chiết tế bào thô sơ. ữ Sư biến tính
bằng kiềm:
Vấn đề cơ bản của kỳ thuật này là có một khoảng pH nhỏ mà ở đó DNA sợi đôi bình
thường bị biến tính, trong khi plasmid siêu xoắn thì không. Neu bổ sung dung dịch hydroxide
vào chất chiết tế bào hay dịch tan sạch thì pH tăng đến 12- 12.5, pH cao này làm đứt nổi
hydrogen trong phân tử DNA bình thường, sau đó 2 sợi polynucleotide tách ra, nếu thêm acid
vào pH giám còn 7. Những sợi DNA của vi khuấn đã biến tính quấn lại với nhau thành một
đám rối. Hỗn hợp này đem ly tâm đế tách DNA plasmid. DNA plasmid nối lên trên, phân tử
DNA thẳng lắng dứơi đáy ống nghiệm.
Một thuận lợi của phương pháp này là (đặc biệt là làm tan tế bào bang SDS và trung hòa
bằng dd acetate Natri) thì hầu hết protein hay RNA cũng không hòa tan và có thể loại bỏ bằng
ly tâm. Sự xử lý với chất chiết phenol và ribonuclease có thê không cần đến nếu phương pháp
biến tính bàng dung dịch kiềm được sử dụng.
Phưong pháp ly tâm trong gradicnt nồng đô nhò’ Ethidiumbromỉde-Cesiuni Chloride:
Gradient nồng độ được tạo ra bằng cách ly tâm dd CsCl với tốc độ cao. Gradient được tạo
ra bởi vì với lực ly tâm lớn kéo các ion Cs + và cr về phía đáy ổng nghiệm. Sự di chuyển xuống
này được cân bằng bằng khuyểch tán. Vì thế mật độ gradient được thiết lập với mật độ CsCl
cao ở phía đáy ổng nghiệm.
Những đại phân tử hiện diện trong dd CsCl khi ly tâm sê tạo
một dãy tách biệt theo gradient, các dãy phân tử riêng biệt
này hiện diện ở đâu tùy thuộc vào mật độ nồi của nó. DNA có
mật độ nổi khoảng 1,7g/cm ' và vì thế sè di chuyển đến điếm
nối có mật độ CsCl là 1.7g/cm\ Trái lại protein có độ nối thấp
hơn và vì thế nối lên trên đỉnh ống nghiệm, RN A thì lắng dưới
đáy. Ly tâm đắng tỷ trọng có thế

-

23-

phân tách DNA, RNA, protein thay thế việc xử lý với phenol và ribonuclease đê tinh sạch
DNA.
Quan trọng hơn là phương pháp này với sự hiện diện của EtBr có thể được dừng đê tách
DNA siêu xoắn khỏi DNA bình thường. EtBr kết hợp với DNA bằng cách xen vào giữa các cặp
base làm cho một phần sợi DNA tháo xoắn và dài ra (mỗi cặp > 3.4A 0). Sự tháo xoắn này làm
giảm mật độ nối 0.125g/cnr’ đối với DNA thẳng. Tuy nhiên DNA siêu xoắn không có đầu tận
cùng tự do, có rất ít đoạn duỗi ra và chỉ kết hợp với một lượng giới hạn ETBr. Mật độ nôi của
phân tử siêu xoắn chỉ giảm 0.085g/cm\
Ket quả là phân tử siêu xoắn tạo thành dãy trong gradient ETBr-CsCl ở vị trí khác với
DNA vòng và thắng.
Ly tâm đăng tỷ trọng với EtBr-CsCl là phương pháp hiệu quả cho việc thu DNA plasmid
sạch. Khi một dịch tan sạch được tạo ra tù’ phương pháp này, dãy plasmid ở vị trí phân biệt với
DNA thăng của vi khuân, phân protein thì nôi lên trên đỉnh, RNA lang dưới đáy. Vị trí của
DNA plasmid có thế được nhìn thấy bằng chiếu bức xạ tia cực tím lên thành ống nghiệm. Tia
này làm cho EtBr đã kết dính phát huỳnh quang. DNA plasmid đựơc lấy ra bằng cách dùng ống
tiêm đâm vào vị trí mẫu trên ống nghiệm. EtBr đã kết hợp với DNA plasmid được lấy ra bằng
n-butanol. Lắc hồn hợp DNA plasmid với n-butanol sẽ phân hai lớp EtBr và DNA. Sau đó tách
CsCl bằng sự thẩm tích. DNA plasmid đựợc đựng trong ổng thâm tích và đặt ổng này trong dd
buffer. CsCl sẽ thấm tích vào buffer.
Sư khuvểch đai plasmid:
Sự chuân bị DNA plasmid có trở ngại là tỷ lệ DNA plasmid thì ít hơn so với tống DNA
trong tế bào vi khuân. Năng suất DNA từ việc nuôi cấy tế bào vi khuân cũng không cao. Vì thế
cần phải khuyếch đại DNA plasmid.
Sự khuyếch đại này nhằm vào việc tăng số lượng bản sao DNA plasmid. Một vài DNA
plasmid có số lượng bản sao lớn (20 hoặc hon), đây là đặc tính có lợi cho sự khuếch đại. Trong
điều kiện đế khuếch đại DNA plasmid DNA thắng của vi khuân không thê sao chép và sự tông
họp protein bị ức chế. Nuôi cấy tế bào

chuân bị cho sự tinh sạch DNA plasmid. Sau khi thỏa mãn mật độ tế bào đạt được, chất ức chế
tống hợp protein được thêm vào (chloramphenicol) và ủ trong 12 giờ. Trong suốt thời gian này
plasmid tiếp tục được sao chép trong khi sự sao chép của DNA thẳng và tong hợp protein bị ức
chế. Ket quả là khoảng vài ngàn bản sao plasmid được tạo thành . Sự khuếch đại này là phương
pháp có hiệu quả đế nâng cao số lượng bản sao DNA plasmid.
$ Sư chuẩn bi DNA phage:
Sự khác nhau cơ bản giữa sự chuấn bị DNA phage và sự chuấn bị tống DNA tế bào và
DNA plasmid là nguyên liệu ban đầu đê tinh sạch phage không phải là chất chiết tế bào. Ta có
the thu được một lượng lớn hạt thực khuân thế trong dịch ngoại bào từ việc nuôi cấy vi khuẩn
bằng phương pháp nhiễm. Khi ly tâm môi trường nuôi cấy này, vi khuân lắng xuống đáy ta thu
được hạt phage trong dịch huyền phù. Tách các hạt phage khỏi dịch huyền phù, DNA của
chúng được tách bằng cách khử protein đc loại bỏ vỏ capsid. Phương pháp này thì nhanh hơn
phương pháp chuân bị tông DNA tế bào và DNA plasmid. Khó khăn chính, đặc biệt đối với
phage lamda là trong nuôi cấy phải đạt mật độ phage lamda đủ cao (số hạt phage /1 ml môi
trường nuôi cấy). Thực tế mật độ phage lamda hợp lý tối đa là 10 l0/ml. Tuy nhiên với mật độ
này lượng DNA phage thu được cùng rất thấp chỉ 500ng DNA. Vì vậy thể tích nuôi cấy phải
đạt 500 -lOOOml để thu được luợng DNA phage mong muổn.
Phát trìên viêc nuôi cây đê đaí mẫt đô lamda cao:
Phát triên việc nuôi cấy với dung tích lớn không là vấn đề (có thể nuôi cấy 50 lit hay lớn
hơn trong công nghệ sinh học). Nhưng đê đạt mật độ phage tối đa thì cần vài kỳ năng. Đối với
phương pháp này, tế bào vi khuân đóng vai trò chính, phage lamda xâm nhiễm vào DNA vi
khuân tạo dạng prophage.
Trong trường hợp này mật độ phage vô cùng thấp, muốn đạt
mật độ phage lamda cao ta cần phải kích ứng đế phage đi vào
giai đoạn sinh tan, kết quả tế bào vi khuấn chết và phóng
thích các hạt phage vào môi trường. Ta có thế kiếm soát
chúng thông qua gen cl (gen này nằm trên vùng đột biến nhạy
cám với nhiệt của

-

25-