Nghiên cứu gen DREB5 mã hóa protein liên quan đến quá trình phiên mã của nhóm gen chịu hạn ở cây đậu tương [Glycine max (L.) Merrill]

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

-------

NGUYỄN HIỆP HÒA

NGHIÊN CỨU GEN DREB5 MÃ HÓA PROTEIN
LIÊN QUAN ĐẾN QUÁ TRÌNH PHIÊN MÃ CỦA NHÓM GEN CHỊU HẠN
Ở CÂY ĐẬU TƯƠNG [Glycine max (L.) Merrill]

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thái Nguyên - 2010
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

-------

NGUYỄN HIỆP HÒA

NGHIÊN CỨU GEN DREB5 MÃ HÓA PROTEIN
LIÊN QUAN ĐẾN QUÁ TRÌNH PHIÊN MÃ CỦA NHÓM GEN CHỊU HẠN
Ở CÂY ĐẬU TƯƠNG [Glycine max (L.) Merrill]

Chuyên ngành: Di truyền học

Mã số: 62.42.70

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. CHU HOÀNG MẬU

Thái Nguyên - 2010
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




LỜI CẢM ƠN

Vớp tấm lòng biết ơn sâu sắc tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Chu Hoàng
Mậu, người đã hết lòng giúp đỡ động viên tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu
khoa học.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy, cô trong bộ môn Di truyền học – trường
Đại học Sư phạm – Đại học Thái Nguyên, các thầy cô và các bạn Viện khoa học sự
sống – Đại học Thái Nguyên đã tạo điều kiên cho tôi học tập, nghiên cứu để hoàn
thành luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn các bạn, đồng nghiệp và những người thân trong
gia đình đã giúp đỡ động viên tôi hoàn thành luận văn này.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi.
Các kết quả, số liệu nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được công
bố trong bất cứ công trình nào khác.

Tác giả

Nguyễn Hiệp Hòa

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




MỤC LỤC

trang
Lời cảm ơn..................................................................................................
Lời cam đoan..............................................................................................
Mục lục.......................................................................................................
Danh mục các chữ viết tắt..........................................................................
Danh mục các bảng.....................................................................................
Danh mục các hình.....................................................................................
MỞ ĐẦU....................................................................................................
1. Đặt vấn đề.........................................................................................................
2. Mục tiêu đề tài..................................................................................................
3. Nội dung nghiên cứu..............................................................................
4. Ý nghĩa khoa học..............................................................................................
Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU.................................................................
1.1.ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT HỌC VÀ HOÁ SINH HẠT ĐẬU TƢƠNG....

1.1.1. Sơ lƣợc về cây đậu tƣơng.........................................................................
1.1.2. Thành phần hoá sinh hạt đậu tƣơng..........................................................
1.1.2.1. Protein dự trữ và thành phần axit amin.................................................
1.1.2.2. Lipit, vitamin và một số chất khác.........................................................
1.2. ĐẶC TÍNH CHỊUHẠN CỦA THỰC VẬT VÀ CÂY ĐẬU TƢƠNG ...
1.2.1. Cơ sở liên quan đến tính chịu hạn ở thực vật ..........................................
1.2.2. Cơ chế sinh lý học và di truyền học đối với hiện tƣợng chống chịu hạn
ở thực vật...............................................................................................................
1.2.3. Nghiên cứu khả năng phản ứng của cây đậu tƣơng đối với hạn.............
1.2.3.1. Sự phản ứng của cây đậu tƣơng đối với hạn ở giai đoạn hạt nảy
mầm.......................................................................................................................
1.2.3.2. Sự phản ứng của cây đậu tƣơng đối với hạn ở giai đoạn cây non........
1.3. NGHIÊN CỨU NHÂN TỐ PHIÊN MÃ DREB......................................
1.3.1. Gen DREB........................................................................................
1.3.2. Nghiên cứu về DREB5 bằng phƣơng pháp RT-PCR .............................
Chƣơng 2.VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP.............................................
2.1.VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU..................................................................
2.1.1. Vật liệu thực vật................................................................................
2.1.2. Các hoá chất và thiết bị.....................................................................
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.......................................................
2.2.1. Phƣơng pháp sinh lý.........................................................................
2.2.1.1. Đánh giá khả năng chịu hạn ở giai đoạn cây non bằng phƣơng
pháp gây hạn nhân tạo................................................................................
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

1

1
4
5

6
7
7
8
9
10
10
10
12
12
13
13
14
16
17



19
22
23
23
26
28
28
28
28
29
29
29

2.2.2. Phƣơng pháp sinh học phân tử .................................................................
2.2.2.1. Phƣơng pháp tách chiết RNA tổng số....................................................
2.2.2.2. Kỹ thuật RT-PCR...................................................................................
2.2.2.3. Phƣơng pháp tinh sạch sản phẩm RT-PCR...........................................
2.2.2.4. Phƣơng pháp gắn gen vào vector tách dòng
2.2.2.5. Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α...............
2.2.2.6. Phƣơng pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (clony-PCR)........................
2.2.2.7. Tách chiết plasmid..................................................................................
2.2.2.8. Phƣơng pháp xác định trình tự nucleotit................................................
2.3.1. Phƣơng pháp xử lí số liệu .........................................................................
2.3.1.1. Phƣơng pháp thống kê bằng chƣơng trình Excel..................................
2.3.1.2. Phƣơng pháp xử lý trình tự gen..............................................................
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..................................................
3.1. KẾT QUẢ PHÂN ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, KÍCH THƢỚC,
KHỐI LƢỢNG...........................................................................................
3.1.1. Đặc điểm hình thái, kích thƣớc, khối lƣợng của 6 giống đậu
tƣơng..........................................................................................................
3.1.2. Tỷ lệ thiệt hại .............................................................................................
3.1.3. Chỉ số chịu hạn tƣơng đối .........................................................................
3.2. KẾT QUẢ PHÂN LẬP GEN DREB5 TỪ ĐẬU TƢƠNG.................
3.2.1. Tách chiết RNA từ lá mầm của các giống........................................
3.2.2. Kết quả RT-PCR tạo DNA .......................................................................
3.2.3. Kết quả dòng hóa sản phẩm gen DREB5 trong vector tách
dòng............................................................................................................
3.2.4. Kết quả giải trình tự gen mã hóa DREB5.........................................
3.2.5. So sánh trình tự nucleotit giữa DREB5 của Xanh tiên đài Việt Nam và
DREB5 của EF 583447 trong ngân hành gen có nguồn gốc từ Trung Quốc
bằng phần mềm Bioedit..............................................................................

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ............................................................................
1. KẾT LUẬN......................................................................................................
2. KIẾN NGHỊ............................................................................................
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU KHOA HỌC
TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

2



31
30
32
34
35
37
37
37
38
38
38
39
40
40
40
42
43
46

46
47
48
49

53
57
57
67
58
59


NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT

DNA

: Deoxyribonucleic acid

RNA

: Ribonucleic acid

cDNA

: Complementary DNA

LEA

: Late embryogenesis abundant

MGPT

: Môi giới phân tử

PCR

: Polymerase chain reaction – Phản ứng chuỗi polimerase

RT-PCR

: Reverse-transcription PCR – PCR ngƣợc

sHSP

: Small heat shock protein – protein sốc nhiệt nhỏ từ 10-30kDa

bp

: Cặp bazơ

dNTP

: Nucleotitde

EDTA

: Ethylendiamin tetraacetic acid

IPTG

: Isopropyl – β – D – thiogalactopyranoside

LB

: Laruia Bertani

TAE

: Tris – Acetate – EDTA

X – gal

: 5-Bromo-chloro-3-indolyl– β – D –galactoside

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

3




DANH MỤC CÁC BẢNG
trang
Bảng 2.1. Danh sách các giống đậu tƣơng nghiên cứu..............................

28

Bảng 2.2: Thành phần hóa chất của phản ứng RT-PCR............................

26

Bảng 2.3. Chu trình nhiệt của phản ứng RT-PCR...................................... 33
Bảng 2.4: Thành phần phản ứng và chu trình nhiệt PCR........................... 34
Bảng 2.5. Thành phần phản ứng gắn gen vào vector tách dòng pCR®2.1TOPO®……………………………………………………………………... 35
Bảng 3.1. Mầu sắc, khối lƣợng, kích thƣớc hạt đậu tƣơng nghiên cứu.....

41

Bảng 3.2. Tỷ lệ thiệt hại của 6 giống đậu tƣơng ở giai đoạn cây non 3 lá
(%)..............................................................................................................

42

Bảng 3.3. Chỉ số chịu hạn tƣơng đối của các giống đậu tƣơng......................... 45

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

4




DANH MỤC CÁC HÌNH
trang
Hình 1.1: Cơ chế biểu hiện của DREB1A khi lúa gặp hạn hán.......................

25

Hình 1.2. Sơ đồ phản ứng tổng hợp cDNA...............................................

26

Hình 2.1. Sơ đồ cấu tạo vector pCR®2.1-TOPO® (Invitrogen).................. 36
Hình 3.1. Hình dạng hạt đậu tƣơng nghiên cứu ............................................ 40
Hình 3.2. Đậu tƣơng trƣớc khi xử lí hạn............................................................ 43
Hình 3.3. Đậu tƣơng sau khi xử lí hạn 9 ngày................................................... 44
Hình 3.4. Đậu tƣơng sau khi xử lí hạn 15 ngày................................................. 44
Hình 3.5. Ảnh điện di RNA tổng số trên gel agarose 1%...........................

46

Hình 3.6 Ảnh điện di DNA sản phẩm của RT-PCR.......................................... 47
Hình 3.7: Đĩa nuôi cấy xuất hiện các khuẩn lạc trắng và khuẩn lạc xanh.

48

Hình 3.8: Ảnh điện di sản phẩm tách plasmit cắt bằng Hind III...............

49

Hình 3.9. Hình ảnh Sequence chuỗi DREB5..................................................... 51
Hình 3.10. Trình tự gen DREB5 ở đậu tƣơng Xanh Tiên Đài – Việt Nam..... 52
Hình 3.11. So sánh trình tự gen DREB5 của đậu tƣơng Xanh tiên đài
của Việt nam và EF 583447 có trong ngân hàng gen quốc tế từ giống
đậu tƣơng của Trung quốc ........................................................................

55

Hình 3.12. So sánh trình tự axit amin của DREB5 ở giống đậu tƣơng

Xanh Tiên Đài Việt Nam và giống đậu tƣơng có mã số EF 583447.1 của
Trung Quốc có trong ngân hàng gen quốc tế.............................................. 56

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

5




MỞ ĐẦU

1. Đặt vấn đề
Đậu tƣơng có tên khoa học là (Glycine max (L.) Merrill) thuộc cây họ đậu
(Fabaceae), đây là một trong những cây lƣơng thực có tầm quan trọng bậc nhất
trên thế giới cũng nhƣ ở Việt Nam. Để có vị trí nhƣ vậy, nhờ đậu tƣơng có những
đặc tính ƣu việt hơn những giống đậu khác đó là: Hàm lƣợng protein và lipit trong
hạt cao: protein từ 32% đến 40%, lipit từ 12% đến 25%, gluxit (10-15%), chứa
nhiều loại vitamin... Các sản phẩm rất quen thuộc của đậu tƣơng nhƣ đậu phụ,
tƣơng, dầu ăn...có vai trò hết sức quan trọng trong đời sống hàng ngày của con
ngƣời. Gần đây các nhà khoa học đã nghiên cứu và phát hiện đậu tƣơng có vai trò
chữa và điều trị bệnh nam y nhƣ ung thƣ, tim mạch... Đậu tƣơng còn có thể giải
quyết một phần vấn đề hết sức nóng bỏng hiện nay trên thế giới là năng lƣợng từ
các sản phẩm của nó. Ngoài ra đậu tƣơng là cây họ đậu nên có tác dụng cải tạo đất
thông qua việc cố định đạm trên các nốt sần ở rễ, góp phần làm giảm lƣợng phân
hóa học bón xuống đất, đây là một trong những nguyên nhân gây thoái hóa đất.
Trên thế giới đậu tƣơng đƣợc ứng dụng và sản xuất trên quy mô lớn và phát
triển mạnh mẽ nhất ở các nƣớc Nam Mỹ nhƣ Brazil, Argentina, Canada... nhƣng
lớn nhất phải kể đến Mỹ và gần đây là Trung Quốc. Hàng năm họ sản xuất và đƣa
ra thị trƣờng thế giới hàng triệu tấn/năm, điều này đã góp phần giải quyết các vấn

đề đƣợc coi là nóng của thế giới đó nhƣ năng lƣợng, ô nhiễm...
Ở Việt Nam, tuy là nƣớc trồng đậu tƣơng lâu đời nhƣng sản lƣợng hàng
năm còn thấp và ngành sản xuất đậu tƣơng ở nƣớc ta vẫn là mức thấp so với thế
giới. Nguyên nhân của vấn đề này là chúng ta còn sử dụng những giống trong

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

6




data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....

data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....

data error !!! can't not
read....

data error !!! can't not
read....

data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....

data error !!! can't not
read....