Nghiên cứu tạo đột biến khử độc và biểu hiện gen mã hoá kháng nguyên tái tổ hợp Staphylococcal enterotoxin B (SEB) phục vụ cho việc chế tạo kít phát hiện t

i

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
-------*-------

PHAN THỊ HOÀNG HẢO

NGHIÊN CỨU TẠO ĐỘT BIẾN KHỬ ĐỘC
VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ
HỢP STAPHYLOCOCCAL ENTEROTOXIN B (SEB) PHỤC
VỤ CHO VIỆC CHẾ TẠO KÍT PHÁT HIỆN TỤ CẦU VÀNG
TRONG THỰC PHẨM

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
Mã số: 604280

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. NCVC Chu Hoàng Hà

Thái Nguyên, Năm 2010

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




ii

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan các kết quả nghiên cứu dưới đây do tôi và nhóm cộng
sự nghiên cứu phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học
thực hiện từ tháng 3 tới tháng 9 năm 2010.

Hà Nội, ngày 27 tháng 09 năm 2010
Học viên ký tên

Phan Thị Hoàng Hảo

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




iii

LỜI CẢM ƠN
Trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS. NCVC Chu
Hoàng Hà, TS. Nguyễn Hữu Cường, TS. Phạm Bích Ngọc phòng Công nghệ tế bào
thực vật, Viện Công nghệ sinh học đã tận tình hướng dẫn và dìu dắt tôi trong quá
trình nghiên cứu và hoàn thành khóa luận.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn TS. Nghiêm Ngọc Minh đã cho phép tôi tham
gia thực hiện đề tài “Nghiên cứu tạo kháng nguyên tái tổ hợp Staphylococcal
enterotoxin B (SEB) phục vụ cho tạo kít phát hiện nhanh ngộ độc thực phẩm do độc
tố tụ cầu vàng”
Trong quá trình nghiên cứu vừa qua, tôi đã nhận được sự giúp đỡ và chỉ bảo
tận tình của TS. Lê Văn Sơn, TS. Lâm Đại Nhân, CN. Hoàng Hà, Ths. Lê Thu Ngọc
và các cán bộ phòng Công nghệ tế bào thực vật cùng các bạn sinh viên trong phòng.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới các thầy cô Khoa Công nghệ Sinh

học, Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên, Lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học
đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu tại Trường và
Viện.
Bên cạnh đó, tôi xin cảm ơn những người thân trong gia đình và bạn bè đã tạo
điều kiện động viên giúp đỡ tôi cả về vật chất và tinh thần để tôi có thể hoàn thành
bản luận văn này.
Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn!

Phan Thị Hoàng Hảo

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




iv

MỤC LỤC
Trang
CÁC CHỮ VIẾT TẮT ....................................................................................... viii
DANH MỤC BẢNG ............................................................................................. ix
DANH MỤC HÌNH .............................................................................................. xi
MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 3
1.1. Tình hình bệnh ngộ độc thực phẩm do Saphylococcus aureus và độc tố ruột
staphylococcal enterotoxin B trên thế giới và tại Việt Nam................................ 3
1.1.1. Khái quát về bệnh ngộ độc thực phẩm ....................................................... 3
1.1.2. Tình hình dịch bệnh ngộ độc thực phẩm do Saphylococcus aureus và độc
tố ruột staphylococcal enterotoxin B trên thế giới và tại Việt Nam .................... 4
1.2. Tụ cầu vàng Staphylococcus aureus ............................................................... 6

1.2.1. Đặc điểm phân loại ...................................................................................... 6
1.2.2. Đặc điểm vi khuẩn học ................................................................................ 6
1.2.2.1. Hình dạng và kích thƣớc .......................................................................... 6
1.2.2.2. Độc tố và khả năng gây bệnh .................................................................... 7
1.2.3. Hệ gen tụ cầu vàng Staphylococcus aureus ............................................... 10
1.3. Nội độc tố ruột staphylococcal enterotoxin B .............................................. 10
1.3.1. Cấu trúc phân tử staphylococcal enterotoxin B ....................................... 10

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




v

1.3.2. Cơ chế gây độc của staphylococcal enterotoxin B .................................... 12
1.3.3. Staphylococcal enterotoxin B tái tổ hợp và tiềm năng ứng dụng ............ 14
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................... 16
2.1. Vật liệu, trang thiết bị và dụng cụ nghiên cứu ............................................ 16
2.1.1. Chủng vi khuẩn và plasmid ....................................................................... 16
2.1.2. Các bộ kít.................................................................................................... 16
2.1.3. Hóa chất, máy móc và thiết bị ................................................................... 16
2.1.4. Môi trƣờng và đệm .................................................................................... 17
2.1.5. Cặp mồi sử dụng ........................................................................................ 17
2.1.6. Phần mềm................................................................................................... 17
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ............................................................................. 17
2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu......................................................................................... 17
2.2.2. Các phƣơng pháp nghiên cứu ................................................................... 18
2.2.2.1. Phƣơng pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) ................................. 18
2.2.2.2. Phƣơng pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony-PCR)...................... 20

2.2.2.3. Phƣơng pháp xử lý enzym hạn chế ........................................................ 20
2.2.2.4. Phƣơng pháp tinh sạch ADN từ gel agarose .......................................... 22
2.2.2.5. Phản ứng ghép nối gen ngoại lai vào vector .......................................... 23

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




vi

2.2.2.6. Phƣơng pháp biến nạp ADN plasmid vào tế bào vi khuẩn Escherichia
coli DH5α ............................................................................................................. 24
2.2.2.7. Phƣơng pháp tách ADN plasmid từ tế bào vi khuẩn Escherichia coli
DH5α .................................................................................................................... 24
2.2.2.8. Biểu hiện protein staphylococcal enterotoxin B tái tổ hợp trong tế bào
vi khuẩn Escherichia coli chủng BL21(DE3) ...................................................... 26
2.2.2.9. Phƣơng pháp điện di protein trên gel polyacrylamide .......................... 26
2.2.2.10. Phƣơng pháp tinh sạch protein ............................................................ 27
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................... 28
3.1. Kết quả nhân gen seb phục vụ cho thiết kế vector biểu hiện ...................... 29
3.1.1. Thiết kế mồi ............................................................................................... 30
3.1.2. Kết quả PCR nhân gen seb ........................................................................ 31
3.1.3. Xử lý enzym hạn chế tạo đầu cắt so le trên gen seb .................................. 32
3.2. Kết quả thiết kế vector biểu hiện pET21a+ mang gen seb đột biến ........... 34
3.2.1. Xử lý enzym hạn chế tạo đầu cắt so le trên pET21a+ .............................. 34
3.2.2. Phản ứng gắn đoạn gen đích seb vào vector biểu hiện ............................. 36
3.2.3. Kết quả kiểm tra vector tái tổ hợp bằng phản ứng colony-PCR ......... 37
3.2.4. Kết quả kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng enzym hạn chế ................... 38
3.2.5. Kết quả giải trình tự gen seb đột biến trên vector biểu hiện ……. ……….……40

3.3. Kết quả biểu hiện gen mã hóa cho protein SEB tái tổ hợp ......................... 39

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




vii

3.3.1. Biến nạp vector tái tổ hợp pET21a+/SEB vào Escherichia coli chủng
BL21(DE3) ........................................................................................................... 40
3.3.2. Kiểm tra sự biểu hiện gen seb.................................................................... 41
3.3.3. Tối ƣu các điều kiện biểu hiện gen seb ...................................................... 43
3.3.4. Tinh sạch protein tái tổ hợp SEB .............................................................. 47
KẾT LUẬN .......................................................................................................... 49

KIẾN NGHỊ ......................................................................................................... 49
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 50

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




viii

CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ADN

Deoxyribonucleic acid

APS

Ammonium persulphate

ARN

Ribonucleic Acid

bp

Base pair

cs

Cộng sự

dH2O

Nước khử ion

dNTP

Deoxyribonucleotide

EDTA

Ethylene Diamine Tetraacetace Axit

IPTG

Isopropylthio--D-galactoside

Kb

Kilobase

LB

Luria and Bertani

PBS

Phosphate buffer saline

PCR

Polymerase Chain Reaction

S. aureus

Staphylococcus aureus

SDS

Sodium dodecyl sulfate

SEB

Staphylococcal enterotoxin B

SEs

Staphylococcal enterotoxins

v/p

Vòng / phút

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




ix

Bảng

Tên bảng

Trang

1.1

Sơ bộ tình hình nhiễm độc tụ cầu vàng trên toàn quốc từ 2007 – 2009

5

2.1

Chu kì phản ứng PCR

20

2.2

Công thức pha gel tách (12%)

27

2.3

Công thức pha gel cô (5%)

27

3.1

Trình tự cặp mồi nhân bản đoạn gen seb đột biến từ vector GS45350

31

DANH MỤC BẢNG

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




x

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....



data error !!! can't not
read....

data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....

data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....

data error !!! can't not
read....

data error !!! can't not
read....

data error !!! can't not
read....