Nghiên cứu sự đa dạng sinh học của một số chủng xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces phân lập tại Thái Nguyên và định hướng ứng dụng

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
-------*-------

ĐỖ THỊ TUYẾN

NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG SINH HỌC CỦA MỘT SỐ
CHỦNG XẠ KHUẨN THUỘC CHI STREPTOMYCES PHÂN
LẬP TẠI THÁI NGUYÊN VÀ ĐỊNH HƯỚNG ỨNG DỤNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Thái Nguyên, 2011

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
-------*-------

ĐỖ THỊ TUYẾN

NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG SINH HỌC CỦA MỘT SỐ CHỦNG
XẠ KHUẨN THUỘC CHI STREPTOMYCES PHÂN LẬP TẠI
THÁI NGUYÊN VÀ ĐỊNH HƯỚNG ỨNG DỤNG

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số: 60 42 80

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS. Vi Thị Đoan Chính

Thái Nguyên, 2011
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




MỤC LỤC
Trang
Lời cam đoan ................................................................................................................i
Lời cảm ơn ................................................................................................................. ii
Mục lục ..................................................................................................................... iii
Danh mục các kí hiệu, viết tắt ....................................................................................vi
Danh mục các bảng .................................................................................................. vii
Danh mục các hình vẽ ............................................................................................. viii
ĐẶT VẤN ĐỀ............................................................................................................. 1
Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................... 3
1.1. ĐẠI CƢƠNG VỀ XẠ KHUẨN........................................................................... 3
1.1.1. Vị trí phân loại và sự phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên ............................. 3
1.1.2. Đặc điểm sinh học của xạ khuẩn ....................................................................... 4
1.1.3. Đặc điểm xạ khuẩn chi Streptomyces ............................................................... 6
1.2. CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN LOẠI XẠ KHUẨN............................................ 7
1.2.1. Phƣơng pháp phân loại truyền thống ................................................................ 7
1.2.2. Phƣơng pháp phân loại dựa vào chỉ thị phân tử gene 16S rRNA .................... 9
1.3. SINH TỔNG HỢP CHẤT KHÁNG SINH TỪ XẠ KHUẨN ...........................12
1.3.1. Cơ chế sinh tổng hợp các chất kháng sinh ......................................................12

1.3.2. Các yếu tố ảnh hƣởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh ..............................13
1.3.3. Tách chiết chất kháng sinh ..............................................................................15
1.4. XẠ KHUẨN ỨNG DỤNG TRONG BẢO VỆ THỰC VẬT ............................16
1.4.1. Vi nấm là nguyên nhân chủ yếu gây ra các bệnh hại cây trồng ......................16
1.4.2. Xạ khuẩn chống nấm gây bệnh thực vật .........................................................17
1.5. XẠ KHUẨN ỨNG DỤNG TRONG BẢO VỆ MÔI TRƢỜNG .......................19
iii
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




1.5.1. Tuyển chọn xạ khuẩn sinh enzyme .................................................................19
1.5.2. Một số enzyme chủ yếu ứng dụng trong bảo vệ môi trƣờng ..........................20
Chƣơng 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...............................23
2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU ...............................................................................23
2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu......................................................................................23
2.1.2. Vi sinh vật kiểm định ......................................................................................23
2.2. HÓA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ MÔI TRƢỜNG ...................................................23
2.2.1. Hóa chất ..........................................................................................................23
2.2.2. Dụng cụ và thiết bị ..........................................................................................24
2.2.3. Môi trƣờng nghiên cứu....................................................................................24
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......................................................................26
2.3.1. Phƣơng pháp phân lập và tuyển chọn xạ khuẩn ..............................................26
2.3.2. Phƣơng pháp đếm số lƣợng tế bào ..................................................................26
2.3.3. Phƣơng pháp xác định hoạt tính kháng sinh ...................................................27
2.3.4. Phƣơng pháp xác định hoạt tính enzyme ........................................................28
2.3.5. Phƣơng pháp xác định khả năng chịu nhiệt của enzyme ................................28
2.3.6. Phƣơng pháp nghiên cứu các đặc điểm sinh học của xạ khuẩn ......................28
2.3.7. Phƣơng pháp xác định trình tự đoạn gene 16S rRNA ....................................30

2.3.8. Nghiên cứu bƣớc đầu quá trình lên men sinh tổng hợp kháng sinh................33
2.3.9. Phƣơng pháp tách chiết chất kháng sinh .........................................................33
2.3.10. Xác định ảnh hƣởng của dịch nuôi cấy đến khả năng nảy mầm của hạt ......34
2.3.11. Phƣơng pháp xử lý số liệu.............................................................................34
Chƣơng 3 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...............................................................35
3.1. SỰ PHÂN BỐ VÀ TÍNH ĐA DẠNG SINH HỌC CỦA XẠ KHUẨN............35
3.1.1. Sự phân bố của xạ khuẩn trong đất .................................................................35
iv
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




3.1.2. Tính đa dạng sinh học của xạ khuẩn ...............................................................36
3. 2. Hoạt tính kháng sinh và chọn lọc chủng xạ khuẩn có HTKS cao.....................37
3.2.1. Hoạt tính kháng sinh của các chủng xạ khuẩn phân lập .................................37
3.2.2. Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng sinh cao ........................41
3.3. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ PHÂN LOẠI 2 CHỦNG HT17.8 VÀ HT19.1 ...44
3.3.1. Đặc điểm hình thái 2 chủng xạ khuẩn HT 17.8 và HT19.1 ............................44
3.3.2. Đặc điểm nuôi cấy ...........................................................................................45
3.3.3. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa ..............................................................................46
3.3.4. Phân loại 2 chủng xạ khuẩn HT17.8 và HT19.1 .............................................51
3.4. NGHIÊN CỨU SINH TỔNG HỢP VÀ MỘT SỐ TÍNH CHẤT CỦA CHẤT
KHÁNG SINH CHỦNG HT17.8 VÀ HT19.1 .........................................................59
3.4.1. Nghiên cứu sinh tổng hợp chất kháng sinh .....................................................59
3.4.2. Tách chiết và xác định một số tính chất của chất kháng sinh chủng HT17.8 .62
3.5. TUYỂN CHỌN XẠ KHUẨN CÓ HOẠT TÍNH ENZYME.............................64
3.5.1. Hoạt tính enzyme của xạ khuẩn ......................................................................64
3.5.2. Khả năng chịu nhiệt của enzyme ....................................................................66
3.6. BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA CKS TRONG DỊCH NUÔI

CẤY CHỦNG HT17.8 VÀ HT19.1 TỚI KHẢ NĂNG NẢY MẦM CỦA HẠT ....68
KẾT LUẬN ...............................................................................................................71
KIẾN NGHỊ ..............................................................................................................72
TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................73

v
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




ĐẶT VẤN ĐỀ
1. Tính cấp thiết của đề tài
Hàng năm, trên thế giới các vi nấm gây bệnh thực vật nhƣ đạo ôn, khô vằn, thối
cổ rễ, mốc sƣơng… đã gây tổn thất nặng nề cho mùa màng, chúng chiếm tới 83%
trong số các bệnh ở cây trồng [15]. Theo thống kê của Tổ chức Nông Lƣơng Liên
hiệp Quốc (FAO), thiệt hại trong nông nghiệp do các bệnh vi nấm lên tới 11,6%
tổng sản lƣợng nông nghiệp thế giới [46].Trong khi đó, việc sử dụng thuốc hóa học
trong bảo vệ thực vật từ lâu đã gây ảnh hƣởng nghiêm trọng tới sức khỏe con ngƣời,
làm mất cân bằng sinh thái và gây ô nhiễm môi trƣờng. Chính vì vậy, việc sử dụng
các loại VSV đối kháng, các chất sinh học diệt khuẩn vào các vùng sinh thái khác
nhau của cây trồng đã và đang là đích mà các nhà khoa học hƣớng đến, và xạ khuẩn
sinh kháng sinh là đối tƣợng trung tâm trong cuộc tìm kiếm này [22].
Xạ khuẩn thuộc nhóm sinh vật nhân sơ (Prokaryote) với số lƣợng loài lớn và
phân bố ở nhiều vùng sinh thái khác nhau. Chúng ngày càng đƣợc biết đến rộng rãi
với nhiều ứng dụng thực tế thông qua việc tạo ra các sản phẩm trao đổi thứ cấp có
giá trị sử dụng cao nhƣ CKS, chất chống ung thƣ, chất kích thích sinh trƣởng và
nhiều hợp chất y dƣợc khác. Thêm vào đó, XK còn khả năng sinh các enzyme ngoại
bào nên đƣợc sử dụng rộng rãi làm các chế phẩm sinh học có ý nghĩa đặc biệt quan
trọng trong công nghệ xử lý rác thải [9], [18].

Thái Nguyên là một tỉnh rất giàu tiềm năng về nông, lâm nghiệp nên có khu
hệ VSV khá phong phú, trong số đó có không ít loài XK sinh CKS. Mặt khác, Thái
Nguyên lại nằm trong vùng sinh khoáng, có nhiều loại hình khoáng sản phân bố tập
trung. Điển hình là khu vực núi Pháo thuộc xã Hà Thƣợng, huyện Đại Từ và khu
vực thị trấn Trại Cau thuộc huyện Đồng Hỷ, là nơi đang diễn ra các hoạt động khai
thác khoáng sản mạnh mẽ. Các hoạt động khai thác khoáng sản đã có những tác
động đáng kể đến môi trƣờng đất, nƣớc và qua đó, rất có thể sẽ ảnh hƣởng đến hệ
VSV. Trên thực tế đã có những nghiên cứu về ảnh hƣởng của hoạt động khai
khoáng tới sự phát triển và đa dạng của các hệ động, thực vật nhƣng lại chƣa có
1
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




nghiên cứu về ảnh hƣởng của hoạt động này tới sự phân bố và các hoạt tính sinh
học đến hệ VSV đất tại những khu vực này.
Xuất phát từ yêu cầu thực tiễn đặt ra nhƣ trên, cũng nhƣ để góp phần khai thác
nguồn VSV vô cùng phong phú của Thái Nguyên, chúng tôi đã tiến hành thực hiện
đề tài: “Nghiên cứu sự đa dạng sinh học của một số chủng xạ khuẩn thuộc chi
Streptomyces phân lập tại Thái Nguyên và định hướng ứng dụng”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
- Khảo sát sự phân bố, đặc điểm hình thái của XK trong các mẫu đất thu tại
các địa điểm nghiên cứu.
- Nghiên cứu hoạt tính sinh học của các chủng XK phân lập đƣợc để từ đó có
thể tuyển chọn ra một số chủng có nhiều triển vọng ứng dụng trong thực tế, đặc biệt
là trong công tác bảo vệ thực vật và môi trƣờng.
3. Nội dung nghiên cứu
- Lấy mẫu, phân lập và thuần khiết XK từ các mẫu đất.
- Kiểm tra HTKS của các chủng đã phân lập đƣợc với các VSV kiểm định để

tuyển chọn ra các chủng có HTKS cao.
- Nghiên cứu các đặc điểm hình thái, nuôi cấy, sinh lý – sinh hóa và phân loại
một số chủng XK có hoạt tính kháng nấm đã đƣợc tuyển chọn.
- Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp CKS của các chủng XK lựa chọn.
- Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào và nghiên cứu tuyển chọn ra một số
chủng có hoạt tính enzyme cao, có nhiều triển vọng ứng dụng trong thực tiễn.

2
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




Chƣơng 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. ĐẠI CƢƠNG VỀ XẠ KHUẨN
1.1.1. Vị trí phân loại và sự phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên
Theo hệ thống phân loại hiện nay, XK thuộc ngành Tenericutes (gồm vi
khuẩn G (+) và XK), thuộc giới vi khuẩn thật (Eubacteria) và siêu giới nhân sơ
(Prokaryota).
Xạ khuẩn thuộc lớp Actinobacteria, phân lớp Actinobacteridae, bộ
Actinomycetales, bao gồm 10 phân bộ, 35 họ, 110 chi và khoảng hơn 1.000 loài.
Trong đó có 478 loài thuộc chi Streptomyces và hơn 500 loài thuộc các chi còn lại
đƣợc xếp vào nhóm XK hiếm [58], [5].
Tên xạ khuẩn – Actinomycetes – bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp “actys” (tia) và
“mykes” (nấm) và ban đầu XK đƣợc coi là vi nấm vì chúng sinh trƣởng giống với
nấm. Tuy nhiên, đến nay, XK đã đƣợc chứng minh là thuộc nhóm vi khuẩn G(+), có
tỷ lệ G+C cao (>55%) trong DNA [60].
Xạ khuẩn là một nhóm VSV rất đa dạng trong đó đa số sinh trƣởng hiếu khí,
hoại sinh và phân bố rộng rãi trong đất, nƣớc, không khí, xác thực vật... Nhƣng chủ

yếu XK phân bố nhiều ở trong đất. Số lƣợng XK trong đất không chỉ phụ thuộc
vào thành phần, tính chất của đất mà còn phụ thuộc vào độ ẩm, mức độ canh tác
và khả năng che phủ của thảm thực vật. Xạ khuẩn phân bố nhiều hơn ở trong lớp
đất đất tơi, xốp, có độ ẩm thích hợp, giàu chất hữu cơ và chất khoáng. Số lƣợng
XK có thể đạt tới 9.800.000 – 80.000.000 CFU trong 1 gam đất [33].
Sự phân bố của XK trong đất còn phụ thuộc nhiều vào pH của đất. Xạ
khuẩn phân bố nhiều trong các loại đất trung tính và kiềm yếu hoặc axit yếu, có
pH khoảng 6,8 – 7,5. Trong các lớp đất kiềm hay axit ít gặp XK và càng hiếm gặp
hơn trong các lớp đất có độ kiềm mạnh. Nhìn chung, nhiệt độ ôn hòa 25 - 30ºC và
pH trung tính là điều kiện tối ƣu cho XK phát triển. Mặc dù vậy, nhiều loài XK đã
đƣợc phân lập ở các môi trƣờng khắc nghiệt ví dụ nhƣ loài Arthrobacter ardleyensis
ƣa lạnh đƣợc phân lập từ trầm tích hồ ở Nam cực có thể sống ở nhiệt độ 0ºC [27] và
3
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




loài Nocardiopis alkaliphila đƣợc phân lập từ đất sa mạc ở Ai Cập có thể sống ở pH
9,5 - 10 [32].
Xạ khuẩn là nhóm VSV đóng vai trò quan trọng trong tự nhiên. Chúng
tham gia tích cực vào các quá trình chuyển hóa nhiều hợp chất hữu cơ phức tạp
trong đất mà nhiều VSV khác không hấp thu đƣợc. Các XK chi Streptomyces đặc
biệt nhiều trong đất nơi chúng phân hủy hoại sinh rất nhiều các hợp chất hữu cơ
bằng các enzyme ngoại bào. Chúng phân hủy và sử dụng các chất hữu cơ khó phân
hủy nhƣ axit humic trong đất [5]. Nhiều chủng XK có khả năng hòa tan lignin bằng
cách sinh các enzyme thủy phân cellulase, hemicellulase ngoại bào có ý nghĩa quan
trọng đối với công nghiệp và bảo vệ môi trƣờng. Thực tế, mùi mốc đặc trƣng của
nhiều loại đất liên quan đến sự sản sinh hợp chất hữu cơ dễ bay hơi có tên là
geosmin [57], [25], [44].

1.1.2. Đặc điểm sinh học của xạ khuẩn
1.1.2.1. Đặc điểm hình thái
Đặc điểm nổi bật của XK là có hệ khuẩn ty (mycelium) phát triển, phân nhánh
và không có vách ngăn. Đƣờng kính của khuẩn ty thay đổi trong khoảng từ 0,2 µm
– 3 µm, chiều dài có thể đạt tới một vài cm. Kích thƣớc và khối lƣợng khuẩn ty
thƣờng không ổn định và phụ thuộc vào từng loại điều kiện nuôi cấy.
Theo ISP, màu sắc KTKS của các chủng XK đƣợc chia thành 8 nhóm màu:
White (W) nhóm trắng, Gray (Gy) nhóm xám, Red (R) nhóm đỏ, Yellow (Y) nhóm
vàng, Green (Gn) nhóm xanh, Blue (B) nhóm xanh da trời, Violet (V) nhóm tím, và
nhóm màu không xác định (X) [5], [40].
Khi nuôi cấy trong môi trƣờng dịch thể, XK tạo thành dạng bông, khi già tạo
thành kết tủa lắng xuống đáy, phần kết tủa này bao gồm các hạt liti, đó là sản phẩm
phân hủy của màng nguyên sinh chất và vách tế bào [19].
Khi nuôi cấy trên môi trƣờng đặc khuẩn ty của XK phát triển thành 2 loại. Một
loại cắm sâu vào môi trƣờng gọi là hệ sợi cơ chất (khuẩn ty cơ chất - substrate
mycelium) với chức năng chủ yếu là dinh dƣỡng. Một loại phát triển trên bề mặt thạch
gọi là hệ sợi khí sinh (khuẩn ty khí sinh - aerial mycelium) với chức năng chủ yếu là
4
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




sinh sản [41]. Nhiều loại XK, các KTKS phát triển theo hình phóng xạ, tạo thành
nhiều vòng tròn đồng tâm. Bản chất của hiện tƣợng này vẫn chƣa đƣợc giải thích
một cách thỏa đáng [19].
Sau một thời gian phát triển, trên đỉnh của KTKS sẽ xuất hiện các cuống sinh
bào tử – là cơ quan sinh sản đặc trƣng của XK. Trên mỗi CSBT mang từ 30 ÷ 100
bào tử, đôi khi có thể mang tới 200 bào tử, nhƣng cũng có khi chỉ mang một bào tử
hoặc hai bào tử. CSBT là một trong những đặc điểm rất quan trọng để phân loại

XK. Tuy nhiên trong nhiều trƣờng hợp, đặc điểm này không đƣợc ổn định mà vẫn
có thể thay đổi theo môi trƣờng nuôi cấy.
Bào tử XK có nhiều hình dạng khác nhau, thƣờng có hình trụ, hình ovan, hình
cầu, hình que với kích thƣớc trung bình khoảng 0,7 ÷ 0,9 × 0,7 ÷ 1,9 µm. Bề mặt
bào tử XK có thể nhẵn (Sm - Smooth), có gai (Sp - Spiny), khối u (Wa - Warty),
nếp nhăn (Ru - Rugose) hay dạng tóc Ha - Hair like. Nhìn chung, trong cùng một
loài, hình dạng bào tử XK tƣơng đối ổn định, vì vậy có thể xem đây là một trong
những đặc điểm quan trọng để phân loại XK [47].
Hình thái của khuẩn lạc XK rất khác nhau, kích thƣớc và hình dạng của chúng
có thể thay đổi phụ thuộc vào môi trƣờng và điều kiện nuôi. Khuẩn lạc thƣờng có
đƣờng kính 0,5 ÷ 2 mm, nhƣng cũng có khuẩn lạc có đƣờng kính đạt tới 1 cm hoặc
lớn hơn nữa. Khuẩn lạc XK thƣờng rắn chắc, không trơn ƣớt hay trong suốt nhƣ của
vi khuẩn hay nấm men mà thƣờng có dạng thô ráp, xù xì, có dạng vôi với nhiều
màu sắc khác nhau và có các nếp tỏa ra theo hình phóng xạ.
1.1.2.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa
XK thuộc nhóm sinh vật dị dƣỡng, chúng sử dụng đƣờng, rƣợu, axit hữu cơ,
lipit, protein và nhiều hợp chất hữu cơ khác để làm nguồn cacbon, sử dụng muối
nitrat, muối amôn, urê, pepton để làm nguồn nitơ. Tuy nhiên khả năng hấp thụ các
chất này không giống nhau ở các loài hay các chủng khác nhau.
Phần lớn XK là nhóm VSV hiếu khí, ƣa ấm, một số ít ƣa nhiệt, nhiệt độ thích
hợp cho sự sinh trƣởng là 25 - 300C. Tuy nhiên, nhiệt độ tối ƣu cho sinh tổng hợp

5
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




data error !!! can't not
read....

data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....



data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....

data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....

data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....

data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....

data error !!! can't not
read....