Tuyển chọn và nghiên cứu hoạt tính sinh học của một số chủng xạ khuẩn phân lập ở núi Pháo - Đại Từ - Thái Nguyên

LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành đề tài này, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cô giáo
- TS. Vi Thị Đoan Chính - người đã định hướng nghiên cứu, tận tình giúp đỡ
em trong quá trình thực hiện đề tài.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn tới ThS. Trịnh Ngọc Hoàng, CN. Đỗ Thị
Tuyến cùng toàn thể các thầy cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên Phòng thí
nghiệm Khoa Khoa học sự sống - Trường Đại học Khoa học đã tận tình giúp
đỡ, tạo mọi điều kiện tốt nhất để em hoàn thành đề tài này.
Qua đây, em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, người
thân, cùng toàn thể các bạn lớp Công nghệ sinh K6 đã động viên và giúp đỡ
em rất nhiều trong quá trình thực hiện đề tài này.
Thái Nguyên, ngày 23 tháng 8 năm 2011
Sinh viên

Lương Thị Hương Giang
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt Chú thích
CFU Colony Forming
Unit
CKS Chất kháng sinh
G (+) Gram dương
G (-) Gram âm
HSKS Hệ sợi khí sinh
HT Hoạt tính
HTKS Hoạt tính kháng
sinh
KS Kháng sinh
VK Vi khuẩn
VSV Vi sinh vật
VSVKĐ Vi sinh vật kiểm

định
XK Xạ khuẩn
DANH MỤC CÁC BẢNG
B
ả
n
g
Tên bảng Trang
1
.
1
Kháng sinh được phát hiện qua các năm 9
2
.
1
Các chủng VSV kiểm định 19
3
.
1
Sự phân bố của xạ khuẩn từ các mẫu đất khác nhau 26
3
.
2
Số lượng và sự phân bố của xạ khuẩn theo nhóm màu 27
3
.
3
HTKS của xạ khuẩn theo nhóm màu 29
3
.

4
Khả năng ức chế các nhóm VSV kiểm định 30
3
.
5
Phổ kháng sinh của các chủng XK đã phân lập 32
3
.
6
HTKS của 5 chủng XK lựa chọn trên môi trường thạch 33
3
.
7
HTKS của dịch lên men 5 chủng XK đã lựa chọn 34
3
.
8
HT kháng nấm gây bệnh trên chè của 3 chủng XK lựa chọn 36
3
.
9
Hoạt tính enzyme của 5 chủng xạ khuẩn lựa chọn 37
3
.
1
0
Hoạt tính enzyme của dịch lên men 5 chủng XK đã lựa chọn 38
3
.
1

1
Khả năng bền nhiệt của dịch enzyme chủng HT12.7 39
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình Tên hình Trang
1.1 Khuẩn lạc xạ khuẩn 5
1.2
Hình dạng cuống sinh bào tử và bề mặt bào tử của chủng
Streptomy ces cinereoruber subp
6
3.1 Tỷ lệ các chủng xạ khuẩn phân theo nhóm màu 28
3.2 Một số chủng xạ khuẩn đã thuần khiết 28
3.3 Tỷ lệ các chủng XK có HTKS phân theo nhóm màu 30
3.4 Tỷ lệ XK có HT với các nhóm VSV kiểm định 31
3.5 Khả năng đối kháng của các chủng XK với các VSV kiểm định 32
3.6 HTKS của 5 chủng XK lựa chọn 33
3.7 Hoạt tính kháng sinh của các chủng xạ khuẩn lựa chọn 35
3.8 HT kháng nấm gây bệnh chè của 3 chủng xạ khuẩn 36
3.9 HT enzyme của 5 chủng xạ khuẩn lựa chọn 38
3.10 Khả năng chịu nhiệt của Cellulase 40
3.11 Khả năng chịu nhiệt của Amylase 40
3.12 Khả năng chịu nhiệt của Protease 41
3.13
Vòng phân giải cơ chất của enzyme sau khi đã xử lí với nhiệt độ
trong thời gian 20 phút
41
TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
1. Tên đề tài
Tuyển chọn và nghiên cứu hoạt tính sinh học của một số chủng xạ
khuẩn phân lập ở núi Pháo - Đại Từ - Thái Nguyên.
2. Đối tượng

70 chủng xạ khuẩn được phân lập từ các loại đất khác nhau thuộc khu
vực núi Pháo - Đại Từ - Thái Nguyên được dùng để tuyển chọn và nghiên cứu
hoạt tính sinh học.
3. Mục tiêu
 Tuyển chọn và nghiên cứu một số chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng
sinh có nhiều triển vọng ứng dụng trong thực tế.
 Tuyển chọn và nghiên cứu một số chủng xạ khuẩn có hoạt tính enzyme
ngoại bào.
4. Kết quả chính
 Khảo sát sự phân bố của xạ khuẩn trong các mẫu đất thu tại khu vực
núi Pháo, xã Hà Thượng, huyện Đại Từ, tỉnh Thái Nguyên là khu vực
đã và đang chịu ảnh hưởng của hoạt động khai thác khoáng sản nhiều
năm.
 Phân lập và thuần khiết được 70 chủng xạ khuẩn từ các mẫu đất khác
nhau: đất trồng chè, đất trồng keo, đất trồng màu, đất trồng lúa, đất
vườn, đất đồi trọc.
 Kiểm tra hoạt tính kháng sinh của các chủng xạ khuẩn với các vi sinh
vật kiểm định bao gồm: vi khuẩn Gram dương, vi khuẩn Gram âm, nấm
mốc, đặc biệt có sử dụng các chủng nấm gây bệnh trên cây chè là loại
cây trồng chủ đạo ở tỉnh Thái Nguyên.
 Tuyển chọn được 3 chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng sinh cao có hoạt
phổ rộng, có khả năng kháng được các vi sinh vật kiểm định thuộc các
nhóm: vi khuẩn Gram dương, vi khuẩn Gram âm, nấm mốc và nấm
gây bệnh trên chè. Các chủng xạ khuẩn này được ký hiệu: HT17.8,
HT19.1 và HT 12.2. Đây là các chủng có nhiều khả năng ứng dụng
trong thực tiễn.
 Kiểm tra hoạt tính enzyme: amylase, protease và cellulase của các
chủng xạ khuẩn và đã tuyển chọn được 2 chủng có hoạt tính enzyme
cao được ký hiệu là: HT12.7 và HT10.6. Đồng thời đã nghiên cứu
được khả năng chịu nhiệt của các enzyme.

MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Từ xa xưa, các bệnh nhiễm khuẩn đã là một trong những nỗi kinh
hoàng đối với con người. Chính điều đó đã thôi thúc các nhà khoa học trên
thế giới phải tìm ra được một chất có khả năng phòng chống và điều trị các
bệnh nhiễm khuẩn. Năm 1928, A. Fleming phát hiện ra penicillin - CKS có
nguồn gốc từ nấm Penicillium nhưng phải hơn 10 năm sau, năm 1941,
penicillin mới chính thức được sử dụng trong y học và đã cứu sống được bệnh
nhân nhiễm trùng máu đầu tiên, cũng từ đó kỷ nguyên CKS bắt đầu. Đây là
một trong những thành tựu vĩ đại nhất của nhân loại trong thế kỷ XX.
Tuy nhiên, do việc sử dụng các CKS không hợp lý đã làm cho hiện
tượng kháng kháng sinh xuất hiện, phát triển và ngày càng lan rộng. Việc sử
dụng một số chất đặc hiệu để chữa trị một số loại bệnh đã không còn mang lại
hiệu quả như mong muốn. Số lượng các vi khuẩn đề kháng với kháng sinh
ngày càng gia tăng. Chính vì vậy, việc tìm kiếm ra những CKS mới luôn thu
hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học. Cho đến nay, con người đã phát hiện
khoảng 17.000 CKS có nguồn gốc VSV, hơn 3.000 CKS bán tổng hợp và mỗi
năm vẫn có khoảng vài trăm CKS mới được phát hiện. Trong số các VSV
sinh CKS thì xạ khuẩn đóng vai trò quan trọng hàng đầu, chiếm 80% các chất
kháng sinh được mô tả, trong đó chủ yếu thuộc chi Streptomyces [11], [19].
Hiện nay, có hai xu hướng nghiên cứu để điều chỉnh sinh tổng hợp chất
kháng sinh của xạ khuẩn là tuyển chọn tạo ra các chủng xạ khuẩn công nghiệp
có khả năng siêu tổng hợp chất kháng sinh và tối ưu hóa các thành phần môi
trường, thiết bị và điều kiện lên men. Tuy các loại chất kháng sinh rất phổ biến
trên thị trường nhưng công nghệ sản xuất chất kháng sinh lại chủ yếu tập trung
vào một số nước, một số tập đoàn dược phẩm của Mỹ, Anh, Đức, Hà Lan… và
được bảo hộ chặt chẽ dưới dạng các sáng chế độc quyền, lưu giữ trong từng cơ
sở sản xuất công nghiệp và được xem như những bí mật thương mại [24].
1
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

Thái Nguyên là một tỉnh rất giàu tiềm năng về nông, lâm nghiệp nên có
khu hệ VSV khá phong phú, trong số đó có không ít loài xạ khuẩn sinh chất
kháng sinh. Mặt khác, Thái Nguyên lại nằm trong vùng sinh khoáng, có nhiều
loại hình khoáng sản phân bố tập trung. Điển hình là khu vực núi Pháo thuộc
xã Hà Thượng - huyện Đại Từ, là nơi đã và đang diễn ra các hoạt động khai
thác khoáng sản mạnh mẽ.Trong đó chủ yếu là khai thác quặng vonfram. Các
hoạt động khai thác khoáng sản đã có những tác động đáng kể đến môi trường
đất, nước và qua đó, rất có thể sẽ ảnh hưởng đến sự phân bố của hệ VSV.
Trên thực tế đã có những nghiên cứu về ảnh hưởng của hoạt động khai
khoáng tới sự phát triển và đa dạng của các hệ động, thực vật nhưng lại chưa
có nghiên cứu về ảnh hưởng của hoạt động này tới sự phân bố và các hoạt
tính sinh học đến hệ VSV đất.
Xuất phát từ nhu cầu thực tế đó, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài:
“Tuyển chọn và nghiên cứu hoạt tính sinh học của một số chủng xạ khuẩn
phân lập ở núi Pháo - Đại Từ - Thái Nguyên”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
- Khảo sát sự phân bố của xạ khuẩn trong các mẫu đất thu tại khu vực
núi Pháo, xã Hà Thượng, huyện Đại Từ, tỉnh Thái Nguyên là khu vực đã và
đang chịu ảnh hưởng của các hoạt động khai thác khoáng sản nhiều năm.
- Nghiên cứu hoạt tính sinh học của xạ khuẩn để từ đó có thể tuyển
chọn ra một số chủng có nhiều triển vọng ứng dụng trong thực tế, đặc biệt là
trong công tác bảo vệ thực vật và môi trường.
3. Nội dung nghiên cứu
- Phân lập và thuần khiết xạ khuẩn từ các mẫu đất.
- Kiểm tra hoạt tính kháng sinh của các chủng đã phân lập được với các
VSV kiểm định để tuyển chọn ra các chủng có hoạt tính kháng sinh cao.
- Kiểm tra khả năng sinh enzyme ngoại bào để chọn ra các chủng có
hoạt tính enzyme cao.
- Xác định khả năng chịu nhiệt của dịch enzyme.
2

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn
Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu về xạ khuẩn
1.1.1. Vị trí phân loại và sự phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên
Theo hệ thống phân loại hiện nay, XK thuộc ngành Tenericutes (gồm vi
khuẩn Gram dương

và xạ khuẩn), thuộc giới vi khuẩn thật (Eubacteria) và
siêu giới nhân sơ (Prokaryota) [34].
Xạ khuẩn thuộc lớp Actinobacteria, phân lớp Actinobacteridae, bộ
Actinomycetales, bao gồm 10 phân bộ, 35 họ, 110 chi và 1000 loài, trong đó
có 478 loài thuộc chi Streptomyces và hơn 500 loài thuộc các chi còn lại được
xếp vào nhóm XK hiếm [12], [42]. Streptomyces đặc biệt nhiều trong đất nơi
chúng phân hủy hoại sinh rất nhiều các hợp chất hữu cơ bằng các enzyme
ngoại bào. Một phần rất lớn các chất kháng sinh được sử dụng hiệu quả trong
điều trị có nguồn gốc từ các loài Streptomyces, trong đó được biết đến nhất là
streptomycin, erythromycin, tetracyclin [40].
Xạ khuẩn là một nhóm vi sinh vật rất đa dạng trong đó đa số sinh
trưởng hiếu khí và tạo khuẩn ty phân nhánh tương tự như nấm. Tên xạ khuẩn
– actinomycete – bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp “actys” (tia) và “mykes” (nấm) và
ban đầu xạ khuẩn được coi là vi nấm vì chúng sinh trưởng giống với nấm.
Mạng lưới phân nhánh của thể sợi thường phát triển ở cả bề mặt cơ chất rắn
(tạo thành hệ sợi khí sinh) lẫn bên trong (tạo thành hệ sợi cơ chất) [27]. Đây
là một trong những đặc điểm để phân loại xạ khuẩn.
Xạ khuẩn là VK G(+) có tỷ lệ G+C cao (>55%) trong DNA. Đa số xạ
khuẩn sống tự do, hoại sinh và phân bố rộng rãi trong đất, nước và xác thực
vật. Xạ khuẩn đóng vai trò quan trọng về mặt sinh thái trong vòng tuần hoàn
tự nhiên. Chúng phân hủy và sử dụng các chất hữu cơ khó phân hủy như
humic acid trong đất [42]. Nhiều chủng xạ khuẩn có khả năng hòa tan lignhin

bằng cách sinh các enzyme thủy phân cellulose, hemicellulose và các
peoxidase ngoại bào [33]. Các chủng xạ khuẩn xuất hiện trong môi trường
3
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn
giàu chất hữu cơ như các compost, ở cả hai pha ôn hòa (mesophilic) và chịu
nhiệt (thermophilic) [39], và ở cống rãnh nước thải nơi mà các xạ khuẩn chứa
mycolic acid kết hợp với việc tạo thành các bọt khí và váng bọt ổn định, đặc
trưng [37].
Nhìn chung, nhiệt độ ôn hòa 25 - 30ºC và pH trung tính là điều kiện
tối ưu cho xạ khuẩn phát triển. Mặc dầu vậy, nhiều loài đã được phân lập ở
các môi trường khắc nghiệt ví dụ như Arthrobacter ardleyensis ưa lạnh được
phân lập từ trầm tích hồ ở Nam cực có thể sống ở nhiệt độ 0ºC [28] và
Nocardiopis alkaliphila được phân lập từ đất sa mạc ở Ai Cập có thể sống ở
pH 9,5 - 10 [30].
1.1.2. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn
* Khuẩn lạc
Đặc điểm nổi bật của xạ khuẩn là có hệ sợi phát triển, phân nhánh
mạnh và không có vách ngăn (chỉ trừ cuống sinh bào tử khi hình thành bào
tử). Hệ sợi xạ khuẩn mảnh hơn nấm mốc với đường kính thay đổi trong
khoảng 0,2 - 1 µm đến 2 - 3 µm, chiều dài có thể đạt tới một vài cm [11],
[13].
Kích thước và khối lượng hệ sợi thường không ổn định và phụ thuộc
vào điều kiện sinh lý và nuôi cấy. Đây là một trong những đặc điểm phân biệt
khuẩn lạc của xạ khuẩn và khuẩn lạc của nấm mốc vì hệ sợi của nấm mốc có
đường kính rất lớn thay đổi từ 5 - 50 µm, dễ quan sát bằng mắt thường.
Khuẩn lạc của xạ khuẩn thường chắc, xù xì, có dạng da, dạng vôi,
dạng nhung tơ hay dạng màng dẻo. Khuẩn lạc xạ khuẩn có màu sắc rất đa
dạng: đỏ, da cam, vàng, nâu, xám, trắng… tùy thuộc vào loài và điều kiện
ngoại cảnh.
Kích thước và hình dạng của khuẩn lạc có thể thay đổi tùy loài và tùy

vào điều kiện nuôi cấy như thành phần môi trường, nhiệt độ, độ ẩm… Đường
kính của mỗi khuẩn lạc chỉ chừng 0,5 - 2 mm nhưng cũng có khuẩn lạc đạt tới
đường kính 1cm hoặc lớn hơn.
4
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn
Khuẩn lạc có 3 lớp, lớp vỏ ngoài có dạng sợi bện chặt, lớp trong tương
đối xốp, lớp giữa có cấu trúc tổ ong.

Hình 1.1. Khuẩn lạc xạ khuẩn [43]
Khuẩn ty trong mỗi lớp có chức năng sinh học khác nhau. Các sản
phẩm trong quá trình trao đổi chất như: CKS, độc tố, enzyme, vitamin, axit
hữu cơ… có thể được tích lũy trong sinh khối của tế bào xạ khuẩn hay được
tiết ra môi trường.
* Khuẩn ty
Trên môi trường cơ chất đặc, hệ sợi của xạ khuẩn phát triển thành 2
loại: một loại cắm sâu vào trong môi trường gọi là hệ sợi cơ chất (khuẩn ty cơ
chất - substrate mycelium) với chức năng chủ yếu là dinh dưỡng. Một loại
phát triển trên bề mặt thạch gọi là hệ sợi khí sinh (khuẩn ty khí sinh - aerial
mycelium) với chức năng chủ yếu là sinh sản.
Nhiều loại chỉ có hệ sợi cơ chất nhưng cũng có loại (như chi
Sporichthya) lại chỉ có hệ sợi khí sinh. Khi đó HSKS vừa làm nhiệm vụ sinh
sản vừa làm nhiệm vụ dinh dưỡng [8].
1.1.3. Sự hình thành bào tử của xạ khuẩn
Bào tử xạ khuẩn được hình thành trên các nhánh phân hóa của khuẩn
ty khí sinh - gọi là cuống sinh bào tử. Đây là cơ quan sinh sản đặc trưng cho
xạ khuẩn. Trên mỗi cuống sinh bào tử mang 30 - 100 bào tử, đôi khi có thể
mang tới 200 bào tử. Hình thái, cuống sinh bào tử và bào tử là các đặc điểm
quan trọng nhất trong phân loại xạ khuẩn.
5
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

Cuống sinh bào tử của xạ khuẩn có dạng thẳng hoặc lượn sóng (RF),
dạng xoắn lò xo (S), chuỗi bào tử không phát triển hoặc xoắn đơn giản có
hình móc câu (RA). Bào tử hình thành đồng thời trên tất cả chiều dài của
cuống sinh bào tử theo 2 cách: kết đoạn hay cắt khúc và thường có hình trụ,
ovan, cầu, que với mép nhẵn hoặc xù xì, có gai hoặc gai phát triển dài thành
dạng lông [10].
Bào tử xạ khuẩn được bao
bọc bởi màng mucopolysaccharide
giàu protein với độ dày khoảng 300
- 400Aº chia làm 3 lớp. Các lớp này
tránh cho bào tử khỏi những tác
động bất lợi của điều kiện ngoại
cảnh như nhiệt độ, pH… Hình
dạng, kích thước chuỗi bào tử và
cấu trúc màng bào tử là những tính
trạng tương đối ổn định và là đặc
điểm quan trọng dùng trong phân
loại xạ khuẩn. Tuy nhiên những
tính trạng này có thể có những thay
đổi nhất định khi nuôi cấy trên môi
trường có nguồn nitơ khác nhau
[14].
Hình 1.2. Hình dạng cuống sinh bào
tử và bề mặt bào tử của chủng
Streptomyces cinereoruber subp [6]
1.1.4. Cấu tạo của xạ khuẩn
Xạ khuẩn có cấu trúc tế bào tương tự VK G(+), toàn bộ cơ thể chỉ là
một tế bào bao gồm các thành phần chính: thành tế bào, màng sinh chất,
nguyên sinh chất, chất nhân và các thể ẩn nhập.
Thành tế bào xạ khuẩn có kết cấu dạng lưới, dày 10 – 20 nm có cấu

tạo tương tự thành tế bào của VK G(+), thành phần chủ yếu là peptidoglucan
tạo nên một lớp vách tế bào tương đối vững chắc. Phân tích dưới kính hiển vi
điện tử thành tế bào XK gồm ba lớp: lớp ngoài cùng dày 60Aº, lớp trong và
lớp giữa dày 50Aº. Căn cứ vào thành phần hóa học, thành tế bào xạ khuẩn
được chia thành 4 nhóm chính [5], [9]:
6
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn
Nhóm I: Thành phần chính của thành tế bào là axit L - 2,6 diaminopimelic
(L - ADP) và glyxin. Chi Streptomyces thuộc nhóm này.
Nhóm II: Thành phần chính của thành tế bào là axit meso - 2,6
diaminopimelic (meso - ADP) và glyxin. Thuộc nhóm này gồm các chi:
Micromonospora, Actinoplanes, Ampullarriella…
Nhóm III: Thành phần chính của thành tế bào là axit meso - 2,6
-diaminopimelic. Thuộc nhóm này có các chi: Dermatophilus,
Geodermatophilus, Frankia…
Nhóm IV: Thành phần chính của thành tế bào là axit meso - 2,6
-diaminopimelic, arabinose và galactose. Thuộc nhóm này gồm các chi:
Mycobacterium, Nocardia, Pseudonocardia…
Thành tế bào có kết cấu dạng lưới, có tác dụng duy trì hình dáng của
khuẩn ty và bảo vệ tế bào. Ngoài ra thành tế bào XK có thể cho phép nhiều
chất như: Chất kháng sinh, axit amin và nhiều hợp chất khác có kích thước
tương đối lớn đi qua một cách dễ dàng. Các chất dinh dưỡng từ môi trường
cũng thẩm thấu một cách chọn lọc qua thành tế bào.
Màng sinh chất là lớp tế bào nằm ngay sát dưới thành tế bào, dày
khoảng 7,5 - 10 nm, chức năng chủ yếu là điều hòa sự hấp thu các chất dinh
dưỡng vào tế bào, tham gia vào quá trình hình thành bào tử. Tế bào chất của
XK gồm một số thành phần chủ yếu như: thể nhân, không bào và thể ẩn
nhập.
Nhân của tế bào XK không có cấu trúc điển hình, chỉ là nhiễm sắc thể
không có màng bao bọc. Khi còn non, toàn bộ tế bào chỉ có một nhiễm sắc

thể sau đó hình thành nhiều hạt rải rác trong toàn bộ hệ khuẩn ty.
1.2. Đại cương về chất kháng sinh
1.2.1. Chất kháng sinh (Antibiotic)
Theo khái niệm cũ, CKS là sản phẩm có nguồn gốc từ vi sinh vật mà
ngay ở nồng độ thấp (µg/ml) cũng có thể ức chế hoặc tiêu diệt các vi sinh
vật khác một cách chọn lọc (vi khuẩn, nấm men, nấm mốc…). Thuật ngữ
antibiotic được bắt nguồn từ chữ Hi Lạp: “anti” là kháng lại, “bios” là sự
7
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn
sống. Thuật ngữ này được Waksman sử dụng vào những năm 1940 để phân
biệt penicillin với sulfonamit đã được phát hiện từ những năm 1930. Thuật
ngữ này được thay đổi sau khi penicillin và các chất kháng khuẩn khác đã
được cải tiến và tổng hợp mới trong phòng thí nghiệm. Ngày nay, thuật ngữ
này được sử dụng phổ biến để chỉ các hợp chất kháng khuẩn tự nhiên, tổng
hợp hoặc bán tổng hợp có hiệu quả diệt khuẩn ở nồng độ thấp. Nhiều chất
kháng sinh được sử dụng như một chất hóa trị liệu có khả năng kháng virus,
tế bào ung thư… Tất cả các CKS đều có tính độc chọn lọc, mỗi CKS thường
chỉ tác dụng với một nhóm vi sinh vật nhất định [10].
1.2.2. Lược sử nghiên cứu chất kháng sinh
Kháng sinh là thuốc được con người dùng chủ yếu để chống các bệnh
truyền nhiễm. Các bệnh truyền nhiễm chiếm phần lớn trong các bệnh của
con người và động vật. Cho đến nửa sau thế kỷ 19 người ta đã phát hiện rằng
vi sinh vật chính là thủ phạm gây ra hàng loạt các bệnh truyền nhiễm. Do đó
liệu pháp hóa học nhằm vào các VSV gây bệnh đã được phát triển thành liệu
pháp điều trị chính.
Năm 1928, Fleming phát hiện ra penicillin và kháng sinh đã được
dùng trong điều trị vào những năm 1940. Ngay sau đó penicillin đã trở thành
một kháng sinh nổi tiếng vì đã cứu sống nhiều chiến binh trong chiến tranh
thế giới II [36].
Từ những năm 1940 đến cuối những năm 1960, nhiều kháng sinh mới

được xác định hầu hết từ xạ khuẩn, và đó trở thành thời kỳ vàng son của hóa
liệu pháp kháng sinh (bảng 1.1).
8
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn
Bảng 1.1. Kháng sinh được phát hiện qua các năm [6]
Năm CKS được phát hiện Nước Năm CKS được phát
hiện
Nước
1929 Penicillin Anh 1939 Gramicidin Mỹ
1943 Streptomycin, Bacitracin Mỹ 1945 Cephalosporin Italia
1947 Cloramphenicol Mỹ 1949 Neomycin Mỹ
1950 Oxytetracyclin Mỹ 1952 Erythromycin Mỹ
1956 Vancomycin Mỹ 1957 Kanamycin Nhật
1963 Gentamycin Mỹ 1966 Docycyclin Mỹ
1971 Torbamycin Mỹ 1972 Cephamycin Mỹ
Năm 1944, streptomycin được phát hiện từ xạ khuẩn đất Streptomyces
griseus. Sau đó đến chloramphenicol, tetracyclin, các kháng sinh thuộc
nhóm macrolide và glycopeptide [11]. Vào năm 1962, các kháng sinh tổng
hợp như nalidixic acid, thuốc chống VSV có bản chất quinolone cũng được
tạo ra. Việc cải tiến trong từng lớp kháng sinh tiếp tục thu được phổ kháng
VSV rộng hơn, hoạt tính kháng VSV cao hơn, ví dụ như các kháng sinh β -
lactam.
Việc phát hiện, phát triển và sử dụng các kháng sinh trong điều trị ở
thế kỷ 20 đã làm giảm đáng kể tỷ lệ chết do nhiễm khuẩn. Tuy nhiên từ năm
1980 số kháng sinh mới được đưa vào điều trị giảm hẳn do chi phí phát triển
và thử nghiệm thuốc mới ngày càng lớn. Bên cạnh đó, một hiện trạng đáng
báo động là ngày càng tăng các VSV gây bệnh kháng với các kháng sinh
hiện có. Do vậy, các nghiên cứu cần phải tập trung vào làm thế nào để vượt
qua tính kháng thuốc kháng sinh cũng như phát hiện các kháng sinh mới có
cơ chế hoạt động khác nhau [29].

9
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn
1.2.3. Sự hình thành chất kháng sinh ở xạ khuẩn
Một trong những đặc điểm quan trọng của xạ khuẩn là khả năng hình
thành chất kháng sinh. Đa số các CKS đang dùng trong y học hiện nay có
nguồn gốc từ XK, trong khoảng 5.500 CKS đã biết đến hiện nay, có tới hơn
4000 chất từ XK [2].
Đa số các chất kháng sinh có nguồn gốc từ xạ khuẩn đều có phổ
kháng sinh rộng, kìm hãm hoặc ức chế sự sinh trưởng và phát triển của
nhiều loài VSV khác nhau.
Ngày nay, người ta đã biết CKS là sản phẩm trao đổi thứ cấp của vi
sinh vật. Dẫu vậy vẫn còn nhiều giả thuyết khác nhau về vai trò của CKS đối
với XK. Một số tác giả cho rằng sự hình thành chất kháng sinh là cơ chế
giúp xạ khuẩn tồn tại trong môi trường tự nhiên, sự hình thành CKS là do sự
cạnh tranh môi trường dinh dưỡng. Lại có giả thuyết cho rằng CKS chỉ là
sản phẩm thải ra của quá trình trao đổi chất của tế bào… [17], [23].
Có 3 con đường sinh tổng hợp chất kháng sinh ở xạ khuẩn:
 CKS được tổng hợp từ 1 chất trao đổi bậc I, thông qua một chuỗi các
phản ứng enzyme.
 CKS được hình thành từ 2 hoặc 3 chất trao đổi bậc I khác nhau.
 CKS được hình thành bằng cách polime hóa các chất trao đổi bậc I,
sau đó tiếp tục biến đổi qua các phản ứng enzyme khác.
Nhiều chủng xạ khuẩn có khả năng tổng hợp đồng thời hai hay nhiều
CKS có cấu trúc hóa học và tác dụng sinh học tương tự nhau [6], [7].
1.2.4. Các chất kháng sinh có nguồn gốc từ xạ khuẩn
Đa số các CKS được dùng trong y học có nguồn gốc từ xạ khuẩn,
trong số đó có nhiều chất hiện vẫn đang được sử dụng tương đối phổ biến
trong thực tiễn.
Streptomycin: Được Waksman phát hiện ra từ năm 1943, có nguồn gốc từ xạ
khuẩn Streptomyces griseus, có khả năng chống các VK G(+)

khá mạnh.
Streptomycin được sử dụng rất hiệu quả để điều trị các bệnh dịch hạch, ho
gà và đặc biệt quan trọng hơn cả là dùng để chữa các bệnh lao [10].
10
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn
Neomycin: Là chất kháng sinh có hoạt phổ rộng, được tách ra từ xạ khuẩn
Streptomyces fradiae vào năm 1949, có tác dụng chống cả VK G(+) và G(-)

.
Đặc biệt là chống được nhiều loài vi khuẩn đã kháng lại với penicillin và
streptomycin [10].
Gentamycin: Có nguồn gốc từ xạ khuẩn Micromonospora purpurea, có phổ
kháng sinh rộng, có tác dụng chống cả VK G(+) như tụ cầu, phế cầu đã
kháng lại penicillin và VK G(-) như màng não cầu, lậu cầu. Trong y học,
chủ yếu dùng để điều trị các bệnh do nhiễm Pseudomonas [10].
Tetracyclin: Là kháng sinh được tách chiết từ dịch nuôi cấy một số chủng xạ
khuẩn thuộc chi Streptomyces, các CKS này có phổ kháng sinh rộng, chống
được cả VK G(+) và G(-), ricketsia và một vài loài virus lớn. Ngoài sử dụng
trong y học, tetracyclin còn được sử dụng trong chăn nuôi - thú y [2], [10].
Cloramphenicol: có nguồn gốc từ xạ khuẩn Streptomyces venezuelae, được
phát hiện vào năm 1947, có hoạt tính chống được nhiều VK G(+) và G(-).
Ngoài sử dụng trong y học, CKS này còn được dùng trong chăn nuôi - thú y
và thủy sản [32].
Erythromycin: Có nguồn gốc từ XK Streptomyces erythreus, là CKS có phổ
rộng đối với VK G(+), được sử dụng nhiều nhất trong điều trị bệnh viêm
phổi do Mycoplasma và viêm họng do liên cầu khuẩn [10], [23].
Novobicin: Có nguồn gốc từ XK Streptomyces spheroides và Streptomyces
niverus, có hoạt tính mạnh với các VK G(+). Đặc biệt có khả năng chống các
tụ cầu đã kháng với penicillin và một số CKS khác [21].

Amphoterycin B: Có nguồn gốc từ XK Streptomyces nodosus, được dùng để
điều chỉnh các bệnh ngoài da do nấm Candida abbicans gây ra [23].
Dactinomycin: Có nguồn gốc từ XK Streptomyces antibiticus, có hoạt tính
kìm hãm phát triển các khối u ác tính. Được dùng để điều trị một số bệnh
ung thư [23].
Daunorubixin: Có nguồn gốc từ XK Streptomyces coeruleorubidus, được
dùng để điều trị bệnh bạch cầu cấp tính, bệnh Hodgkin [23].
1.3. Ứng dụng của chất kháng sinh
11
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn
1.3.1. Ứng dụng trong y học
Kể từ khi CKS được sử dụng và đã cứu sống được bệnh nhân bị
nhiễm trùng máu năm 1941 [22], đến nay hàng loạt CKS đã được phát hiện
và ứng dụng trong y học đã đóng góp một phần không nhỏ trong công tác
phòng và điều trị bệnh tật, nhất là các bệnh nhiễm khuẩn của con người. Nhờ
có các loại thuốc kháng sinh mà con người đã khống chế và loại bỏ được
nhiều bệnh nguy hiểm như dịch tả, thương hàn v.v…
Hiện nay các loại bệnh phổ biến do nấm gây ra như nấm da, nấm tóc,
móng chân, móng tay… đều sử dụng kháng sinh để điều trị bằng cách bôi
trực tiếp lên da bị nhiễm bệnh hoặc bằng cách uống. Có nhiều loại thuốc
được sử dụng để điều trị bệnh này như: nystatin, natamicin, hamicin,
rimocyclin…
Phần lớn các CKS được sử dụng trong y học có nguồn gốc từ XK,
trong đó có tới 1/3 các chất kháng sinh là do xạ khuẩn hiếm sinh ra. Trong y
học, kháng sinh có thể được dùng kết hợp cùng lúc nhiều loại kháng sinh
nhằm mang lại hiệu quả cộng hợp - tăng liều gấp hai của mỗi loại kháng
sinh (khi kết hợp hai KS hãm khuẩn) hoặc hiệu quả cộng lực - tăng hiệu lực
của CKS (khi kết hợp hai KS diệt khuẩn) [22].
Căn bệnh ung thư là một trong số những bệnh rất nguy hiểm đối với
con người. Trước đây thường sử dụng biện pháp xạ trị và phẫu thuật để điều

trị thì ngày nay y học đã biết sử dụng thuốc KS trong trường hợp bệnh đã
chuyển sang giai đoạn di căn. Hiện nay y học đã sử dụng thuốc kháng sinh
trong điều trị ung thư như daunorubicin được dùng trong điều trị bệnh bạch
cầu cấp tính, đối với việc phòng loại bệnh này người ta đã dùng penicillin G
hay erythromycin. Các thuốc kháng sinh như mitomycin (do S. cacspitosus
sinh ra) được dùng trong điều trị ung thư vú, dạ dày, phổi, đại tràng [22].
Tuy nhiên, cho đến nay chưa có CKS nào có thể điều trị các bệnh do
virus gây ra một cách có hiệu quả do virus không chịu tác động của CKS.
1.3.2. Ứng dụng trong bảo vệ thực vật và chăn nuôi thú y
12
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn
Chất kháng sinh không chỉ được sử dụng trong y học để chữa bệnh
cho con người mà còn được ứng dụng rộng rãi trong một số lĩnh vực khác
như: bảo vệ thực vật, chăn nuôi, bảo quản thực phẩm…
Trong chăn nuôi, kháng sinh được dùng để phòng chữa bệnh và kích
thích tăng trọng cho gia súc, gia cầm.
Kháng sinh bổ sung vào thức ăn chăn nuôi có tác dụng ức chế và loại
bỏ sự hoạt động của vi khuẩn, đặc biệt là vi khuẩn gây bệnh đường tiêu hóa
và hô hấp trên động vật non, làm cho chúng khỏe mạnh, tăng trưởng tốt. Rất
nhiều KS được dùng với mục đích này như tetracyclin, bacitraxin,
monelzin… Ở Việt Nam, năm 1982 đã sản xuất chế phẩm biovit 5 và terravit
trên quy mô 12 tấn/năm. Kết quả thử nghiệm trên gia súc, gia cầm đã tăng
trọng 15 - 25%, giảm tiêu tốn thức ăn 8,2%, tăng sản lượng đẻ trứng ở gà 5 -
7% [1].
Hiện nay, biện pháp thường được sử dụng trong công tác bảo vệ thực
vật chống lại sâu bệnh là sử dụng các thuốc hóa học. Nhưng thuốc hóa học
có nhiều nhược điểm như hiện tượng kháng thuốc của sâu bệnh, mặt khác lại
gây ô nhiễm môi trường và nhiều chất độc tồn dư trong sản phẩm có thể gây
độc cho con người v.v… Để khắc phục những nhược điểm trên thì việc sử
dụng các CKS trong bảo vệ thực vật vừa có tác dụng nhanh, dễ phân hủy, có

tính đặc hiệu cao, chỉ tiêu diệt một hoặc một số sâu bệnh nhất định mà
không ảnh hưởng đến các loài có ích khác và đặc biệt chất kháng sinh còn có
khả năng ức chế các vi sinh vật đã kháng thuốc hóa học. Các kháng sinh
được dùng để tiêu diệt các nấm và vi khuẩn gây bệnh cho cây trồng như các
bệnh khô vằn, vàng lụa ở lúa, bệnh thối cổ rễ ở các cây có củ… Ngoài ra
CKS còn được sử dụng làm chất kích thích tăng trưởng ở những nồng độ
nhất định như kích thích sự nảy mầm của hạt. Các CKS được dùng trong
công tác bảo vệ thực vật thường ở dạng bột hoặc dung dịch có bổ sung các
chất độn để tăng độ bền của CKS. Các CKS có thể được trộn lẫn vào đất,
phun trực tiếp lên thực vật hoặc dùng trong quá trình xử lý hạt giống để tiêu
diệt các mầm bệnh ở bên trong và bên ngoài hạt.
13
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn
Ngày nay, việc sử dụng các CKS trong công tác bảo vệ thực vật được
phổ biến rộng rãi trên thế giới nhất là ở các nước Nga, Nhật, Trung Quốc,
Ấn Độ… Năm 1950, Trung Quốc đã tuyển chọn được chủng Streptomyces
sp. 5406 có khả năng ức chế Rhizoctonia solani và Verticillium albo – atrum
gây thối rễ ở bông non [19]. Năm 2002, ở Ấn Độ đã phân lập được chủng
Streptomyces sp. 201 có khả năng sinh CKS mới là z – methylheptyl iso –
nicotinate, CKS này có khả năng kháng được nhiều loại nấm gây bệnh như
Fusarium oxysporum, Fusarium solani, Fusarium semitectum, Fusarium
moniliforme…[17].
Hiện nay, nước ta cũng bắt đầu sử dụng các CKS có nguồn gốc từ
Trung Quốc, Nhật Bản để thay thế dần cho việc sử dụng các chất hóa học
độc hại trong công tác bảo vệ thực vật. Năm 2002, Trung tâm công nghệ
sinh học – ĐHQGHN đã phân lập được từ đất chủng XK Streptomyces sp .
LD30 có khả năng sinh CKS phổ rộng, kháng vi khuẩn và nấm, nhưng mạnh
nhất là chống chủng Pseudomonas solanacearum gây bệnh héo lá ở cây
trồng [4].
Ngoài công tác bảo vệ thực vật và chăn nuôi thú y thì CKS còn được

sử dụng trong công nghệ thực phẩm. Dùng kháng sinh để bảo quản thực
phẩm vừa rẻ vừa đơn giản, vừa không cần trang thiết bị đặc biệt nhưng vẫn
đảm bảo chất lượng thực phẩm. Một số CKS được sử dụng trong bảo quản
thực phẩm như: clotetraciclin, nisin, subtilin, actidion, biomicin… Tuy
nhiên, việc sử dụng CKS trong bảo quản thực phẩm cũng còn có một số tồn
tại: chất kháng sinh khó phân hủy và khi tồn dư trong thực phẩm có thể gây
ra nhiều mối nguy hiểm cho người, làm xuất hiện nhiều chủng vi sinh vật có
khả năng kháng thuốc, làm mất tác dụng của chất kháng sinh trong điều trị.
Vì vậy, để khắc phục tồn tại trên việc sử dụng chất kháng sinh trong bảo
quản thực phẩm cần phải tuân theo đúng nguyên tắc.
1.4. Khả năng tổng hợp enzyme của vi sinh vật
1.4.1. Ưu thế của vi sinh vật để sinh tổng hợp enzyme
14
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn
Enzyme là những protein được sản xuất tự nhiên từ thực vật, động vật, vi
sinh vật, có vai trò quyết định quá trình trao đổi chất của tế bào. Chúng là những
chất xúc tác thúc đẩy tốc độ các phản ứng hóa học mà không làm thay đổi tính
chất của chúng. Việc sản xuất và sử dụng enzyme đã có từ lâu ở nhiều nước trên
thế giới. Tuy nhiên, chỉ sau khi con người chứng minh được khả năng xúc tác
của enzyme ngoài tế bào thì việc nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng enzyme mới
thực sự phát triển mạnh mẽ. Ngày nay, nhiều loại enzyme đã được sản xuất ra
với sản lượng lớn và được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành kinh tế khác nhau
như: công nghiệp thực phẩm, dược phẩm, dệt, hóa chất… Trước đây con người
đã tiến hành sản xuất chế phẩm enzyme từ động, thực vật với khối lượng lớn
(vạn tấn/năm) nhưng không kinh tế và chưa đáp ứng được nhu cầu tiêu dùng, do
lượng enzyme trong cơ thể động, thực vật rất hạn chế. VSV trái lại có thể tổng
hợp được một lượng lớn các enzyme khác nhau. Do vậy VSV là đối tượng chính
được sử dụng để sản xuất enzyme trong vòng 30 năm trở lại đây [25].
Hệ enzyme ở VSV vô cùng phong phú: VSV có thể đồng hóa được hầu
hết các chất có trong thiên nhiên, từ các hợp chất đơn giản như: N

2
, S, Fe, CO
2
,
CH
4
… đến các hợp chất hữu cơ phức tạp như: tinh bột, protein, các pectin,
cellulose… chứng tỏ rằng trong tế bào VSV phải có chứa những hệ enzyme
tương ứng [3]. Điều đó cho phép con người mở ra khả năng tìm kiếm và chọn
lựa những phức hệ enzyme cần thiết phục vụ cho các nhu cầu công nghệ khác
nhau, đặc biệt là các nhóm enzyme không thể khai thác được từ nguồn động vật
và thực vật.
Enzyme VSV có hoạt tính cao hơn enzyme từ các sinh vật khác do VSV
có tốc độ chuyển hóa thức ăn rất lớn. VSV sinh trưởng và phát triển rất nhanh
chóng, hàm lượng enzyme trong tế bào tương đối lớn nên trên quy mô sản xuất
công nghiệp, chỉ sau khoảng thời gian ngắn đã có thể lên men sản xuất được
lượng lớn chế phẩm enzyme.
Việc lên men sản xuất enzyme có thể triển khai trên quy mô sản xuất
công nghiệp nên không bị hạn chế lớn về diện tích và sự biến đổi về thời tiết, khí
hậu… Phần lớn các thức ăn để nuôi VSV đều là các nguồn nguyên liệu đơn
15
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn
giản, rẻ tiền và dễ kiếm. Trong thực tiễn sản xuất enzyme hiện nay thường dùng
các nguyên liệu chất lượng thấp, các phụ phẩm hay phế thải của một số ngành
sản xuất khác và một số muối vô cơ. Do đó việc sản xuất enzyme nhờ VSV có
khả năng triển khai với nhiều ưu thế cho phép tạo hiệu quả kinh tế cao.
VSV rất nhạy cảm với tác động của môi trường và có khả năng điều
chỉnh quá trình trao đổi chất (mà thực chất là điều chỉnh sự sinh tổng hợp hay
điều chỉnh hoạt lực của enzyme) để thích nghi nhanh chóng với điều kiện môi
trường. Vì vậy, thông qua việc thay đổi thành phần môi trường dinh dưỡng hay

điều chỉnh các điều kiện trong quá trình lên men, người ta còn có khả năng điều
chỉnh phổ các enzyme sẽ được tổng hợp, làm tăng cường năng lực sinh tổng hợp
enzyme hay làm thay đổi hoạt tính của chúng.
Ngoài ra, so với nguồn enzyme động vật và thực vật, đối với nhóm
enzyme ngoại bào VSV người ta không cần phải phá vỡ tế bào nên có thể sử
dụng được tác nhân qua nhiều chu kỳ sản xuất, đồng thời, việc tinh chế thu
enzyme ngoại bào VSV thường dễ dàng và chi phí thấp hơn.
16
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn
1.4.2. Tuyển chọn các chủng sinh enzyme cao từ tự nhiên
VSV sống khắp nơi trên Trái Đất, chúng có khả năng biến dị nhanh để
duy trì sự sống và tồn tại trong các điều kiện sống thay đổi. VSV có hệ enzyme
đa dạng và phong phú. Tuy nhiên không phải tất cả các VSV đều có khả năng
sinh enzyme như nhau, ngay cả những chủng cùng một giống cũng không cùng
hoạt tính sinh tổng hợp enzyme. Vì vậy, khi tuyển chọn VSV để tìm kiếm, lựa
chọn và phân lập chủng có hoạt lực cao trong việc tạo thành enzyme mong
muốn là cần thiết. Ví dụ, muốn lựa chọn các chủng VSV sinh enzyme chịu nhiệt
nên lựa chọn từ suối nước nóng hay bể ủ rác thải; tuyển chọn các VSV sinh
enzyme chịu kiềm, chịu axit phải từ nơi có độ kiềm cao hay axit cao; lựa chọn
chủng sinh amylase thì lựa chọn nơi có nhiều tinh bột; lựa chọn chủng sinh
enzyme chịu mặn thì nên lựa chọn chủng từ nguồn nước biển; lựa chọn chủng
sinh cellulase thường tìm thấy ở các mẫu đất có nhiều xác thực vật bị phân hủy.
Như vậy, trong tự nhiên, nhiều loại VSV có khả năng sử dụng trong sản xuất đòi
hỏi các bước nghiên cứu công phu, mất nhiều công sức. Tuy hiện nay có nhiều
chủng VSV đã đưa vào sản xuất nhưng còn nhiều lĩnh vực đòi hỏi tiếp tục
nghiên cứu tuyển chọn các chủng mới nhằm phục vụ cao nhất cho con người.
1.4.3. Một số enzyme phổ biến có nguồn gốc từ vi sinh vật
Tuy đã biết hơn 1000 loại enzyme khác nhau nhưng cũng chỉ các enzyme
thủy phân mới được sử dụng rộng rãi trong hơn 30 ngành kinh tế khác nhau, đó
là các enzyme amylase, cellulase và protease. Lượng các enzyme sản xuất hàng

năm: protease từ vi khuẩn là 500 tấn/năm, protease từ nấm mốc là 10 tấn/năm,
pectinase là 10 tấn/năm… [26]. Các enzyme này có ứng dụng nhiều trong nông
nghiệp, đặc biệt là trong chăn nuôi, với mục đích là làm tăng giá trị dinh dưỡng,
tăng hệ số tiêu hóa thức ăn, giảm chi phí thức ăn… Các enzyme được dùng ngày
càng nhiều ở các nước trên thế giới.
* Enzyme amylase: Amylase là các enzyme đường hóa, có khả năng phân
hủy amylose và amylopectin và các polysaccharit tương tự giải phóng glucose.
Các enzyme này có ý nghĩa quan trọng trong việc phân hủy phế thải chứa các
nguồn tinh bột từ các làng nghề làm bún, bánh đa, bánh cuốn, chế biến nông sản
17
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn