Tnguyển chọn và nghiên cứu hoạt tính sinh học của một số chủng xạ khuẩn phân lập từ đất bị nhiễm quặng ở khu vực Trại Cau- Đồng Hỷ- Thái Nguyên

MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Tìm ra thuốc để chữa bệnh cho người, từ lâu đã là mơ ước của nhân
loại. Năm 1928, A. Fleming phát hiện ra Penicillin - một chất kháng sinh
(CKS) có nguồn gốc từ nấm Penicillium. Nhưng phải hơn 10 năm sau, vào
năm 1940, một nhóm các nhà khoa học mới tách chiết thành công được
Penicillin. Kể từ đó, Penicillin mới chính thức được dùng để chữa bệnh cho
người. Đây là một trong những thành tựu vĩ đại nhất của nhân loại trong thế
kỷ XX. Sự ra đời của CKS có vai trò quan trọng trong nhiều lĩnh vực sản xuất
và đời sống. Trong y học, CKS được sử dụng để phòng và chữa bệnh cho
người. Trong chăn nuôi, CKS được sử dụng để chữa bệnh và tăng trọng cho
vật nuôi. Trong nông nghiệp, CKS được sử dụng để thay thế thuốc hóa học và
dùng làm chất kích thích sinh trưởng. Ngoài ra, CKS còn được sử dụng để
bảo quản thực phẩm…[1].
Tuy nhiên, việc sử dụng các CKS không hợp lý đã dẫn đến sự xuất hiện
ngày càng nhiều các VSV gây bệnh có khả năng kháng lại các thuốc kháng
sinh hiện có, đặc biệt là nhiều loài VSV có khả năng kháng chéo nhiều CKS
có cấu trúc tương tự nhau. Do đó việc tìm ra những CKS mới, nhất là các
CKS có cấu trúc hóa học tự nhiên do chính VSV tiết ra cần được quan tâm
nhiều hơn. Hàng năm có khoảng vài trăm CKS mới được phát hiện và cho
đến nay, người ta đã phát hiện khoảng 17000 CKS có nguồn gốc VSV, hơn
30000 CKS bán tổng hợp, nhưng trong số các CKS này chỉ có 1 - 2% là được
sử dụng trong y học [15, 21].
Trong số các VSV có khả năng sinh CKS thì xạ khuẩn đóng vai trò
quan trọng hàng đầu, chiếm 80% các CKS được mô tả [18]. XK là nhóm sinh
vật nhân sơ (Prokaryote) với số lượng loài lớn và phân bố ở nhiều vùng sinh
thái khác nhau trên thế giới. Nhóm VSV này được biết đến với nhiều ứng
dụng thực tế thông qua việc tạo ra các sản phẩm trao đổi thứ cấp có giá trị sử
dụng cao như các enzym thủy phân hợp chất cao phân tử, chất kháng sinh và
nhiều hợp chất y dược khác.
1

Thái Nguyên là một tỉnh rất giàu tiềm năng về nông, lâm, ngư nghiệp
nên có khu hệ VSV khá phong phú. Đồng thời, Thái Nguyên cũng nằm trong
vùng sinh khoáng, có nhiều loại hình khoáng sản phân bố tập trung. Các hoạt
động khai thác khoáng sản đã có những tác động đáng kể đến môi trường đất
và qua đó chắc chắn sẽ có ảnh hưởng đến hệ VSV đất ở những khu vực này
mà hiện vẫn chưa được nghiên cứu.
Xuất phát từ những yêu cầu thực tế trên, từ xu hướng nghiên cứu trên
thế giới hiện nay và cũng như để góp phần khai thác nguồn VSV vô cùng
phong phú của Thái Nguyên, chúng tôi thực hiện đề tài: “Tuyển chọn và
nghiên cứu hoạt tính sinh học của một số chủng xạ khuẩn phân lập từ đất
bị nhiễm quặng ở khu vực Trại Cau - Đồng Hỷ - Thái Nguyên”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
- Tuyển chọn và nghiên cứu một số chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng
sinh có nhiều triển vọng ứng dụng trong thực tế.
- Tuyển chọn và nghiên cứu một số chủng xạ khuẩn có hoạt tính enzym
ngoại bào.
3. Nội dung nghiên cứu
- Phân lập và thuần khiết XK từ các mẫu đất.
- Kiểm tra HTKS của các chủng XK đã phân lập được với các VSVKĐ
để tuyển chọn ra các chủng có HTKS cao.
- Kiểm tra khả năng sinh enzym ngoại bào để chọn ra các chủng có
hoạt tính enzym cao.
- Xác định khả năng chịu nhiệt của dịch enzym.

2
Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu về xạ khuẩn
1.1.1. Vị trí phân loại và sự phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên
Theo hệ thống phân loại hiện nay, XK thuộc ngành Tenericutes (gồm

vi khuẩn G (+) và XK), thuộc giới vi khuẩn thật (Eubacteria) và siêu giới
nhân sơ (Prokaryota) [32].
Xạ khuẩn thuộc lớp Actinobacteria, phân lớp Actinobacteridae, bộ
Actinomycetales, bao gồm 10 phân bộ, 35 họ, 110 chi và 1000 loài trong đó
có 478 loài thuộc chi Streptomyces và hơn 500 loài thuộc các chi còn lại
được xếp vào nhóm XK hiếm [11, 36].
Xạ khuẩn phân bố rộng rãi trong tự nhiên và có thể tìm thấy trong hầu
hết các môi trường: đất, nước, không khí, thậm chí cả những môi trường mà
cả vi khuẩn và nấm mốc không phát triển được. XK phân bố nhiều nhất ở
trong đất, và đóng vai trò rất quan trọng trong chu trình tuần hoàn vật chất
trong tự nhiên. Chúng sử dụng acid humic và các chất hữu cơ khó phân giải
khác trong đất [36]. Theo Waksman thì trong một gam đất có khoảng 29.000 -
2.400.000 mầm XK, chiếm 9 - 45% tổng số VSV [34]. Sự phân bố của XK
phụ thuộc vào khí hậu, thành phần đất, mức độ canh tác và thảm thực vật. Sự
phân bố của XK còn phụ thuộc nhiều vào độ pH môi trường, chúng có nhiều
trong các lớp đất trung tính và kiềm yếu hoặc axit yếu 6,8 - 7,5. XK có rất ít
trong lớp đất kiềm hoặc axit và càng hiếm trong các lớp đất rất kiềm, số lượng
XK trong đất cũng thay đổi theo thời gian trong năm.
Một trong những đặc tính quan trọng nhất của XK là khả năng hình
thành chất kháng sinh, 60 - 70% XK được phân lập từ đất có khả năng sinh
CKS [15]. Ngoài ra, XK tham gia tích cực vào các quá trình chuyển hoá nhiều
hợp chất trong đất, nước. Dùng để sản xuất nhiều enzym như proteaza,
amylaza, cellulaza… một số axit amin và axit hữu cơ. Một số XK có thể gây
bệnh cho người, động vật [8].
3
1.1.2. Đặc điểm sinh học của xạ khuẩn
* Cấu tạo tế bào xạ khuẩn
Xạ khuẩn có cấu trúc tế bào tương tự như vi khuẩn G

(+), toàn bộ cơ

thể chỉ là một tế bào bao gồm các thành phần chính: thành tế bào, màng sinh
chất, nguyên sinh chất, chất nhân và các thể ẩn nhập. Thành tế bào của xạ
khuẩn có kết cấu dạng lưới, dày 10 - 20 nm có tác dụng duy trì hình dáng của
khuẩn ty, bảo vệ tế bào. Thành tế bào gồm 3 lớp: lớp ngoài cùng dày khoảng
60 ÷ 120A
0
, khi già có thể đạt tới 150 ÷ 200A
0
, lớp giữa rắn chắc, dày khoảng
50A
0
, lớp trong dày khoảng 50A
0
. Các lớp này chủ yếu cấu tạo từ các lớp
glucopeptide bao gồm các gốc N - axetyl glucozamin liên kết với N - axetyl
muramic bởi các liên kết 1,4 - β glucozit. Thành tế bào XK không chứa
cellulose và kitin nhưng chứa nhiều enzym tham gia vào quá trình trao đổi
chất và quá trình vận chuyển vật chất qua màng tế bào.
Căn cứ vào thành phần hoá học, thành tế bào XK được chia thành 4
nhóm chính [5, 9]. Bao gồm:
Nhóm I: Thành phần chính của thành tế bào là axit L - 2,6 diaminopimelic
(L - ADP) và glyxin. Chi Streptomyces thuộc nhóm này.
Nhóm II: Thành phần chính của thành tế bào là axit meso - 2,6
diaminopimelic (meso - ADP) và glyxin. Thuộc nhóm này gồm các giống:
Micromonospora, Actinoplanes, Ampullarriella…
Nhóm III: Thành phần chính của thành tế bào là axit meso - 2,6
-diaminopimelic. Thuộc nhóm này có các giống: Dermatophilus,
Geodermatophilus, Frankia…
Nhóm IV: Thành phần chính của thành tế bào là axit meso - 2,6
-diaminopimelic, arabinose và galactose. Thuộc nhóm này gồm các giống:

Mycobacterium, Nocardia, Pseudonocardia…[10].
Dưới lớp thành tế bào là màng sinh chất dày khoảng 50 nm được cấu
tạo chủ yếu bởi 2 thành phần là photpholipit và protein. Chúng có vai trò đặc
biệt quan trọng trong quá trình trao đổi chất và quá trình hình thành bào tử
của XK.
4
Tế bào chất của XK có chứa mezoxom, thể nhân, và các vật thể ẩn
nhập gồm các hạt poliphotphat và polixacarit. Nhân của tế bào XK không có
cấu trúc điển hình, chỉ là những nhiễm sắc thể không có màng. Khi còn non,
toàn bộ tế bào chỉ có 1 nhiễm sắc thể sau đó hình thành nhiều hạt rải rác
trong toàn bộ hệ khuẩn ty [25].
* Khuẩn lạc, khuẩn ty xạ khuẩn
Xạ khuẩn có hệ sợi rất phát triển, phân nhánh mạnh và không có vách
ngăn (trừ cuống bào tử khi hình thành bào tử). Hệ sợi XK có đường kính thay
đổi trong khoảng 0,2 ÷ 1 µm đến 2 ÷ 3 µm, chiều dài có thể đạt tới một vài
cm [11]. XK phát triển theo kiểu mọc chồi, phân nhánh theo kiểu 30 µm một
nhánh. Độ dài khuẩn ty XK trong giai đoạn phát triển là 11µm [35].
Khuẩn ty XK bắt màu gram dương, hiếu khí, hoại sinh, không hình
thành nha bào, không có lông và giáp mô, đa hình thái như dạng hình chùy,
dạng phân nhánh hay dạng sợi dài, dạng phân nhánh thành chùm, thành bó
gọi là khuẩn ty thể (mycelium). Kích thước và khối lượng khuẩn ty thường
không ổn định và phụ thuộc vào từng loại điều kiện nuôi cấy [31]. Hệ sợi của
XK có màu sắc rất đa dạng: xanh, đỏ, trắng, vàng, lục, lam, tím, hồng… Các
khuẩn ty non và các khuẩn ty có mang bào tử thường lớn hơn các khuẩn ty già
và khuẩn ty không mang bào tử. Các loài XK khác nhau đều có cùng một kiểu
cấu tạo hệ sợi, chỉ khác nhau ở chỗ có loài có hệ sợi dài, thẳng hay làn sóng
hoặc rất ít phân nhánh, có loài lại có hệ sợi ngắn, thường phân nhánh, thẳng
hoặc xoắn.
Khi nuôi cấy trên môi trường đặc khuẩn ty của XK phát triển thành 2 loại.
Một loại cắm sâu vào môi trường gọi là hệ sợi cơ chất (khuẩn ty cơ chất -

substrate mycelium) với chức năng chủ yếu là dinh dưỡng. Một loại phát triển
trên bề mặt thạch gọi là hệ sợi khí sinh (khuẩn ty khí sinh - aerial mycelium) với
chức năng chủ yếu là sinh sản [28]. Một số XK không có sợi khí sinh mà chỉ có
sợi cơ chất, làm cho bề mặt XK nhẵn và khó tách ra khi cấy truyền. Loại chỉ
có sợi khí sinh thì ngược lại, rất dễ tách toàn bộ khuẩn lạc khỏi môi trường
[25].
5
Hệ sợi của XK phát triển rất mạnh tạo thành các khuẩn lạc. Hình thái
của khuẩn lạc XK rất khác nhau, kích thước và hình dạng của chúng có thể
thay đổi phụ thuộc vào môi trường và điều kiện nuôi cấy như: thành phần môi
trường, nhiệt độ, độ ẩm… Khuẩn lạc thường có đường kính 0,5 ÷ 2 mm,
nhưng cũng có khuẩn lạc có đường kính đạt tới 1 cm hoặc lớn hơn nữa.
Khuẩn lạc XK thường rắn chắc, không trơn ướt như của vi khuẩn hay nấm
men mà thường có dạng thô ráp, không trong suốt, xù xì, có dạng vôi, dạng
nhung tơ hay màng dẻo… với nhiều màu sắc khác nhau: đỏ, da cam, vàng,
trắng, xanh… [8], có các nếp tỏa ra theo hình phóng xạ và bám sâu vào thạch.
Khuẩn lạc thường có cấu tạo 3 lớp: lớp vỏ ngoài có dạng sợi bện chặt, lớp
trong tương đối xốp và lớp giữa có cấu trúc tổ ong. Các sản phẩm trong quá
trình trao đổi chất như CKS, độc tố, enzym… có thể được tích lũy trong sinh
khối tế bào XK hay được tiết ra môi trường lên men. Hệ sợi cơ chất có thể tiết
vào môi trường các loại sắc tố, thường có màu xanh, tím, hồng, nâu, đen… có
sắc tố chỉ tan trong nước, có sắc tố chỉ tan trong dung môi hữu cơ [38].
* Bào tử của xạ khuẩn
Bào tử XK được hình thành trên các nhánh phân hóa của khuẩn ty khí
sinh (gọi là cuống sinh bào tử). Đó là cơ quan sinh sản đặc trưng cho XK.
Trên mỗi cuống sinh bào tử mang từ 30 ÷ 100 bào tử, đôi khi có thể mang tới
200 bào tử, nhưng cũng có khi chỉ mang một bào tử hoặc hai bào tử. Sự hình
thành bào tử ở XK có thể xảy ra do sự kết đoạn (fragmenlation) hoặc do sự
cắt khúc (segmentation) của cuống sinh bào tử.
Bào tử XK có nhiều hình dạng khác nhau, thường có hình trụ, ovan,

hình cầu, hình que với kích thước trung bình khoảng 0,7 ÷ 0,9 × 0,7 ÷ 1,9 µm.
Kích thước của bào tử thay đổi khác nhau tùy loài, tùy cá thể trong loài thậm
chí ngay trên cùng một chuỗi bào tử. Bề mặt bào tử XK có thể nhẵn (Sm -
Smooth), có gai (Sp - Spiny), khối u (Wa - Warty), nếp nhăn (Ru - Rugose)
hay dạng tóc Ha - Hair like [10].
Bào tử XK được bao bọc bởi màng mucopolysaccharide giàu protein
với độ dày khoảng 300 ÷ 400A
0
gồm có 3 lớp, các lớp này giúp cho bào tử
6
tránh được những ảnh hưởng bất lợi của ngoại cảnh như: nhiệt độ, độ ẩm,
pH… Hình dạng, kích thước của chuỗi bào tử và cấu trúc màng có thể thay
đổi khi nuôi cấy trên những môi trường có nguồn nitơ khác nhau [14].
* Đặc điểm sinh lý, sinh hóa
XK thuộc nhóm sinh vật dị dưỡng, chúng sử dụng đường, rượu, axit
hữu cơ, lipit, protein và nhiều hợp chất hữu cơ khác để làm nguồn cacbon,
muối nitrat, muối amôn, urê, amino axit, pepton để làm nguồn nitơ. Tuy nhiên
khả năng hấp thụ các chất này không giống nhau ở các loài hay các chủng
khác nhau.
Phần lớn XK là nhóm VSV hiếu khí, ưa ẩm, một số ít ưa nhiệt, nhiệt độ
thích hợp cho sự sinh trưởng là 25 - 30
0
C. Tuy nhiên, nhiệt độ tối ưu cho sinh
tổng hợp CKS thường chỉ nằm trong khoảng 18 - 28
0
C. Độ ẩm thích hợp đối
với XK dao động trong khoảng 40 - 50%, giới hạn pH trong khoảng 6,8 - 7,5.
XK không có giới tính [28]. XK có khả năng hình thành enzym và các CKS
nên được ứng dụng vào trong nhiều lĩnh vực của đời sống.
1.2. Sự hình thành chất kháng sinh từ xạ khuẩn

Một trong những đặc điểm quan trọng nhất của XK là khả năng hình
thành CKS. Trong số 8000 CKS hiện biết trên thế giới có trên 80% là có
nguồn gốc từ XK [5].
Một trong những tính chất của các CKS có nguồn gốc từ VSV nói
chung và từ XK nói riêng là có tác dụng chọn lọc. Mỗi CKS chỉ có tác dụng
với một nhóm VSV nhất định. Hầu hết CKS có nguồn gốc XK đều có phổ
kháng khuẩn rộng. Khả năng kháng khuẩn của các CKS là một đặc điểm quan
trọng để phân loại XK.
Có nhiều quan điểm khác nhau về khả năng hình thành CKS, nhưng có
hai giả thuyết được ủng hộ hơn cả là:
- Việc tổng hợp CKS nhằm tạo ra ưu thế phát triển cạnh tranh có lợi
cho chủng sinh kháng sinh, nhờ đó chúng có thể tiêu diệt hay kìm hãm được
sự phát triển của các loài khác cùng tồn tại và phát triển trong hệ sinh thái cục
bộ đó.
7
- Việc tổng hợp CKS là một đặc tính cần thiết và đảm bảo cho khả năng
sống sót cao của chủng sinh ra CKS trong tự nhiên, nhất là các loài có bào tử
[2].
Mặc dù CKS có cấu trúc khác nhau và VSV sinh ra chúng cũng đa
dạng, nhưng quá trình sinh tổng hợp chúng chỉ theo một số con đường nhất
định.
- CKS được tổng hợp từ một chất chuyển hóa sơ cấp duy nhất như
chloramphenicol, các kháng sinh thuộc nhóm nucleoside.
- CKS được hình thành từ hai hoặc ba chất trao đổi bậc một khác nhau
như lincomycin, novobiocin.
- CKS được hình thành bằng con đường polyme hóa các chất trao đổi
bậc một, sau đó tiếp tục biến đổi qua các phản ứng enzym khác.
Nhiều chủng xạ khuẩn có khả năng tổng hợp đồng thời hai hay nhiều
CKS có cấu trúc hóa học và có tác dụng tương tự nhau. Quá trình sinh tổng
hợp CKS phụ thuộc vào cơ chế điều khiển đa gen, ngoài các gen chịu trách

nhiệm tổng hợp CKS, còn có cả các gen chịu trách nhiệm tổng hợp các tiền
chất, enzym và cofactor [15].
1.3. Phương pháp phân loại xạ khuẩn
1.3.1. Phân loại theo phương pháp truyền thống
Cũng như đối với vi khuẩn, việc phân loại xạ khuẩn hiện nay chủ yếu
dựa vào phân tích trình tự gen mã hóa cho 16S rRNA. Bên cạnh đó các đặc
điểm về hóa phân loại, hình thái, các đặc điểm sinh lý, sinh hóa thường được
kết hợp để định danh xạ khuẩn một cách chính xác đến tên loài.
Trong các đặc điểm hóa phân loại, thành phần hóa học của thành tế bào
được coi là đặc điểm quan trọng nhất. Các đặc điểm hóa phân loại khác như
thành phần đường, menaquinone, photpholipit, axit béo của tế bào và tỷ lệ GC
trong ADN genom cũng mang tính đặc trưng cho loài và có ý nghĩa quan
trọng trong phân loại xạ khuẩn.
Các đặc điểm sinh lý, sinh hoá thường được kết hợp sử dụng trong
phân loại xạ khuẩn là khả năng đồng hoá các nguồn cacbon và nitơ, nhu cầu
8
các chất kích thích sinh trưởng, khả năng phân hủy các chất khác nhau nhờ hệ
thống enzym. Bên cạnh đó, các chỉ tiêu khác như mối quan hệ với pH, nhiệt
độ, khả năng chịu muối và các yếu tố khác của môi trường, mối quan hệ với
chất kìm hãm sinh trưởng và phát triển khác nhau, tính chất đối kháng và
nhạy cảm với CKS, khả năng tạo thành CKS và các sản phẩm trao đổi chất
đặc trưng khác của XK cũng được tiến hành phân tích đồng thời [10].
1.3.2. Phân loại theo phương pháp hiện đại
Các nhà khoa học trên thế giới đều cho rằng mức độ tương đồng về
trình tự rRNA phản ánh mối quan hệ tiến hóa giữa các cá thể VSV. Tất cả các
loài VSV trong sinh giới đều sử dụng cùng một cách tổng hợp protein nhờ các
riboxom. Vì vậy người ta đã tiến hành so sánh trình tự nucleotit của gen mã
hoá rRNA ở các VSV khác nhau để xác định mối quan hệ giữa chúng. rRNA
là phân tử lý tưởng cho các nghiên cứu về tiến hoá của VSV vì:
- Phân tử này có mặt trong mọi tế bào VSV.

- Thực hiện cùng một chức năng là cấu thành nên riboxom, bộ máy
tổng hợp protein của tế bào.
- Có kích thước vừa phải (1500 bp) để tiến hành các nghiên cứu phả hệ.
- Là một trong những cao phân tử xuất hiện sớm nhất trong lịch sử tiến
hóa.
Cấu trúc của rRNA thay đổi rất chậm theo thời gian, hay nói cách khác
các gen mã hoá cho chúng được bảo tồn rất tốt trong quá trình tiến hoá. Mặc
dù mang tính bảo thủ cao, các gen mã hoá cho rRNA cũng chứa những vùng
có mức độ bảo thủ thấp hơn, dễ có sự sai khác giữa các loài sinh vật khác
nhau. Dựa vào những vùng bảo thủ trong gen mã hoá cho rRNA, các nhà
khoa học đã thiết kế các cặp mồi vạn năng để có thể khuếch đại toàn bộ chiều
dài của gen, bao gồm cả các vùng biến đổi. So sánh sự khác biệt giữa các
vùng này, người ta có thể chỉ ra được những sự khác biệt giữa các loài gần gũi
[26].
Hiện nay phân loại XK cũng như vi khuẩn nói chung được tiến hành
dựa trên so sánh trình tự gen mã hóa cho phân tử 16S rRNA kết hợp với các
9
đặc điểm khác theo phân loại cổ truyền. Các nhà phân loại học thường lấy
ngưỡng 98% trong độ tương đồng về trình tự 16S rRNA để phân biệt hai loài
khác nhau. Bên cạnh đó, phép lai ADN genom cũng thường được tiến hành
như một thí nghiệm bổ sung để khẳng định vị trí phân loại tới mức độ loài.
Hai chủng XK (hay vi khuẩn nói chung) được coi là hai loài riêng biệt nếu
chúng có độ tương đồng về ADN genom thấp hơn 70%. Dựa trên mức độ
tương đồng về trình tự 16S rRNA người ta có thể dựng cây phát sinh chủng
loại (cây phả hệ) thể hiện mối tương quan của các loài đang nghiên cứu với
các loài có họ hàng gần và tổ tiên của chúng. Trong đa số trường hợp, các
phân tích về hóa phân loại và sinh lý, sinh hóa có sự tương đồng cao so với
phân loại theo trình tự 16S rRNA [27].
1.4. Ứng dụng của chất kháng sinh
1.4.1. Ứng dụng trong y học

Kể từ khi CKS được sử dụng và đã cứu sống được bệnh nhân bị nhiễm
trùng máu năm 1941 [21], đến nay hàng loạt CKS đã được phát hiện và ứng
dụng trong y học đã đóng góp một phần không nhỏ trong công tác phòng và
điều trị bệnh tật, nhất là các bệnh nhiễm khuẩn của con người. Nhờ có CKS
mà y học đã làm giảm bớt mối lo cho nhân loại về căn bệnh nhiễm trùng, điều
trị loại bỏ những mối nguy hiểm của một số bệnh thường gặp như thương
hàn, dịch hạch, dịch tả, thấp khớp, các bệnh về răng miệng, mắt, mũi.
Hiện nay các loại bệnh phổ biến do nấm gây ra như nấm da, nấm tóc,
móng chân, móng tay… đều sử dụng kháng sinh để điều trị bằng cách bôi trực
tiếp lên da bị nhiễm bệnh hoặc bằng cách uống. Có nhiều loại thuốc được sử
dụng để điều trị bệnh này như: nystatin, natamicin, hamicin, rimocyclin…
Phần lớn các CKS được sử dụng trong y học có nguồn gốc từ XK,
trong đó có tới 1/3 các CKS là do XK hiếm sinh ra. Trong y học, kháng sinh
có thể được dùng kết hợp cùng lúc nhiều loại kháng sinh nhằm mang lại hiệu
quả cộng hợp - tăng liều gấp hai của mỗi loại kháng sinh (khi kết hợp hai
kháng sinh hãm khuẩn) [21].
10
Hiện nay các CKS còn được sử dụng trong điều trị ung thư. Ngày nay y
học đã biết sử dụng thuốc kháng sinh trong trường hợp bệnh đã chuyển sang
giai đoạn di căn để thay thế cho biện pháp xạ trị và phẫu thuật. Cho đến nay
đã có nhiều loại thuốc kháng sinh được sử dụng trong điều trị ung thư như:
daunorubicin được dùng trong điều trị bệnh bạch cầu cấp tính, bệnh Hodgkin,
sarcom lưới… mitomycin dùng trong điều trị ung thư vú, dạ dày, tụy,
streptozocin dùng trong điều trị ung thư tụy…
Đến năm 2010 thuốc kháng sinh có 17 nhóm với gần 500 tên thuốc
trong đó có 4 nhóm chuyên biệt là chống nấm, chống lao, chống phong, trị
ung thư, còn lại 13 nhóm là thuốc trị các bệnh nhiễm khuẩn thông thường
[37]. Tuy nhiên vẫn chưa có một kháng sinh nào có tác dụng để điều trị virus.
Các bệnh do virus gây ra thường sử dụng các vaccin và interferon để điều trị.
1.4.2. Ứng dụng trong bảo vệ thực vật và chăn nuôi thú y

Trong công tác bảo vệ thực vật hiện nay, biện pháp phổ biến được sử
dụng để chống lại sâu bệnh là sử dụng các thuốc hóa học. Ngoài mặt tích cực
như: tiêu diệt được nhiều loài sâu bệnh, tác dụng nhanh, mạnh… thì nó cũng
có nhiều nhược điểm như: hiện tượng kháng thuốc của sâu bệnh, mặt khác nó
lại gây ô nhiễm môi trường và nhiều chất độc tồn dư trong sản phẩm có thể
gây độc cho con người.
Để khắc phục tình trạng trên, con người đã tìm ra một số biện pháp kỹ
thuật như thay đổi cơ cấu cây trồng, mùa vụ. Tuy nhiên biện pháp này gây
xáo trộn hệ sinh thái đồng ruộng, tạo điều kiện để phát sinh một số bệnh mà
trước đây ít gặp. Việc tuyển chọn các dòng cây kháng bệnh cũng chỉ được vài
năm, sau đó các tác nhân gây bệnh lại kháng lại.
Việc sử dụng CKS trong trồng trọt nhằm các mục đích như chống bệnh
do nấm gây ra trên rau quả và cây trồng, chống bệnh do vi khuẩn gây ra, diệt
côn trùng và cỏ dại... kiềm chế các bệnh thực vật sinh ra từ đất. So với thuốc
hóa học, dùng các CKS trong bảo vệ thực vật vừa có tác dụng nhanh, dễ phân
hủy, có tác dụng chọn lọc cao, độ độc thấp không gây ô nhiễm môi trường,
còn có khả năng ức chế các VSV đã kháng thuốc hóa học. CKS và dịch lên
11
men các chủng sinh CKS còn dùng để xử lý hạt giống với mục đích tiêu diệt
nguồn bệnh ở bên ngoài và trong hạt, diệt bệnh cả ở các bộ phận nằm trên đất
của cây và khử trùng đất [16].
Ngày nay, việc sử dụng các CKS trong bảo vệ thực vật được phổ biến
rộng rãi trên thế giới nhất là ở các nước Nga, Nhật, Trung Quốc, Ấn Độ... Ở
Trung Quốc đã tuyển chọn được nhiều chủng XK từ đất và nghiên cứu sản
xuất nhiều CKS phòng chống bệnh cây có hiệu quả cao như polixin chống
bệnh đạo ôn, jangamicin chống bệnh khô vằn. Năm 2002, ở Ấn Độ đã phân
lập được chủng Streptomyces sp. 201 có khả năng sinh CKS mới là z -
methylheptyl iso - nicotinate, CKS này có khả năng kháng được nhiều loại
nấm gây bệnh như Fusarium oxysporum, Fusarium solani, Fusarium
semitectum, Fusarium moniliforme... [16].

Ở Việt Nam cũng đã sử dụng nhiều chế phẩm kháng sinh trong bảo vệ
thực vật nhập từ Trung Quốc hay Nhật Bản và đã phân lập được một số chủng
XK có khả năng chống Pyricularia oryzae gây bệnh đạo ôn và Fusarium
oxysporum gây bệnh thối rễ ở thực vật [1]. Năm 2002, Trung tâm công nghệ
sinh học - Đại học Quốc gia Hà Nội đã phân lập được từ đất chủng xạ khuẩn
Streptomyces sp. LD30 có khả năng sinh chất kháng sinh phổ rộng, kháng vi
khuẩn và nấm, nhưng mạnh nhất là chống các chủng Pseudomonas
solanacearum gây bệnh héo lá ở cây trồng [4]. Tuy nhiên việc sử dụng CKS
trong lĩnh vực bảo vệ thực vật ở nước ta còn ở mức độ thấp bởi tập quán canh
tác chỉ quen dùng một số hóa chất bảo vệ thực vật nhất định.
Ngoài công tác bảo vệ thực vật thì CKS còn được sử dụng trong chăn
nuôi gia súc, gia cầm, nuôi trồng thủy sản, công nghệ thực phẩm… Các loại
CKS thường được sử dụng trong chăn nuôi như: biomycin, terranycin,
tetracyclin, bacitrcin… để phòng chống, điều trị bệnh và tăng trọng cho gia
súc, gia cầm. Kháng sinh bổ sung vào thức ăn chăn nuôi có tác dụng ức chế
và loại bỏ sự hoạt động của vi khuẩn, đặc biệt vi khuẩn gây bệnh đường tiêu
hóa và hô hấp trên động vật non, như vậy làm cho chúng khỏe mạnh tăng
trưởng tốt. Ở Việt Nam, năm 1982 đã sản xuất chế phẩm biovit 5 và terravit ở
12
quy mô 12 tấn /năm. Kết quả thử nghiệm trên gia súc, gia cầm đã tăng trọng
15 - 25%, giảm tiêu tốn thức ăn 8,2%, tăng sản lượng đẻ trứng ở gà 5 - 7%
[1]. Trong công nghiệp thực phẩm, việc sử dụng CKS kết hợp với công nghệ
làm lạnh có thể làm tăng thời gian bảo quản của thực phẩm mà không gây độc
hại cho con người. Một số chất kháng sinh thường được sử dụng trong bảo
quản thực phẩm như: clotetracyclin, nisin, subtilin, actidion, biomicin,… Các
chất kháng sinh sử dụng theo hướng này cần phải có phổ tác dụng rộng để tác
động lên cả vi khuẩn và nấm. Tuy nhiên, việc sử dụng chất kháng sinh trong
bảo quản thực phẩm cũng còn có một số tồn tại: chất kháng sinh khó phân
hủy và khi tồn dư trong thực phẩm có thể gây ra nhiều mối nguy hiểm cho
người, làm xuất hiện nhiều chủng vi sinh vật có khả năng kháng thuốc, làm

mất tác dụng của chất kháng sinh trong điều trị. Vì vậy để khắc phục tồn tại
trên, việc sử dụng chất kháng sinh trong bảo quản thực phẩm cần phải tuân
theo đúng nguyên tắc.
1.5. Khả năng tổng hợp enzym ở vi sinh vật
1.5.1. Ưu thế của vi sinh vật để sinh tổng hợp enzym
Enzym là chất xúc tác sinh học do tế bào tổng hợp nên và chúng có vai
trò rất quan trọng, quyết định quá trình trao đổi chất của tế bào. Việc sản xuất
và sử dụng enzym đã có từ lâu ở nhiều nước trên thế giới. Tuy nhiên, chỉ sau
khi con người chứng minh được khả năng xúc tác của enzym ngoài tế bào thì
việc nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng enzym mới thực sự phát triển mạnh
mẽ. Ngày nay, nhiều loại enzym đã được sản xuất ra với sản lượng lớn và
được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành kinh tế khác nhau như: công nghiệp
thực phẩm, dược phẩm, dệt, hóa chất… Trước đây con người đã tiến hành sản
xuất chế phẩm enzym từ động, thực vật với khối lượng lớn (hàng vạn
tấn/năm) nhưng không kinh tế và chưa đáp ứng được nhu cầu tiêu dùng, do
lượng enzym trong cơ thể động, thực vật rất hạn chế. VSV trái lại có thể tổng
hợp được một lượng lớn các enzym khác nhau. Do vậy VSV là đối tượng
chính được sử dụng để sản xuất enzym trong vòng 30 năm trở lại đây [22].
13
Hệ enzym ở VSV vô cùng phong phú: VSV có thể đồng hóa được hầu
hết các chất có trong thiên nhiên, từ các hợp chất đơn giản như: N
2
, S, Fe,
CO
2
, CH
4
… đến các hợp chất hữu cơ phức tạp như: tinh bột, protein, các
pectin, cellulose… chứng tỏ rằng trong tế bào VSV phải có chứa những hệ
enzym tương ứng [3]. Điều đó cho phép con người mở ra khả năng tìm kiếm

và chọn lựa những phức hệ enzym cần thiết phục vụ cho các nhu cầu công
nghệ khác nhau, đặc biệt là các nhóm enzym không thể khai thác được từ
nguồn động vật và thực vật.
Enzym VSV có hoạt tính cao hơn enzym từ các sinh vật khác do VSV
có tốc độ chuyển hóa thức ăn rất lớn. VSV sinh trưởng và phát triển rất nhanh
chóng, hàm lượng enzym trong tế bào tương đối lớn nên trên quy mô sản xuất
công nghiệp, chỉ sau khoảng thời gian ngắn đã có thể lên men sản xuất được
lượng lớn chế phẩm enzym.
Việc lên men sản xuất enzym có thể triển khai trên quy mô sản xuất
công nghiệp nên không bị hạn chế lớn về diện tích và sự biến đổi về thời tiết,
khí hậu… Phần lớn các thức ăn để nuôi VSV đều là các nguồn nguyên liệu
đơn giản, rẻ tiền và dễ kiếm. Trong thực tiễn sản xuất enzym hiện nay chúng
thường dùng các nguyên liệu chất lượng thấp, các phụ phẩm hay phế thải của
một số ngành sản xuất khác và một số muối vô cơ. Do đó việc sản xuất enzym
nhờ VSV có khả năng triển khai với nhiều ưu thế cho phép tạo hiệu quả kinh
tế cao.
VSV rất nhạy cảm với tác động của môi trường và có khả năng điều
chỉnh quá trình trao đổi chất (mà thực chất là điều chỉnh sự sinh tổng hợp hay
điều chỉnh hoạt lực của enzym) để thích nghi nhanh chóng với điều kiện môi
trường nuôi. Vì vậy, thông qua việc thay đổi thành phần môi trường dinh
dưỡng hay điều chỉnh các điều kiện trong quá trình lên men, người ta còn có
khả năng điều chỉnh phổ các enzym sẽ được tổng hợp, làm tăng cường năng
lực sinh tổng hợp enzym hay làm thay đổi hoạt tính của chúng.
Ngoài ra, so với nguồn enzym động vật và thực vật, đối với nhóm
enzym ngoại bào VSV người ta không cần phải phá vỡ tế bào nên có thể sử
14
dụng được tác nhân qua nhiều chu kỳ sản xuất, đồng thời, việc tinh chế thu
enzym ngoại bào VSV thường dễ dàng và chi phí thấp hơn.
1.5.2. Tuyển chọn các chủng sinh enzym cao từ tự nhiên
VSV sống khắp nơi trên Trái Đất, chúng có khả năng biến dị nhanh để

duy trì sự sống và tồn tại trong các điều kiện sống thay đổi. VSV có hệ enzym
đa dạng và phong phú. Tuy nhiên không phải tất cả các VSV đều có khả năng
sinh enzym như nhau, ngay cả những chủng cùng một giống cũng không cùng
hoạt tính sinh tổng hợp enzym [19]. Vì vậy, khi tuyển chọn VSV để tìm kiếm,
lựa chọn và phân lập chủng có hoạt lực cao trong việc tạo thành enzym mong
muốn là cần thiết. Ví dụ, muốn lựa chọn các chủng VSV sinh enzym chịu
nhiệt nên lựa chọn từ suối nước nóng hay bể ủ rác thải; tuyển chọn các VSV
sinh enzym chịu kiềm, chịu axit phải từ nơi có độ kiềm cao hay axit cao; lựa
chọn chủng sinh amylaza thì lựa chọn nơi có nhiều tinh bột; lựa chọn chủng
sinh enzym chịu mặn thì nên lựa chọn chủng từ nguồn nước biển; lựa chọn
chủng sinh cellulase thường tìm thấy ở các mẫu đất có nhiều xác thực vật bị
phân hủy. Như vậy, trong tự nhiên, nhiều loại VSV có khả năng sử dụng
trong sản xuất đòi hỏi các bước nghiên cứu công phu, mất nhiều công sức.
Tuy hiện nay có nhiều chủng VSV đã đưa vào sản xuất nhưng còn nhiều lĩnh
vực đòi hỏi tiếp tục nghiên cứu tuyển chọn các chủng mới nhằm phục vụ cao
nhất cho con người.
1.5.3. Một số enzym vi sinh vật chủ yếu
Tuy đã biết hơn 1000 loại enzym khác nhau nhưng cũng chỉ các enzym
thủy phân mới được sử dụng rộng rãi trong hơn 30 ngành kinh tế khác nhau,
đó là các enzym amylaza, enzym cellulaza và enzym proteaza. Lượng các
enzym sản xuất hàng năm: Proteaza từ vi khuẩn là 500 tấn/năm, proteaza từ
nấm mốc là 10 tấn/năm, pectinaza là 10 tấn/năm [22]. Các enzym này có ứng
dụng nhiều trong nông nghiệp, đặc biệt là trong chăn nuôi, với mục đích là
làm tăng giá trị dinh dưỡng, tăng hệ số tiêu hóa thức ăn, giảm chi phí thức
ăn… Enzym được dùng ngày càng nhiều ở các nước trên thế giới.
15
- Enzym amylaza: enzym này bao gồm nhiều nhóm men khác nhau, đó
là amylaza, glucoamylaza, glucozidaza, dextrinaza… Các enzym này có ý
nghĩa quan trọng trong việc phân hủy phế thải chứa các nguồn tinh bột từ các
làng nghề làm bún, bánh đa, bánh cuốn, chế biến nông sản ngô, khoai, sắn...

Từ các phế thải lương thực này, nhờ các amylaza có thể dùng để sản xuất
alcohol. Cũng nhờ các enzyme đường hoá α-amylaza và glucoamylaza, từ
các phế thải lương thực chứa tinh bột của các dây chuyền quy trình chế biến
thức ăn có thể sản xuất màng bao gói có tính chất phân huỷ quang học và
sinh học.
- Enzym cellulaza: Trong thập kỷ qua, enzym thuỷ phân cellulose ngày
càng được quan tâm. Sự quan tâm này là do các enzym này có khả năng thủy
phân chất thải chứa celluloza, chuyển hoá các hợp chất kiểu lignocelluloza và
celluloza trong rác thải tạo nên nguồn năng lượng thông qua các sản phẩm
đường, ethanol, khí sinh học hay các các sản phẩm giầu năng lượng khác. Thí
dụ: từ các chất thải nhà máy giấy như các sản phẩm từ bột giấy và giấy có thể
thu nguồn năng lượng ethanol [29].
- Enzym proteaza: Proteaza thuộc nhóm enzym thủy phân protein được
sử dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm, chẳng hạn trong chế biến cá
và thịt. Proteaza có thể thủy phân các protein có trong chất thải, để sản xuất
các dung dịch đặc hoặc các chất rắn khô có giá trị dinh dưỡng cho cá hoặc vật
nuôi. Proteaza thủy phân các protein không tan thông qua nhiều bước, ban
đầu chúng được hấp thụ lên các chất rắn, cắt các chuỗi polypeptit tạo thành
các liên kết lỏng trên bề mặt. Sau đó, quá trình hoà tan những phần rắn xảy ra
với tốc độ chậm hơn phụ thuộc vào sự khuếch tán enzym lên bề mặt cơ chất
và tạo ra những phần nhỏ. Chính vì tính chất trên mà proteaza được sử dụng,
một mặt để tận dụng các phế thải từ nguồn protein để những phế thải này
không còn là các tác nhân gây ô nhiễm môi trường, một mặt để xử lý các phế
thải protein tồn đọng trong các dòng chảy thành dạng dung dịch rửa trôi
không còn mùi hôi thối [30].
16
Chương 2
ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
Các mẫu đất được lấy ở những địa điểm khác nhau thuộc khu vực Trại

Cau - Đồng Hỷ - Thái Nguyên. Từ đó phân lập được 92 chủng xạ khuẩn.
2.2. Đối tượng nghiên cứu
2.2.1 Xạ khuẩn
92 chủng xạ khuẩn được phân lập từ các loại đất khác nhau thuộc khu
vực Trại Cau - Đồng Hỷ - Thái Nguyên.
2.2.2. Vi sinh vật kiểm định
7 chủng VSVKĐ nhận từ Viện Bảo tàng giống chuẩn VSV Việt Nam
và Viện Kiểm nghiệm - Bộ Y tế và Khoa Vi sinh vật - Bệnh viện Đa khoa
TW - Thái Nguyên. (Bảng 2.1).
Bảng 2.1. 7 chủng Vi sinh vật kiểm định
Vi sinh vật kiểm định Cơ quan cung cấp
VK G (+)
Staphylococcus aureus ATCC 25923
Viện Kiểm Nghiệm –
Bộ Y tế
Bacillus subtilis VTCC-B-888
Viện Bảo tàng giống
chuẩn VSV
VK G (-)
Escherichia coli VTCC-B-883
Viện Bảo tàng giống
chuẩn VSV
Pseudomonas aeruginosa VTCC-
B-481
Viện Bảo tàng giống
chuẩn VSV
Nấm mốc
Fusarium oxysporum VTCCF-1301
Viện Bảo tàng giống
chuẩn VSV

Fusarium solani VTCCF-1302
Viện Bảo tàng giống
chuẩn VSV
Aspergillus niger VTCCF-001
Viện Bảo tàng giống
chuẩn VSV
2.3. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị
2.3.1. Hóa chất
- Các loại đường chuẩn: glucose, saccarose, lactose, fructose, mantose… của
hãng Merck (Đức), Trung Quốc sản xuất.
17
- Các loại muối: K
2
HPO
4
, KH
2
PO4, KI, MgSO
4
.7H
2
O, KNO
3
, CaCO
3
, NaCl,
FeSO
4
.7H
2

O… nhập từ Anh, Trung Quốc.
- Các loại cao: cao thịt, cao nấm men, cao malt, peptone… của hãng Merck
(Đức).
- Các loại hóa chất khác: Thạch, tinh bột tan, casein, CMC (Carboxyl Methyl
Cellulose)… của Nhật, Trung Quốc, Việt Nam sản xuất.
2.3.2. Dụng cụ và thiết bị
- KHVQH Olympus (Nhật) - Tủ ấm, tủ sấy Memmert (Đức)
- KHVĐT Joel (Nhật) - Cân phân tích, cân kỹ thuật
- Máy lắc (Hàn Quốc) - Nồi khử trùng (Đài Loan)
- Box cấy vô trùng Nuaire (Mỹ) - Máy đo pH 151 Martini (Nhật)
- Máy ly tâm Hettich (Đức) - Máy cất nước Hamilton
- Tủ lạnh - Lò vi sóng Sharp
- Các dụng cụ thủy tinh của Trung Quốc, Đức, Việt Nam…
2.3.3. Môi trường nghiên cứu
* Môi trường gause 1 (g/l) (môi trường phân lập xạ khuẩn)
- Tinh bột tan - 20 - FeSO
4
- 0.01
- NaCl - 0.5 - Thạch - 20
- K
2
HPO
4
- 0.5 - Nước cất vừa đủ 1 lít
- MgSO
4
.7H
2
O - 0.5 - pH = 6,8 - 7
- KNO

3
- 1
* Môi trường MPA (g/l) (môi trường nuôi vi khuẩn)
- Cao thịt - 5 - Thạch - 20
- Pepton - 10 - Nước cất vừa đủ 1 lít
- NaCl - 5 - pH = 7 -7,2
* Môi trường khoai tây (PDA - Potato Dextrose Agar) (g/l) (môi trường phân
lập và giữ giống nấm)
- Khoai tây - 200 - Nước cất vừa đủ 1 lít
- Đường - 20 - pH = 7 - 7,4
- Thạch - 20
18