Phân lập và tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng thủy phân keratin từ lông vũ gia cầm và thiết kế vector tái tổ hợp biểu hiện keratinase trong tế bào vi khuẩn E.Coli

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM

NGUYỄN THỊ MINH

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG VI SINH VẬT
CÓ KHẢ NĂNG THỦY PHÂN KERATIN TỪ LÔNG VŨ GIA CẦM
VÀ THIẾT KẾ VECTOR TÁI TỔ HỢP BIỂU HIỆN KERATINASE
TRONG TẾ BÀO VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN – 2011

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM

NGUYỄN THỊ MINH

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG VI SINH VẬT
CÓ KHẢ NĂNG THỦY PHÂN KERATIN TỪ LÔNG VŨ GIA CẦM
VÀ THIẾT KẾ VECTOR TÁI TỔ HỢP BIỂU HIỆN KERATINASE
TRONG TẾ BÀO VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI
Chuyên ngành : Di truyền học
Mã số: 60.42.70

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Huy Hoàng

THÁI NGUYÊN – 2011

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




Luận văn Thạc sĩ khoa học

HVCH: Nguyễn Thị Minh

LỜI CẢM ƠN
Em xin bày tỏ lòng biết ơn tri ân và sâu sắc tới TS. Nguyễn Huy Hoàng
– Phó trưởng Phòng Vi sinh vật đất, Viện Công nghệ Sinh học, Viện KH&CN
Việt Nam, là người thầy_người anh đã tận tình hướng dẫn, dìu dắt, tạo mọi
điều kiện thuận lợi giúp đỡ và chia sẻ những khó khăn cùng em trong suốt quá
trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn.
Trong quá trình nghiên cứu vừa qua, em đã nhận được sự giúp đỡ và chỉ
bảo tận tình của các cán bộ Phòng Vi sinh vật đất, đặc biệt là Th.S. Nguyễn
Quỳnh Mai, CN. Nguyễn Thu Hiền đã giúp đỡ em trong quá trình tiến hành
thí nghiệm.
Em cũng xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo tham gia giảng dạy tại
Khoa Sinh-KTNN Đại Học Thái Nguyên- ĐH Sư Phạm Thái Nguyên- Khoa
đào tạo sau đại học đã truyền đạt cho em những kiến thức bổ ích trong suốt 2
năm qua.
Bên cạnh đó, em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới BGH cùng toàn

thể cán bộ giáo viên trường THPT Điềm Thụy, Phòng ADT ứng dụng thuộc
Phòng thí nghiệm trọng điểm CNG đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ em
trong quá trình học tập và nghiên cứu tại Trường và Viện
Cuối cùng, em xin gửi tới bố, mẹ và những người thân trong gia đình
lòng biết ơn sâu sắc, cảm ơn những người bạn đã chia sẻ khó khăn thử thách
trong cuộc sống và công việc để em có được kết quả này.
Một lần nữa em xin chân thành cảm ơn!
Thái Nguyên, tháng 09 năm 2011

Nguyễn Thị Minh

Chuyên ngành Di truyền học

Lớp Sinh K17


Luận văn Thạc sĩ khoa học

HVCH: Nguyễn Thị Minh

MỤC LỤC
Trang
Trang phụ bìa

i

Lời cảm ơn

ii

Mục lục

iii

Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt

iv

Danh mục các bảng

v

Danh mục các hình

vi

MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1
PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................. .3
1.1. Keratin .. ...................................................................................................3
1.2. Keratinase ............................................................................................... .6
1.3. Đa dạng vi sinh vật có khả năng sinh keratinase cao .............................. 8
1.4. Tình hình nghiên cứu ........................................................................... .12
1.4.1 Tình hình nghiên cứu trong nước ..................................................... .12
1.4.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới .................................................... 13
1.5. Sản xuất và ứng dụng quá trình thuỷ phân keratin trong lông vũ ......... 14
1.5.1. Tăng hàm lượng chất dinh dưỡng trong thức ăn gia súc ................. 17
1.5.2. Tạo phân bón .................................................................................... 17
1.5.3. Tạo enzyme trong các ngành công nghiệp ....................................... 18
1.5.4. Cải tạo đất......................................................................................... 18
1.5.6. Tạo hợp chất màu ............................................................................. 19

1.5.7. Ứng dụng trong công nghiệp dược và sản xuất thực phẩm chức năng ... 19
PHẦN II: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ..................................... 20
2.1. Nguyên liệu ........................................................................................... 20
2.1.1. Nguyên liệu ...................................................................................... 20
2.1.2. Hoá chất............................................................................................ 20
2.1.3. Thiết bị ............................................................................................. 20

Chuyên ngành Di truyền học

i

Lớp Sinh K17


Luận văn Thạc sĩ khoa học

HVCH: Nguyễn Thị Minh

2.1.4. Môi trường nuôi cấy ......................................................................... 20
2.1.4.1. Môi trường Broth Peptone.......................................................... 20
2.1.4.2. Môi trường I ............................................................................... 20
2.1.4.3. Môi trường II .............................................................................. 21
2.1.4.4. Môi trường III ............................................................................. 21
2.1.4.5. Môi trường để phân lập chủng Chryseobacterium ................... .21
2.1.4.6. Môi trường nuôi lắc lông vũ ...................................................... 21
2.1.4.7. Môi trường MPA ........................................................................ 21
2.2. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................... 22
2.2.1. Phân lập chủng vi khuẩn có khả năng sinh keratinase cao .............. 22
2.2.1.1. Lấy mẫu và đo pH đất ................................................................. 22
2.2.1.2. Phân lập chủng vi khuẩn Chryseobacterium .............................. 22

2.2.1.3. Phân lập chủng vi khuẩn Vibrio ................................................. 23
2.2.1.4. Phân lập chủng vi khuẩn Bacillus............................................... 23
2.2.2. Xác định khả năng thuỷ phân lông vũ ............................................. 23
2.2.2.1. Nuôi giống cấp 1 vào môi trường MPA ..................................... 23
2.2.2.2. Xác định mật độ tế bào............................................................... 25
2.2.3. Lựa chọn môi trường thích hợp cho các chủng vi khuẩn có khả
năng sinh keratinase cao ............................................................................ 25
2.2.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH lên khả năng sinh trưởng của vi
khuẩn thủy phân lông vũ............................................................................ 26
2.2.5. Xác định đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn ..................... 26
2.2.6. Xác định gram âm và gram dương của vi khuẩn ............................ 26
2.2.6.1. Phương pháp Hucker cải tiến ..................................................... 26
2.2.6.2. Xác định bằng cách kiểm tra độ kết dính ................................... 27
2.2.7. Phương pháp phân loại vi khuẩn theo đặc tính sinh hoá ................. 28
2.2.8. Chọn dòng gene keratinase vào vector biểu hiện pET32a .............. 30
2.2.8.1. Tách chiết DNA tổng số của chủng vi khuẩn ............................ 30
2.2.8.2. Nhân bản đoạn DNA bằng PCR ................................................ 32

Chuyên ngành Di truyền học

ii

Lớp Sinh K17


Luận văn Thạc sĩ khoa học

HVCH: Nguyễn Thị Minh

2.2.9. Phân tích hoạt tính keratinase ngoại bào ......................................... 38

PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................... 41
3.1. Kết quả lấy mẫu ở các địa điểm ............................................................ 41
3.2. Giá trị pH của các mẫu đất.................................................................... 41
3.3. Phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả thủy phân keratin ..... 42
3.4. Lựa chọn môi trường thích hợp của các chủng được chọn lọc............. 44
3.5. Tối ưu nhiệt độ của các chủng vi khuẩn chọn lọc ................................ 47
3.6. Đặc điểm hình thái nhóm vi khuẩn thuỷ phân lông vũ ......................... 48
3.7. Kết quả xác định gram của các chủng vi khuẩn ................................... 49
3.8. Phân loại các chủng phân lập theo phương pháp sinh hoá ................... 50
3.8.1. Phân loại theo kit API 50CHB của chủng vi khuẩn Đ.GT.2.2 ....... 50
3.8.2. Phân loại theo kit API 20NE của chủng vi khuẩn L.SC.1.2 ........... 51
3.9. Phân loại theo kiểu gene ....................................................................... 52
3.9.1. Tách DNA tổng số ........................................................................... 52
3.9.2. Nhân đoạn gene mã hóa 16S rARN bằng kỹ thuật PCR ................. 53
3.10. Chọn dòng gene keratinase vào vector biểu hiện pET32a ................. 55
3.10.1. Nhân đoạn gene keratinase bằng kỹ thuật PCR .......................... 55
3.10.2. Gắn sản phẩm PCR đã thôi gel tinh sạch vào vector tách
dòng pET32a ........................................................................................... 56
3.10.3. Biến nạp sản phẩm lai vào tế bào khả biến DH10B ................... 58
3.10.4. Tách DNA plasmid tái tổ hợp ..................................................... 59
3.11. Đánh giá hoạt tính ezyme dịch thô của chủng chọn lọc ................... 60
3.11.1. Định lượng Protein bằng phương pháp Bradford ....................... 60
3.11.2. Thử hoạt tính enzyme bằng azokeratin ....................................... 62
PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................... 64
4.1 Kết luận .................................................................................................. 64
4.2 Kiến nghị ................................................................................................ 64
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 65

Chuyên ngành Di truyền học

iii

Lớp Sinh K17


Luận văn Thạc sĩ khoa học

HVCH: Nguyễn Thị Minh

BẢNG CHỮ VIẾT TẮT
PCR

Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp)

EtBr

Dung dịch Ethidium Bromide

BSA

Bovine serum albumin

DNA

Deoxyribonucleic axid

rARN

Ribosomal ribonucleic acid

LB

Luria-Bertani

Ker

Keratinase

bp

Base pair(cặp ba zơ)

E.coli

Escherichia coli.

µl

Microlit

EtOH

Ethanol

Primer-F

Mồi xuôi

Primer-R

Mồi ngược

Chuyên ngành Di truyền học

iv

Lớp Sinh K17


Luận văn Thạc sĩ khoa học

HVCH: Nguyễn Thị Minh

DANH MỤC CÁC BẢNG
Số hiệu bảng

Tên bảng

Trang

1.1

Sự đa dạng của vi sinh vật có khả năng sinh

9

keratinase và các đặc tính hóa sinh của keratinase
1.2

Ứng dụng của enzyme

16

2.1

49 phép thử lên men API 50 CHB

28

2.2

50 phép thử sinh hóa API 20 CHB

31

3.1

Địa điểm lấy mẫu

41

3.2

Giá trị pH của các mẫu đất

41

3.3

Tỷ lệ thủy phân lông vũ của các chủng tuyển chọn

43

3.4

Mật độ tế bào và khả năng thủy phân 1 gam lông vũ

47

ở các nhiệt độ khác nhau(Sau 4 ngày nuôi cấy lắc)
3.5

Kết quả xác định gram âm, gram dương

50

3.6

Kết quả phép thử sinh hóa theo kit API 50 CHB của

50

chủng Đ.G.T.2.2
3.7

Kết quả phép thử sinh hóa theo kit API 50 CHB của

52

chủng L.SC.1.2

3.8

Kết quả đo giá trị mật độ quang (OD) của BSA

61

3.9

Kết quả đo giá trị mật độ quang (OD) và hàm lượng

62

protein của dịch nổi vi khuẩn
3.10

Kết quả xác định hoạt tính enzyme keratinase

Chuyên ngành Di truyền học

v

63

Lớp Sinh K17


Luận văn Thạc sĩ khoa học

HVCH: Nguyễn Thị Minh

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
Số hiệu hình vẽ

Tên hình vẽ

Trang

1.1

Một số hình dạng lông vũ

3

1.2

Cấu tạo phân tử keratin

5

1.3

Ảnh dưới kính hiển vi các sợi bên trong tế bào

6

keratin
1.4

Cấu tạo phân tử enzyme keratinase

7

3.1

Khả năng thủy phân lông vũ của 4 chủng chọn lọc

44

(Sau 4 ngày nuôi cấy lắc)
3.2

Khả năng sinh trưởng và thủy phân lông vũ của

46

các chủng vi khuẩn trên các môi trường khác nhau
(Sau 4 ngày nuôi cấy lắc)
3.3

Khả năng thủy phân lông vũ của các chủng vi

46

khuẩn trên các môi trường khác nhau (Sau 4 ngày
nuôi cấy lắc)
3.4

Khả năng thủy phân lông vũ của các chủng vi

48

khuẩn các khung nhiệt độ khác nhau (Sau 4 ngày
nuôi cấy lắc)
3.5

Hình ảnh tế bào vi khuẩn với độ phóng đại 4800

49

lần
3.6

Ảnh điện di DNA tổng số

53

3.7

Sản phẩm PCR bằng mồi 16S

54

3.8

Cây phát sinh chủng loại của 2 chủng Đ.GT.2.2

55

và L.SC.1.2
3.9

Sản phẩm PCR bằng mồi ker F và ker R

56

3.10

Sản phẩm thôi gel tinh sạch gene ker

56

Chuyên ngành Di truyền học

vi

Lớp Sinh K17


Luận văn Thạc sĩ khoa học

3.11

HVCH: Nguyễn Thị Minh

Sản phẩm tinh sạch gene ker và vector

57

pET32asau khi xử lý bằng 2 enzyme cắt
3.12

Vector tái tổ hợp pET32a /ker

58

3.13

Sản phẩm biến nạp của 2 chủng vi khuẩn vào tế

58

bào khả biến E.coli DH10B
3.14

Ảnh điện di sản phẩm tách DNA plasmid tái tổ

59

hợp của các chủng sau biến nạp
3.15

Sản phẩm phản ứng cắt DNA plasmid tái tổ hợp

60

bằng 2 enzyme cắt XhoI và BamHI
3.16

Đường chuẩn Bradford

Chuyên ngành Di truyền học

vii

61

Lớp Sinh K17


data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....

data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....

data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....

data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....

data error !!! can't not
read....