Phân lập và tuyển chọn một số chủng vi sinh vật có khả năng sinh enzyme cellulase từ rong giấy tại hòn chồng nha trang

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƢỜNG
*****






ĐIỀN THỊ PHƢƠNG
MSSV: 48134256




PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG VI SINH
VẬT CÓ KHẢ NĂNG SINH ENZYME CELLULASE TỪ RONG
GIẤY TẠI HÕN CHỒNG – NHA TRANG



ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC




GVHD: TS. VŨ NGỌC BỘI

Nha Trang, năm 2010

i
LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành Đồ án này
Trƣớc hết tôi xin gửi tới Ban Giám Hiệu Trƣờng Đại học Nha Trang,
Ban Giám đốc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trƣờng, Phòng Đào tạo Đại
học và Sau đại học niềm kính trọng, sự tự hào đƣợc học tập tại trƣờng trong
những năm qua.
Sự biết ơn sâu sắc nhất tôi xin đƣợc giành cho thầy: TS. Vũ Ngọc Bội -
Phó Giám đốc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trƣờng - Trƣờng Đại học
Nha Trang đã tận tình hƣớng dẫn và động viên tôi trong suốt quá trình thực
hiện đồ án tốt nghiệp này.
Xin cám ơn: PGS. TS. Ngô Đăng Nghĩa - Giám đốc Viện Công nghệ
Sinh học và Môi trƣờng, ThS. Khúc Thị An - Quyền Trƣởng Bộ môn Công
nghệ Sinh học và các thầy cô phản biện đã cho tôi những lời khuyên quí báu
để công trình nghiên cứu đƣợc hoàn thành có chất lƣợng.
Đặc biệt xin đƣợc ghi nhớ tình cảm, sự giúp đỡ của: các thầy cô giáo
trong Bộ môn Công nghệ Sinh học - Viện Công nghệ Sinh học và Môi trƣờng
- Trƣờng Đại học Nha Trang, Phòng thí nghiệm CNSH đã giúp đỡ nhiệt tình
và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian tôi thực hiện đồ án này.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, ngƣời thân và các bạn bè đã tạo điều
kiện, động viên khích lệ để tôi vƣợt qua mọi khó khăn trong quá trình học tập
vừa qua.

ii
MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i
MỞ ĐẦU 1
CHƢƠNG I. TỔNG QUAN 3
1.1. TỔNG QUAN VỀ CELLULASE 3
1.1.1. Giới thiệu về cellulose 3
1.1.2. VSV sinh tổng hợp cellulase 5
1.2. ỨNG DỤNG CỦA ENZYME CELLULASE 6
1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ ENZYME CELLULASE 8
1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới 8
1.3.2. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc 9
CHƢƠNG II. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 10
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU 10
2.1.1. Rong giấy 10
2.1.2. VSV sinh cellulase. 10
2.1.3. Môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật 10
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11
2.2.1. Phƣơng pháp phân lập 11
2.2.2. Phƣơng pháp tuyển chọn chủng VSV sinh cellulase mạnh nhất 13
2.2.3. Bố trí thí nghiệm xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp 13
2.2.4. Phƣơng pháp phân loại chủng vi sinh vật 14
2.2.5. Kiểm tra khả năng lên men các loại đƣờng và khả năng sinh hơi 15
2.2.6. Kiểm tra khả năng chịu muối 15
2.2.7. Kiểm tra khả năng sinh tổng hợp các enzyme thủy phân khác 15
2.3. PHƢƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 16
2.4. DỤNG CỤ THÍ NGHIỆM 16
CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 17

iii
3.1. PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VSV SINH CELLULASE
CAO TỪ RONG GIẤY 17

3.2. XÁC ĐỊNH MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG SINH
TỔNG HỢP ENZYME CELLULASE CỦA CÁC CHỦNG N3 VÀ N4 TUYỂN
CHỌN ĐƢỢC 19
3.2.1. Ảnh hƣởng của thời gian 19
3.2.2. Ảnh hƣởng của nhiệt độ 211
3.2.3. Ảnh hƣởng của nồng độ chất cảm ứng 23
3.2.4. Ảnh hƣởng của pH ban đầu 244
3.3. SƠ BỘ PHÂN LOẠI HAI CHỦNG NẤM N3 VÀ N4 266
3.4. XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HÓA CỦA N3 VÀ N4 30
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 34
KẾT LUẬN 34
ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 35
TÀI LIỆU THAM KHẢO 36
TIẾNG VIỆT Error! Bookmark not defined.
TIẾNG ANH Error! Bookmark not defined.
PHỤ LỤC 40












iv
DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Một số VSV sản xuất cellulase 6
Bảng 3.1. Hoạt tính cellulase của một số chủng VSV phân lập 17
Bảng 3.2. Hoạt tính cellulase của 4 chủng đã qua sơ tuyển 18
Bảng 3.3. Khả năng lên men các loại đƣờng của hai chủng N3 và N4 30
Bảng 3.4. Khả năng chịu muối của hai chủng N3 và N4 311


v
DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Cấu trúc không gian của phân tử cellulose 3
Hình 1.2. Cấu trúc phân tử celulose 3
Hình 1.3. Cơ chế tác dụng của cellulase 5
Hình 2.1. Quá trình phân lập vi sinh vật sinh cellulase từ rong giấy 13
Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp 14
Hình 3.1. Hình ảnh về hai chủng nấm sợi có khả năng sinh cellulase mạnh nhất 19
Hình 3.2. Hoạt tính cellulase của hai chủng N3 và N4 trên CMC 19
Hình 3.3. Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh cellulase của chủng N3 20
Hình 3.4. Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh cellulase của chủng N4 20
Hình 3.5. Ảnh hƣởng của nhiệt độ tới khả năng sinh cellulase của chủng N3 22
Hình 3.6. Ảnh hƣởng của nhiệt độ tới khả năng sinh cellulase của chủng N4 22
Hình 3.7. Ảnh hƣởng của nồng độ chất cảm ứng đến khả năng sinh cellulase của chủng N323
Hình 3.8. Ảnh hƣởng của nồng độ chất cảm ứng đến khả năng sinh cellulase của chủng N4233
Hình 3.9. Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng đến khả năng sinh cellulase của chủng N3 25
Hình 3.10. Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng đến khả năng sinh cellulase của chủng N4 255
Hình 3.11. Hình thái khuẩn lạc của chủng N3 trên đĩa petri 266
Hình 3.12. Hệ sợi nấm N3 ở các độ phóng đại 10X; 40 X 27
Hình 3.13. Hệ sợi nấm N3 ở các độ phóng đại 40 X và 100X 277
Hình 3.14. Hình thái khuẩn lạc chủng N4 trên đĩa petri 277

Hình 3.15. Hệ sợi chủng N4 ở các độ phóng đại 40 X và 100X. 28
Hình 3.16. Cuống đính bào tử của chủng N4 ở độ phóng đại 100X 288
Hình 3.17. Các kiểu cuống bào tử đính của Aspergillus theo Samson và cộng sự, (1995) 29
Hình 3.18. Một số hình ảnh về khả năng lên men đƣờng của hai chủng N3 và N4 31
Hình 3.19. Khả năng chịu muối của chủng N3 và N4 ở nồng độ 6% 32
Hình 3.20. Khả năng sinh tổng hợp các enzyme thủy phân của chủng N3 và N4 32

1
MỞ ĐẦU
Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của Công nghệ sinh học, các chế
phẩm enzyme đƣợc sản xuất càng nhiều và đƣợc sử dụng trong hầu hết trong các
lĩnh vực nhƣ: công nghiệp, chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế…
Các enzyme đang đƣợc sử dụng phổ biến protease, amylase, pectinase,
glucooxydase, …
Cellulase là một trong số các enzyme đƣợc ứng dụng phổ biến trong công
nghệ thực phẩm, công nghiệp dệt, bia - rƣợu, bột giặt, sản xuất phân bón hữu cơ, y
tế, xử lý môi trƣờng, Đặc biệt hiện nay cellulase đƣợc toàn thế giới quan tâm
nghiên cứu và phát triển nhằm ứng dụng trong công nghệ chế tạo nhiên liệu sinh
học. Đây là nguồn nhiên liệu thân thiện với môi trƣờng và có thể giải quyết đƣợc
vấn đề thiếu nhiên liệu khi các nguồn nhiên liệu truyền thống đang ngày càng cạn
kiệt.
Tuy vậy, hiện nay enzyme cellulase đƣợc sử dụng trong các ngành công
nghiệp ở Việt Nam chủ yếu đƣợc nhập khẩu từ nƣớc ngoài với giá thành cao.
Nƣớc ta là một nƣớc sản xuất nông nghiệp nên nguồn nguyên liệu dùng để sản
xuất enzyme cellulase là rất phong phú. Vì thế, việc nghiên cứu sản xuất ra các
enzyme từ vi sinh vật phân lập từ tự nhiên tại Việt Nam hiện nay đang là một đòi
hỏi cấp thiết. Việc tuyển chọn các vi sinh vật có khả năng sản xuất enzyme nhất là
cellulase từ tự nhiên không những giúp tận dụng các nguồn gen quý hiếm có sẵn từ
tự nhiên mà còn góp phần bảo tồn gen, cải tạo các chủng vi sinh vật công nghiệp
đã bị thoái hóa giống sau một thời gian sử dụng. Xuất phát từ lý do trên và tình

hình nghiên cứu tại Việt nam, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: “Phân lập và
tuyển chọn một số chủng vi sinh vật có khả năng sinh enzyme cellulase từ rong
giấy tại Hòn Chồng-Nha Trang” với mục tiêu: thu thập các chủng vi sinh vật chịu
mặn có khả năng sinh cellulase có thể thủy phân rong giấy với họat tính cao làm cơ
sở cho việc sản xuất enzyme cellulase, ứng dụng trong sản xuất cồn từ rong biển -
một hƣớng đang đƣợc toàn thế giới quan tâm.

2

Nội dung của đề tài:
1) Phân lập và tuyển chọn được chủng vi sinh vật chịu mặn có khả năng sinh
cellulase cao từ rong giấy thu tại Hòn Chồng-Nha Trang;
2) Sơ bộ phân loại các chủng vi sinh vật sinh cellulase cao phân lập được;
3) Xác định một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp cellulase
của chủng vi sinh tuyển chọn được.
Do thời gian nghiên cứu có hạn nên báo cáo không thể tránh đƣợc các hạn chế.
Em rất mong nhận đƣợc các ý kiến góp ý của những ai quan tâm đến vấn đề này, để
cho báo cáo thêm hoàn thiện. Em xin chân thành cám ơn.

3
CHƢƠNG I. TỔNG QUAN
1.1. TỔNG QUAN VỀ CELLULASE
1.1.1. Giới thiệu về cellulose
Cellulose là thành phần cơ bản của thực vật. Ngoài ra, ngƣời ta còn thấy chúng
có nhiều ở tế bào một số loài vi sinh vật (VSV). Ở tế bào thực vật và một số tế bào
vi sinh vật, chúng tồn tại ở dạng sợi.

Hình 1.1. Cấu trúc không gian của phân tử cellulose
Cellulose không có trong tế bào động vật. Chúng là một homopolimer mạch
thẳng, đƣợc cấu tạo bởi các β-D-glucose-pyranose. Các thành phần này liên kết với
nhau bởi liên kết glucose, liên kết các glucose này với nhau bằng liên kết α-1,4
glucoside. Các gốc glucose trong cellulose thƣờng lệch nhau một góc 180
o
và có
dạng nhƣ một chiếc ghế bành. Cellulose thƣờng chứa 10.000-14.000 gốc đƣờng và
đƣợc cấu tạo nhƣ hình 1.1 và hình 1.2.

Hình 1.2. Cấu trúc phân tử celulose
Cellulose là chất hữu cơ khó phân hủy. Ngƣời và hầu hết động vật không có
khả năng phân hủy cellulose. Do đó, khi thực vật chết hoặc con ngƣời thải các sản
phẩm hữu cơ có nguồn gốc thực vật đã để lại trong môi trƣờng lƣợng lớn rác thải
hữu cơ. Tuy nhiên nhiều chủng VSV bao gồm nấm, xạ khuẩn và vi khuẩn có khả

4
năng phân hủy cellulose thành các sản phẩm dễ phân hủy nhờ enzyme cellulase
(Trịnh Đình Khá và cộng sự, 2007).

Cellulase là phức hệ enzyme thủy phân cellulose tạo thành các phân tử đƣờng
β-glucose. Theo kết quả nghiên cứu của một số tác giả, cellulose bị phân hủy dƣới
tác dụng hiệp đồng của phức hệ cellulase bao gồm ba enzyme là Exo-β-(1,4)-
glucananse hay enzyme C
1
, Endo-β- glucananse hay endocellulase còn gọi là
enzyme CMC-ase hay C
x
và β-(1,4)-glucosidase hay cellobioase:
Exo-1,4-gluconase (hay cellobiohydrolase, C1 EC 3.2.1.91) giải phóng
cellobiose hoặc glucose từ đầu không khử của cellulose, tác dụng yếu lên CMC
nhƣng tác dụng mạnh lên cellulose vô định hình hoặc cellulose đã bị phân giải một
phần. Tác dụng lên cellulose kết tinh không rõ nhƣng khi có mặt endoglucanase thì
có tác dụng hiệp đồng rõ rệt.
Endo-1,4-glucanase (hay CMC-ase, Cx, EC 3.2.1.4) thủy phân liên kết ß-1,4-
glucoside và tác động vào chuỗi cellulose một cách tùy tiện, sản phẩm của quá trình
thủy phân là cellobiose và glucose. Do thủy phân CMC hoặc cellulose theo kiểu tùy
tiện nên endo-1,4-glucanase làm giảm nhanh chiều dài chuỗi cellulose và tăng chậm
các nhóm khử, enzyme tác dụng mạnh lên cellodextrin. Enzyme này hoạt động
mạnh ở vùng vô định hình nhƣng lại hoạt động yếu ở vùng kết tinh của cellulose.
ß-1,4-glucosidase (hay cellobiase, EC 3.2.1.21) thủy phân cellobiose và các
cellodextrin khác hòa tan trong nƣớc sinh ra, chúng có hoạt tính cao trên cellobiase,
còn cellodextrin thì hoạt tính thấp và giảm khi chiều dài của chuỗi tăng lên. Chức
năng của ß-glucosidase có lẽ là điều chỉnh sự tích lũy các chất cảm ứng của
cellulase.
Cơ chế tác dụng của enzyme cellulase
Cellulase là một hệ enzyme phức tạp xúc tác sự thủy phân cellulose thành
cellobiose và cuối cùng thành glucose.
Sự phân giải cellulose dƣới tác dụng của hệ enzyme cellulase xảy ra theo 3
giai đoạn chủ yếu sau:

5
Trong giai đoạn thứ nhất, dƣới tác dụng của tác nhân C
1
, cellulose bị thủy
phân thành cellulose hòa tan. Trong giai đoạn thứ hai, cellulose hòa tan sẽ bị thủy
phân dƣới tác dụng xúc tác của hệ enzyme C
x
tạo thành đƣờng cellobiose.
Ở giai đoạn cuối cùng, dƣới tác dụng của enzyme ß-1,4-glucosidase (hay
cellobiase, EC 3.2.1.21), cellobiose bị thủy phân thành glucose.

Hình 1.3. Cơ chế tác dụng của cellulase
Các loài vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp cellulase trong điều kiện tự
nhiên thƣờng bị ảnh hƣởng bởi tác động nhiều mặt của các yếu tố ngoại cảnh nên có
loài phát triển rất mạnh, có loài phát triển yếu. Chính vì thế, việc phân hủy cellulose
trong tự nhiên đƣợc tiến hành không đồng bộ, xảy ra rất chậm.
1.1.2. VSV sinh tổng hợp cellulase
Trong điều kiện tự nhiên, cellulose bị phân hủy bởi VSV cả trong điều kiện
hiếu khí và yếm khí. Các loài VSV thay phiên nhau phân hủy cellulose đến sản
phẩm cuối cùng là glucose. Số lƣợng các loài VSV tham gia sinh tổng hợp enzyme
có trong điều kiện tự nhiên rất phong phú. Chúng thuộc nấm sợi, xạ khuẩn, vi khuẩn
và trong một số trƣờng hợp các nhà khoa học còn thấy cả nấm men cũng tham gia
quá trình phân giải này. Bảng 1.1 dƣới đây là một số loại VSV đƣợc các nhà khoa
học nghiên cứu kỹ nhất.

6
Bảng 1.1. Một số VSV sản xuất cellulase
Nấm sợi
Xạ khuẩn

Vi khuẩn
Aspergillus niger
A.oryzae
A.terreus
A.syndovii
A. flavus
Fusarium culmorum
Fusarium oxysporum
Mucor pusilus
Pen. notatum
Penicillium spp
Trichoderma lignorum
Trichoderma reesei
Trichoderma viride
Trichoderma konongi

Actinomyces aureus
Act.cellulose
Act.diastaticus
Act. roseus
Act.griseus
Act.melamocylas
Act.coelicolor
Act.candidus
Act.chromogenes
Act. hygroscopicus
Act.griseofulvin
Act.ochroleucus
Act.thermofulcus
Act.xanthostrums

Thermonospora curvata
Preudomonas
Fluorescens
B.megaterium
B.mensenteroides
Clostridium sp.
Acetobacter xylinum
Vi khuẩn dạ cỏ
Ruminoccus albus
Ruminobacter parum
Bacteroides
Amylophillus sp.
Clos.butiricum
Clos.locheheadil
Cellulosemonas
1.2. ỨNG DỤNG CỦA ENZYME CELLULASE
Hiện nay, enzyme cellulase đƣợc ứng dụng mạnh mẽ trong các ngành công
nghiệp khác nhau nhƣ: công nghiệp thực phẩm, công nghiệp sản xuất bia rƣợu,
công nghiệp chế biến thức ăn gia súc, công nghiệp dệt, sản xuất bột giặt, sản xuất
giấy, trong nông nghiệp
Ứng dụng trƣớc tiên của cellulase đối với chế biến thực phẩm là tăng độ hấp
thu, nâng cao phẩm chất về vị và làm mềm nhiều loại thực phẩm thực vật, đặc biệt
là đối với thức ăn cho trẻ em. Một số nƣớc đã dùng cellulase để xử lý các loại rau
quả nhƣ bắp cải, hành, cà rốt, khoai tây, táo và lƣơng thực nhƣ gạo, mỳ… hay xử lý

7
chè và các loại tảo biển… Hay trong công nghiệp chế biến thức ăn gia súc, cellulase
cùng với hemicellulase đƣợc ứng dụng nhằm làm tăng khả năng hấp thu các chất từ
thức ăn.
Trong sản xuất bia, dƣới tác dụng của cellulase hay phức hệ citase trong đó có

cellulase, thành tế bào của hạt đại mạch bị phá hủy tạo điều kiện tốt cho tác động
của protease và quá trình đƣờng hóa.
Trong sản xuất agar-agar, sử dụng cellulase xúc tác để xử lý rong thu agar-
agar có chất lƣợng cao hơn so với phƣơng pháp dùng acid để phá vỡ thành tế bào.
Mặt khác khi sử dụng cellulase để xử lý rong thu agar-agar lại giúp hạn chế ô nhiễm
môi trƣờng so với phƣơng pháp sử dụng acid vốn gây ô nhiễm môi trƣờng.
Cellulase ứng dụng trong xử lý môi trƣờng: enzyme cellulase đóng một vai trò
vô cùng quan trọng trong việc phân hủy cellulose có trong chất thải, sự có mặt của
enzyme cellulase sẽ giúp cho sự phân hủy cellulose trong tự nhiên dễ dàng và hiệu
quả hơn. Hiện nay enzyme cellulase là thành phần quan trọng của chế phẩm sinh
học (các chế phẩm EM) trong xử lý ô nhiễm môi trƣờng.
Trong nông nghiệp, cellulase đƣợc dùng để phân hủy cellulose từ các phế phụ
phẩm để sản xuất phân bón hữu cơ thay thế cho các loại phân bón hóa học truyền
thống làm giảm ô nhiễm môi trƣờng cũng nhƣ sự thoái hóa đất.
Trong ngành công nghệ sản xuất bột giặt enzyme cellulase đƣợc sử dụng nhƣ
một tác nhân nhằm làm hoàn thiện cho bột giặt (tẩy sạch vết bẩn, vải rờ mịn tay, sợi
vải sáng bóng hơn và không làm hại da tay).
Cellulase đƣợc ứng dụng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật. Sự phá vỡ màng
tế bào là một việc đòi hỏi các kỹ thuật công phu và tốn kém. Ngƣời ta có thể thu
nhận các tế bào trần bằng phƣơng pháp xử lý qua enzyme cellulase. Khi đó ta sẽ thu
đƣợc tế bào trần của thực vật (protoplast) và tế bào trần nấm men (spheroplast).
Chế phẩm cellulase tinh khiết đƣợc ứng dụng trong kỹ thuật di truyền. Trong
kỹ thuật tạo tế bào trần (protoplas), ngƣời ta thƣờng dùng chế phẩm cellulase tinh
khiết để phá vỡ thành tế bào thực vật. Ứng dụng cellulase phá vỡ thành tế bào thực

8
vật không làm tổn thƣơng các cơ quan bên trong tế bào, đảm bảo sự nguyên vẹn các
nhân tố di truyền.
Ngoài ra, việc sản xuất enzyme cellulase có hoạt độ cao để phân hủy cellulose
thành các nguồn nhiên liệu sinh học đang đƣợc quan tâm đặc biệt trong ngành công

nghiệp năng lƣợng sạch của toàn thế giới.
1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ ENZYME CELLULASE
1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Nghiên cứu và ứng dụng của cellulase bắt đầu từ những năm 1950. Cuối thế
kỷ XIX đã có rất nhiều tác giả nghiên cứu về khả năng tổng hợp cellulase từ các
loại vi sinh vật. Một số nghiên cứu về cellulase từ nấm của một sồ tác giả nhƣ :
Trichoderma reseii (Ogawa và cộng sự, 1991), Aspergillus sp. (Lusta và cộng sự,
1999), Schizophillum commune (Wilick & Seligy, 1985), Fusarium lini, Penicillium
funiculosum (Fogarty & Kelly, 1990). Năm 2000, Mawadza và cộng sự đã nghiên
cứu về khả năng tổng hợp cellulase từ các loại nấm có tính đặc hiệu cao bao gồm
phức hệ 3 enzyme: endoglucanase, cellobihydrolase và β-glucosidase thủy phân
hoàn toàn cellulose.
Trong số những nghiên cứu về khả năng sinh cellulase của vi khuẩn thì
Bacillus là chủng có khả năng sản sinh cellulase ngoại bào với số lƣợng lớn, và
đƣợc quan tâm nghiên cứu nhiều hơn cả đặc biệt là: B.subtilis (Park và cộng sự,
1991), B.polymxa, B.cereus (Robson & Chambliss, 1989), B.pumilus
(Christakopoulos và cộng sự, 1999), Bacillus sp. KMS-330 (Ozaki & Ito, 1991) và
KMS-635 (Ito và cộng sự, 1989).
Do cellulase có nhiều ứng dụng, cho nên rất nhiều nghiên cứu về enzyme
cellulase nhƣ: nghiên cứu về các tính chất hóa lý của chúng nhƣ xác định khối
lƣợng phân tử của Macarrón và cộng sự (1993); Sang và cộng sự (1995);
Henriksson và cộng sự (1999); Karisson và cộng sự (2001); Coral và cộng sự
(2002); Hiroshi và cộng sự (2005), xác định nhiệt độ tối ƣu của Isabel và cộng sự
(1992); Macarrón và cộng sự (1993); Coral và cộng sự (2002), xác định pH tối ƣu

9
(Macarrón và cộng sự, 1993; Coral và cộng sự, 2002), xác định ảnh hƣởng của ion
kim loại (Sang và cộng sự, 1995).
1.3.2. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc
Trong những năm gần đây ở Việt Nam đã có một số nghiên cứu về vi sinh vật

phân hủy cellulose và cellulase (Đặng Minh Hằng, 1999; Hoàng Quốc Khánh và
cộng sự, 2003; Trịnh Đình Khá và cộng sự, 2007; Nghiêm Ngọc Minh và cộng sự,
2006). Những nghiên cứu này chủ yếu đề cập vấn đề phân lập các chủng vi sinh vật
và đánh giá ảnh hƣởng của một số yếu tố môi trƣờng đến khả năng sinh tổng hợp
cellulase nhƣ: tuyển chọn, nghiên cứu ảnh hƣởng của các yếu tố môi trƣờng lên khả
năng sinh tổng hợp cellulase và tinh sạch, đánh giá tính chất hóa lý của cellulase từ
chủng penicillium sp. DTQ - HK1 (Trịnh Đình Khá và cộng sự, 2007). Nghiên cứu
phân loại và xác định hoạt tính cellulase của chủng xạ khuẩn ƣa nhiệt XKS
2
(Nghiêm Ngọc Minh và cộng sự, 2006).
Từ các phân tích ở trên cho thấy hiện ở Việt Nam chƣa có công trình nào công
bố về việc phân lập tuyển chọn các chủng vi sinh vật sinh enzyme celluase từ rong
giấy. Vì thế việc “Phân lập và tuyển chọn một số chủng vi sinh vật có khả năng sinh
enzyme cellulase từ rong giấy tại Hòn Chồng-Nha Trang” là cần thiết nhằm thu
thập các chủng vi sinh vật chịu mặn có khả năng sinh cellulase có thể thủy phân
rong giấy với họat tính cao làm cơ sở cho việc sản xuất enzyme cellulase ứng dụng
trong sản xuất cồn từ rong biển - một hƣớng đang đƣợc toàn thế giới quan tâm.



10
CHƢƠNG II. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU
2.1.1. Rong giấy:
Mẫu rong giấy mục đƣợc lấy từ bãi biển Hòn Chồng - Nha Trang. Rong Giấy
có tên khoa học là: Ulva retieulata, Thuộc ngành: Chlorophyta, lớp:
Chlorophyceae, bộ: Ulvales.
2.1.2. VSV sinh cellulase:
Bao gồm cả nấm mốc, xạ khuẩn và vi khuẩn hiện diện trên rong giấy.
2.1.3. Môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật

* Môi trƣờng phân lập VSV: các loại môi trƣờng sử dụng: thạch thƣờng,
capek, ISP
4
, các môi trƣờng đƣờng (glucose, maltose, manitol, D-frucrose, sucrose,
lactose) đều của Merck - Đức cung cấp.
* Môi trƣờng ISP - 4 (g/l):
K
2
HPO
4
.3H
2
O 1 g
MgSO
4
.7H
2
O 1 g
CaCO
3
2 g
(NH
4
)
2
SO
4
2 g
Tinh bột tan 10 g
NaCl 1 g

Agar 15 g
Nƣớc 1 lít
pH 6 - 7
* Môi trƣờng Capek - dox (g/l):
NaNO
3
3 g
KH
2
PO
4
1 g
MgSO
4
.7H
2
O 0,5 g
KCl 0,5 g
Saccarose 30 g
Agar 20 g

11
Nƣớc cất 1 lít
pH 5 - 6
* Môi trƣờng thạch thƣờng (g/l):
Nƣớc mắm 10 ml
Pepton 10 g
Agar 15 - 20 g
Nƣớc 1 lít
pH 7

2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
VSV có khả năng sinh enzyme cellulase cao là những chủng có khả năng phân
giải tốt cơ chất cellulose. Vì thế các chủng VSV sinh enzyme cellulase cao thƣờng
hiện diện ở những nơi giàu nguồn cellulose nhƣ: rơm rạ mục, lá cây mục, gỗ mục,
mùn cƣa mục hay hiện diện trên thân rong… Vì thế chúng tôi tiến hành phân lập và
tuyển chọn những VSV sinh enzyme cellulase trên rong giấy và tuyển chọn các
chủng sinh cellulase cao theo các bƣớc sau:
- - Nha Trang.
- các chủng VSV trên môi trƣờng thạch đặc trƣng
(chọn chủng VSV có vòng phân giải CMC lớn nhất là chủng có khả năng sinh
cellulase cao nhất).
-
.
-
.
2.2.1. Phƣơng pháp phân lập
Tiến hành phân lập các mẫu rong nhƣ sau:
Lấy 10 g rong đã ủ mục cho vào bình tam giác chứa 90 ml nƣớc cất đã vô
trùng, lắc đều rồi tiến hành pha loãng ở các nồng độ khác nhau. Pha loãng mẫu theo
các nồng độ từ 10
-1
- 10
-8
. Lấy 1 ml ở bình tam giác sau khi lắc đều cho vào ống
nghiệm thứ nhất chứa 90 ml nƣớc cất, lắc đều rồi lại lấy 1 ml cho vào ống nghiệm
thứ hai, cứ làm nhƣ vậy cho đến khi đƣợc nồng độ thí nghiệm (để có số khuẩn lạc

12
trên đĩa phù hợp, mẫu thƣờng đƣợc pha loãng. Do hiếm khi biết trƣớc đƣợc nồng độ
VSV trong mẫu, ngƣời ta dùng nhiều nồng độ khác nhau). Tùy vào số lƣợng VSV

nhiều hay ít mà ta cho nồng độ cấy thích hợp (thƣờng từ 10
-3
– 10
-8
).
Dùng môi trƣờng thạch thƣờng để phân lập các chủng vi khuẩn, môi trƣờng
Capek để phân lập các chủng nấm và môi trƣờng ISP
4
để phân lập các chủng xạ
khuẩn. Các môi trƣờng đƣợc hấp khử trùng rồi phân phối vào các đĩa peptri. Dùng
pipet man hút 0.1 ml dịch đã pha loãng nhỏ vào đĩa thạch đã ghi tên mẫu, nồng độ
và ngày phân lập. Dùng que cấy tran trang đều dịch mẫu trên mặt thạch. Sau đó cất
và nuôi cấy mẫu phân lập ở 37
0
C. Sau khoảng 24 h vi khuẩn đã phát triển trên đĩa
thạch tiến hành quan sát, tách và thuần khiết khuẩn lạc đối với vi khuẩn. Sau 2 - 3
ngày đối với nấm và 5 - 7 ngày đối với xạ khuẩn.
+ Đối với vi khuẩn: bề mặt nhẵn, ƣớt, khi dùng que gạt không còn lại trong
thạch.
+ Đối với xạ khuẩn: bề mặt khô xù xì, có hình tròn.
+ Đối với nấm: có hệ sợi.
Tách và thuần khiết khuẩn lạc: Chọn những khuẩn lạc riêng rẽ trên đĩa peptri
cấy rồi cấy vào ống nghiệm, mỗi khuẩn lạc cấy vào một ống (ghi kí hiệu đầy đủ để
cho các bƣớc nghiên cứu tiếp theo), đặt vào tủ ấm 37
0
C. Sau các khoảng thời gian
thích hợp cấy ziczac ra đĩa petri để tinh sạch các chủng VSV, tiến hành tinh sạch
nhiều lần. Kiểm tra độ thuần khiết của giống bằng cách kiểm tra vết cấy, kiểm tra
độ thuần chủng của các khuẩn lạc và kiểm tra tế bào dƣới kính hiển vi. Khi đƣợc
khuẩn lạc thuần nhất và tách rời trên đĩa thạch thì cấy vào ống nghiệm giữ giống

(hình 2.1).
Phƣơng pháp giữ giống và cấy chuyền: Sau khi tinh sạch xong ta chọn khuẩn
lạc mọc riêng rẽ cấy vào ống nghiệm thạch nghiêng. Tiến hành cấy ziczac trên ống
thạch nghiêng để đƣợc giống thuần khiết. Giống thuần khiết đƣợc bảo quản trong tủ
lạnh ở nhiệt độ 4
0
C, thời gian tốt nhất là 1 tháng. Sau 1 tháng tiến hành cấy chuyền
định kì để đảm bảo dinh dƣỡng cho vi sinh vật. Trƣớc khi sử dụng chủng thuần
khiết cần đƣợc hoạt hóa.

13

Hình 2.1. Quá trình phân lập vi sinh vật sinh cellulase từ rong giấy
Lƣu ý: Mọi thao tác trên phải đƣợc thực hiện trong điều kiện vô trùng:
Tay và bề mặt tiếp xúc trong tủ cấy đƣợc khử trùng bằng cồn.
Không khí trong tủ cấy đƣợc khử trùng bằng tia UV.
Dụng cụ phải đƣợc khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn.
2.2.2. Phƣơng pháp tuyển chọn chủng VSV sinh cellulase mạnh nhất
VSV đƣợc nuôi cấy lắc 200 vòng/phút, ở nhiệt độ phòng, trong môi trƣờng
dịch thể. Sau 24 h đối với vi khuẩn, 36 - 48 h đối với nấm và 72 h đồi với xạ khuẩn
tiến hành ly tâm dịch nuôi cấy với tốc độ 8000 vòng/phút trong 15 phút hoặc lọc thu
dịch enzyme rồi đem xác định hoạt tính cellulase theo phƣơng pháp Miller (phụ lục
02), (Miller, 1959).
2.2.3. Bố trí thí nghiệm xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp
* Phƣơng pháp xác định thời gian nuôi cấy thích hợp
Nấm mốc đƣợc nuôi cấy lắc 200 vòng/phút ở các khoảng thời gian: 6; 12; 18;
24;30; 36; 42; 48; 54 và 60 h. Sau đó lọc thu sinh khối và xác định hoạt độ enzyme.
* Phƣơng pháp xác định nhiệt độ nuôi cấy thích hợp
Nấm mốc đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng bán rắn ở các nhiệt độ: 25; 30; 35;
40; 45; 50

o
C. Sau 36 - 48 h sấy ở nhiệt độ 50
0
C, đem nghiền mịn bằng máy nghiền
bi rồi cho vào đó một lƣợng nƣớc gấp 4 - 5 lần khối lƣợng canh trƣờng để hòa tan

14
protein-enzyme từ khối canh trƣờng nấm sợi. Sau đó đem xác định hoạt độ enzyme
cellulase bằng phƣơng pháp đổ dịch.
* Phƣơng pháp xác định nồng độ chất cảm ứng thích hợp
Nấm mốc đƣợc nuôi cấy lỏng lắc 200 vòng/phút trong môi trƣờng có chứa
nồng độ chất cảm ứng (rơm và rong) ở các nồng độ từ 1% - 8%. Sau 36 - 48 h thu
dịch lọc và xác định hoạt tính enzyme cellulase.
* Phƣơng pháp xác định pH môi trƣờng nuôi cấy thích hợp
Nấm mốc đƣợc nuôi cấy lắc 200 vòng/phút trong môi trƣờng có pH là :
3,4,5,6,7,8 ở nhiệt độ phòng. Sau 36 - 48 h đem xác định hoạt tính enzyme.

Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp
2.2.4. Phƣơng pháp phân loại chủng VSV (phân loại theo phƣơng pháp
truyền thống)
Phân loại theo phƣơng pháp truyền thống là phƣơng pháp phân loại chủng
VSV dựa vào các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa. Dựa vào đó ngƣời ta phân

15
loại chúng và các chi. Đối với nấm sợi chúng tôi tiến hành phân loại bằng phƣơng
pháp quan sát đặc điểm hình thái đặc trƣng trên kính hiển vi.
Nguyên lý:
Nấm thƣờng đƣợc nhận diện bằng các đặc điểm hình thái đặc trƣng quan sát
đƣợc dƣới kính hiển vi. Tế bào nấm thƣờng phát triển thành hệ sợi gọi là khuẩn ty
thể. Sợi nấm có thể có hay không có vách ngăn. Khuẩn ty mọc lên trên bề mặt cơ

chất thƣờng là những cấu trúc mang bào tử. Cuống mang bào tử có thể phân nhánh
hay không phân nhánh. Bào tử vô tính của nấm sợi thƣờng tập trung trong hai nhóm
là bào tử kín và bào tử trần.
Cách tiến hành:
- Quan sát hình thái khuẩn lạc, màu sắc sợi nấm trên đĩa petri.
- Lấy một miếng băng dính trong suốt, đặt mặt dính nhẹ lên khuẩn lạc nấm,
sau đó lấy ra và áp sát vào phiến kính sao cho băng dính dính chặt vào phiến kính.
- Quan sát phiến kính dƣới kính hiển vi.
2.2.5. Kiểm tra khả năng lên men các loại đƣờng và khả năng sinh hơi
Dùng que cấy vô trùng lấy khuẩn lạc cần kiểm tra cấy vào mỗi ống nghiệm có
chứa từng loại đƣờng riêng biệt, để tủ ấm 37
o
C. Sau 24 - 72 h lấy ra đọc kết quả:
Phản ứng dƣơng tính khi môi trƣờng chuyển từ màu đỏ sang màu vàng và ngƣợc
lại; VSV có khả năng sinh hơi khi có bọt khí trong ống duhaml.
2.2.6. Kiểm tra khả năng chịu muối
Cấy vi sinh vật lên đĩa peptri chứa môi trƣờng đặc trƣng với các nồng độ muối
khác nhau từ 1 - 11%, giữ trong tủ ấm 37
o
C. Sau 1 - 5 ngày lấy ra đọc kết quả, nếu
VSV mọc đƣợc ta kết luận chúng có khả năng chịu muối và ngƣợc lại.
2.2.7. Kiểm tra khả năng sinh tổng hợp các enzyme thủy phân khác
(protease và amylase)
Nấm sợi đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng capek lỏng, lắc 200 vòng/phút, sau 36
– 48 h tiến hành thu dich lọc và xác định hoạt tính các enzyme theo phƣơng pháp
khuếch tán trên môi trƣờng thạch chứa cơ chất đặc trƣng (casein với protease và

16
tinh bột với amylase). Để tủ ấm 37
0

C trong 24 h rồi đổ lugol và xác định hoạt tính
enzyme bằng cách đo vòng thủy phân.
2.3. PHƢƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU
Xử lý số liệu nghiên cứu theo phƣơng pháp thống kê sinh học. Mỗi thí nghiệm
đều tiến hành 3 lần, mỗi lần 3 mẫu và kết quả là trung bình cộng của các lần thí
nghiệm.
Số liệu đƣợc xử lý đƣợc vẽ trên phần mềm Ecxel với hệ số tƣơng quan R ≥ 0,95.
2.4. DỤNG CỤ THÍ NGHIỆM
Sử dụng các thiết bị hiện đại có tại phòng thí nghiệm CNSH: thiết bị ly tâm
(Eppendorf Centrifuge 5417R - Mỹ), máy vortex (máy trộn mẫu BE34), tủ lạnh
(NANO Silver, Việt Nam), kính hiển vi 3 mắt ngắm có camera và máy tính (Motic
BA 300 - Mỹ), máy lắc (GFL 3005 - Đức), tủ cấy (Telstar AV 100 - Tây Ban Nha),
tủ sấy (Binder - Đức), tủ ấm Memmert - Đức,






17
CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VSV SINH
CELLULASE CAO TỪ RONG GIẤY
Để tuyển chọn các chủng VSV có khả năng sinh enzyme cellulase thủy phân
cellulose, chúng tôi tiến hành phân lập VSV từ các mẫu rong giấy đã mục thu tại bãi
biển Hòn Chồng - Nha Trang. Sử dụng môi trƣờng thạch thƣờng để phân lập vi
khuẩn, môi trƣờng Capek để phân lập nấm mốc và môi trƣờng ISP
4
để phân lập xạ
khuẩn. Sơ tuyển VSV bằng phƣơng pháp đặt thỏi thạch trên môi trƣờng CMC và

xác định hoạt tính enzyme cellulase bằng cách đo vòng thủy phân trên CMC. Kết
quả phân lập thể hiện ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Hoạt tính cellulase của một số chủng VSV phân lập
STT
Ký hiệu chủng
Hoạt tính cellulase (D-mm)
1
VK1
27
2
VK2
24
3
VK3
23
4
VK4
30
5
VK5
24
6
VK6
12
7
VK7
15
8
N1
32

9
N2
36
10
N3
48
11
N4
40
12
N5
31
13
XK1
24
14
XK2
26
15
XK3
31
16
XK4
30


18
Nhận xét:
Kết quả phân lập ở bảng 3.1 cho thấy đã phân lập đƣợc 16 chủng VSV có khả
năng sản xuất enzyme cellulase, trong đó có 14 chủng VSV có hoạt tính enzyme

cellulase cao bao gồm 7 chủng vi khuẩn, 4 chủng nấm mốc và 4 chủng xạ khuẩn.
Từ những chủng có họat tính cellulase cao, chúng tôi chọn đƣợc bốn chủng VSV
có vòng thủy phân cellulose mạnh nhất gồm VK
4
, N3, N4 và XK
4
. Tiếp tục xác
định hoạt độ enzyme cellulase theo phƣơng pháp Miller để chọn chủng có hoạt tính
cellulase cao nhất. Kết quả xác định hoạt tính cellulase đƣợc thể hiện nhƣ sau (bảng
3.2).
Bảng 3.2. Hoạt tính cellulase của 4 chủng đã qua sơ tuyển
Chủng
Hoạt tính
cellulase (mm)
Hoạt tính C
1

(đơn vị/ml)
Hoạt tính C
x
(đơn vị/ml)
VK4
24
x
x
N3
35
0,147
0,189
N4

32
0,192
0,182
XK4
25
x
x

Ghi chú: x coi nhƣ không có hoạt tính (lƣợng dịch enzyme không đủ làm
chuyển màu của methylene xanh (phụ lục 02)).
Qua bảng kết quả xác định họat tính cellulase, chúng tôi chọn đƣợc hai chủng
nấm sợi N3 và N4 là hai chủng phân lập đƣợc từ rong giấy đã ủ mục tại bãi biển
Hòn Chồng - Nha Trang là những chủng sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất (hình
3.1 và 3.2). Hai chủng này đƣợc đem bảo quản và phục vụ cho các thí nghiệm về
sau.

19

Hình 3.1. Hình ảnh về hai chủng nấm sợi có khả năng sinh cellulase mạnh nhất
(N3 và N4) đƣợc tuyển chọn

Hình 3.2. Hoạt tính cellulase của hai chủng N3 và N4 trên CMC
3.2. XÁC ĐỊNH MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG
SINH TỔNG HỢP ENZYME CELLULASE CỦA CÁC CHỦNG N3 VÀ N4
TUYỂN CHỌN ĐƢỢC
3.2.1. Ảnh hƣởng của thời gian
Tiến hành nuôi cấy hai chủng N3 và N4 trên máy lắc với tốc độ 200 vòng/phút
trong môi trƣờng Capek, sau các khoảng thời gian: 6; 12; 18; 24; 30; 36; 42; 48; 54;
60 h lấy mẫu để xác định hoạt tính của enzyme cellulase và đo sinh khối tế bào. Kết
quả nghiên cứu đƣợc thể hiện ở phụ lục 01, hình 3.3 và hình 3.4.