ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP: PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT VI SINH VẬT SINH TỔNG HỢP ENZYME NATTOKINASE TỪ THỰC PHẨM NATTO

BỘ CÔNG THƯƠNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC & KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC
ĐỀ TÀI:
PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT VI SINH VẬT SINH TỔNG
HỢP ENZYME NATTOKINASE TỪ THỰC PHẨM NATTO
GVHD:
SVTH:

TP.HCM, THÁNG 2 NĂM 2017


BỘ CÔNG THƯƠNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC & KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC
ĐỀ TÀI:
PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT VI SINH VẬT SINH TỔNG
HỢP ENZYME NATTOKINASE TỪ THỰC PHẨM NATTO
GVHD:
SVTH:

TP.HCM, THÁNG 2 NĂM 2017


MỤC LỤC
3

ĐẶT VẮN ĐỀ
Ngày nay, tỉ lệ bệnh nghẽn mạch (như chứng nhồi máu cơ tim hay nhồi máu
não) đang tăng cao ở một số nước châu Á như Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc,
Việt Nam, Philippin... do xu hướng “âu hóa” trong các chế độ ăn uống. Nếu huyết
tụ ở não sẽ làm cản trở việc cung cấp oxy cho các mô não gây ra các bệnh lý nguy
hiểm như: tai biến mạch máu não, suy não, giảm trí nhớ, đột quỵ. Nếu huyết khối
ở tim gây ra các bệnh lý như: co thắt động mạch vành, nhồi máu cơ tim… Theo
báo cáo của Tổ chức Y tế Thế giới mỗi năm có khoảng 17 triệu người chết vì
bệnh tim mạch và dự báo rằng bệnh do nghẽn mạch (hay huyết khối xơ vữa) sẽ
là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu vào các năm tới đây. Huyết khối xơ vữa đã
thật sự trở thành mối đe dọa đối với sức khỏe con người.
Tại Nhật Bản, sản phẩm lên men truyền thống Natto đã rất được phổ biến và
thu hút nhiều sự chú ý. Nó được xem là một loại thức ăn giúp giảm thiểu sự nghẽn
mạch máu vì Natto chứa enzyme phân hủy huyết khối “Nattokinase”, một nhân tố
mang đến sự trường thọ cho người Nhật.
Nattokinase là serine protease gồm 275 axit amin, hoạt động ở pH tối ưu
o
từ 8-10, nhiệt độ tối ưu từ 30 - 70 C, có trọng lượng phân tử từ 27,7 - 44kDa,
điểm đẳng điện (pI) = 8 và cấu trúc tương đồng với subtilisin. Cơ chế hoạt
động của nattokianse là trực tiếp phân cắt fibrin trong huyết khối và gián tiếp bằng

3

cách hoạt hóa sự sản xuất urokinase và plasmin trong mô. Sự tuần hoàn máu của
người bị tác động bởi một số enzyme đặc biệt. Nattokinase hỗ trợ cho máu có thể
lưu thông tốt hơn và giúp cho huyết áp ở mức bình thường.4
Nattokinase có thể được tổng hợp từ các vi sinh vật (nhân sơ và nhân
thật) như là Bacillus subtilis, Fusarium và Rhizomucor sp. và các enzyme tương
tự có thể được tổng hợp từ tuyến tụy của người (Trypsin và chymotrypsin). Vi
sinh vật có thể được dùng để sản xuất Nattokinase là Bacillus subtilis (Vi khuẩn)
và Rhizomucor sp. (Nấm mốc).
Các đề tài nghiên cứu phân lập, tối ưu hóa và áp dụng các dòng vi khuẩn có
khả năng sinh nattokinase được thực hiện khá nhiều trên thế giới. Ở Việt Nam các
bài nghiên cứu về vấn đề này còn khá ít. Với các lý do trên, đề tài “ Phân lập và
khảo sát vi sinh vật sinh tổng hợp enzyme nattokinase từ thực phẩm natto” được
thực hiện để bước đầu giải quyết các vấn đề trên.

PHẦN 1: TỔNG QUAN
1.1.Enzyme Nattokinase
1.1.1.Đậu tương
Đậu nành còn có tên là đậu tương. Nguồn gốc từ Trung Quốc, sau lan sang
Việt Nam, Nhật Bản, Triều Tiên. Châu Âu mới biết đến đậu nành từ thế kỷ 18.
Từ cổ xưa, đậu nành dùng làm thực phẩm, nhưng gần đây y học thế giới phát hiện
ra nhiều tác dụng chữa bệnh của nó.
Đây là kết luận được các chuyên gia Mỹ đưa ra trong hội nghị về khai
thác giá trị dinh dưỡng từ đậu nành đối với sức khỏe con người tại Viện Dinh
dưỡng thuộc Đại học Columbia (Mỹ).
- Ngừa ung thư vú ở phụ nữ
Một cuộc khảo sát của các nhà khoa học thuộc Đại học Georgetown
(Mỹ) cho thấy bổ sung đậu nành ở mức độ vừa phải giúp giảm nguy cơ bị ung
thư vú. Theo Hiệp hội Ung thư Mỹ, dùng 3 khẩu phần đậu nành mỗi ngày đem
lại nhiều ích lợi cho phụ nữ có nguy cơ hoặc có tiền sử gia đình mắc bệnh ung thư
vú.

-Tác dụng trên tim mạch
Theo một cuộc khảo sát, bổ sung 20-133g protein từ đậu nành mỗi ngày
có thể giúp giảm 7-10% hàm lượng cholesterol xấu LDL trong cơ thể. “Dùng
đậu nành là một phần của chế độ dinh dưỡng giúp giảm nguy cơ mắc bệnh
tim”, Wahida Karmally – Giám đốc dinh dưỡng tại Viện Nghiên cứu Irving nói.
Còn theo Cơ quan Quản lý dược phẩm và thực phẩm Mỹ (FDA), thêm 25g
protein từ đậu nành mỗi ngày có tác dụng giảm lượng chất béo bão hòa, qua

4


đó giảm nguy cơ mắc bệnh tim mạch.
Các nhà khoa học thuộc Hội mãn kinh ở Bắc Mỹ đã kết luận: Đậu nành
và các chất chiết từ đậu nành có tác dụng giảm huyết5 áp tâm trương, giảm
cholesterol toàn phần, giảm cholesterol xấu (tức LDL-cholesterol), ngăn chặn sự
tiến triển của
các mảng xơ vữa, cải thiện tính đàn hồi của động mạch. Do đó, ở Mỹ, cơ quan
quản lý thực phẩm và thuốc (FDA) từ năm 1999 đã cho phép dùng đậu nành để
làm giảm nguy cơ động mạch vành.
- Cung cấp đủ dưỡng chất
Các chuyên gia dinh dưỡng Mỹ khẳng định chế phẩm từ đậu nành rất giàu
dinh dưỡng và ăn một khẩu phần đậu nành mỗi ngày giúp bổ sung đầy đủ
dưỡng chất. “Đậu nành cung cấp nhiều chất quan trọng như kali, ma-giê, chất xơ,
chất chống ô-xy hóa”, hãng tin New Kerala dẫn lời chuyên gia Katherine Tucker
cho biết.
- Điều trị chứng mãn kinh
Gần đây, người ta phát hiện thấy trong hạt đậu nành có isoflarm còn gọi là
estrogen thực vật (phytoestrogen); hoạt chất này góp phần làm cân bằng hormon ở
phụ nữ mãn kinh, cải thiện rõ rệt các triệu chứng khác của tuổi mãn kinh như: Bốc
hỏa, đổ mồ hôi đêm, trầm cảm, khô âm đạo…

- Tác dụng chuyển hoá xương
Thống kê dịch tễ học cho thấy: Tỷ lệ gãy xương ở phụ nữ châu Á thấp hơn
rõ rệt so với phụ nữ ở các nước phương Tây. Kết quả này có liên quan tới sử
dụng nhiều thức ăn chế biến từ đậu nành.(Isoflarm của đậu nành) làm tăng mật độ
khoáng tại các đốt sống 1,2 đến 1,4 lần (so sánh với phụ nữ dùng thức ăn ít có đậu
nành). Ở chuột thực nghiệm, làm giảm nguy cơ loãng xương do ức chế hoạt tính
của hủy cốt bào, nên có tác dụng hiệp đồng chống tiêu xương.
- Tác dụng trên các khối u phụ thuộc và hormon
Thống kê dịch tễ học cũng cho thấy một số loại khối u phụ thuộc
vào hormon (ở màng trong tử cung, ở vú, buồng trứng…) có tỷ lệ rất thấp ở
phụ nữ châu Á. Nhận xét này có liên quan tới chế độ ăn giàu đậu nành ở công dân
châu Á. Kết quả nghiên cứu về thực nghiệm và lâm sàng cho thấy (isoflarm ở đậu
nành) có tác dụng làm giảm nguy cơ ung thư ở tử cung, vú và buồng trứng.
- Ung thư
Genistein trong đậu nành làm giảm nguy cơ ung thư bằng cách giảm sự tổn
thương tế bào, và chất ức chế Protease BowmanBirk có trong Protein đậu nành
cũng có thể ức chế sự khởi phát ung thư. Chất Daidzein trong Protein đậu nành,
nếu được sử dụng với liều cao sẽ có tác dụng kích thích hệ thống miễn dịch, để phá
hủy những chất có hại cho cơ thể, do đó có tác động lên việc giảm nguy cơ bị ung

5


thư.
- Xương khớp
Qua nghiên cứu, người ta thấy rằng những phụ nữ6 dùng nhiều đạm động
vật sẽ gây mất Calcium qua nước tiểu, do đó sẽ có nguy cơ gãy xương nhiều hơn
là những phụ nữ dùng Protein thực vật. Nghiên cứu cho thấy rằng dùng Protein
đậu nành, đặc biệt là Isoflavones có thể có tác động tốt lên đậm độ khoáng trong
xương ở những phụ nữ mãn kinh mà không dùng Ostrogen thay thế.

- Đậu nành dùng trong dinh dưỡng và công nghiệp
Trong dinh dưỡng bột đậu nành trộn với bột ngũ cốc, dùng làm thức ăn
cho trẻ sơ sinh, người bị bệnh đái tháo đường, bệnh gút… Trong công nghiệp
dược, bột đậu nành dùng trong môi trường nuôi cấy kháng sinh.
Những sản phẩm đi từ đậu nành như Tàu hủ, tương, chao, sữa, natto… là
những thực phẩm giàu protein (đạm) cung cấp nhiều loại acid amin cần thiết cho
cơ thể. Những acid amin của đậu nành kết hợp rất tốt với các loại acid amin của
những ngũ cốc khác. Đậu nành còn là nguồn của Lecithin và Vitamin E là những
hoạt chất chống oxy- hóa thiên nhiên ngăn chận tác hại của Cholesterol nồng độ
thấp (LDL) mặt khác đậu nành lại giàu Magnesium giữ vai trò quan trọng cho
xương, tim mạch và chống xơ vữa động mạch. Hơn thế nữa đậu nành còn có
tác dụng rất tốt cho Thận thực hiện chức năng của mình (phế thải chất bã do
chuyển hóa của đạm, phế thải nước, khoáng chất dư thừa trong cơ thể, độc tố trong
thực phẩm…). Đạm thực vật có trong đậu nành thay thế đạm động vật (từ thịt) làm
cho Thận làm việc ít hơn, lượng protein trong nước tiểu giảm, ngăn ngừa nguy cơ
sạn thận. Tại hội nghị quốc tế về dinh dưỡng tổ chức tại New Zealand, GS
Masafumi Kitakaze đã khẳng định Natto có tác dụng làm giảm rõ rệt các chứng
Mỡ (Triglyceride và Cholesterols) trong máu cao qua nghiên cứu chung của 4
cơ quan y tế Nhật Bản, kêu gọi cộng đồng thế giới cải thiện nếp sinh hoạt
(Lifestyle) và tiêu thụ Natto thiên nhiên trước nguy cơ béo phì do “thừa” dinh
dưỡng và các chứng bệnh hiểm nghèo, nan y (tiểu đường, ung thư) ngày càng tăng
khắp nơi trên thế giới.
1.1.2. Natto và Nattokinase
Natto còn được gọi là pho mai thực vật là những hạt đậu nành đã luộc chín
o
được ủ với men ở một môi trường 40 C trong vòng 14-18 giờ để lên men thành
những hạt đậu có màu nâu, độ nhờn nhớt cao, có mùi nồng nặc rất khó chịu với
người không quen. Theo kinh nghiệm của nhà sản xuất cho biết khi độ nhớt càng
cao thì chất lượng Natto càng tốt và vị càng ngọt. Là một món ăn dân dã rất phổ
biến ở nông thôn Nhật bản, họ thường ăn cơm sáng với Natto, nước tương với

rong biển phơi khô (Nori) và trứng gà sống. Natto có chứa nhiều chất bổ dưỡng

6


cho sức khỏe trong đó enzym Nattokinase là một hoạt chất sản sinh trong quá trình
lên men Natto được xem là hoạt chất có hiệu quả trong việc ngăn ngừa các chứng
bệnh tim mạch-một phát hiện vô cùng lý thú bởi nhà nghiên
cứu sinh lý học
7
Nhật bản nổi tiếng, giáo sư Sumi Hiroyuki vào năm 1980.
Nattokinase còn được gọi là: Subtilisin NAT, Subtilisin BSP. Nattokinase là
một enzym có hoạt động fibrinolytic rất mạnh mẽ, được chiết xuất và tinh chế từ
natto.

Hình 1: Natto và enzyme Nattokinase
1.1.2.1. Nguồn gốc của Natto và Nattokinase
Natto là một món ăn truyền thống từ hàng ngàn năm của Nhật Bản.
Nó được biết đến như là bí quyết giúp người Nhật sống lâu, khỏe mạnh, kéo
dài tuổi thọ. Người ta cho rằng natto rất hữu hiệu trong việc phòng chống
bệnh cảm cúm, ngộ độc thức ăn (kiết lỵ, tiêu chảy cấp…), làm chắc xương, tiêu
diệt vi trùng gây bệnh cũng như giúp cho phụ nữ mang thai sinh con khỏe
khoắn. Trong suốt thời kì chiến tranh Nhật-Nga (1904-1905), quân đội Nhật Bản
đã phải ăn ngày
3 bữa bằng natto với cơm nhờ vậy binh lính gìn giữ được sức khỏe không bị đau
bụng, tiêu chảy hay táo bón trên đường hành quân. Natto đã trở thành một đề
tài nóng hổi khi TS Sumi Hiroyuki đưa ra những kết quả bất ngờ về hiệu quả của
natto trong việc làm tan các huyết khối trong động mạch, một trong những nguyên
nhân suy tim và tử vong của bệnh nhân bị các chứng xơ vữa động mạch vành hay
đột quị vì nghẽn hay xuất huyết não vào năm 1980.

Trong bữa cơm trưa tại nhà ăn của đại học Y khoa Chicago, Sumi lấy
một mẫu natto đặt vào khay thủy tinh có cục máu đông thì 18 giờ sau cục máu
đông này

7


tan rã hoàn toàn, điều đó gợi ý rằng trong natto có thể có một hay nhiều hoạt
chất có thể phân hủy huyết khối nhờ thủy phân sợi fibrin có khả năng làm đông
máu (tụ máu) để ngăn chứng xuất huyết nội. Sumi bắt8 đầu lưu ý tới vai trò
của “Nattokinase” và Vitamin K2 có trong natto để chứng minh nó là hoạt chất
giúp cho người Nhật Bản sống lâu, làm tăng khả năng tạo ra plasmin nội sinh
giúp cho cơ thể tránh được tai biến hay đột quị bởi huyết khối hay các
chứng xơ vữa động mạch, suy tim biến chứng gây nên. Theo kết quả nghiên cứu
của 3 cơ quan y tế đại học bang Oklahoma (Mỹ), JCR Pharmaceuticals (N) và
Trường Y khoa Miyazaki phối hợp thử nghiệm trên cơ thể người bằng cách cho
ăn natto 200 g/ngày và đã kiểm chứng được những hiệu ứng kể trên, đặc biệt
phát hiện lượng plasmin nội sinh giảm sụt ở người cao tuổi không đủ để làm
tan huyết khối, vón cục trong động mạch thì hiệu quả càng rõ rệt.
Năm 1987, Sumi Hiroyuki công bố toàn bộ kết quả nghiên cứu về tác dụng
của Nattokinase sau khi thử nghiệm gần 200 loại thực phẩm khác nhau để
so sánh, xác định Nattokinase là một loại enzyme mang khả năng phân hủy huyết
khối một cách hữu hiệu và mạnh nhất trong các loại enzym, gấp 4 lần
plasmin,enzym nội sinh làm tan máu đông, đồng thời tuyệt đối an toàn cho cơ thể
khi hấp thụ qua đường ăn uống .
1.1.2.2. Cơ chế tác động của Nattokinase
Nattokinase phân hủy fibrin trực tiếp hay gián tiếp thông qua 3
con
đường khác nhau :
- Nattokinase trực tiếp làm tiêu sợi fibrin nên giải phóng tiểu cầu và giải tỏa

những khu vực mà dòng máu lưu thông bị cản trở.
- Bằng cách kích thích cơ thể tăng cường sản xuất plasmin từ Urokinase,
Nattokinase không những giúp làm tan huyết khối đã hình thành mà còn hoạt động
như một thành phần chống hình thành huyết khối.
- Nattokinase giúp tăng cường t-PA để sản sinh plasmin. Đây là enzyme nội
sinh tiêu

hủy fibrin tự nhiên trong cơ thể.

Đặc biệt Nattokinase không ảnh hưởng đến quá trình hình thành fibrin
từ fibrinogen, do đó không làm suy giảm cơ chế đông máu bình thường của cơ
thể. Vì vậy, Nattokinase không gây ra biến chứng chảy máu như các thuốc
chống đông máu bình thường.
Nattokinase, hoạt chất chính chiết xuất từ Natto,là một enzyme tìm
thấy trong tự nhiên có trọng lượng phân tử 20,000 ± 5000. Nó bền với nhiệt đến
60ºC với pH 6–12. Mặc dù cơ thể con người có vài loại enzyme tạo ra cục máu

8


đông nhưng chỉ có một enzyme duy nhất là “plasmin” để phá hủy và hòa tan nó.
Đặc tính của Nattokinase gần giống với plasmin. Nattokinase chiết xuất từ Natto,
là một enzyme thủy phân hiệu quả các mảng bám và huyết9 khối khi các sợi fibrin
này kết hợp lại với nhau. Nattokinase có cấu trúc của một protein, được tạo ra
bởi chuỗi đơn polypeptide có 275 phân tử, có Ala ở N-cuối cùng. Nó thủy
phân sợi huyết mạnh mẽ. Nattokinase là một enzyme thủy phân fibrin mạnh
nhất trong gần 200 loại thực phẩm bổ xung qua đường ăn uống được nghiên cứu.
Nattokinase hoạt động mạnh gấp 4 lần plasmin nội sinh, một loại
enzyme làm tan fibrin trong cơ thể. Do sức khỏe và tuổi tác, cơ thể giảm sản sinh
plasmin càng làm tăng nguy cơ hình thành cục máu đông. Nattokinase cũng

giúp tăng cường plasmin của cơ thể và các thành phần chống đông máu khác như
urokinase tăng cường lưu thông máu, ngăn chặn xơ vữa mạch. Không giống
như aspirin và hầu hết các thuốc chống đông máu khác sẽ ức chế sản xuất fibrin,
Nattokinase trực tiếp làm tiêu sợi fibrin nên giải phóng tiểu cầu và giải tỏa những
nơi máu bị cản trở lưu thông .
Bằng cách kích thích cơ thể tăng cường sản xuất plasmin, Nattokinase
không những giúp làm tan cục máu đông đã hình thành mà còn hoạt động như một
thành phần chống hình thành cục máu đông
Các tác dụng của Nattokinase:
- Làm tan cục máu đông: Nattokinase làm tan cục máu đông bằng cách
làm tan sợi fibrin (chất sợi buộc các tiểu cầu vón kết lại với nhau hình thành cục
máu đông). Nattokinase hoạt động mạnh gấp 4 lần plasmin nội sinh (loại
enzyme duy nhất trong cơ thể làm nhiệm vụ phá tan sợi fibrin) với cơ chế tương tự
như plasmin này. Do sức khỏe và tuổi tác, cơ thể giảm sản sinh plasmin càng làm
tăng nguy cơ hình thành cục máu đông. Nattokinase cũng giúp tăng cường plasmin
của cơ thể và các thành phần chống đông máu khác như urokinase.
- Huyết áp: Nattokinase làm giảm huyết áp. Người Nhật ăn loại đậu lên
men đã hơn 1000 năm vì mục đích này. Các nghiên cứu chỉ ra rằng nó làm giảm
huyết áp bằng cách ức chế enzyme chuyển đổi angiotensin (ACE). ACE khiến
mạch máu bị hẹp lại và huyết áp tăng cao. Nattokinase có khả năng ức chế ACE,
ngăn cản dầy nội mạc mạch.
- Tăng cường lưu thông máu: Nattokinase trợ giúp máu lưu thông bằng cách
hỗ trợ bù trừ trong tuần hoàn. Nó cũng được chứng minh là có tác dụng ngăn
chặn xơ vữa mạch.
- Các lợi ích khác: làm chắc xương, trợ giúp đau khớp, giảm nhức
đầu, kháng khuẩn, ngừa bệnh tả, thương hàn, bệnh lị.
Cục máu đông làm tắc mạch máu là nguyên nhân chính dẫn đến sa sút
trí nhớ, xuất huyết não, nhồi máu cơ tim, đau thắt ngực và trĩ. Lợi ích tuyệt vời từ

9

Nattokinase hứa hẹn mang lại nhiều lợi ích cho những người bệnh này.
* Các nghiên cứu:
- Hoạt động tiêu huyết khối
1
Tiến sĩ Hiroyuki Sumi khám phá ra Nattokinase vào năm 1980 trong khi
tiến hành nghiên cứu tại Đại học Chicago. Tiến sĩ thử nghiệm với gần 200 loại
thực phẩm và phát hiện ra tiềm năng của đậu natto khi cho nó vào cục máu nhân
tạo và giữ ở nhiệt độ cơ thể. Ông nhận thấy huyết khối bị tan dần và hoàn toàn
biến mất sau 18 tiếng.
TS Sumi kế tiếp thử nghiệm lâm sàng với con người và động vật. Trong
nghiên cứu đầu tiên, 12 tình nguyện viên được cho sử dụng 200g Natto hàng ngày.
Các hoạt động Fibrinolytic máu của họ được đo theo 2 cách. Lấy mẫu máu và kích
thích tạo một cục máu đông trong mẫu sau đó đo thời gian cục máu đông tan hoàn
toàn. Nhóm sử dụng Nattokinase mất một nửa thời gian so với nhóm đối chứng.
Bài kiểm tra thứ hai dùng máu cho vào đĩa với một loại polyme
fibrinogen đặc biệt. Mức độ tan được đo 4 tiếng 1 lần. Nhóm đối chứng cho thấy
không tan trong khi nhóm Nattokinase có tốc độ tan là 14mm/h.
Một thử nghiệm thứ ba sau đó được thực hiện để đo các mô hoạt hóa
plasminogen (t-PA) trong máu. Nhóm dùng Nattokinase cho thấy có sự tăng
tPA. tPA làm tăng plasmin, do đó các nghiện chỉ ra rằng ngoài khả năng trực tiếp
tiêu sợi Fibrin, nó còn tăng cường hoạt động chống hình thành cục máu đông của
cơ thể.
TS Sumi cũng tiến hành một thử nghiệm lâm sàng liên quan đến chó.
Một cục máu đông được tạo ra trong tĩnh mạch chân của chó gây tắc nghẽn hoàn
toàn. Sau 5h nhóm được cho ăn đậu Natto tĩnh mạch đã hoàn toàn lưu thông.
Trong khi đó nhóm dùng giả dược vẫn còn những cục máu đông gây tắc nghẽn 18
giờ sau đó.
Năm 1995, nhà nghiên cứu ở phòng thí nghiệm Nghiên cứu Công nghệ sinh

học và JCR Pharmaceuticalscủa Kobe, Nhật Bản đã thử nghiệm hiệu quả
của Nattokinase trong việc giảm huyết khối động mạch cảnh trên chuột. Một số
chuột được tiêm huyết khối ở động mạch cảnh, nguồn cung cấp dinh dưỡng cho
não. Ba enzym là Nattokinase, plasmin và elastase được dùng để thử nghiệm trên
chuột. Elastase cho thấy không mở lại các động mạch bị chặn. Nhóm ăn Plasmin
cho thấy lưu thông phục hồi 16% sau một giờ. Còn nhóm ăn Nattokinase cho
thấy phục hồi 62% lưu thông trong cùng khoảng thời gian. Kết quả này giúp nhà
nghiên cứu kết luận rằng "các kết quả cho thấy các khả năng tiêu fibrin của
Nattokinase là mạnh hơn so với plasmin hoặc elastase trong cơ thể”.
Các nhà nghiên cứu từ JCR Pharmaceuticals, Oklahoma State University và
Miyazaki Medical College tiến hành một nghiên cứu sâu hơn nữa trong đó có

10


12 tình nguyện viên được cho uống 200 mg Nattokinase và sau đó theo dõi khả
năng tiêu Fibrin của họ thông qua một loạt các xét nghiệm huyết tương. Các đối
tượng tham gia thí nghiệm cho thấy khả năng phân hủy cục1 máu đông cao trong 28 giờ. Năm 2003, Cesarin và cộng sự đã làm thí nghiệm với Nattokinase và
giả dược đã được trao cho 184 tình nguyện viên trước khi lên một chuyến bay 7-8
giờ. 7 trong số 92 người trong nhóm dùng giả dược cho thấy cục máu đông hình
thành. Không ai trong số 92 người trong nhóm Nattokinase hình thành cục máu
đông.
- Hoạt động huyết áp
Năm 1995, các nhà nghiên cứu từ Trường y khoa Miyazaki Kurashiki
và Đại học Khoa học và Nghệ thuật tại Nhật Bản đã nghiên cứu tác dụng của
Nattokinase với huyết áp ở cả động vật và con người. Trong các thử nghiệm chuột
được cho uống một liều duy nhất 400-450 gam Nattokinase. Tính trung bình
huyết áp tâm thu (SBP) của chuột giảm 12,7% trong hai giờ.
Nhóm người tình nguyện tham gia có huyết áp cao được uống 30
gam lyophilized trích xuất (tương đương 100 g natto). Trung bình huyết áp tâm thu

SBP giảm 10,9% và huyết áp tâm trương (DBP) giảm 9,7%.
1.1.2.3. Cấu trúc của Nattokinase
Kí hiệu: EC = 3.4.21.62
Trong đó:
+ 3 (loại): Hydroxylase
+ 4 (nhóm): Protease
+ 21(dưới nhóm): protease serin
+ 62(enzyme): subtilisin
Nattokinase có cấu trúc protein tạo thành từ 1 chuỗi polypeptid
duy nhất bao gồm 275 gốc acid amin, có trọng lượng phân tử .
MW= 27728 Da, pI= 8,6+0,3, có tính chất tương đồng cao với cơ chất và
không có cầu disulfide.
Nattokinase thuộc họ subtilisin của protease serin, cũng có trung tâm
hoạt động bao gồm nhóm hydroxyl của Ser-221, imidazol của His-64 và
nhóm carboxyl của Asp-32.
1.1.2.4. Tính an toàn của Nattokinase
Những thành quả của TS Sumi Hiroyuki cũng đã được hai vị chuyên gia
ở hai khu vực khác nhau phối hợp nghiên cứu, đó là bác sĩ Martin Milner ở
Trung tâm Y khoa tự nhiên Portland, bang Oregon (Hoa Kỳ) và TS Kouhei Makise
thuộc bệnh viện Makise ở Kyoto, cùng công bố kết quả qua bài viết trên tạp chí
chuyên môn kết luận rằng “là chuyên gia lâu năm về tim mạch và hô hấp chúng tôi
nhất trí khẳng định rằng Nattokinase là một phát hiện đầy phấn chấn trong việc

11


ngăn ngừa và điều trị các chứng bệnh liên quan đến tim mạch”, và “chúng
tôi xác định Nattokinase là một hoạt chất thiên nhiên có thể làm tan các huyết
khối hữu hiệu, không gây dị ứng và có độ an toàn cao” hơn1 cả tỏi , nhân sâm Triều
Tiên hay bromelain (từ quả Dứa) thiên nhiên thúc đẩy sản sinh ra plasmin trong

quá trình thủy phân sợi fibrin.
1.1.2.5. Các nguồn vi sinh vật tổng hợp Nattokinase
Vi sinh vật là nguồn sản xuất quan trọng để tạo ra các hợp chất có khả năng phân
hủy máu đông. Streptokinase từ Streptococus hemolyticus và Satphylokinase từ
Streptococus aureus đã sớm chứng minh được có hiệu quả trong liệu pháp tan
huyết khối. Nhiều năm qua, có thêm nhiều enzyme từ các loài vi sinh vật khác nhau
đã được khám phá như nattokinase từ Bacillus natto, Subtilisin DFE và
Subtilisin DJ-4 từ Bacillus myloliquefaciens.Các vi sinh vật sinh tổng hợp enzyme
thủy phân fibrin bao gồm vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc và tảo.
Streptomycesmegaspores SD5 được phân lập từ suối nước nóng có khả năng tạo ra
enzyme phân hủy fibrin chịu nhiệt . Một số loại nấm cũng có thể tạo ra protease
có hoạt tính thủy phân fibrin cao như Aspergillus ochraceus 513,
Fusarium oxysporum, Penicillium chrysogenum H9,… Trong đó các chủng
thuộc chi Bacillus là nguồn vi sinh vật quan trọng để sản xuất enzyme thủy phân
fibrin.

1.2. Giới thiệu bệnh huyết khối
1.2.1. Khái niệm về huyết khối
Bình thường, trong cơ thể, máu lưu thông trong lòng mạch ở trạng thái thể
dịch nhờ sự cân bằng giữa hệ thống hoạt hoá và ức chế đông máu. Khi xảy ra tổn
thương mạch máu, các yếu tố đông máu sẽ cùng với nội mạc mạch máu và tiểu
cầu phối hợp xảy ra một loạt các phản ứng để tạo nút cầm máu tại vị trí tổn
thương. Tình trạng tăng đông máu xảy ra khi mất cân bằng giữa hệ thống hoạt hoá
và ức chế đông máu do tăng hoạt hoá đông máu hoặc do giảm ức chế đông máu,
tiêu sợi huyết dẫn đến huyết khối lan rộng quá giới hạn cần thiết, gây tắc nghẽn.
Huyết khối có thể được định nghĩa là một quá trình bệnh lý do một sự phát động
và lan rộng bất hợp lý của phản ứng cầm máu của cơ thể dẫn đến hình thành
huyết khối trong lòng mạch máu. Tuỳ theo kích thước của huyết khối, đường kính
mạch máu mà huyết khối có thể gây tắc mạch hoàn toàn hay bán tắc, nghẽn
mạch…

1.2.2. Nguyên nhân hình thành huyết khối
Huyết khối được tạo thành do 3 nguyên nhân:
- Tổn thương mạch máu: Khi mạch máu bị tổn thương do áp lực máu cao,

12


những thứ có trong mạch máu như cholesterol, tiểu cầu đến tích tụ ở những nơi bị
tổn thương khiến mạch máu trở nên cứng và dày lên, lòng mạch máu dần dần hẹp
lại.
1
- Xơ vữa động mạch (XVĐM): Chất béo tích tụ trong thành của các động
mạch tạo thành các mảng XVĐM. Mảng XVĐM có thể ngày càng to dần gây hẹp
lòng của động mạch. Đôi khi mảng XVĐM bị vỡ
ra làm cho máu tiếp xúc
với lõi chất béo bên trong mảng. Khi đó các tế bào tiểu cầu và hệ thống đông
máu bị hoạt hóa dẫn đến hình thành huyết khối gây tắc động mạch.
- Giảm sản sinh, giảm hoạt tính Plasmin: Plasmin là enzym duy nhất trong
cơ thể có khả năng làm tan huyết khối. Khi giảm sản sinh và giảm hoạt tính
plasmin, huyết khối sẽ dễ dàng hình thành và không bị loại bỏ.
1.2.3. Biến chứng của bệnh huyết khối
Huyết khối xuất hiện khi dải protein có tên là fibrin tích lũy trong lòng
mạch. Ở tim, huyết khối là nguyên nhân gây tắc các dòng mạch máu tới nuôi
mô và cơ tim. Nếu dòng máu bị chặn, oxy cung cấp cho các cơ đó bị giảm hoặc
không còn. Điều này dẫn đến chứng đau thắt ngực và cơn đau tim. Huyết khối
trong các tâm thất của tim có thể di chuyển lên não. Trong não, huyết khối có thể
gây tắc nghẽn các mạch máu lên não và gây ra các biến chứng: Tai biến mạch
máu não, suy não, suy giảm trí nhớ, đột quỵ. Một số biến chứng thường gặp do
ảnh hưởng của huyết khối:
Bệnh động mạch vành: Bệnh này ảnh hưởng đến các mạch máu cung cấp

máu cho cơ tim. Nếu động mạch bị nghẽn và dòng máu đưa vào tim bị hạn chế, có
thể gây ra cơn đau tim đột qụy, bệnh động mạch vành cũng có thể gây ra cơn đau
ngực. Đột quỵ: Đột quỵ khi động mạch mang máu và oxy đến tim bị chặn lại,
không có oxy, phần cơ này của tim không hoạt động và sẽ có cảm giác đau ở
ngực. Trong giai đoạn cấp, bệnh nhân yếu đột ngột hoặc liệt hẳn một nửa bên
người kèm với yếu hoặc liệt nửa mặt cùng bên. Người bệnh có thể có những triệu
chứng khác như: Nói khó, nuốt khó, rối loạn thị giác, mất thăng bằng. Nặng hơn là
rối loạn tri giác, lơ mơ hoặc hôn mê, thậm chí có thể ngưng thở và tử vong rất
nhanh.
Suy tim: Tim khoẻ mạnh sẽ bơm máu đến khắp cơ thể. Một quả tim yếu sẽ
không đủ khả năng làm việc bơm máu này một cách hiệu quả. Khi tim không bơm
đủ máu, sẽ bị suy

tim.

Xơ vữa động mạch: Khi các mạch máu bị tắc bởi sự tích tụ cholesterol,

13


chất béo và canxi (còn được biết đến như là những mảng bám), đây chính là điều
kiện dẫn đến bệnh XVĐM. Những mảng bám tạo thành trên thành của mạch máu,
mạch máu trở nên kém mềm dẻo và sự lưu thông trong mạch
1 máu cũng kém hơn,
làm dòng máu khó chảy qua. Đột quỵ hay cơn đau tim có thể xuất hiện nếu sự tích
tụ mảng bám trở nên dày và mạch máu bị tắc nghẽn nên dòng máu không thể chảy
qua được.
Huyết áp cao: Huyết áp cao xuất hiện khi máu được đẩy đi trong mạch máu
với áp suất cao. Khi huyết áp lên cao, thành mạch trở nên yếu và có thể gây ra các
biến chứng như đột quỵ hay cơn đau tim.

Những enzyme làm tan huyết khối được sinh ra ở thành tế bào trong
lòng mạch máu có ở khắp cơ thể như: Trong động mạch, hệ thống mao mạch và
mạch bạch huyết. Ở người già việc sản sinh các enzym này bị suy giảm dẫn đến
tình trạng hình thành các huyết khối ở bất kỳ vị trí nào trong cơ thể. Những
nghiên cứu gần đây cho thấy sự tắc nghẽn dòng máu lên não có thể gây suy giảm
và mất trí nhớ ở người cao tuổi.
1.2.4 Tình hình bệnh huyết khối trên thế giới và ở Việt Nam
Hàng năm trên thế giới có khoảng 17 triệu người tử vong vì nhồi máu cơ
tim và 5 triệu người tử vong vì đột quỵ. Đây là hai trong những căn bệnh gây tử
vong hàng đầu hiện nay và đều xuất phát từ một nguyên nhân, đó là hậu quả của
chứng huyết khối do XVĐM. Theo dự báo của WHO thì huyết khối sẽ là nguyên
nhân gây tử vong hàng đầu vào năm 2020. Nhồi máu cơ tim thường xảy ra đột
ngột, nhanh và rất nguy hiểm. Khoảng 30% bệnh nhân chết trước khi kịp đến bệnh
viện .
Trong số những người nhập viện, có 5 đến 10% chết do các biến chứng như
suy tim, choáng tim, rối loạn nhịp tim. Theo thống kê cứ 6 người bị nhồi máu cơ
tim thì có 1 người sẽ bị tái phát cơn nhồi máu cơ tim, đột quỵ, tử vong do tim
mạch sau 1 năm.
Ở Việt Nam, hàng năm có khoảng 200.000 người được chẩn đoán đột quỵ.
Trong những năm gần đây, tỷ lệ mắc bệnh huyết khối ngày càng tăng cao và ngày
càng có nhiều người trẻ tuổi bị huyết khối .

14


PHẦN 2: VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1

2.1. Địa điểm – thời gian

Địa điểm: Phòng thí nghiệm Công Nghệ Sinh Học tại Tân kỳ Tân Quý.
Thời gian thực hiện:
Vật liệu thí nghiệm: Thực phẩm natto của Nhật Bản.

2.2. Dụng cụ, hóa chất và thiết bị
Bảng 2.2 Dụng cụ,thiết bị và hóa chất
DỤNG CỤ
STT TÊN DỤNG CỤ
1
Đĩa petri
2
Ống nghiệm Ø18
3
Cốc 100 ml
4
Cốc 250 ml
5
Cốc 1000ml
6
Que cấy
7
Que trang
8
Bình tam giác 250ml
9
Đèn cồn
10
Pipet 1ml
11
Pipet 5ml

12
Pipet 10ml
13
Micropipet
14
Quả bóp cao su
15
Bình tia
16
Ống nhỏ giọt
17
Lam kính
18
Giấy quỳ
19
Giấy lọc

QUY CÁCH

SL/ĐVT

GHI CHÚ

15


HÓA CHẤT
STT TÊN HÓA CHẤT QUY CÁCH
1
Peptone

2
Cao thịt
3
Cao nấm men
4
Glucose
5
Agar
KH PO
6
2 4
CH COONa
7
3
MgSO 7H O
8
4. 2
9
Tryptone
10
Ethanol 96%
11
Xanh metylen
12
Lugol
13
Safranin
K HPO
14
2

4
15
HCl
16
Dầu soi
17
NaCl
18
NaOH
CaCO
19
3
20
Sucrose
CaCl
21
2

SL/ĐVT GHI CHÚ
1

16


THIẾT BỊ
STT TÊN THIẾT BỊ
QUY CÁCH
1
Kính hiển vi
2

Máy li tâm
3
Bể ổn nhiệt
4
Máy lắc
5
Tủ cấy
6
Nồi hấp khử trùng
7
Cân 2 số
8
Micropipet
9
Máy khuấy từ
10
Máy phá mẫu
11
Tủ sấy
12 Tủ ấm
13 Máy đo pH

SL
GHI CHÚ
1
1
1
1
1
1

1
1
1
1
1
1
1
1
1

2.3. Môi trường
- Môi trường cơ bản (CM) dùng để khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố tới
tổng hợp Nattokinase của vi khuẩn: KH PO 0,5%; K HPO 0,1%; MgSO
2 4
2
4
4
0,01%; Casein 0,2%; Sucrose 0,1%; Cao nấm men 0,1%; CaCl 0,03%; pH 6,8-7,0.
2
- Môi trường máu thỏ (BAM) dùng để phân lập vi khuẩn tổng hợp
Nattokinase: KH PO 0,5%; K HPO 0,1%; MgSO 0,01%; Sucrose 0,1%;
2 4
2
4
4
Cao nấm men 0,1%; Máu thỏ 5%; CaCl 0,03%; Agar 2%; pH 6,8-7,0.
2
- Môi trường LBA dùng để phân lập và giữ giống vi khuẩn: Cao nấm
men 0,5%; Peptone 1,0%; NaCl 0,5%; Agar 2%; pH 7,2 - 7,4.
- Môi trường LB dùng để nhân giống vi khuẩn: Cao nấm men 0,5%;

Peptone 1,0%; NaCl 0,5%; pH 7,2 - 7,4.

2.4. Phương pháp nghiên cứu
Quá trình nghiên cứu sẽ làm theo tuần tự sau:

•
•
•
•

Thu mẫu thực phẩm natto của Nhật Bản.
Phân lập vi khuẩn có hoạt tính nattokinase.
Mô tả đặc điểm khuẩn lạc đã phân lập.
Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy tới hoạt tính sinh Nattokinase của vi
khuẩn

17


2.4.1. Thu mẫu
- Mua các thực phẩm natto của Nhật Bản
1
2.4.2. Phương pháp phân lập VK trong Natto:
* Nguyên tắc
- Tách rời các tế bào vi khuẩn
- Nuôi cấy các tế bào trong MT dinh dưỡng đặc trưng để cho KL riêng rẽ, tách
biệt nhau.
* Cách tiến hành

- Lấy 10g natto của Nhật Bản giã nhỏ trong cối sứ vô trùng, cho vào bình tam giác

có

90 ml nước muối sinh lý, lắc đều tạo huyền phù, được dung dịch pha loãng 10-1.

- Lắc đều, hút 1 ml dung dịch 10-1 cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước muối sinh
lý, ta được dịch pha loãng 10-2. Cứ tiếp tục pha loãng như thế được dịch pha
loãng 10-3, 10-4, 10-5, 10-6.
- Từ dịch pha loãng 10-4, 10-5, 10-6, nhỏ 0,1 ml (ở mỗi nồng độ) vào đĩa petri có sẵn
MT LBA. Dùng que trang trải đều dung dịch khắp bề mặt thạch, tiếp tục sử dụng
que trang đó trải tiếp 2 đĩa tiếp theo (mỗi nồng độ 3 đĩa).
o
- Lật ngược đĩa petri, gói vào giấy báo, ủ ở nhiệt độ 37 C trong 24h – 48h.
Chọn những KL riêng rẽ cấy vào ống thạch nghiêng .
Các chủng thuần khiết được cấy lên môi trường LBA, nuôi 24h ở nhiệt
o
độ 37 C. Sau đó dùng que đục lỗ thạch để lấy vùng vi khuẩn phát triển tốt
o
(0,5cm), đặt lên bề mặt môi trường BAM ủ ở 37 C. Đo đường kính vòng phân
giải sau 18 giờ ủ.
2.4.3. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái của vi khuẩn
2.4.3.1. Phương pháp quan sát hình thái khuẩn lạc
* Nguyên tắc
Quan sát, mô tả hình dạng, kích thước và màu sắc KL của các chủng phân lập
được để xác định hình dạng tế bào, khả năng di động và khả năng bắt màu qua
phương pháp nhuộm Gram.
* Tiến Hành
- Lấy một vòng que cấy KL trên ống thạch nghiêng, gạt 3-4 lần trên mặt thạch (MT
LBA) ở một góc. Quay đĩa thạch sang hướng khác và ria cấy từ một vạch thành 3-4
đường khác sao cho không trùng với các đường trước. Lặp lại theo một hướng thứ

18


ba để pha loãng hơn nữa phần VK dính trên que cấy. Chú ý không nhấc tay lên và
không thay đổi hướng của vòng que cấy.
o
1
- Đặt mẫu ở nhiệt độ 37 C trong 1-2 ngày để chọn ra các KL mọc riêng rẽ.
- Tiến hành quan sát các KL này từ các phía (từ trên xuống, từ bên cạnh), chú ý về
hình dạng KL, hình dạng mép, bề mặt, độ dày, có núm hay không, độ trong, màu
sắc ( trên, dưới, có khuếch tán ra MT không).
2.4.3.2. Phương pháp nhuộm Gram
* Nguyên tắc.
- Dựa trên khả năng bắt màu của tế bào chất và màng tế bào với thuốc nhuộm tím
kết tinh và iod mà hình thành nên hai loại phức chất khác nhau.
- Loại phức chất thứ nhất vẫn giữ nguyên màu thuốc nhuộm do không bị rửa trôi
khi xử lí bằng cồn. VSV có phức chất này thuộc Gram dương.
- Loại phức chất thứ hai không giữ được màu thuốc nhuộm nên mất màu khi xử lí
bằng cồn và bắt màu thuốc nhuộm bổ sung. VSV này thuộc Gram âm.
* Cách tiến hành
- Làm vết bôi với VK nuôi cấy từ 16 – 24h trên ống thạch nghiêng màu.
- Để khô vết bôi trong không khí hoặc cố định nhẹ trên đèn cồn.
- Đặt miếng giấy lọc lên vết bôi.
- Nhuộm tiêu bản bằng tím gentian qua giấy lọc trong 1 phút.
- Nhuộm lugol trong 1 phút.
- Rửa bằng nước cất.
- Tẩy bằng cồn trong 30 giây, để nghiêng tiêu bản, nhỏ từ từ giọt cồn đến khi tan
hết
- Rửa bằng nước cất.
- Nhuộm bổ sung Fuchsin từ 10 – 30 giây.

- Rửa nước, làm khô và quan sát trên KHV với vật kính x100
* Đọc kết quả: VK Gram âm sẽ bắt màu hồng, VK Gram dương sẽ bắt màu tím.
2.4.4. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy tới khả năng
sinh tổng hợp Nattokinase của vi khuẩn:
2.4.4.1. Phương pháp khuếch tán thạch để xác định hoạt tính Nattokinase
(R.Dubey, 2011).
Hoạt tính của nattokinase được xác định bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch
chứa fibrin, 5ml dung dịch fibrin thỏ nồng độ 2% (w/v) trong đệm phosphate
(pH=7,4) được trộn với 35ml dung dịch agar 2% đã tiệt trùng trong đĩa petri
(đường kính 100mm- Độ dày của thạch sẽ là 5mm). Để cố định 30 phút để thạch
đông cứng, sau đó sử dụng que đục lỗ thạch tạo các giếng thạch có đường kính

19


5mm. Dịch nổi ly tâm của dịch lên men vi khuẩn được đưa vào giếng thạch và ủ
o
ở 37 C trong 18h. Sau đó đo đường kính vòng phân giải để xác định hoạt tính của
2
enzyme. Một đơn vị (U) được định nghĩa là lượng enzyme có trong 25µl dung
2
o
dịch enzyme có khả năng tạo ra vòng phân giải 1mm ở pH 7,4 và nhiệt độ 37 C
trong 18h.
2
2
Hoạt tính enzyme = (D – 5 ) * 3,14/16 (U)

2.4.4.2. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy tới khả
năng tổng hợp Nattokinsae của vi khuẩn.

Để xác định ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy tới quá trình tổng hợp Nattokinase,
chủng vi khuẩn được nuôi lắc (150 vòng/phút) trong 50ml môi trường CM trong
o
bình tam giác 250ml ở 37 C. Sau các khoảng thời gian 12, 24, 36, 48, 72 giờ tiến
hành hút 5ml dịch nuôi cấy, cho vào ống Falcon 15ml và ly tâm ở chế độ
6000
o
vòng/phút, ở 4 C trong 20 phút. Sau đó dịch nổi được sử dụng để phân tích
hoạt tính Nattokinase theo phương pháp khuếch tán thạch.
2.4.4.3. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường tới khả năng
tổng hợp Nattokinase của vi khuẩn.
Chủng vi khuẩn được nuôi lắc (150 vòng/phút) trong 20ml môi trường CM
o
trong bình tam giác 50ml ở 37 C. pH ban đầu của môi trường được điều chỉnh với
các giá trị: 5,0; 6,0; 7,0; 8,0 bằng dung dịch NaOH 1N hoặc HCL 1N. Sau 36h
o
nuôi cấy tiến hành ly tâm ở chế độ 6000 vòng/phút, 4 C trong 20 phút. Sau đó dịch
nổi được sử dụng để phân tích hoạt tính Nattokinase theo phương pháp khuếch tán
thạch.

2.5. Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật
Giống vi sinh vật được bảo quản trên môi trường thạch nghiêng LBA ở nhiệt độ
o
4 C. Sau 2-3 tuần giống vi sinh vật được cấy chuyển một lần để đảm bảo sức
sống và ổn định của giống vi sinh vật trong quá trình nghiên cứu.

2.6. Phương pháp nhân giống vi khuẩn
Dùng que cấy lấy sinh khối từ ống giống cấy vào môi trường LB, sau đó nuôi

20

o
lắc (150 vòng/phút) ở nhiệt độ 37 C trong 24h. Sau khi kết thúc thời gian nuôi cấy,
mật độ tế bào tăng lên khoảng 108 tế bào/ml sẽ được2 cấy chuyển vào môi
trường nuôi cấy tiếp theo với tỷ lệ 10%.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.Lê Thị Bích Phượng, Võ Thị Hạnh, Trần Thạnh Phong, Lê Tấn Hưng, Trương
Thị Hồng Vân, Lê Thị Hương (2012). Phân lập và tuyển chọn một số chủng
bacillus sinh tổng hợp nattokinase. Tạp chí Sinh học.
2.Lê Hồng Thọ (2011). Natto là gì?. Vietsciences.
3.Ralph E., Holsworth Jr.(2002).Nattokinase and Cardiovascular Health.Special
Report.
4.Sumi H., Hamada H., Tsushima H. et al. (1987). A novel fibrinolytic enzyme
(nattokinase) in the vegetable cheese natto. Fibrinolysis 2: 67.
5.Meruvu H., Vangalapati M., 2011. Nattokinase: A Review on Fibrinolytic
Enzyme, International Journal of Chemical.
6.SumiH. (1994). Structure and Fibrinolytic Propertiesof Nattokinase.Okayama,
Japan: Departmentof Nutrition, Faculty of Health and Welfare Science, Okayama
Prefectural University.
7.Maruyama M. & Sumi H. (2008). Effect on Natto diet on blood pressure,
JTTAS.
8.Sumi H., 1995, Healthy Mirobe “Bacillius Natto” , Japan Bio Science
Laboratory.
9.Kim S., Choi N. (2000). Purification and characterization of subtilisin DJ-4
secreted by Bacillus sp. strain DJ-4 screened from Doen-Jang. Biotechnol.
Biochem, 64: 1722-1725.
10.Kim W., Choi K., Kim Y., Park H., Choi J., Lee Y., Oh H., Kwon I., Lee S.
(1996). Purification and characterization of a fibrinolytic enzyme produced from

Bacillus sp. strain CK 11-4 screened from Chungkook-Jang. Appl. Environ.
Microbiolo., 62 (7): 1488-2482.
11. chuabenh-it-biet-cua-dau-nanh-post119335.gd

21


2

22