Nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử virus dịch tả vịt tại Việt Nam qua khảo sát các gen UL5, UL32 và DNA-polymerase

VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

Hán Thị Hƣơng

Nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử virus dịch tả
vịt tại Việt Nam qua khảo sát các gen UL5, UL32
và DNA-polymerase

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60.42.30

Ngƣời hƣớng dẫn: PGS.TS. Lê Thanh Hòa

Hà Nội – 2012
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




LỜI CẢM ƠN
Em xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến PGS.TS.Lê Thanh Hòa
- Trƣởng phòng Miễn dịch học - Viện Công nghệ sinh học đã tận tình hƣớng
dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong quá trình học tập và
hoàn thành luận văn này.
Em xin chân thành cảm ơn TS.Lê Thị Kim Xuyến - phòng Miễn dịch
học - Viện Công nghệ sinh học đã hƣớng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ em hoàn
thành luận văn này.
Em xin chân thành cảm ơn NCS.Tạ Hoàng Long - Giám đốc trung tâm
kiểm nghiêm thuốc thú y trung ƣơng 1 đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em
trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn này.

Em xin cảm ơn sự hỗ chợ kinh phí của đề tài nhánh “Giải mã gen đặc
trƣng xây dựng dữ liệu sinh học phân tử của 5 chủng virus gia cầm quốc gia”
do PGS.TS Lê Thanh Hòa làm chủ nhiệm thuộc đề tài “Ứng dụng kỹ thuật sinh
học phân tử để xây dụng danh mục giống virus gia cầm quốc gia” năm 2011 do
Trung tâm kiểm nghiệm thuốc thú y chủ trì nằm trong “Chƣơng trình công
nghệ sinh học Nông nghiệp” của bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn.
Em xin chân thành cảm ơn Cơ sở đào tạo Viện Sinh thái và Tài nguyên
sinh vật, Ban lãnh đạo Viện sinh thái và Tài nguyên sinh vật cùng các thầy cô
đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong quá trình học tập và hoàn thành
luận văn.
Em xin đƣợc bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới tất cả các cô chú, anh chị
phòng Miễn dịch học, Viện Công nghệ sinh học đã nhiệt tình giúp đỡ trong
quá trình tiến hành thí nghiệm cũng nhƣ tạo mọi điều kiện để luận văn đƣợc
hoàn thiện.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới ngƣời thân, gia đình và
bạn bè đã luôn khuyến khích, động viên cũng nhƣ chia sẻ những khó khăn
với em trong suốt quá trình học tập và hoàn thành nghiên cứu của mình.
Học viên

Hán Thị Hƣơng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

MỤC LỤC
Lời cảm ơn…………………………………………………………………….…….i
Mục lục…………………………………………………………………………...iii
Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt.....………………………………......….…iv
Danh mục các bảng……………………………………………………………...…v
Danh mục các hình……………………………………………………………...…vi

ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................... 1
CHƢƠNG 1........................................................................................................ 3
TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................................. 3
1.1. Giới thiệu về bệnh dịch tả vịt và virus gây bệnh ........................................ 3
1.1.1. Lịch sử và địa dƣ bệnh ............................................................................. 4
1.1.2. Đƣờng xâm nhập, cách lây lan và cơ chế gây bệnh ................................. 5
1.1.3. Triệu chứng lâm sàng ............................................................................... 6
1.1.4. Bệnh tích .................................................................................................. 8
1.1.5. Vaccine phòng bệnh ................................................................................. 9
1.2. Sinh học phân tử virus dịch tả vịt ............................................................. 11
1.2.1. Cấu trúc hệ gen của virus dịch tả vịt ...................................................... 11
1.2.2. Sự nhân lên của virus ............................................................................. 16
1.3. Tình hình nghiên cứu virus dịch tả vịt trên thế giới và tại Việt Nam ....... 18
CHƢƠNG 2...................................................................................................... 20
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................... 20
2.1. Vật liệu ...................................................................................................... 20
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ........................................................................... 21
2.2.1. Phƣơng pháp tiếp truyền ........................................................................ 21
2.2.2. Phƣơng pháp tách chiết DNA tổng số.................................................... 22
2.2.3. Kỹ thuật PCR ......................................................................................... 23
2.2.4. Phƣơng pháp tinh sạch sản phẩm PCR .................................................. 24

2.2.5. Phƣơng pháp giải trình tự....................................................................... 25
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




2.2.6. Phƣơng pháp xử lý số liệu sử dụng các phần mềm tin-sinh học ........... 26
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................................... 28
3.1. Kết quả tiếp truyền virus ........................................................................... 28
3.2. Kết quả thu nhận chuỗi gen nghiên cứu .................................................... 30
3.2.1. Kết quả thu nhận chuỗi gen DNA-polymerase và giải trình tự ............. 30
3.2.2. Kết quả thu nhận chuỗi gen helicase (UL5) và giải trình tự .................. 32
3.2.3. Kết quả thu nhận chuỗi gen kháng nguyên (UL32) và giải trình tự ............ 35
3.3. Kết quả phân tích, so sánh thành phần gen của các chủng virus dịch tả vịt
Việt Nam với các chủng của thế giới dựa trên gen UL5 và UL32 ....................... 39
3.3.1. Kết quả phân tích gen UL5 ...................................................................... 40
3.3.2. Kết quả phân tích gen UL32 .................................................................... 46
3.4. Bàn luận chung .......................................................................................... 52
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.......................................................................... 54
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................ 56
PHỤ LỤC………………………………………………..…………………..63

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Ký hiệu

Tiếng Anh

Tiếng Việt

bp

base pair

Cặp bazơ

cDNA

complementary DNA

DNA bổ sung

Da

dalton

DEV

Duck Enteritis Virus

Virus gây bệnh dịch tả trên vịt

DNA

Deoxyribonucleic acid

Axit deoxyribonucleic

kDa

kilo dalton

nm

nanometer

ORF

Open Reading Frame

Khung đọc mở

RNA

Ribonucleic Acid

Axit ribonucleic

PCR

Polymerase chain reaction

Phản ứng trùng hợp chuỗi gen

UL

Unique long

Vùng dài

US

Unique short

Vùng ngắn

UTR

Untranslated region

Vùng không mã hóa

IRS

short internal repeat

vùng lặp ngắn trong

TRS

short terminal repeat

vùng lặp ngắn cuối

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng

Tên bảng

Trang

Bảng 2.1 Thành phần phản ứng PCR và chu trình nhiệt trong nghiên
cứu sinh học phân tử virus dịch tả vịt.
Bảng 2.2 Các cặp mồi (primer) đƣợc sử dụng trong nghiên cứu

23

Bảng 3.1 Kết quả tiếp truyền virus cƣờng độc dịch tả vịt trên vịt

27

Bảng 3.2 Danh sách các chủng Dịch tả vịt của Việt Nam và thế giới sử
dụng trong phân tích so sánh
Tỷ lệ (%) đồng nhất về nucleotide (trên đƣờng chéo) và
tƣơng đồng về amino acid (dƣới đƣờng chéo) của gen UL5
Bảng 3.3 của chủng DTVCDKN (Việt Nam) với chủng DTVVXKN
(Việt Nam) và 07 chủng DTV của thế giới
Tỷ lệ (%) đồng nhất về nucleotide (trên đƣờng chéo) và
Bảng 3.4 tƣơng đồng về amino acid (dƣới đƣờng chéo) của gen UL32
của chủng DTVCDKN (Việt Nam) với chủng DTVVXKN

(Việt Nam) và 07 chủng DEV của thế giới

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



23

39

44

50


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình

Tên hình

Trang

Hình 1.1

Triệu chứng vịt bị bệnh dịch tả

8

Hình 1.2

Bệnh tích vịt bị bệnh dịch tả vịt

9

Hình 1.3

Cấu trúc không gian của Herpesviruses

11

Hình 1.4

Cấu tạo hạt virus dịch tả vịt

12

Hình 1.5

Chu trình nhân lên của Herpesvirus trong tế bào vật chủ

18

Hình 3.1

Triệu chứng và bệnh tích vịt bệnh dịch tả vịt

28
29

Hình 3.3

Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR trên thạch
agarrose 1%
Trình tự gen DNA-polymerase của chủng DTVCDKN

Hình 3.4

Trình tự gen DNA-polymerase của chủng DTVVXKN

31
32

Hình 3.6

Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR trên thạch
agarrose 1%
Trình tự gen UL5 của chủng DTVCDKN

Hình 3.7

Trình tự gen UL5 của chủng DTVVXKN

34
35

Hình 3.9

Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR trên thạch
agarrose 1%
Trình tự gen UL32 của chủng DTVCĐKN

Hình 3.10

Trình tự gen UL32 của chủng DTVVXKN

37

Hình 3.2

Hình 3.5

Hình 3.8

Hình 3.11

Hình 3.12

Hình 3.13

Hình 3.14

Kết quả so sánh thành phần nucleotide của các chủng dịch
tả vịt Việt Nam với các chủng của thế giới dựa trên gen
Helicase (UL5)
Kết quả so sánh thành phần amino acid của các chủng
dịch tả vịt Việt Nam với các chủng của thế giới dựa trên
gen Helicase (UL5)
Kết quả so sánh thành phần nucleotide của các chủng dịch
tả vịt Việt Nam với các chủng của thế giới dựa trên gen
kháng nguyên (UL32)

Kết quả so sánh thành phần amino acid của các chủng
dịch tả vịt Việt Nam với các chủng của thế giới dựa trên
gen kháng nguyên (UL32)

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên



30

33

36

42

43

48

49


ĐẶT VẤN ĐỀ
Dịch tả vịt (duck plague) là một bệnh truyền nhiễm cấp tính, lây lan
nhanh, gây bệnh cho nhiều loài thuỷ cầm, trƣớc hết là loài vịt, ngỗng, ngan,
thiên nga, ở hầu hết mọi lứa tuổi từ vài ngày cho đến vài tháng tuổi, thậm chí
ở vịt giống nuôi hàng năm (Wobeser, 1997), gây nhiều thiệt hại cho ngành
chăn nuôi trên thế giới cũng nhƣ tại Việt Nam.
Virus dịch tả vịt (duck enteritis virus-DEV) là thành viên của họ

Herpesviridae, có hệ gen là DNA sợi đôi có độ dài khoảng 150-170kb giống nhƣ
nhiều loại virus thuộc họ Herpesviridae khác. Phân bố thành phần nucleotide
trong hệ gen thiên về G+C (Guanine và Cytosine), chiếm tỷ lệ 64,3%, cao hơn
rất nhiều so với các Herpesvirus khác của gia cầm (Gardner và cs., 1993). Mặc
dù cho đến nay, virus gây bệnh dịch tả vịt đƣợc phân nhóm vào dƣới họ
Alphaherpesvirinae (Shawky và Schat, 2002) nhƣng do đặc tính sinh học và
phân loại học của loại virus này còn gặp nhiều vấn đề, nên hiện nay Ủy ban phân
loại virus học quốc tế (ICTV) đã tạm thời xếp vào nhóm virus chƣa xác định cụ
thể thuộc họ Herpesviridae (Fauquet và cs., 2005; Liu và cs., 2008).
Về cấu trúc phân tử, hệ gen của DEV chia làm hai vùng gen quan trọng
hay còn gọi là vùng độc nhất (unique region, U), bao gồm UL (vùng dài) và
US (vùng ngắn), và bao bọc hai đầu của vùng ngắn là hai vùng lặp ký hiệu
IRS và TRS. Vì hệ gen của virus dịch tả vịt tƣơng đối lớn nên đến nay mới
chỉ có một vài hệ gen đƣợc giải mã (Wang và cs., 2011), tuy nhiên một số hợp
phần gen quan trọng đã đƣợc giải mã và phân tích. Trong số các gen của hệ
gen virus dịch tả vịt, ngƣời ta thƣờng sử dụng một số gen đặc thù để làm chỉ thị
phân tử chẩn đoán, giám định và xác định đặc tính sinh học hệ gen virus dịch tả
vịt, trƣớc hết là gen DNA-polymerase (DNA-pol), gen UL32 mã hoá cho
glycoprotein vỏ hay còn đƣợc coi là gen kháng nguyên (Hansen và cs., 2000)
và gen UL5 (Pan và cs., 2008).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




Cho đến nay virus dịch tả vịt vẫn diễn biến hết sức phức tạp và gây
nhiều ổ dịch ở khắp các địa phƣơng trong cả nƣớc. Tuy nhiên, tại Việt Nam lại
chƣa có một nghiên cứu đầy đủ nào về đặc tính phân tử, nguồn gốc phả hệ, tính
tƣơng đồng giữa các chủng virus cƣờng độc và các chủng virus vaccine.
Xuất phát từ yêu cầu thực tế đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:

“Nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử virus dịch tả vịt tại Việt Nam qua
khảo sát các gen UL5, UL32 và DNA-polymerase”.
- Đối tƣợng nghiên cứu:
- Chủng virus cƣờng độc dịch tả vịt do Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc
thú y Trung ƣơng cung cấp, đƣợc kí hiệu là DTVCDKN.
- Chủng virus nhƣợc độc vaccine do Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc thú
y Trung ƣơng cung cấp, đƣợc kí hiệu là DTVVXKN.
- Mục tiêu của đề tài là: Giải mã các gen UL5, UL32 và DNA-polymerase
của chủng virus cƣờng độc và nhƣợc độc vaccine tại Việt Nam; phân tích và
so sánh đặc điểm sinh học phân tử với các chủng của thế giới.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....

data error !!! can't not
read....



data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....

data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....

data error !!! can't not
read....


data error !!! can't not
read....

data error !!! can't not
read....