Phương pháp thu nhận Enzyme Protease

Đồ án Công nghệ 1

LỜI MỞ ĐẦU
Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của Công nghệ sinh học, các chế
phẩm enzyme được sản xuất càng nhiều và được sử dụng trong hầu hết trong các
lĩnh vực như: chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế… Hàng năm
lượng enzyme được sản xuất trên thế giới đạt khoảng trên 300.000 tấn với giá trị
trên 500 triệu USD, được phân phối trong các lĩnh vực khác nhau [4].
Phần lớn enzyme được sản xuất ở quy mô công nghiệp đều thuộc loại
enzyme đơn cấu tử, xúc tác cho phản ứng phân hủy. Khoảng 75% chế phẩm là
enzyme thủy phân được sử dụng cho việc thủy phân cơ chất tự nhiên.
Protease là enzyme được sử dụng nhiều nhất hiện nay trong một số ngành
sản xuất như: chế biến thực phẩm (đông tụ sữa làm pho mát, làm mềm thịt, bổ
sung để làm tăng chất lượng sản phẩm trong sản xuất bia, xử lý phế phụ phẩm
trong chế biến thực phẩm…), sản xuất chất tẩy rửa, thuộc da, y tế, nông nghiệp…
Qua nhiều năm, việc gia tăng sử dụng vi sinh vật như là một nguồn cung cấp
protease đã cải thiện đáng kể hiệu quả sản xuất và sản phẩm được tạo ra nhiều
hơn. Tuy nhiên giá thành chế phẩm protease còn khá cao, do đó cũng hạn chế việc
sử dụng rộng rãi enzyme trong sản xuất. Các chế phẩm thu được sau quá trình
nuôi cấy sản xuất enzyme chưa phải là chế phẩm có độ tinh khiết cao vì protein
chỉ chiếm 20-30% [6]. Vì vậy, việc nghiên cứu cải tiến phương pháp tách và tinh
chế enzyme nhằm thu được chế phẩm có độ tinh khiết cao rất cần thiết. Để tách và
tinh chế enzyme nói riêng và protein nói chung thường có một loạt phương pháp
hóa-lý và hóa học khác nhau. Có thể chia làm ba nhóm phương pháp sau:
- Phương pháp kết tủa

Trang: 1


Đồ án Công nghệ 1
- Phương pháp sắc ký

- Phương pháp phân tách hê ê hai pha nước
Protease phân bố ở thực vật, động vật, vi sinh vật. Tuy nhiên nguồn enzyme
ở vi sinh vật phong phú nhất, có ở hầu hết các vi sinh vật như vi khuẩn, nấm mốc
và xạ khuẩn… Có thể nói vi sinh vật là nguồn nguyên liệu thích hợp nhất để sản
xuất enzyme ở quy mô lớn dùng trong công nghệ và đời sống.

Trang: 2


Đồ án Công nghệ 1

Chương 1:
TỔNG QUAN VỀ ENZYM PROTEASE
1.1.

Tình hình nghiên cứu enzyme.

1.1.1. Vấn đề nghiên cứu enzyme ở nước ta
Hầu như mọi phản ứng hoá học trong cơ thể sống đều cần phải có vai trò
xúc tác của enzyme - chất xúc tác sinh học. Chính vì vậy, các nghiên cứu về
enzyme đã thu hút sự quan tâm của các cán bộ hoá sinh học, sinh học thực nghiệm
và nhiều nhà nghiên cứu ở các lĩnh vực liên quan khác. Các nghiên cứu nhằm theo
hướng tách, tinh sạch enzyme, tạo các chế phẩm có độ sạch khác nhau, nghiên cứu
cấu trúc, mối liên quan giữa cấu trúc và hoạt tính sinh học của enzyme, khả năng
ứng dụng enzyme trong thực tế. Nghiên cứu về công nghệ enzyme đã được tiến
hành bởi nhiều tác giả như sử dụng phủ tạng của lò mổ để sản xuất pancrease,
pepsin, trypsin... sử dụng mầm mạ để sản xuất amylase. Đã có những thử nghiệm
công nghệ như sản xuất amino acid từ nhộng tằm bằng protease, bột protein thịt
bằng bromelain từ đọt dứa, lên men rượu bằng enzyme cố định trên cột. Cũng đã
có những nghiên cứu sử dụng peroxydase, cyt-P 450 trong chế tạo biosensor và

thuốc phát hiện chất độc... Trong lĩnh vực y dược, việc nghiên cứu sâu về cơ chế
tác dụng của một số enzyme nhằm mục đích kiến tạo nên một số thuốc dùng điều
trị một số bệnh đặc biệt là tạo ra một số chế phẩm thuốc chống suy dinh dưỡng ở
trẻ em, đồng thời đã tiến hành sản xuất đại trà. Đây là một đóng góp rất thiết thực
và kịp thời trong việc phòng chống suy dinh dưỡng ở nước ta.
1.1.2. Công nghệ sản xuất enzyme trên thế giới.
Trong những năm gần đây, giá trị thương mại của các enzyme công nghiệp
trên toàn thế giới đạt khoảng 1 tỷ USD, trong đó chủ yếu là các enzyme thủy phân
(75%), và protease là mô êt trong ba nhóm enzyme lớn nhất sử dụng trong công
nghiệp (60%) [4].

Trang: 3


Đồ án Công nghệ 1
1.2.

Tổng quan về enzyme Protease.

1.2.1. Giới thiệu chung.
Nhóm enzyme protease (peptit – hidrolase 3.4) xúc tác quá trình thuỷ phân
liên kết liên kết peptit (-CO-NH-)n trong phân tử protein, polypeptit đến sản phẩm
cuối cùng là các axit amin. Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thuỷ phân
liên kết este và vận chuyển axit amin.

ﾧ

Hình 1.1. Mô hình enzyme Protease thủy phân phân tử Protein.
Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức
độ tế bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng

từ vi sinh vật (vi khuẩn, nấm và virus) đến thực vật (đu đủ, dứa...) và động vật
(gan, dạ dày bê...). So với protease động vật và thực vật, protease vi sinh vật có
Trang: 4


Đồ án Công nghệ 1
những đặc điểm khác biệt. Trước hết hệ protease vi sinh vật là một hệ thống rất
phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình
dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhất.
Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên protease vi sinh vật
thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thuỷ phân triệt để và đa dạng.
Hình 1.2. Cấu trúc
không gian enzyme
Protease.
1.2.2. Phân

loại

Protease
Protease
(peptidase) thuộc phân
lớp 4 của lớp thứ 3 (E.C.3.4) .

Peptidase (Protease)
(E.C.3.4)

Exopeptidase
(E.C. 3.4.11-17)

Endopeptidase

(E.C. 3.4.21-99)
Serine proteinase

Aminopeptidase
Cystein proteinase

Carboxypeptidase

Aspartic proteinase

Metallo proteinase

Trang: 5


Đồ án Công nghệ 1

Hình 1.3. Sơ đồ phân loại protease
Protease được phân chia thành hai loại: endopeptidase và exopeptidase.
* Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide, exopeptidase được phân
chia thành hai loại:
+ Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của
chuỗi polypeptide để giải phóng ra một amino acid, một dipeptide hoặc một
tripeptide.
+ Carboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu C của chuỗi
polypeptide và giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptide.
* Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase được chia thành bốn
nhóm:
+ Serin proteinase: là những proteinase chứa nhóm –OH của gốc serine
trong trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc

tác của enzyme. Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ: chymotrypsin và subtilisin.
Nhóm chymotrypsin bao gồm các enzyme động vật như chymotrypsin, trypsin,
elastase. Nhóm subtilisin bao gồm hai loại enzyme vi khuẩn như subtilisin
Carlsberg, subtilisin BPN. Các serine proteinase thường hoạt động mạnh ở vùng
kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng.
+ Cysteine proteinase: Các proteinase chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt
động. Cystein proteinase bao gồm các proteinase thực vật như papayin, bromelin,
một vài protein động vật và proteinase ký sinh trùng. Các cystein proteinase
thường hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng.

Trang: 6


Đồ án Công nghệ 1
+ Aspartic proteinase: Hầu hết các aspartic proteinase thuộc nhóm pepsin.
Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa như: pepsin, chymosin, cathepsin,
renin. Các aspartic proteinase có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động
và thường hoạt động mạnh ở pH trung tính.
+ Metallo proteinase: Metallo proteinase là nhóm proteinase được tìm thấy ở
vi khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn. Các metallo proteinase
thường hoạt động vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới tác dụng của
EDTA.
Ngoài ra, protease được phân loại một cách đơn giản hơn thành ba nhóm:
- Protease acid: pH 2-4
- Protease trung tính: pH 7-8
- Protease kiềm: pH 9-11

Trang: 7

Đồ án Công nghệ 1

Chương 2:
NGUỒN THU NHẬN ENZYM PROTEASE
2.1.

Nguồn động vật:
- Tụy tạng: đây là nguồn enzyme sớm nhất, lâu dài nhất và có chứa nhiều

enzyme nhất.
- Dạ dày bê: Trong ngăn thứ tư của dạ dày bê có tồn tại enzyme thuộc nhóm
Protease tên là renin. Enzyme này đã từ lâu được sử dụng phổ biến trong công
nghệ phomat. Renin làm biến đổi cazein thành paracazein có khả năng kết tủa
trong môi trường sữa có đủ nồng độ Ca2+. Đây là quá trình đông tụ sữa rất điển
hình, được nghiên cứu và ứng dụng đầy đủ nhất. Trong thực tế nhiều chế phẩm
renin bị nhiểm pepxin (trong trường hợp thu chế phẩm renin ở bê quá thì. Khi
đó dạ dày bê đã phát triển đầy đủ có khả năng tiết ra pepxin) thì khả năng đông
tụ sữa kém đi.
Gần đây có nghiên cứu sản xuất protease từ vi sinh vật có đặc tính renin như
ở các loài Eudothia Parasitica và Mucor Purillus.
2.2.

Nguồn thực vật:
Có 3 loại protease thực vật như Bromelain, Papain và Ficin. Papain thu

được từ nhựa của lá, thân, quả đu đủ (Carica papaya) còn Bromelain thu từ quả,
chồi dứa, vỏ dứa (Pineapple plant). Các enzyme này được sử dụng để chống lại
hiện tượng tủa trắng của bia khi làm lạnh (chilling proofing) do kết tủa protein.
Những ứng dụng khác của protease thực vật này là trong công nghệ làm mềm thịt
và trong mục tiêu tiêu hoá. Ficin thu được từ nhựa cây cọ (Ficus carica). Enzyme

được sử dụng thuỷ phân protein tự nhiên.

Trang: 8


Đồ án Công nghệ 1

Hình 2.1. Nguồn thu enzyme
Protease từ thực vật
2.3. Nguồn vi sinh vật:
Enzyme Protease phân bố chủ yếu vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn…gồm
nhiều loài thuộc Aspergillus, Bacillus, Penicillium, Clotridium, Streptomyces và
một số và một số loại nấm men.
 Vi khuẩn
Lượng protease sản xuất từ vi khuẩn được ước tính vào khoảng 500 tấn,
chiếm 59% lượng enzyme được sử dụng [6].
Protease của động vật hay thực vật chỉ chứa một trong hai loại
endopeptidase hoặc exopeptidase, riêng vi khuẩn có khả năng sinh ra cả hai loại
trên, do đó protease của vi khuẩn có tính đặc hiệu cơ chất cao. Chúng có khả năng
phân hủy tới 80% các liên kết peptide trong phân tử protein [6].
Trong các chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp mạnh protease là
Bacillus subtilis, B. mesentericus, B. thermorpoteoliticus và một số giống thuộc
chi Clostridium. Trong đó, B. subtilis có khả năng tổng hợp protease mạnh nhất
(Nguyễn Trọng Cẩn và cs, 1998). Các vi khuẩn thường tổng hợp các protease hoạt
động thích hợp ở vùng pH trung tính và kiềm yếu.
Các protease trung tính của vi khuẩn hoạt động ở khoảng pH hẹp (pH 5-8)
và có khả năng chịu nhiệt thấp. Các protease trung tính tạo ra dịch thủy phân
protein thực phẩm ít đắng hơn so với protease động vật và tăng giá trị dinh dưỡng.
Các protease trung tính có khả năng ái lực cao đối với các amino acid ưa béo và
thơm. Chúng được sinh ra nhiều bởi B. subtilis, B. mesentericus, B.

thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chi Clostridium.

Trang: 9


Đồ án Công nghệ 1

Hình 2.2. Clostridium
Protease của Bacillus ưa kiềm có điểm đẳng điện bằng 11, khối lượng phân
tử từ 20.000-30.000. Ổn định trong khoảng pH 6-12 và hoạt động trong khoảng
pH rộng 7-12 .

Hình 2.3.
Bacillus

 Nấm
Nhiều loại
nấm mốc có khả
năng tổng hợp
một lượng lớn
protease

được

ứng dụng trong
công nghiệp thực

Trang: 10

Đồ án Công nghệ 1
phẩm là các chủng: Aspergillus oryzae, A. terricola, A. fumigatus, A. saitoi,
Penicillium chysogenum)… Các loại nấm mốc này có khả năng tổng hợp cả ba
loại protease: acid, kiềm và trung tính. Nấm mốc đen tổng hợp chủ yếu các
protease acid, có khả năng thủy phân protein ở pH 2,5-3.
Một số nấm mốc khác như: A. candidatus, P. cameberti, P. roqueforti… cũng
có khả năng tổng hợp protease có khả năng đông tụ sữa sử dụng trong sản xuất
pho mát.

Hình
2.4.
Nấm
mốc
X
ạ

khuẩn
Về phương diện tổng hợp protease, xạ khuẩn được nghiên cứu ít hơn vi
khuẩn và nấm mốc. Tuy nhiên, người ta cũng đã tìm được một số chủng có khả
năng tổng hợp protease cao như: Streptomyces grieus, S. fradiae, S. Trerimosus...

Trang: 11


Đồ án Công nghệ 1

Trang: 12


Đồ án Công nghệ 1

ﾧ

Hình 2.5. Xạ khuẩn
Các chế phẩm protease từ xạ khuẩn được biết nhiều là pronase (Nhật) được
tách chiết từ S. grieus, enzyme này có đặc tính đặc hiệu rộng, có khả năng thủy
phân tới 90% liên kết peptide của nhiều protein thành amino acid. Ở Liên Xô (cũ),
người ta cũng tách được chế phẩm tương tự từ S. grieus có tên là protelin.
Từ S. fradiae cũng có thể tách chiết được keratinase thủy phân karetin. Ở
Mỹ, chế phẩm được sản xuất có tên là M-Zim dùng trong sản xuất da. Protease từ
S. fradiae cũng có hoạt tính elastase cao, do đó chúng được dùng trong công
nghiệp chế biến thịt.
Hầu hết các protease phân cắt protein ở các liên kết đặc hiệu, vì thế có thể
sử dụng các enzyme này theo chiều phản ứng tổng hợp để tổng hợp các liên kết
peptide định trước. Yếu tố tăng cường quá trình tổng hợp bao gồm pH, các nhóm
carboxyl hoặc nhóm amine được lựa chọn để bảo vệ, khả năng kết tủa sản phẩm,
phản ứng trong hệ hai pha lỏng.
Có thể nói vi sinh vật là nguồn nguyên liệu thích hợp nhất để sản xuất
enzyme ở quy mô lớn dùng trong công nghệ và đời sống. Dùng nguồn vi sinh vật
có những lợi ích chính như sau:
 Chủ động về nguyên liệu nuôi cấy vi sinh vật và giống vi sinh vật.
 Chu kỳ sinh trưởng của vi sinh vật ngắn: 16÷ 100 giờ nên có thể thu hoặc
nhiều lần quanh năm.
 Có thể điều khiển sinh tổng hợp enzyme dễ dàng theo hướng có lợi (định
hướng sử dụng và tăng hiệu suất tổng thu hồi).
 Giá thành tương đối thấp vì môi trường tương đối rẻ, đơn giản, dể tổ chức
sản xuất.

Trang: 13

Đồ án Công nghệ 1
Tuy nhiên trong mọi trường hợp cần lưu ý khả năng sinh độc tố (gây độc,
gây bệnh) để có biện pháp phòng ngừa, xử lý thích hợp.
Để sản xuất chế phẩm enzyme, người ta có thể phân lập các giống vi sinh
vật có trong tự nhiên hoặc các giống đột biến có lựa chọn theo hướng có lợi nhất,
chỉ tổng hợp ưu thế một loại enzyme nhất định cần thiết nào đó.

Chương 3:
THU NHẬN VÀ LÀM SẠCH ENZYM PROTEASE TỪ
VI SINH VẬT VÀ THỰC VẬT
3.1. Thu nhận và làm sạch enzyme Protease từ vi sinh vật.

chọn
cảiyếu
tạo là
giống
Nguồn thu proteaseTuyển
vi sinh
vậtvàchủ
vi khuẩn, nấm mốc và xạ
vi sinh vật

khuẩn.

Quá trình sản xuất các chế phẩm enzyme vi sinh vật bao gồm các giai
đoạn chủ yếu

Phương pháp bảo quản giống
vi sinh vật

Môi trường nuôi cấy vi sinh
vật sinh tổng hợp enzim

Tách và làm sạch chế phẩm
enzim

Trang: 14


Đồ án Công nghệ 1

Hình 3.1. Các công đoạn sản xuất chế phẩm enzyme
3.1.1. Tuyển chọn và cải tạo giống vi sinh vật cho enzyme có hoạt lực cao.
Để chọn giống vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme cao, người ta
có thể phân lập từ môi trường tự nhiên hoặc có thể dùng các tác nhân gây đột biến
tác động lên bộ máy di truyền hoặc làm thay đổi đặc tính di truyền để tạo thành
các biến chủng có khẳ năng tổng hợp đặc biệt hữu hiệu một loại enzyme nào đó,
cao hơn hẳn chủng gốc ban đầu.
3.1.1.1. Phương pháp gây đột biến.
Đây là phương pháp hay được dùng nhất nhằm để:
 Tạo những đột biến bị giảm khả năng sinh tổng hợp repressor hoặc tổng
hợp repressor có ái lực thấp với gene opertor.
 Tạo những đột biến tổng hợp enzyme có cấu trúc bậc 1 thay đổi do đó có
thể giảm độ thay đổi với kiểu kìm hãm theo cơ chế liên hệ ngược.
Nếu sự thay đổi cấu trúc bậc 1 xảy ra ở vùng trung tâm hoạt động hoặc ở gần đó
thì có thể làm thay đổi rõ rệt hoạt tính của enzyme.
 Gây đột biến ở đoạn gene hoạt hóa promotor để làm tăng áp lực của nó đối
với ARN-polymerase do đó làm tăng tốc độ sao chép mã…Dùng biện pháp này có
thể làm tăng lượng glucoza-6-phosphatdehydrogenaza lên 6 lần.
Hiện tượng đột biến thường liên hệ với sự thay đổi một gene, chẳng hạn bị “lồi”

một bazo khi tái tạo phân tử ADN.

Trang: 15


Đồ án Công nghệ 1
Để tạo một đột biến gene có thể dùng tác nhân vật lý (tia tử ngoại, tia
phóng xạ) hay hóa học (các hóa chất) tác dụng lên tế bào sinh vật.
3.1.1.2. Phương pháp biến nạp.
Là sự biến đổi tính trạng di truyền của một nòi vi sinh vật dưới ảnh hưởng
của ADN trong dịch chiết nhận nhận được từ tế bào của vi sinh vật khác. Ở đây
yếu tố biến nạp là AND. Sự chuyển vật liệu di truyền (ADN) từ tế bào cho đến tế
bào nhận có thể xảy ra trong ống nghiệm (invitro) khi cho tế bào nhận tiếp xúc
với dịch chiết từ tế bào cho mà không có sự tiếp xúc giữa các tế bào.
Các tế bào có thể nhận bất kỳ loại ADN nào chớ không đòi hỏi phải là ADN
từ các giống họ hàng. Tuy nhiên tế bào chỉ có thể nhận một số đoạn ADN nhất
định, thường không quá 10 đoạn. Các đoạn ADN được di truyền trong biến nạp có
M=106-107 và phải có cấu trúc xoắn kép. Hiện tượng biến nạp phổ biến ở nhiều
loài vi khuẩn như: Diplococus, Staphylocus, Hemophilus, Agrobacterium,
Rhizobium, Bacillus, Xantomonas.
3.1.1.3. Phương pháp tiếp hợp gene.
Khác với biến nạp, ở đây vật liệu di truyền chỉ được truyền từ tế bào cho
đến tế bào nhận khi hai tế bào tiếp xúc với nhau. Do vậy các vi sinh vật có khả
năng biến nạp thì sẽ không có khả năng tham gia tiếp hợp gene nữa. Hiện nay quá
trình tiếp hợp gene đã được nghiên cứu ở một số loài vi khuẩn như E.coli,
salmonella, Pseudomonas aeruginosa.
3.1.1.4. Phương pháp tải nạp
Vật liệu di truyền (ADN) được chuyển từ tế bào cho sang tế bào nhận nhờ
vai trò trung gian của thực khuẩn thể (phage). Trong quá trình tải nạp, các đoạn
AND được chuyển từ tế bào cho đến tế bào tiếp hợp với AND của tế bào nhận. Do

đó làm biến đổi tính chất di truyền của tế bào nhận.
3.1.2. Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật.
Khi sử dụng vi sinh vật để sản xuất enzyme cần chọn giống thuần chủng, đã
được kiểm tra đầy đủ về các đặc tính hóa sinh, vi sinh, nuôi cấy và cần đặc biệt
lưu ý đến điều kiện bảo quản giống. Thực tế khi bảo quản giống gốc trong một
Trang: 16


Đồ án Công nghệ 1
thời gian có thể tạo ra các biến dị ngẫu nhiên không mong muốn do đó định kỳ
phải cấy chuyền và kiểm tra lại các đặc tính ban đầu.
 Phương pháp cấy chuyền.
Đây là phương pháp phổ biến nhất dễ thực hiện bằng cách giữ giống trên
môi trường thạch (thạch nghiêng, hộp petri,…) với thành phần môi trường nuôi
cấy và điều kiện nuôi cấy thích hợp cho giống vi sinh vật đó. Sau khi giống đã
mọc tốt cần bảo quản ở nhiệt độ lạnh 3-4 0C và sau mỗi tuần phải cấy chuyền lại.
Khi cấy chuyền chỉ lấy bào tử hoặc khuẩn lạc mà không nên lấy cả môi trường
dinh dưỡng để đảm bảo không chuyền các sản phẩm trao đổi chất vào môi trường
mới (có thể gây biến đổi bất lợi không thể lường hết được). Nếu là xạ khuẩn thì
không nên bảo quản giống trên môi trường thạch mà nên giữ trong đất để khử
trùng.
Để kéo dài thời gian bảo quản giống từ hàng tháng đến 1 năm, người ta phủ
1 lớp paraphin lỏng để tiệt trùng trên bề mặt giống để hạn chế sự phát triển của nó.
Cần lưu ý chỉ phủ lớp dầu sau khi cấy vi sinh vật đạt đến độ chín sinh lý.
Phương pháp cấy chuyền rất có hiệu quả để bảo quản các giống nấm men, vi
khuẩn và rất hữu hiệu, dễ dàng triễn khai giống ra sản xuất lớn, hạn chế các tai
biến có thể dẫn đến hư hỏng giống gốc.
ﾧ

Hình 3.2. Bảo quản

bằng

phương

pháp

cấy truyền trên môi
trường thạch
 Phương

pháp

làm khô
Bằng cách giữ
giống trên cát, đất,

Trang: 17


Đồ án Công nghệ 1
silicagen trong điều kiện khô ráo (tất cả đều được khử trùng cẩn thận). Trong
điều kiện như vậy sẽ hạn chế sự phát triển tiếp tục của giống khi bảo quản.
Phươg pháp này rất hay được sử dụng để bảo quản nấm mốc, xạ khuẩn, một
vài loại nấm men, vi khuẩn thời gian giữu giống có thể được 1 năm.
Phương pháp làm khô cũng thực hiện đơn giản, không cần dụng cụ đắt tiền.
Tuy nhiên giống như phương pháp cấy chuyền thời gian bảo quản tương đối
ngắn.
 Phương pháp đông khô
ﾧ

Hình 3.3. Đông khô vi sinh vật.
Đông khô là quá trình mà nước được lấy ra khỏi mẫu khi các mẫu đang ở
trạng thái lạnh sâu. Ở đây vi sinh vật được huyền phù trong môi trường thích hợp
và được làm lạnh trong môi trường chân không. Thiết bị đông khô sẽ hút nước và
cuối cùng mẫu được làm khô đến mức nhất định. Mẫu được hàn kín để cho môi
trường chứa mẫu là chân không. Đây là phương pháp phổ biến có hiệu quả cao
cho bảo quản các đối tượng vi sinh vật khác nhau như nấm sợi, nấm men, vi khuẩn
và một số virut. Tuy nhiên, phương pháp này ít được ứng dụng đối với tảo, động
vật nguyên sinh và tế bào động vật.
 Phương pháp bảo quản lạnh sâu:

Trang: 18


Đồ án Công nghệ 1
Đối với phương pháp bảo quản lạnh sâu thì vi sinh vật được bảo quản trong
môi trường dịch thể và nước cần cho hoạt động sống của vi sinh vật bị bất hoạt
ở nhiệt độ lạnh sâu (-196°C -> -80 °C).

Hình 3.4. Bảo
quản lạnh sâu
Với phương
pháp này, tế bào có
thể bị vỡ trong quá
trình làm lạnh và
làm tan mẫu. Một
nguyên nhân dẫn
đến làm vỡ tế bào là việc tích luỹ các chất điện giải trong mẫu bảo quản và hình
thành các tinh thể nước trong tế bào. Để khắc phục nhược điểm này người ta đã bổ
sung các chất làm hạn chế tốc độ lạnh sâu và làm tan nhanh như glycerol, DMSO

(dimethyl sulfoxide). Việc bảo quản theo phương pháp lạnh sâu này được thực
hiện ở các thang nhiệt độ khác nhau như -20 ° C, -30° C, -40° C, -70° C, -140°C và
-196° C. Nói chung mức nhiệt độ cao hơn -30 ° C cho hiệu quả thấp do tế bào chịu
nồng độ muối cao sinh ra từ các chất điện giải. Phương pháp bảo quản này có hiệu
quả với nhiều nhóm vi sinh vật khác nhau như nấm sợi, nấm men, vi khuẩn, xạ
khuẩn và virut.
Đặc biệt với phương pháp bảo quản lạnh sâu trong nitơ lỏng là phương
pháp vạn năng hơn cả. Phương pháp này thích hợp với nhiều đối tượng vi sinh vật
khác nhau như vi khuẩn, nấm sợi, nấm men, virut, tảo và cả các dòng tế bào động
vật. Tuy nhiên, phương pháp này cũng bộc lộ một số nhược điểm như đầu tư kinh
phí cho thiết bị và điện, nitơ lỏng hoặc rủi ro như cháy nổ... Đặc biệt phương pháp

Trang: 19


Đồ án Công nghệ 1
này không thích hợp với các chủng vi sinh vật thường xuyên dùng đến. Nói chung
phương pháp này thường được dùng với các chủng vi sinh vật có những đặc tính
quí mà không thích hợp với phương pháp đông khô.
ﾧﾧ

Hình 3.5. Bảo quản
trong nitơ lỏng.
3.1.3. Môi

trường

nuôi cấy vi sinh vật
tổng

hợp

enzyme

Protease.
Cần phải chọn môi trường vì thành phần môi trường dinh dưỡng có ảnh
hưởng trực tiếp đến sự sinh trưởng và tổng hợp enzyme của vi sinh vật. Trong
thành phần môi trường phải có đủ các chất đảm bảo được sự sinh trưởng bình
thường của vi sinh vật và tổng hợp enzyme.
Đặc biệt lưu ý là để tăng sự tổng hợp enzyme người ta thường dựa vào hiện
tượng cảm ứng. Vì nếu như trong thành phần môi trường có các chất cảm ứng thì
chất đó hay sản phẩm phân giải của nó sẽ kìm hãm hoặc làm yếu tác dụng kìm toả
của chất kìm hãm nhằm bảo đảm khả năng sinh tổng hợp enzyme đã cho không bị
cản trở. Chất cảm ứng tổng hợp enzyme cho thêm vào môi trường nuôi thường là
cơ chất tương ứng của enzyme cần tổng hợp.
Thành phần chính của môi trường: C, N, H, O. Ngoài ra các chất vô cơ:
Mn, Ca, P, S, Fe, K và các chất vi lượng khác.
3.1.3.1. Nguồn cacbon.
Thường là hợp chất hữu cơ trong đó chủ yếu là gluxit, tùy thuộc vào đặc
tính của enzyme và nòi vi sinh vật mà người ta lựa chọn cho thích hợp.

Trang: 20


Đồ án Công nghệ 1
Có nhiều chất hydratcacbon và các hợp chất khác là nguồn cacbon thích
hợp đối với nấm mốc sinh ra enzyme protease có hoạt lực cao. Các nguồn cacbon
có tác dụng đến sinh tổng hợp proteinase của nấm mốc có thể theo thứ tự:
Đối với Asp. flavus 74: fructoza→ glucoza→ sacaroza→ ramnoza→
manoza→ galactoza→ arabinora→ lactoza.

Đối với Asp. awamori 200: fructoza→ manit→ sacaroza→ arabinoza→
manoza→ galactoza→ lactoza.
Đối với Asp. oryzae 79: fructoza→ sacaroza→ maltoza→ glucoza→
manit→ arabinoza→ galactoza.
Tinh bột là nguồn cacbon của nhiều chủng vi khuẩn sinh tổng hợp enzyme
Protease. Ví dụ: Vi khuẩn Bac. Subtilis có khả năng sinh tổng hợp Protease ở môi
trường tinh bột >8%.
Nhiều xạ khuẩn ưa nhiệt, trong đó Micromonospora vulgaris 42, mọc tốt và
sinh tổng hợp protease cao ở môi trường có tinh bột. Tăng nồng độ tinh bột từ
0,25- 1,5% sinh khối cũng tăng đồng thời với hiệu xuất tổng hợp enzyme.Nếu tăng
nồng độ tinh bột hơn nữa sẽ không thu được kết quả dương tính. Tỷ số giữa
cacbon và nitơ cần phải là 4: 1. Trên môi trường có maltoza (0,5- 2%) vi sinh vật
phát triển bình thường, nhưng tổng hợp protease ngoại bào bị ức chế. Xạ khuẩn
không phát triển được ở trên môi trường có các nguồn cacbon duy nhất là
sacaroza, lactoza hoặc arabinoza. Glucoza, manoza, fructoza, xyloza có trong môi
trường (0,2- 5%) làm ức chế sinh trưởng của xạ khuẩn và sinh tổng hợp enzyme.
Ngoài ra một số loại hydrocacbon cũng có nguồn cacbon có 125 chủng vi
sinh vật. Chẳng hạn chủng Ps. Seruginosa có thể đồng hoá hydrocacbon và có khả
năng sinh tổng hợp protease có hoạt lực cao trên môi trường n- parafin với 12, 14
và 16 nguyên tử cacbon, dầu nặng hoặc propylenglycol. Chúng không chỉ đồng
hoá được cả hydrocacbon béo mà còn đồng hoá cả hydrocacbon thơm.
3.1.3.2. Nguồn nito.
Nguồn nito sử dụng rất phong phú, bao gồm 2 nhóm: vô cơ và hữu cơ.

Trang: 21


Đồ án Công nghệ 1
Đối với một số loài nấm mốc thuộc họ (A. oryzae, A. awamori, A. niger, A.
flavus) trên môi trường có các nguồn nitơ hữu cơ sinh tổng hợp protease axit cao.

Trên môi trường kzapek NaNO 3 được thay bằng cả cazein hoạt lực protease của
nấm mốc được tăng lên 3,5 lần, còn khi thay tinh bột bằng glucoza và bổ sung
pepton hoạt lực enzyme tăng 6 lần. Nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy sinh tổng
hợp enzyme được nâng cao khi trong môi trường có đồng thời cả nguồn nitơ hữu
cơ và nitơ vô cơ. Cho thêm vào môi trường có cám mì, bột đậu tương đã tách chất
béo, các nguồn nitơ và hữu cơ hoạt lực enzyme protease tăng 22- 74%. Còn trường
hợp dùng các nguồn nitơ vô cơ duy nhất trong môi trường sẽ dẫn đến ngừng sinh
tổng hợp protease nói chung.
Trong quá trình nuôi cấy vi khuẩn, trong đó có B. subtilis và B.
mesentericus, các hợp chất nitơ vô cơ và hữu cơ được dùng phối hợp trong môi
trường sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho sinh tổng hợp protease. Trong số các nguồn
nitơ vô cơ thì NH4, H2PO4 là tốt hơn cả. Những muối khác NH 4Cl, (NH4)2SO4,
NH4NO3, NaNO3, KNO3, Ca(NO3)2 làm giảm hoạt lực protease tới 30- 50% , còn
amylaza giảm 7- 10 lần. Còn trong môi trường chỉ có nguồn nitơ hữu cơ hoạt lực
protease và amylaza cũng thấp hơn trong môi trường đối chứng (NH 4)2HPO4 và
nước chiết đậu tương.
Đối với xạ khuẩn ưa nhiệt Actynomyces Vulgaris U2 thì pepton là chất
cảm ứng để sinh tổng hợp enzyme protease là tốt nhất.
Các axit amin có ảnh hưởng rõ rệt tới sinh tổng hợp enzyme bằng vi sinh
vật. Glyxin, alanin, metionin và lơxin có tác dụng làm tăng hoạt lực protease của
chủng đột biến A. oryzae 251- 90 đến 6- 9% và nguyên chủng A. oryzae 132- 63
tới 7- 24%. Nhiều axit amin có tác dụng ức chế đến sinh tổng hợp enzyme, Valin,
axit glutamic, izolơxin và valin ức chế tổng hợp enzyme ở B. megaterium 60%.
Còn đối với B. subtilis các axit amin ức chế trong quá trình này là glyxin,
metionin, axit glutamic, alanin, lơxin,…

Trang: 22


Đồ án Công nghệ 1

Ngoài ra, các bazơ purin như A (adenin), G (guanin) và các dẫn xuất của
chúng, ARN và các sản phẩm thuỷ phân cũng làm tăng đáng kể sinh tổng hợp
proteinza vi sinh vật.
3.1.3.3. Nguồn các nguyên tố khoáng và các yếu tố (chất) kích thích sinh
trưởng
Muối khoáng rất cần thiết cho hoạt động vi sinh vật.
Ion Mg2+ có tác dụng sinh tổng hợp và ổn định các enzyme có hoạt tính ở
nhiệt độ cao.
Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đối với môi trường nuôi cấy. Nhiệt độ nuôi cấy
thông thường từ 25 - 300C. Trị số pH ban đầu của môi trường (chủ yếu ở môi
trường nước) cũng có thể gây ảnh hưởng nào đó đến sự tạo thành enzyme, nhưng
khi đó cũng cần tính đến khả năng biến đổi nhanh chóng chỉ số đó bởi vi sinh vật.
Độ thông khí cũng rất cần thiết cho việc sinh tổng hợp enzyme. Vì vậy ở
môi trường bề mặt người ta thường thêm chất xốp như trấu vào, còn ở môi trường
bề sâu (môi trường dịch thể) , thì người ta thường lắc (nếu enzyme cần lắc thì việc
này cực kỳ quan trọng). Độ ẩm cũng rất quan trọng (chỉ có tác dụng ở nuôi cấy bề
mặt), phụ thuộc vào thành phần môi trường bề mặt.
Khi lựa chọn môi trường cần chú ý đến cả thành phần định tính và định
lượng sao cho quá trình sinh tổng hợp enzyme mong muốn là cao nhất. Muốn vậy
người ta có thể sử dụng một số phương pháp:
Phương pháp tối ưu hóa quy hoạch thực nghiệm toàn phần.
Phương pháp toán học mô hình hóa thực nghiêm.
3.1.4. Các loại môi trường nuôi cấy vi sinh vật tổng hợp enzyme.
Có thể chia làm 2 loại: môi trường tổng hợp và môi trường tự nhiên.
 Môi trường tổng hợp: là môi trường bao gồm các chất với liều lượng xác
định (qua tìm hiểu, nghiên cứu), chẳng hạn nguồn cacbon có thể là tinh bột,
xenluloza, đường, axit, rượu, nguồn nitơ vô cơ và hữu cơ. Loại môi trường này
được sử dụng cho mục đích nghiên cứu.

Trang: 23

Đồ án Công nghệ 1
 Môi trường tự nhiên: thường dùng các loại phế liệu, nguyên liệu có chứa
các nguồn cacbon, nitơ, khoáng, các yếu tố sinh tổng hợp trưởng. Mặt khác,
các nguyên liệu này có sẵn, rẻ tiền nên được sử dụng rất nhiều trong công
nghiệp sản xuất các chế phẩm enzyme từ vi sinh vật. Các nguyên liệu để chuẩn
bị làm môi trường tự nhiên bao gồm: cám và bột hạt cốc, nước chiết ngô, dịch
ép hoa quả, rau, khô dầu, bã rượu, rĩ đường, sản phẩm phân huỷ nấm, men bia,
trấu, lõi ngô. Khi lựa chọn sử dụng môi trường cần chú ý đến các chất có tác
dụng điều hoà sinh tổng hợp enzyme, đặc biệt các chất cảm ứng.
Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đối với môi trường nuôi cấy. Nhiệt độ nuôi cấy
thông thường từ 25 - 300C. Trị số pH ban đầu của môi trường (chủ yếu ở môi
trường nước) cũng có thể gây ảnh hưởng nào đó đến sự tạo thành enzyme,
nhưng khi đó cũng cần tính đến khả năng biến đổi nhanh chóng chỉ số đó bởi
vi sinh vật.
3.1.5. Các phương pháp nuôi cấy vi sinh vật.
 Nuôi cấy bề mặt:
Phương pháp này rất thích hợp để nuôi cấy các loại nấm mốc do khả năng
phát triển nhanh, mạnh, nên ít bị tạp nhiễm. Khi nuôi nấm mốc phát triển bao phủ
bề mặt hạt chất dinh dưỡng rắn, các khuẩn ty cũng phát triển đâm sâu vào lòng
môi trường đã được tiệt trùng, làm ẩm. Đối với một số mục đích đặc biệt, người ta
nuôi vi sinh vật trực tiếp trên bề mặt hạt gạo (sản xuất tương), hạt đậu tương (đậu
tương lên men- misô) đã được nấu chín trộn hạt cốc còn sống (làm men thuốc bắc,
men dân tộc, làm tương).
Người ta thường dùng cám mì, cám gạo, ngô mảnh… có chất phụ gia là
trấu. Cám, trấu, có bề mặt tiếp xúc lớn, mông, tạo được độ xốp nhiều, không có
những chất gây ảnh hưởng xấu đến sự phát triển của nấm mốc. Tỉ lệ các chất phụ
gia phải bảo đảm sao cho hàm lượng tinh bột trong khối nguyên liệu không được
thấp hơn 20%, có thể bổ sung thêm nguồn nitơ vô cơ ((NH 4)2SO4, (NH4)2CO),

photpho, nitơ hữu cơ và các chất kích thích sinh trưởng như malt, nước chiết ngô,
nước lọc bã rượu.
Trang: 24


Đồ án Công nghệ 1
 Quy trình công nghệ:
Nguyên liệu  Trộn  Làm ẩm  Thanh trùng bằng nhiệt  Lam nguội, tơi
 Gieo giống vsv  Chuyển vào dụng cụ nuôi cấy  Nuôi cấy, theo dõi, xử
lý.
 Ưu nhược điểm:
Nồng độ enzyme tạo thành cao hơn nhiều lần so với dịch nuôi cấy chìm sau
khi đã tách tế bào vi sinh vật. Trong công nghiệp rượu muốn đường hoá 100kg
tinh bột chỉ cần 5kg chế phẩm nấm mốc bề mặt nhưng phải cần đến 100lit nấm
mốc chìm để lọc bã và tế bào vi sinh vật.
Chế phẩm dễ dàng sấy khô mà không làm giảm đáng kể hoạt tính enzyme,
chế phẩm khô, dễ bảo quản, vận chuyển, nghiền nhỏ hoặc sử dụng trực tiếp nếu
không cần khâu tách và làm sạch enzyme.
Tốn ít năng lượng, thiết bị, dụng cụ nuôi cấy đơn giản, có thể thực hiện qui
mô gia đình, trang trại cũng như ở qui mô lớn đến 20T/ngày.
Nuôi cấy trong điều kiện vô trùng tuyệt đối và trong quá trình nuôi cấy nếu có
nhiễm trùng phần nào, khu vực nào thì chỉ cần loại bỏ canh trường phần đó.
Tuy nhiên phương pháp bề mặt có năng suất thấp, khó cơ khí hoá, tự động hoá,
cần diện tích nuôi lớn, chất lượng chế phẩm ở các mẻ không đồng đều.
 Nuôi cấy chìm
Vi sinh vật được nuôi cấy trong môi trường lỏng với cơ chất chủ yếu trong
đa số trường hợp là tinh bột. Chỉ có một số ít giống vsv dùng nguồn cơ chất
cacbon là đường glucoza, saccharoza. Thực tế, trong một số trường hợp đường hoá
sơ bộ tinh bột trước khi thanh trùng. Khi đó đường maltoza được tạo thành là chất
cảm ứng tốt, môi trường thường giảm độ nhớt nên dễ dàng cho quá trình khuấy

trộn và sục khí.
Phương pháp nuôi cấy bề sâu đòi hỏi phải được vô trùng tuyệt đối ở các
khâu vệ sinh tổng hợp, thanh trùng môi trường dinh dưỡng, thao tác nuôi cấy,
không khí cung cấp cho quá trình nuôi cấy.

Trang: 25