Nghiên cứu đặc điểm và biểu hiện gen liên quan đến tính kháng mọt phân lập từ cây ngô

1
MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Ngô (Zea mays L.) là một trong những cây ngũ cốc chính có năng suất
cao và giá trị kinh tế lớn, góp phần nuôi sống hơn 30% dân số thế giới. Ngày
nay, trên thế giới cây ngô đứng thứ ba về diện tích, đứng thứ hai về sản lượng
và đứng đầu về năng suất. Ngô được dùng để sản xuất ra khoảng 650 mặt
hàng khác nhau trong các ngành công nghiệp lương thực, thực phẩm, dược
phẩm9 và công nghiệp nhẹ. Ngô góp phần vào việc ổn định sản lượng ngũ
cốc trên thế giới và có vai trò quan trọng trong kinh tế và thương mại quốc
tế. Ở Việt Nam, việc phát triển cây ngô trong thời gian qua đã đạt được
nhiều thành tựu, tăng nhanh cả về diện tích, năng suất và sản lượng; tuy
nhiên cũng gặp nhiều thách thức, trong đó có vấn đề sâu hại. Đã có nhiều
giống ngô lai mới có năng suất cao được đưa vào sản xuất, song xuất hiện
những hạn chế về khả năng bảo quản, như dễ bị nấm, mọt… xâm hại trong
khi nhiều giống ngô địa phương truyền thống tuy năng suất thấp nhưng khả
năng bảo quản sau thu hoạch lại tốt hơn.
Mọt ngô (Sitophilus zeamais Motsch.) là loại đa thực, chúng có thể
ăn được hầu hết các loại ngũ cốc, các loại đậu, hạt có dầu và nhiều sản phẩm
thực vật khác. Thức ăn thích hợp nhất với mọt ngô là hạt ngô. Năng suất và
chất lượng ngô bị ảnh hưởng nhiều bởi mọt ngô, chúng làm giảm sản lượng
sau thu hoạch trung bình là 20%, có những trường hợp sự phá hại của chúng
lên đến 90% trong vòng sáu tháng. Ngăn chặn sự tấn công của mọt với ngô
hiện nay đang là vấn đề cấp bách trong bảo quản ngô góp phần bảo đảm an
ninh lương thực trên toàn thế giới. Một số biện pháp bảo quản ngô sau thu
hoạch hiện nay được sử dụng phổ biến là sấy ở nhiệt độ cao để tiêu diệt ấu
trùng mọt, vần đảo, trộn bụi trơ, dùng thảo mộc,… Tuy vậy, các biện pháp
này tốn nhiều công sức, hiệu quả thấp, giá thành cao. Mặt khác, biện pháp
dùng thuốc hoá học thì gây ra nhiều mối lo ngại về ô nhiễm môi trường, độc
hại tới vật nuôi và con người.
Defensin thực vật phân bố rộng rãi trong giới thực vật, có cấu trúc

2
không gian nhỏ, bền, hình cầu với thành phần cơ bản khoảng 45 - 54 amino
acid giàu cysteine. Defensin là protein đa chức năng, chúng ức chế quá trình
dịch mã, ảnh hưởng đến chức năng của kênh màng, làm suy yếu vi sinh vật,
tăng cường khả năng chống chịu kẽm, làm thay đổi trạng thái oxy hoá khử
ascorbic acid, ức chế protease và đặc biệt ức chế hoạt động α-amylase của
côn trùng. Đã có nhiều nghiên cứu cho thấy, defensin phân lập từ đậu xanh,
đậu đũa có khả năng ức chế hoạt động α-amylase của ấu trùng mọt đậu xanh
và đậu đũa. Nhưng sự ức chế của các defensin này với α-amylase từ động
vật có xương sống là thấp. Vì vậy, đã có nhiều tác giả tập trung nghiên cứu
tăng cường khả năng kháng mọt ở đậu, đỗ bằng sử dụng protein defensin và
đạt kết quả cao. Tuy nhiên, cho đế n nay chưa có những công trình nghiên
cứu mở rộng ứng dụng protein defensin với nhiều đối tượng nông sản khác
cũng bị thiệt hại lớn bởi mọt hại như ngô.
Trong những năm gần đây, biế n đổ i di truyề n đã trở thành mô ̣t
công cu ̣ quan tro ̣ng trong nghiên cứu về quá trình cơ bản ở thực vâ ̣t và trong
cải tiế n giống cây trồ ng. Kỹ thuâ ̣t ta ̣o cây chuyể n gen đang phát triể n nhanh
chóng kể từ thành công đầ u tiên trong viê ̣c đưa gen ngoa ̣i lai vào trong thực
vâ ̣t nhờ A. tumefaciens. Cây chuyển gen có những đă ̣c điể m đă ̣c biê ̣t, có thể
cải tiế n về giá tri ̣ về dinh dưỡng, tăng sản lượng, tăng khả năng chống chịu
và nhiề u đă ̣c tính ưu viê ̣t khác. Việc ứng dụng kỹ thuâ ̣t chuyể n gen để tạo ra
các giống ngô có khả năng kháng mọt cao là vấ n đề thực tiễn được đặt ra
trong nghiên cứu bảo quản ngô hạt sau thu hoạch.
Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi xây dựng đề tài luận án là:
“Nghiên cứu đặc điểm và biểu hiện gen liên quan đến tính kháng mọt
phân lập từ cây ngô”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Xác định được đặc điểm của gen ZmDEF1 phân lập từ một số

giống ngô có khả năng kháng mọt ngô khác nhau. Biểu hiện được protein
ZmDEF1 tái tổ hợp (rZmDEF1) ở cây chuyển gen.


3
3. Nội dung nghiên cứu
(i) Đánh giá khả năng kháng mọt của các giống ngô nghiên cứu trong điều
kiện lây nhiễm mọt ngô nhân tạo.
(ii) Phân tích đặc điểm gen ZmDEF1 của các giống ngô có khả năng kháng
mọt ngô khác nhau.
(iii) Thiết kế vector chuyển gen chứa ZmDEF1 và đánh giá hoạt động của
vector chuyển gen trên cây thuốc lá ở thế hệ T0 và T1, phân tích khả năng ức
chế α-amylase từ ấu trùng mọt ngô của protetin rZmDEF1.
(iv) Nghiên cứu tạo cây ngô chuyển gen ZmDEF1 từ giống LC1 và LVN99.
Phân tích sự biể u hiê ̣n gen ZmDEF1 trên cây ngô chuyể n gen ở thế hệ T1 và
đánh giá hoạt động ức chế α-amylase từ ấu trùng mọt ngô của protein
rZmDEF1.
4. Những đóng góp mới của luận án
Luận án là công trình nghiên cứu có hệ thống, từ đánh giá khả năng
kháng mọt ngô của các giống ngô đến sự phân lập, tách dòng, giải trình tự
gen, thiết kế vector chuyển gen và phân tích biể u hiê ̣n gen ZmDEF1 trên cây
thuốc lá và cây ngô chuyển gen.
Cụ thể là:
1) Đánh giá khả năng kháng mọt của các giống ngô nghiên cứu đã
xác định được giống ngô SL có khả năng kháng mọt ngô tốt nhất và hai
giống LC1 và LVN99 có khả năng kháng mọt ngô kém.
2) Gen ZmDEF1 (DNA) phân lập từ các giống ngô nghiên cứu có
345 bp, cấu trúc bởi hai exon và một intron ở giữa với 102 bp; gen ZmDEF1
(cDNA) có 243 bp mã hóa cho 80 amino acid.
3) Gen ZmDEF1 được biểu hiện thành công trên cây thuốc lá, cây

ngô chuyển gen. Protein rZmDEF1 tách chiết từ cây thuốc lá và cây ngô
chuyển gen có khối lượng phân tử gần 10 kDa đã biểu hiện chức năng ức
chế hoạt động của α-amylase của ấu trùng mọt ngô.
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài luận án
Kết quả đạt được của luận án có giá trị khoa học và thực tiễn trong


4
tiếp cận nghiên cứu tăng cường khả năng kháng mọt ngô bằng kỹ thuật
chuyển gen.
Về mặt khoa học
Kết quả nghiên cứu của đề tài góp phần làm sáng tỏ đặc điểm cấu
trúc của gen ZmDEF1 phân lập từ các giống ngô địa phương và giống ngô lai
LVN99, góp phần xác định được cấu trúc gen ZmDEF1 ở ngô thông qua so
sánh trình tự nucleotide phân lập từ cDNA và DNA.
Phát triển thành công cấu trúc mang gen chuyển ZmDEF1 và sự biểu
hiện chức năng ức chế hoạt động α-amylase từ ấu trùng mọt ngô của protein
rZmDEF1 ở cây chuyển gen là cơ sở khoa học cho ứng dụng kỹ thuật
chuyển gen để nâng cao khả năng kháng mọt ngô của cây ngô.
Các bài báo đăng tải trên các tạp chí khoa học - công nghệ quốc tế và
trong nước cùng với các trình tự gen công bố trên Ngân hàng Gen là những
tư liệu có giá trị tham khảo trong nghiên cứu và giảng da ̣y.
Về mặt thực tiễn
Dịch chiết protein của hạt các dòng cây thuốc lá, cây ngô chuyển gen
ZmDEF1 có khả năng ức chế hoạt động của α-amylase từ ấu trùng mọt ngô
đã góp phần giải quyết cơ sở lý luận của vấn đề nâng cao khả năng kháng
mọt theo cách tiếp cận tăng cường biểu hiện gen ZmDEF1 bằng phương
pháp chuyển gen. Kết quả này là cơ sở khoa học vững chắc cho hướng
nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật chuyể n gen trong nâng cao khả năng kháng
mọt của ngô, mở ra triển vọng ứng du ̣ng mới trong thực tiễn tạo giống ngô

kháng mọt cao.
6. Cấu trúc luận án: Luận án có 122 trang (kể cả tài liệu tham khảo) được
chia thành các chương, phần: Mở đầu (04 trang), Chương 1: Tổng quan tài
liệu (34 trang), Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu (22 trang);
Chương 3: Kết quả và thảo luận (45 trang); Kết luận và đề nghị (01 trang);
Các công trình công bố liên quan đến luận án (02 trang); Tài liệu tham khảo
(14 trang). Luận án có 30 bảng, 33 hình và tham khảo 130 tài liệu.


5
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Luận án đã tham khảo 8 tài liệu tiếng Việt; 122 tài liệu tiếng Anh để
tổng kết các nội dung có liên quan, bao gồm: (1) Mọt ngô (Sitophilus zeamais
Motsch.) (2) Đặc điểm của defensin thực vật; (3) Nghiên cứu chuyển gen ở
ngô.
Mọt ngô là loài gây hại phổ biến và là dịch hại nguyên phát, phân
bố phổ biến ở hầu khắp các nước trên thế giới, gây hại lớn ở những vùng ấm
áp, nhất là ở Châu Á, vùng Địa Trung Hải (Châu Âu) và Bắc Mỹ. Ở nước ta,
có thể gặp mọt hại ngô ở tất cả các địa phương, chúng có mặt trong 100%
kho bảo quản ngô. Tác hại của mọt hại đến sản lượng và chất lượng của ngô
là rất lớn. Trung bình mọt hại làm giảm 20% khối lượng ngô sau thu hoạch.
Tuy nhiên, với kho bảo quản tốt thì mức độ thiệt hại thường dưới 20%, kho
bảo quản thường thiệt hại trên 20% còn một số trường hợp tổn thất do mọt
hại gây ra với ngô lên đến 90%. Hạt ngô có đặc điểm vỏ càng dày, độ cứng
càng cao, hàm lượng phenolic acid cao, chất ức chế tripsin, ức chế αamylsae và hàm lượng chất sơ trong hạt ngô càng cao thì khả năng kháng
mọt càng cao.
Defensin là peptide cation với vùng chức năng chứa từ 45-55
amino acid với 8 phân tử cystein (Cys) tạo nên 4 cầu nối disulfide tạo nên
cấu trúc không gian ba chiều ổn định với dạng CSαβ đặc trưng cho defensin
thực vật. Cấu trúc không gian ba chiều của defensin gồm 3 phiến gấp β và

một chuỗi xoắn α. Trong đó, giữa nếp gấp β thứ 2 và thứ 3 có vùng loop 3,
vùng này có chức năng quan trọng trong ức chế hoạt động của α- amylase
của mọt. Do có sự liên kết gữa loop 3 (VrD1) với trung tâm hoạt động αamylase của ấu trùng mọt bằng lực hút tĩnh điện, ngăn cản tinh bột đi vào do
đó quá trình tiêu hóa tinh bột của mọt bị ngừng trệ làm mọt suy yếu dần, dẫn
đến chết (Feng Lin và Cs 2007). Sự ức chế này biể u hiê ̣n thấp đối với αamylase của động vật, vì có sự sai khác về độ dài của 3 loop trung tâm hoạt
động của α-amylase của động vật là dài hơn, dẫn đến ngăn cản loop 3 của
defensin (VuD1) không liên kết vào trung tâm hoạt động của α-amylase


6
(Pelegrini và cs (2008).
Phôi non đã chứng tỏ là mô ̣t nguồ n nguyên liê ̣u vươ ̣t trô ̣i cho
chuyển gen ở ngô nhờ A. tumefaciens. Sản lượng và giá trị dinh dưỡng của
ngô ngày càng được tăng lên vì đã sử dụng các giống ngô chuyển gen vào
sản xuất. Đến nay, hàng loạt gen mã hóa protein có hoạt tính diệt côn trùng
gây hại như gen Cry của vi khuẩn Bacillus thuringiensis được chuyển thành
công vào ngô (Liliana và cs 2013). Các giống ngô có khả năng chịu hạn cao
cũng đã được đưa vào sản xuất (Qiudeng và cs 2014). Nhiều giống ngô
chuyển gen cho năng suất cao bởi tăng số lượng hạt ngô trên bắp hay tăng
trọng lượng của hạt (Zhang và cs 2016). Ngô chứa đa vitamin cũng đã được
tạo ra bằng chuyển đa gen (Shaista và cs 2009)…Tuy nhiên, trong các thành
tựu quan trọng của cây ngô chuyển gen, hướng nghiên cứu tạo ngô chuyển
gen nhằm tăng cường khả năng kháng mọt hại chưa được quan tâm nhiều.
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
Sử dụng 4 giống ngô địa phương với ký hiệu giống SL, LC1, LC2,
LC3 và giống ngô lai LVN99 do Trung tâm giống cây trồng Lào Cai, Sơn
La cung cấp. Giống thuốc lá Nicotinana tabacum C9-1 do Viện Kinh tế Kỹ
thuật thuốc lá Việt Nam cung cấ p.
Các chủng vi khuẩn và các loại vector sử dụng trong nghiên cứu

được cung cấp từ Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học &
Công nghệ Việt Nam gồm: Escherichia coli DH5α, A. tumefaciens CV58;
vector pBT tách dòng gen, p201- SLHEP- HA, pBetaPhaso-dest (nhập từ
công ty MCLAB, Mỹ).
2.2. HOÁ CHẤT, THIẾT BỊ VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
Hoá chất, các bộ KIT được mua tại các hãng nổi tiếng Thế giới như
Bio-Neer, Fermentas, Invitrogen...; Các thí nghiệm đánh giá khả năng kháng
mọt và kiểm tra chức năng sinh học của gen chuyển được tiến hành tại
phòng thí nghiệm Khoa Sinh - Hoá, Trường Đại học Tây Bắc. Các thí


7
nghiệm phân lập gen, thiết kế vector, chuyển gen vào cây thuốc lá và phân
tích cây chuyển gen, ... được tiến hành tại phòng Công nghệ ADN ứng dụng,
phòng Công nghệ Tế bào thực vật và Phòng thí nghiệm trọng điểm Công
nghệ gen thuộc Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công
nghệ Việt Nam. Các thí nghiệm chuyển gen vào cây ngô được thực hiện tại
phòng Tế bào và Sinh học hiện đại, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư
phạm - Đại học Thái Nguyên. Công trình được hoàn thành tại Bộ môn Sinh
học hiện đại & Giáo dục Sinh học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm
- Đại học Thái Nguyên.
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Các phương pháp nghiên cứu chia thành 5 nhóm chính: (1) nhóm
phương pháp đánh giá khả năng kháng mọt của các giống ngô nghiên cứu,
(2) nhóm phương pháp tách dòng và xác định trình tự gen, (3) nhóm phương
pháp thiết kế vector chuyển gen thực vật, (4) nhóm phương pháp tạo cây
chuyển gen, (5) nhóm phương pháp phân tích cây chuyển gen. Các thí
nghiệm được tiến hành theo sơ đồ tổng quát mô tả ở hình 2.2.

Hình 2.1. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát

8
2.3.1. Phương pháp đánh giá khả năng kháng mọt
Hạt các giống ngô nghiên cứu, loại bỏ các hạt sâu, bệnh, được sấy
khô đến khi đo độ ẩm trên máy đạt 13%, tiến hành chia thành lô thí nghiệm
và lô đối chứng. Lô thí nghiệm, cân 50g hạt ngô và thả 15 cặp mọt ngô vào
bình có nắp, còn lô đối chứng thì không thả mọt. Các chỉ tiêu đánh giá tại
các thời điểm 15 ngày, 30 ngày, 45 ngày và 60 ngày gây nhiễm mọt nhân
tạo, xác định các chỉ tiêu: Khối lượng hạt hao hụt ở lô thí nghiệm, tỷ lệ
nhiễm mọt, tỷ lệ tạo bột ngô, hệ số gia tăng quần thể (r) mọt.
2.3.2. Phương pháp tách dòng và giải tự trình tự gen ZmDEF1
Phân lập gen ZmDEF1 bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu
đã thiết kế ZmDEF1F_SalI /ZmDEF1R_HindIII và khuôn mẫu từ DNA tổng
số tách chiết ở lá; từ RNA tổng số tách chiết ở lá khi hạt đã ngâm ủ với
ABA qua tổng hợp cDNA.
Tách dòng và giải trình tự gen qua các bước: i) Tinh sạch sản phẩm
PCR, ii) Ghép nối đoạn gen vào vector tách dòng pBT; iii) Biến nạp plasmid
tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α; iv) Chọn dòng khuẩn lạc bằng
colony PCR; v) Tách chiết plasmid và cắt kiểm tra bằng BamHI; vi) Xác
định và phân tích trình tự nucleotide. Kết quả nghiên cứu về các trình tự
gen, amino acid được xử lý bằng phần mềm BioEdit, DNA Star.
2.3.3. Phương pháp thiết kế vector chuyển vào thực vật mang chuyển
ZmDEF1
Vector chứa gen ZmDEF1 chuyển gen vào thực vật được phát triển
theo hai bước cơ bản: (1) Ta ̣o cấu trúc mang gen chuyển pDON201-SLHEPZmDEF1 (2) Gắn cấu trúc gen mang gen chuyể n ZmDEF1 vào vector
chuyển gen pBetaPhaso-ZmDEF1.
2.3.4. Phương pháp tạo cây chuyển gen thông qua vi khuẩn
A.tumefaciens
Biến nạp pBetaPhaso-ZmDEF1 vào tế bào A. tumefaciens CV58 bằng xung

điện, chọn lọc bằng colony PCR và nhân dòng vector chuyển gen để tạo chủng vi
khuẩn mang vector chứa cấu trúc gen chuyển ZmDEF1 phục vụ biến nạp.


9
Chuyển vector chứa cấu trúc gen chuyển ZmDEF1 vào cây thuốc lá
N. tabacum C9-1 thông qua vi khuẩn A. tumefaciens và tạo cây thuốc lá
chuyển gen qua hệ thống tái sinh phù hợp theo mô tả của Topping - 1998.
Chuyển vector chứa cấu trúc gen chuyển ZmDEF1 vào phôi ngô
giống LC1 và LVN99 nhờ vi khuẩn A. tumefaciens. Quy trình tạo cây ngô
chuyển gen được thực hiện dựa trên nghiên cứu của Frame và cs 2002 và
Trần Thị Lương và cs 2014.
Hiệu suất chuyển gen (%) =

Số cây mang gen chuyển
× 100
Tổng số mẫu biến nạp

2.3.5. Phương pháp phân tích cây chuyển gen
Kiểm tra sự có mặt của gen chuyển bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi
đặc hiệu ZmDEF1F_SalI/ZmDEF1R_HindIII, kỹ thuật lai Southern. Kiểm
tra sự có mặt của sản phẩm phiên mã gen ZmDEF1 bằng RT-PCR. Đánh giá
mức độ biểu hiện phiên mã của gen chuyển bằng Real-time RT-PCR theo
phương pháp R=2-∆∆Ct của Livak - 2001. Kiểm tra sự có mặt của protein
rZmDEF1 bằng lai Western. Đánh giá sự biểu hiện chức năng sinh học của
gen chuyển bằng khả năng ức chế hoạt động α-amylase từ ấu trùng mọt của
protein rZmDEF1.
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG MỌT CỦA CÁC GIỐNG NGÔ
NGHIÊN CỨU

Để xác định được các giống ngô nghiên cứu về khả năng kháng
mọt (Sitophilus zeamais Motsch.) đồng thời để có căn cứ lựa chọn giống
ngô có khả năng kháng mọt tốt nhất, phục vụ phân lập gen nhằm cung cấp
nguyên liệu cho việc phát triển vector chuyển gen, chúng tôi thực hiện đánh
giá khả năng kháng mọt của các giống ngô nghiên cứu trong điều kiện gây
nhiễm mọt nhân tạo của 4 giống địa phương: SL, LC1, LC2, LC3 và giố ng
ngô lai LVN99. Các chỉ tiêu được đánh giá bao gồm: khối lượng ngô hao
hụt, tỷ lệ bột ngô tạo ra, tỷ lệ nhiễm mọt và hệ số gia tăng quần thể mọt. Số


10
liệu phân tích trình bày ở các bảng 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5 của luận án và các
kết quả đều cho thấy giống SL có khả năng kháng mọt tốt nhất, giống thấp
LVN99 và LC1 có khả năng kháng mọt kém.
Bảng 3.5. Chỉ số mẫn cảm mọt tương đối (S) của các giống ngô nghiên cứu
Giống

SL

S

1754,19

LC1
3515,75

LC2

LC3

2594,27

2128,14

LVN99
6088,71

3.2. ĐẶC ĐIỂM GEN ZmDEF1 PHÂN LẬP TỪ CÁC GIỐNG NGÔ
NGHIÊN CỨU
3.2.1. Đặc điểm của gen ZmDEF1 (cDNA) phân lâ ̣p từ các giống ngô
nghiên cứu
3.2.1.1. Tách dòng cDNA và xác định trình tự gen ZmDEF1
Dựa trên trình tự gen ZmDEF1 của ngô đã công bố tại Ngân hàng
Gen quốc tế mang mã số JF797205, cặp mồi đặc hiệu ZmDEF1F_SalI
/ZmDEF1R_HindIII và chứa điểm cắt enzyme giới hạn SalI và HindIII để
thiết kế vector. Sản phẩm PCR khuếch đại gen ZmDEF1 từ cDNA được
kiểm tra trên gel agarose nhận được một băng DNA kích thước khoảng
0,25kb phù hợp với kích thước dự đoán khi thiết kế cặp mồi PCR (Hình 3.2A). Gen ZmDEF1 được tách dòng với các bước: gắn vào vector pBT; biến
nạp vào E.coli DH5α bằng sốc nhiệt; colony PCR chọn dòng mang gen đích
tái tổ hợp bằng cặp mồi M13_F/M13_R (Hình 3.2-C). Trước khi đọc trình
tự, plasmid tái tổ hợp mang gen ZmDEF1 được cắt kiểm tra bằng BamHI
cho kết quả dương tính 5/5 mẫu thử. Việc giải trình tự trên máy tự động
được thực hiện lặp lại 3 lần/mẫu. Kết quả phân tích cho thấy đoạn mã hoá
của gen ZmDEF1 ở các giống ngô nghiên cứu đều có kích thước là 243 bp,
mã hoá 80 amino acid, có đô ̣ tương đồ ng của các trình tự gen này là 98,8 %
đến 99,6%. Như vậy có thể khẳng định đã phân lâ ̣p và tách dòng thành công
gen ZmDEF1 (cDNA) từ các giống ngô nghiên cứu.


11

Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR nhân gen ZmDEF1
(A); Sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp bằng BamHI (B) và colony-PCR
chọn lọc dòng vi khuẩn mang vector tái tổ hợp (C)
(SL, LC1, LC2, LC3: các giống ngô địa phương, LVN99 giống ngô lai
LVN99; 1 - 21: các dòng vi khuẩn được chọn lọc bằng colony-PCR với cặp
mồi M13; (-): đối chứng âm PCR từ nước cất; ĐC: plasmid tái tổ hợp không
cắt bởi BamHI; M: thang DNA 1kb plus; M1: thang DNA 1kb)
3.2.1.2. Phân tích trình tự nucleotide vùng mã hoá của gen ZmDEF1
Kết quả so sánh trình tự nucleotide của gen ZmDEF1 phân lập từ
các giống ngô địa phương nghiên cứu và giống ngô lai LVN99 với trình tự
mang mã số JF797205 trên Ngân hàng gen quốc tế cho thấy giữa các trình
tự gen ZmDEF1 có 5 vi ̣trí nucleotide sai khác ở các vi ̣trí nucleotide thứ 43,
53, 101, 161 và 195.
Trình tự amino acid suy diễn từ vùng mã hóa gen ZmDEF1của các
giống ngô nghiên cứu và JF797205 đều có 80 amino acid hình 3.4. Hình 3.4
cho thấy, trong vùng chức năng của các giống ngô nghiên cứu có 2 vị trí
amino acid sai khác nhau là vị trí 3, 23. Đặc biệt ở vị trí amino acid thứ 3
các giống ngô địa phương SL, LC1, LC2, LC3 và trình tự JF797205 đều là
cystein (C) để tạo cầu nối disulfide với Cys thứ 49, còn giống ngô lai
LVN99 thì vị trí thứ 3 này là tyrorine (Y). Vì thế trong cấu trúc protein
ZmDEF1 của giống ngô lai LVN99 sẽ chỉ có 3 cầu nối disulfide.


12

Hình 3.4. Trình tự amino acid suy diễn của protein ZmDEF1 ở
các giống nghiên cứu và JF797205 trên Ngân hàng gen Quốc tế
3.2.2. Đặc điểm của gen ZmDEF1 phân lập từ DNA
So sánh trình tự gen ZmDEF1 phân lập từ DNA tổng số với trình tự

phân lập từ cDNA cho thấy, ZmDEF1 trong hệ gen dài 345 bp gồm 2 exon
và 1 intron xen kẽ với 102 bp (Hình 3.6).
Intron – 102 bp

Exon1- 64 bp
1

65

Exon2- 179 bp

166

345

Hình 3.6. Sơ đồ cấu trúc của gen ZmDEF1 của ngô
3.2.3. Sự đa dạng về trình tự vùng mã hóa gen ZmDEF1 ở ngô
Để xác định mức độ đa dạng trong trình tự nucleotide của gen
ZmDEF1, chúng tôi thực hiện so sánh vùng mã hoá của gen ZmDEF1 của
14 trình tự công bố trên Ngân hàng gen quốc tế. Kết quả cho thấy 14 trình tự
vùng mã hóa của gen ZmDEF1, chia sơ đồ thành hai nhóm lớn, với khoảng
cách di truyề n là 2,8%.
3.3. BIỂU HIỆN GEN ZmDEF1 Ở CÂY THUỐC LÁ CHUYỂN GEN
3.3.1. Thiết kế cấu trúc mang gen chuyển ZmDEF1
Trình tự nucleotid gen ZmDEF1 của giống SL được sử dụng để thiết
kế vector chuyển gen thực vật thông qua A. tumefaciens. Vector chuyển gen
mang gen ZmDEF1 được phát triển qua hai bước: (1) Ta ̣o cấu trúc mang gen
chuyển pDON201-SLHEP-ZmDEF1, pDON201-SLHEP-ZmDEF1 chứa
trình tự trao đổi chéo attL; (2) Gắn cấu trúc gen mang gen chuyể n ZmDEF1
vào vector chuyển gen pBetaPhaso-ZmDEF1 bẳng cách phản ứng LR với

13
pBetaPhaso-dest có trình tự attR trao đổi với attL để tạo vector chuyển gen
nhị thể pBetaPhaso-ZmDEF1 và dòng hóa vào tế bào khả biến E. coli
DH5α. Phản ứng colony-PCR đã được thực hiện bằng cặp mồi
ZmDEF1F_SalI/ZmDEF1R_HindIII. Những dòng khuẩn lạc dương tính với
phản ứng colony-PCR được sử dụng tách plasmid tái tổ hợp pBetaPhasoZmDEF1 và được cắt bởi enzyme giới hạn HindIII để kiểm tra sự có mặt
của ZmDEF1 trong vector tái tổ hợp (Hình 3.8-A). Kết quả cắt plasmid và
cắt bởi enzyme giới hạn HindIII thu được 3 băng DNA với kích thước
khoảng 1,85 kb, 2,4 kb và 11,5 kb. Các kích thước này hoàn toàn phù hơ ̣p
với tính toán theo lý thuyết.

Hình 3.8. Hình ảnh điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp bằng
Hind III (A) và hình ảnh điện di sản phẩm colony-PCR bằng cặp mồi
ZmDEF1F_SalI/ZmDEF1R_HindIII từ khuẩn lạc A. tumefaciens CV58 (B)
(M1: Thang DNA chuẩn 1kb; M2: Thang DNA chuẩn 1kb plus; 1, 2: Sản
phẩm cắt HindIII plasmid tái tổ hợp của 2 dòng khuẩn lạc; 1, 2, 3: Sản phẩm PCR
của 3 dòng khuẩn lạc A.tumefaciens; (-):Đối chứng âm dòng khuẩn lạc không biến
nạp; (+): Đối chứng dương sản phẩm PCR gen ZmDEF1; ĐC: plasmid tái tổ hợp
không cắt bởi HindIII).
Sau khi kiểm tra vector tái tổ hợp mang cấu trúc pBetaPhasoZmDEF1 được biến nạp vào tế bào vi khuẩn A.tumefaciens CV58 bằng kỹ
thuật xung điện. Phản ứng colony-PCR bằng cặp mồi đặc hiệu
ZmDEF1F_SalI/ZmDEF1R_HindIII được thực hiện (Hình 3.8-B) cho thấy


14
cả 3 dòng vi khuẩn A. tumefaciens CV58 đều mang vector chứa cấu trúc
pBetaPhaso-ZmDEF1 và chúng được sử dụng để chuyển gen vào tế bào thực
vật qua lây nhiễm.

3.3.2. Chuyển cấu trúc pBetaPhaso-ZmDEF1 vào cây thuốc lá nhờ A.
tumefaciens
Tiến hành chuyển cấu trúc pBetaPhaso-ZmDEF1 vào cây thuốc lá
N. tabacum C9-1 nhờ A.tumefaciens với hai lần biến nạp qua các giai đoạn:
đồng nuôi cấy, tái sinh đa chồi, chọn lọc ở các giai đoạn kéo dài chồi, ra rễ,
ra bầu đất và ra nhà lưới (hình 3.10).

Hình 3.10. Kết quả tái sinh và chuyển cấu trúc pBetaPhaso-ZmDEF1
vào cây thuốc lá C9-1
(A: Mảnh lá sau khi rửa khuẩn được cấy trên môi trường chọn lọc; B: Các cụm
chồi được tạo thành sau hai tuần nuôi cấy trên môi trường chọn lọc; C: Các chồi
màu xanh được tách ra trên môi trường chọn lọc; D: Chồi cây chuyển gen
sau 3 tuần trên môi trường tạo rễ; E: Hình thái rễ của cây thuốc lá chuyển
gen trên môi trường chọn lọc; F: Cây thuốc chuyển gen ra hoa)
Sau 2 lần biến nạp cấu trúc pBetaPhaso-ZmDEF1 vào các mảnh lá
thuốc lá với 30 mảnh lá/lần, kế t quả đươ ̣c trình bày ở bảng 3.9 với 18 dòng
cây chuyển gen ra nhà lưới.


15

Bảng 3.9. Kết quả biến nạp cấu trúc pBetaPhaso-ZmDEF1 vào mảnh lá
thuốc lá C9-1
Lô thí

Số mảnh lá

Số

Số cụm

nghiệm

biế n na ̣p

mảnh lá

chồi tạo

sống sót

thành

Số dòng

Số dòng

cây

cây ra

cây trồng

sống

bầu đất

tại nhà

Số

sót
Thí

lưới

2 x 30 = 60

32

68

98

36

18

ĐC0

30

0

-

-

-

-

ĐC1

30

30

72

102

10

10

nghiệm

(ĐC0: thuốc lá không chuyển gen được cấy trên môi trường tái sinh có bổ
sung kháng sinh; ĐC1: thuố c lá không chuyển gen được cấy trên môi
trường tái sinh không bổ sung kháng sinh)
3.3.3. Phân tích cây thuốc lá chuyển gen
3.3.3.1. Xác định sự có mặt của gen chuyển ZmDEF1 ở cây thuốc lá chuyển
gen thế hệ T0
Để kiểm tra sự có mặt của gen chuyển ZmDEF1 ở 18 dòng cây
thuốc lá chuyển gen thế hệ T0. Chúng tôi tiến hành tách DNA tổng số lá của
18 dòng cây chuyển gen đã trồng ở nhà lưới để thực hiện phản ứng PCR với
cặp mồi đặc hiệu ZmDEF1F_SalI/ZmDEF1R_HindIII.

Hình 3.11. Kết quả điện di sản phẩm PCR xác định sự có mặt của gen

ZmDEF1 trong các cây thuốc lá chuyển gen
(M: thang chuẩn DNA 1kb; 1 - 18: các dòng thuốc lá chuyển gen; (-): cây đối
chứng không chuyển gen; (+): PCR từ cấu trúc chuyển gen pBetaPhaso-ZmDEF1)


16
Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose ở hình 3.11 với
13/18 dòng dương tính với phản ứng PCR. Hiệu suất chuyển gen đến giai
đoạn này là 13/60= 21,67%.
3.3.3.2. Phân tích biểu hiện ZmDEF1 ở cây thuốc lá chuyển gen T1
Phân tích biểu hiện ZmDEF1 ở cây thuốc lá chuyển gen T1 ở mức độ phiên mã
bằng phản ứng RT- PCR. Hạt các dòng cây dương tính với phản ứng PCR
được sử dụng thực hiện phản ứng RT- PCR (Hình 3.12).

Hình 3.12. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm RT-PCR nhân gen
ZmDEF1 của dòng cây thuốc lá chuyển gen
(M: thang chuẩn DNA 1kb; 1 - 18: các dòng cây thuốc lá chuyển gen; (-):
cây đối chứng không chuyển gen; (+): PCR từ vector chuyển gen
pBetaPhaso-ZmDEF1)

Hình 3.14. Biểu đồ mức độ biểu hiện của gen ZmDEF1 từ các
dòng thuốc lá chuyển gen thế hệ T1
(T1-1, T1-3, T1-10, T1-17: các dòng thuốc lá chuyển gen ở thế hệ T1;Thanh
đứng trên mỗi cột biểu đồ là sai số chuẩn)


17

Đánh giá mức độ phiên mã gen ZmDEF1 trên cây thuốc lá chuyển gen T1
bằng Real-time RT-PCR: Hạt các cây thuốc lá các dòng T1-1, T1-3, T1-10,

T1-17 và cây không chuyển gen (đối chứng âm) được sử dụng thực hiện
phản ứng Real-time RT-PCR với cặp mồi qDEF1-F/qDEF1-R. Chu kỳ
ngưỡng (Ct) của đối chứng âm gen ZmDEF1 sau chu kỳ thứ 40, nghĩa là
giống kiểm tra không có gen ZmDEF1. Kết quả phân tích cho thấy, tỷ lệ
biểu hiện của gen ZmDEF1 ở các dòng cây chuyển gen số T1-1, T1-10,T1-17
cao hơn dòng cây T1-3 tương ứng 1,17 lần, 1,22 lần và 1,44 lần (Hình 3.14)
Phân tích biểu hiện protein ZmDEF1 tái tổ hợp bằng lai Western:

Hình 3.15. Kết quả lai Western cây thuốc lá chuyển gen thế hệ T1
(M: thang chuẩn protein 10-180 kDa của Thermo Scientific, 1, 3, 10, 17:
protein các cây thuốc lá chuyển gen T1-1, T1-3, T1-10, T1-17; (+): đối chứng
dương là protein có kích thước khoảng 35 kDa có chuỗi c-myc phía đầu C;
(-): đối chứng âm là protein cây thuốc lá không chuyển gen)
Hình 3.15 cho thấy, trên màng lai nitrocellulose của các dòng thuốc
lá chuyển gen T1-1, T1-3, T1-10, T1-17 xuất hiện băng protein ở vị trí kích
thước khoảng10 kDa. Điều đó chứng tỏ, cả 4 dòng cây thuốc lá chuyển gen
đều có protein rZmDEF1.
3.2.3. 4. Đánh giá sự biểu hiện chức năng sinh học của gen ZmDEF1 trên
hạt cây thuốc lá ở thế hệ T1
Kiểm tra chức năng sinh học protein rZmDEF1 bằng xác định khả
năng ức chế hoạt động của α -amylase của mọt. Kết quả thể hiện ở bảng


18
3.11. Bảng 3.11 cho thấy, với hiệu suất hoạt động α-amylase của hỗn hợp
gồm α-amylase từ ấu trùng mọt và protein của cây không chuyển gen thì
hoạt độ α-amylase của các mẫu gồm hỗn hợp protein các dòng cây thuốc lá
chuyển gen giảm, chỉ còn 28,19 % đến 37,58%.
Bảng 3.11. Kết quả phân tích khả năng ức chế α-amylase mọt ngô của
protein tái tổ hợp ZmDEF1 từ hạt cây thuốc lá chuyển gen T1

Chỉ có

Mẫu

ĐC

Hỗn hợp α-amylase của mọt và protein hạt

α -amylase

của các dòng thuốc lá chuyển gen T1
T1-1

Hoạt

α- 7,18  0,29

độ

amylase

7,13 

2,26

0,36

0,46

T1-3



2,01

T1-10

T1-17

 2,68  0,73 2,15  0,68

0,58

(ĐVHĐ/mg)
Hiệu

suất

100

31,69

28,19

37,58

30,15

hoạt động αamylase (%)

(ĐC: Hỗn hợp α -amylase của mọt và protein của cây không chuyển gen)

3.4. BIỂU HIỆN GEN ZmDEF1 Ở CÂY NGÔ CHUYỂN GEN
3.4.1. Kết quả chuyển gen gus vào phôi ngô giống LVN99
Ảnh hưởng của mâ ̣t đô ̣ A. tumefaciens, nồ ng đô ̣ acetosyringone
(AS), thời gian nhiễm khuẩ n, tuổi phôi ngô đế n hiê ̣u quả chuyể n gen gus và
ngưỡng chọn lọc phôi mang gen chuyển của kanamycin ở giống ngô LVN99
đã được xác định, để làm cơ sở cho chuyển thành công gen đích ZmDEF1
vào phôi ngô. Các kết quả được trình bày ở bảng 3.12, 3.13, 3.14 ở luận án
cho thấy, quy trình chuyể n gen gus qua phôi non ở ngô nhờ A. tumefaciens
chủng C58 đã được xây dựng và tố i ưu với mật độ vi khuẩn A. tumefaciens
thích hơ ̣p ở giá tri ̣ OD660nm = 0,8 và thời gian nhiễm khuẩn tố i ưu là 30 phút,
AS bổ sung là 150M và tuổi phôi từ 10 - 12 ngày tuổi (tương ứng với kích
thước 0,9 – 1,3 mm) là tuổi phôi tối ưu cho khả năng tiếp nhận gen và sự tái
sinh. Ngưỡng chọn lọc kháng sinh kanamycin đố i với phôi chuyển gen là
50mg/l.


19
3.4.2. Chuyển cấu trúc mang gen ZmDEF1 vào phôi ngô nhờ A.
tumefaciens
Giống ngô lai LVN99 và giống ngô địa phương LC1 làm vật liệu
để nhận gen chuyển ZmDEF1. Quá trình biến nạp, tái sinh tạo cây ngô
chuyển gen được minh hoạ ở hình 3.17.

Hình 3.17. Hình ảnh tái sinh ngô chuyể n gen ZmDEF1 từ phôi
ngô non giố ng LVN99 vụ hè - thu năm 2016
(A1: Phôi sau khi nhiễm khuẩn được nuôi trên môi trường đồng nuôi cấy;
A2: Phôi nuôi trên trên môi trường chọn lọc kháng sinh kanamycine 50mg/l,
chọn phôi mang gen chuyển lần 1; A3: Phôi nuôi trên môi trường chọn lọc
kháng sinh kanamycine 25mg/l, chọn lọc phôi mang gen chuyển lần 2; A4:
Phôi nuôi trên môi trường phục hồi mô sẹo; A5: Phôi nuôi trên môi trường

tái sinh chồi; A6: Phôi nuôi trên môi trường ra rễ; Ra cây: Cây được trồng
ngoài trời)
Sau hai lần biến nạp sử dụng phôi non ngô ở vụ đông - xuân (tháng
11 năm 2015 đến 2 năm 2016) và vụ hè - thu (tháng 5- tháng 8 năm 2016)
chúng tôi thu được kết quả biến nạp và tái sinh cây chuyển gen của hai
giống ngô LC1 và LVN99 ở bảng 3.15 với 5 cây chuyển gen từ giống LC1,
4 cây chuyển từ giống LVN99 ra bầu đất.


20
Bảng 3.15. Kết quả tái sinh cây chuyển gen ZmDEF1 của giống ngô LC1
và LVN99
Số mô
Lô thí nghiệm

Số phôi
biến nạp

sẹo

Số mô

Số cây

được

sẹo tái

ra bầu

chọn

sinh

đất

Số cây
kết hạt

lọc
Vụ đôngxuân (20152016)

LC1

136

7

1

0

0

LVN99

147

8

1

0

0

LC1

158

22

8

5

3

LVN99

167

23

7

4

2

Vụ hè - thu

ĐC0- LC1

30

3

0

0

0

(2016)

ĐC0- LVN99

30

4

0

0

0

ĐC1- LC1

30

22

16

10

10

ĐC1- LVN99

30

20

13

10

10

(ĐC0- LC1: phôi ngô giống ngô LC1 không chuyển gen được cấy trên môi
trường tái sinh có bổ sung kháng sinh; ĐC0- LVN99: phôi ngô giống
LVN99 không chuyển gen được cấy trên môi trường tái sinh có bổ sung
kháng sinh; ĐC1- LC1: phôi ngô giống LC1 không chuyển gen được cấy
trên môi trường tái sinh không bổ sung kháng sinh; ĐC1- LVN99: phôi ngô
giống LVN99 không chuyển gen được cấy trên môi trường tái sinh không bổ
sung kháng sinh)
3.3.3. Xác định sự có mặt của gen chuyển ZmDEF1 ở thế hệ cây ngô

chuyển gen T0
3.3.3.1. Xác định sự có mặt của gen chuyển ZmDEF1 ở thế hệ cây ngô
chuyển gen T0 bằng phản ứng PCR
DNA tổng số từ lá của 9 cây ngô chuyển gen của hai giống LC1 (5
cây) và LVN99 (4 cây) sau khi được tinh sạch, thực hiện phản ứng PCR
hình 3.18. Kết quả cho thấy, cả 5 cây chuyển gen giống LC1 đều cho kết quả có
2 băng DNA với kích thước khoảng 0,25 kb và 0,35 kb tương ứng với kích
thước ước tính cho gen ZmDEF1 nội tại và gen ZmDEF1 ngoại lai. Hiệu suất


21
chuyển gen của giống LC1 đến giai đoạn đánh giá là 5/158=3,16%. Các cây
chuyển gen giống LVN99 có 3 cây dương tính. Hiệu suất chuyển gen của giống
LVN99 đến giai đoạn xác định sự có mặt của gen chuyển bằng phản ứng PCR
là 3/167= 1,79%.

Hình 3.18. Kết quả điện di sản phẩm PCR xác định sự có mặt của gen
chuyển ZmDEF1 trong các cây ngô chuyển gen
(C1- C5: Các cây ngô chuyển gen của giống LC1thế hệ T0; L1- L4: Các cây
ngô chuyển gen của giống LVN99 thế hệ T0; M: Thang chuẩn DNA 1kb;
(+): sản phẩm PCR vector chuyển gen ZmDEF1; (-): Sản phẩm PCR từ
nước cất; WT: Sản phẩm PCR từ DNA cây ngô không chuyển gen)
3.3.3.2. Xác định sự có mặt của gen chuyển ZmDEF1 ở thế hệ cây ngô
chuyển gen T0 bằng lai Southern
Các cây ngô chuyển gen cả hai giống LC1 và LVN99 dương tính
với phản ứng PCR được tiến hành kiểm tra sự có mặt của gen chuyển và số
bản copy trong genome bằng phương pháp lai Southern, kết quả thể hiện ở
hình 3.19.
Kết quả cho thấy, 5 cây chuyển gen giống LC1 đều dương tính với
lai Southern. Hiệu suất chuyển gen của giống đến thời điểm phân tích lai

Southern là 5/158=3,16%. Giống LVN99 có 3 cây dương tính với PCR (T0L1, T0-L3, T0-L4) được lai Southern kết quả cho thấy cả 3 cây chuyển gen
đều dương tính với lai Southern, với mỗi cây có 1 bản copy. Hiệu suất
chuyển gen của giống LVN99 là 3/167= 1,79%.


22

Hình 3.19. Kết quả lai Southern các cây ngô chuyển gen ZmDEF1
(M: Marker 1kb, (+): Vector pBetaPhaso-ZmDEF1 mang gen nptII; (-):
Cây ngô LVN99 không chuyển gen; C1- C5: Các cây ngô chuyển gen giống
LC1 thế hệ T0; L1, L3, L4: Các cây ngô chuyển gen giống LVN99 thế hệ T0)
3.3.4. Phân tích biểu hiện protein ZmDEF1 tái tổ hợp ở thế hệ T1
Cây ngô chuyển gen giống LC1 có 3 cây kết hạt (T1-C1, T1-C3, T1C5). Giống LVN99 có 2 cây kết hạt là cây T1-L1 và T1-L3 và cây số 2
không mang gen chuyển. Hạt các cây ngô chuyển gen được tách protein để
thức hiện lai Western kiểm tra hoạt động của gen chuyển ở mức độ dịch mã,
hình 3.20.

Hình 3.20. Kết quả lai Western trên các cây ngô chuyển gen ZmDEF1
thế hệ T1
(M: Thang chuẩn protein 10-180 kDa của Thermo Scientific; C1,C3,C5:
Các cây ngô chuyển gen giống LC1ở thế hệ T1; L1, L3: Các cây ngô chuyển
gen giống LVN99 ở thế hệ T1 ; (+): Protein chứa đuôi c myc kích thước
khoảng 35 kDa; (-): Protein cây ngô LVN99 không chuyển gen)


23
Hiệu suất chuyển gen đến giai đoạn dịch mã với giống LC1 là
3/158 = 1,89% còn giống LVN99 = 2/167 = 1,19%.
3.3.4. Kiểm tra chức năng sinh học của protein ZmDEF1 tái tổ hợp ở
thế hệ T1

Đánh giá khả năng ức chế hoạt động của α-amylase ấu trùng mọt
của hạt ngô chuyển gen thế hệ T1 ở bảng 3.16
So với cây không chuyển gen giống LC1, protein rZmDEF1 ở cây
T1-C1 có hiệu suất ức chế α-amylase của ấu trùng mọt ngô là 63,09%, cây
T1-C3 là 56,45% và cây T1-C5 với 58,79%. Ở giống LVN99 protein
rZmDEF1 ở cây T1-L1 với hiệu suất ức chế α-amylase của ấu trùng mọt ngô
là 54,52%, cây T1-L3 đạt 55,20%.
Bảng 3.16. Kết quả phân tích khả năng ức chế α-amylase mọt ngô của
protein tái tổ hợp ZmDEF1 từ hạt cây ngô chuyển gen T1
Mẫu

Chỉ có

Hỗn hợp gồm α -amylase của mọt

Hỗn hợp α -amylase của

α-

và protein của giống ngô LC1

mọt và protein của giống

amylases
của mọt

Hoạt độ
α-amylase

LVN99

ĐC

Cây chuyển gen
T1-C1

T1-C3

T1-C5

ĐC

Cây chuyển gen
T1-L1

T1-L3

7,98 

5,12

1,89 

2,23 

2,11 

5,87 

2,67

2,63

0,67

0,59

0,62

0,37

0,47

0,65

0,29

0,43

100

36,91

43,55

41,21

100

45,48

44,80

0

63,09

56,45

58,79

0

54,52

55,20

(ĐVHĐ/mg)
Hiệu

suất

hoạt động α amylase (%)
Hiệu suất ức
chế hoạt động
α - amylase của
rZmDEF1 (%)

(ĐC: Cây không chuyển gen)

24
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
1. Kết luận
1.1. Giống ngô địa phương SL có khả năng kháng mọt tốt nhất, chỉ số mẫn
cảm mọt là 1754,19; giống LVN99, LC1 có khả năng kháng mọt kém, chỉ số
mẫn cảm với mọt lần lượt là 6088,71 và 3515,75.
1.2. Gen ZmDEF1 của các giống ngô nghiên cứu đã được tách dòng thành
công và xác định trình tự nucleotide. Gen ZmDEF1 có hai exon có kích
thước 243 bp, mã hóa cho 80 amino acid và một intron chứa 102 bp.
1.3. Cấu trúc pBetaPhaso-ZmDEF1 được thiết kế và chuyển vào cây thuốc
lá N. tabacum C9-1 nhờ A.tumefaciens CV58. Protein rZmDEF1 được biểu
hiện ở 4 dòng cây chuyển gen (T1-1, T1-3, T1- 10, T1-17) và có khả năng ức
chế hoạt động α-amylase của ấu trùng mọt ngô.
1.4. Cấu trúc pBetaPhaso-ZmDEF1 được chuyển thành công và tạo được cây
ngô chuyển gen ở thế hệ T1 từ giống ngô địa phương LC1 và LVN99 với hiệu
suất chuyển gen lần lượt là 1,89% và 1,19%.
1.5. Protein rZmDEF1 có kích thước gần 10 kDa được biểu hiện 3 dòng cây
từ giống LC1 (T1-C1, T1-C3, T1-C5) và 2 dòng từ giống LVN99 (T1-L1, T1L3). Protein rZmDEF1 biểu hiện ức chế hoạt động của α-amylase của ấu
trùng mọt ngô. So với protein cây không chuyển gen, protein rZmDEF1 ở
các dòng chuyển gen có hiệu suất ức chế α-amylase cao hơn từ 54,52% đến
63,09%.
2. Đề nghị
Tiế p tu ̣c phân tích các cây ngô chuyển gen của hai giống LC1 và
LVN99 chuyể n gen qua các thế hê ̣ T2, T3,... nhằm chọn, tạo được dòng cây
ổn định về khả năng ức chế hoạt độ của α-amylase của mọt ngô, bồi dưỡng
tạo giống ngô chuyển gen kháng mọt.