Luận văn nghiên cứu phương pháp định lượng một số glycoside tim trong dược phẩm và dược liệu

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ
NHIÊN
---------------------

BÙI THỊ TÂM

NGHIÊN CỨU PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG MỘT
SỐ
GLYCOSIDE TIM TRONG DƢỢC PHẨM VÀ DƢỢC LIỆU

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - Năm 2015


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ
NHIÊN
---------------------

BÙI THỊ TÂM

NGHIÊN CỨU PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG MỘT
SỐ
GLYCOSIDE TIM TRONG DƢỢC PHẨM VÀ DƢỢC LIỆU

Chuyên ngành : Hoá Phân Tích
Mã số

: 60440118

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. NGUYỄN VĂN RI

Hà Nội - Năm 2015


Luận văn thạc sĩ

Bùi Thị Tâm

LỜI CẢM ƠN!

Sau một thời gian học tập và nghiên cứu tôi đã hoàn thành luận văn cao học
của mình với đề tài: "Nghiên cứu phương pháp định lượng một số glycoside tim
trong dược phẩm và dược liệu" dƣới sự hƣớng dẫn, chỉ bảo của PGS.TS Nguyễn Văn Ri
và các thầy cô, anh chị em, các bạn trong bộ môn Hóa phân tích.
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS
Nguyễn Văn Ri, ngƣời đã giao đề tài và tận tình chỉ dẫn tôi trong quá trình hoàn thành
luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn tất cả quý Thầy Cô trong bộ môn hóa Phân tích
và khoa Hóa học trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội đã tạo
điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình làm luận văn.
Tôi cũng xin chân thành gửi lời cảm ơn đến ThS. Nguyễn Công Tuấn phòng máy HPLC đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình hoàn thành luận văn.
Cuối cùng tôi cũng xin chân thành cảm ơn toàn thể các anh chị, các bạn
trong phòng thí nghiệm Hoá phân tích, các bạn cao học K23 đã giúp đỡ tôi trong thời
gian thực hiện đề tài.

Luận văn thạc sĩ

Bùi Thị Tâm

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN! ............................................................................................................1
MỞ ĐẦU.....................................................................................................................1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN.......................................................................................3
1.1. Khái quát chung về các hợp chất glycoside tim...............................................3
1.1.1. Cấu tạo, tên gọi.....................................................................................................3
1.1.2. Tác dụng của các hợp chất glycoside tim ......................................................9
1.1.3. Liên quan giữa cấu trúc và tác dụng ...............................................................9
1.1.4. Tính chất của glycoside tim.............................................................................10
1.1.5. Phân bố trong tự nhiên......................................................................................12
1.1.6. Một số loại thuốc chứa glycoside tim...........................................................13
1.2. Khái quát về digoxin và digitoxin ..................................................................13
1.2.1. Digoxin .................................................................................................................14
1.2.2. Digitoxin...............................................................................................................15
1.3. Các phƣơng pháp xác định glycoside tim ......................................................15
1.3.1. Phƣơng pháp sắc kí xác định glycoside tim................................................15
1.3.2. Phƣơng pháp khác xác định glycoside tim..................................................17
1.3.3. Phƣơng pháp chiết tách các glycoside tim ra khỏi nền mẫu thực .........20
1.3.4. Phƣơng pháp định tính và định lƣợng. .........................................................21
CHƢƠNG 2: THỰC NGHIỆM ................................................................................23
2.1. Mục tiêu và đối tƣợng nghiên cứu ................................................................23
2.1.1. Mục tiêu nghiên cứu..........................................................................................23
2.1.2. Đối tƣợng nghiên cứu .......................................................................................23
2.2. Chất chuẩn, hoá chất, thiết bị .........................................................................24
2.2.1. Chất chuẩn............................................................................................................24
2.2.2. Hoá chất ................................................................................................................24

2.2.3. Thiết bị, dụng cụ.................................................................................................24
2.3. Phƣơng pháp phân tích...................................................................................25
2.3.1. Phƣơng pháp xử lý mẫu....................................................................................25


Luận văn thạc sĩ

Bùi Thị Tâm

2.3.2. Phƣơng pháp phân tích. ....................................................................................26
2.4. Thực nghiệm...................................................................................................26
2.4.1. Khảo sát điều kiện tối ƣu .................................................................................26
2.4.2. Xây dựng đƣờng chuẩn.....................................................................................27
2.4.3. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng..................................................27
2.4.4. Đánh giá phƣơng pháp phân tích ..................................................................29
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN............................................................30
3.1. Tối ƣu hoá các điều kiện chạy sắc ký.............................................................30
3.1.1. Van bơm mẫu ......................................................................................................30
3.1.2. Cột tách .................................................................................................................30
3.1.3. Detector.................................................................................................................31
3.1.4. Bƣớc sóng hấp thụ cực đại của các glycoside tim.....................................31
1.1.5. Khảo sát và chọn thành phần pha động và tốc độ dòng...........................32
3.1.6. Khảo sát độ lặp lại của thiết bị .......................................................................39
3.1.7. Điều kiện tối ƣu cho quá trình phân tích các glycoside tim ...................40
3.2. Đƣờng chuẩn các glycoside tim....................................................................42
3.2.1. Khảo sát sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ chất.............................42 3.2.2.
Dựng đƣờng chuẩn..............................................................................................43 3.2.3 .
Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng..................................................45
3.3. Đánh giá phƣơng pháp phân tích ..................................................................46
3.3.1. Đánh giá độ lặp lại của phƣơng pháp phân tích.........................................46

3.3.2. Đánh giá hiệu suất thu hồi của phƣơng pháp ............................................47
3.4. Phân tích mẫu thực tế .....................................................................................48
KẾT LUẬN ...............................................................................................................52 TÀI
LIỆU THAM KHẢO........................................................................................52 Tiếng
Việt:.................................................................................................................53 Tiếng
Anh:.................................................................................................................53


Luận văn thạc sĩ

Bùi Thị Tâm

DANH MỤC HÌNH VẼ

Hình 3.1: Phổ UV của 2 glycoside tim .....................................................................32
Hình 3.2: Sắc đồ tách các glycoside tim ở các tỉ lệ dung môi pha động khác nhau......37
Hình 3.3: Sắc đồ tách các glycoside tim ở các tốc độ dòng pha động khác nhau.....38
Hình 3.4: sắc đồ của digoxin ở điều kiện tối ƣu. ......................................................40
Hình 3.5: Sắc đồ của digitoxin ở điều kiện tối ƣu. ...................................................41
Hình 3.6: Sắc đồ tách các chất glycoside tim ở ở điều kiện tối ƣu. ..........................42
Hình 3.8: Đƣờng chuẩn của 02 glycoside tim nghiên cứu trong luận văn................45
Hình 3.9: Sắc đồ của mẫu thực .................................................................................51


Luận văn thạc sĩ

Bùi Thị Tâm

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1: Tên gọi, công thức cấu tạo của một số glycoside tim [21].........................6
Bảng 2.2: Nồng độ các dung dịch chuẩn glycoside tim............................................24
Bảng 3.1: Khảo sát tỉ lệ pha động của digoxin .........................................................34
Bảng 3.2: Khảo sát tốc độ pha động của digoxin......................................................34
Bảng 3.3: Khảo sát tỉ lệ pha động của digitoxin .......................................................35
Bảng 3.4: Khảo sát tốc độ pha động của digitoxin ...................................................35
Bảng 3.5: Độ lặp lại thời gian lƣu của các Glycoside tim. .......................................39
Bảng 3.6: Độ lặp lại diện tích píc của các Glycoside tim .........................................40
Bảng 3.7: Các dung dịch đƣờng chuẩn .....................................................................44
Bảng 3.8: Diện tích pic trung bình thu đƣợc của các glycoside tim .........................44
Bảng 3.9: Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng của các Glycoside tim ..........45
Bảng 3.10: Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng của phƣơng pháp ................46
Bảng 3.12: Hiệu suất thu hồi của các glycoside tim .................................................48
Bảng 3.13: Kết quả thu đƣợc của mẫu 1 ...................................................................49
Bảng 3.14: Kết quả thu đƣợc của mẫu 2 ...................................................................49
Bảng 3.15: Kết quả thu đƣợc của mẫu 3 ...................................................................49


Luận văn thạc sĩ

Bùi Thị Tâm

BẢNG KÝ HIỆU CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT

ACN: Acetonitrin
DD: dung dịch
HPLC: High performance liquid chromatography
LC-MS: liquid chromatography - spectrometry
LOD: Limit of detection
LOQ: Limit of quantity

RP-HPLC: Reversed-phase performance liquid chromatography
RSD: Relative standard deviation
PDA: Photo-diode - array
SD: Standard deviation
UV: Ultraviolet
UV- VIS: Ultraviolet visible


Luận văn thạc sĩ

Bùi Thị Tâm

MỞ ĐẦU

Ra đời từ rất sớm phƣơng pháp sắc kí lỏng - lỏng đƣợc phát triển mạnh vào
cuối thế kỉ 20. Vào những năm 1970, sắc kí đƣợc phát triển mạnh và đã đạt đƣợc
những thành tựu đáng kể nhƣ tách đƣợc các hỗn hợp các chất cực kì giống nhau nhƣ các
nguyên tố đất hiếm, các ankaloid, các hydrocacbon trong các mẫu dầu.
Ngày nay rất nhiều cải tiến đã đƣợc thực hiện để nâng cao độ nhạy của
phƣơng pháp, nhƣ sử dụng pha tĩnh mới, detector có độ nhạy cao. HPLC (sắc kí lỏng
hiệu năng cao) là một kỹ thuật không thể thiếu trong phân tích để quản lí một mảng các
chất phân tích mà phƣơng pháp khác không thể đáp ứng đƣợc. Với việc áp dụng đƣợc
cho nhiều loại đối tƣợng chất phân tích, từ không phân cực nhƣ: các chất thơm PAHs,
các axit béo, các dƣợc phẩm (digoxin, gitoxin, diginatin,…), các mẫu sinh học trong
phân tích lâm sàng (theobromine, theophilline,..) đến phân cực nhƣ: axit amin,
phenol,…, phƣơng pháp RP - HPLC - UV ( RP - HPLC: sắc kí lỏng hấp phụ pha ngƣợc Reversed-phase performance liquid chromatography) có độ nhạy tốt, độ chọn lọc cao
và hiệu quả tách cao, pic cân đối. Thêm vào đó pha động thƣờng là hỗn hợp của nƣớc
và các dung môi phân cực nên rẻ tiền, kinh tế.
Đây là một phƣơng pháp rất thành công [6,7].
Glycoside tim là một nhóm chất bắt đầu đƣợc sử dụng trong y học bởi bác sĩ

ngƣời Anh - Withering vào năm 1985, và hiện nay glycoside tim có một vị trí quan trọng
trong thuốc điều trị bệnh tim. Trong số rất nhiều loại glycoside tim có trong tự nhiên thì
digoxin và digitoxin đƣợc sử dụng rộng rãi nhất trong điều trị suy tim sung huyết, loạn
nhịp tim và đƣợc nghiên cứu nhiều nhất hiện nay. Tuy nhiên các các chất glycoside tim
thƣờng rất độc, nếu sử dụng quá hàm lƣợng cho phép dẫn đến ngộ độc, thậm chí dẫn tử
vong cho con ngƣời [18]. Chính vì thế cần xác định chính xác hàm lƣợng của các
glycoside tim trong các loại thuốc để đƣa vào điều trị đạt hiệu quả cao không sử dụng
quá liều ảnh hƣởng tới sức khỏe ngƣời tiêu dùng đang rất đƣợc chú trọng.

1


Luận văn thạc sĩ

Bùi Thị Tâm

Yêu cầu đặt ra là phải có phƣơng pháp phù hợp định lƣợng các glycoside tim
trong dƣợc liệu, dƣợc phẩm một cách nhanh chóng và chính xác nhất. Việc ứng dụng
phân tích HPLC vào phân tích thuốc và dƣợc phẩm đã đƣợc làm nhiều trên thế giới
nhƣng ở Việt Nam vẫn còn tƣơng đối mới mẻ và chƣa có nhiều công trình về lĩnh vực
này.
Chính vì lí do trên chúng tôi xin lựa chọn và thực hiện đề tài "Nghiên cứu
phương pháp định lượng một số glycoside tim trong dược phẩm và dược liệu".
Trong đề tài này tôi sử dụng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ghép
nối detector PDA để định lƣợng một số glycoside tim trong dƣợc phẩm và dƣợc liệu.

2


Luận văn thạc sĩ

Bùi Thị Tâm

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Khái quát chung về các hợp chất glycoside tim.
1.1.1.

Cấu tạo, tên gọi.

Glycoiside tim cũng nhƣ các glycosid khác, cấu trúc hóa học gồm 2 phần:
aglycon và phần đƣờng [9].
a) Phần aglycon: có thể chia làm 2 phần:
Nhân hydrocarbon và mạch nhánh (vòng lacton).
* Nhân hydrocarbon
Nhân hydrocarbon có cấu trúc steran: 10, 13-dimethyl cyclopentanoper
hydrophenanthren. Đính vào nhân này có các nhóm chức oxy.

18
11

1

17
16

19
1
2
3

9

A
4

5

B

C
8

14

D

15

7

6

Ở C-3 luôn luôn có đính nhóm OH, hầu hết các chất có trong cây đều hƣớng β, trừ
một vài chất ví dụ carpogenin, carpogenol, epidigitoxigenin có OH C-3 hƣớng α.
Ở C-14 của hầu hết các glycosid tim có tác dụng sinh học đều có nhóm OH
hƣớng β. Một vài chất không có nhóm OH này do trong quá trình thủy phân hoặc
do sắc ký cột có xẩy ra sự dehydrat hóa tạo thành nối đôi ở C 14-15. Tuy nhiên, có

3

Luận văn thạc sĩ

Bùi Thị Tâm

một số chất do bản chất tự nhiên không có nhóm OH này nhƣ các chất diffugenin,
strophanthilin A, β-anhydro-uzarigenin.
Sự oxy hóa (gắn nhóm OH hoặc carbonyl) còn có thể xảy ra thêm ở các vị trí
nhƣ 1, 5, 11, 12, 16, 19. Mức độ oxy hóa ở C-19 có thể là CH2OH, CHO, COOH. Các
chất có mức độ oxy hóa khác nhau này thƣờng cùng tồn tại trong cùng một cây. Chất Gstrophanthidin có đến 6 OH trong phần aglycon. Nhóm OH có thể bị acyl hóa ví dụ
oleandrigenin, gitalixigenin. Có trƣờng hợp các nhóm OH gần nhau tƣơng tác với
nhau để tạo nhóm chức epoxy, ví dụ adynerin. Nhóm OH ở C-11 có thể tác dụng với
COOH ở C-19 để tạo thành vòng lacton ví dụ chất sarmentosigenin E có trong
Strophanthus sarmentosus.
* Vòng lacton
Phần glycon của glycosid tim ngoài khung hydrocarbon nói trên, đặc biệt còn
có một vòng lacton nối vào vị trí C-17 của khung. Vòng lacton này đƣợc coi là mạch
nhánh.

Hầu hết các chất có tác dụng sinh học đều có vòng lacton ở hƣớng β. Một số
ít ở hƣớng α do enzym epimerase có mặt trong cây chuyển hóa mà thành. Có hai loại vòng
lacton: loại thứ nhất có 4 carbon với một nối đôi ở vị trí α-β, những aglycon nào có
vòng lacton này thì có 23 carbon và đƣợc xếp vào nhóm

4


Luận văn thạc sĩ

Bùi Thị Tâm

"cardenolid". Loại thứ hai có 5 carbon có 2 nối đôi (vòng γ-pyron hay coumalin),
những aglycon nào có vòng lacton này thì có 24 carbon và đƣợc xếp vào nhóm
"bufadienolid" (do chữ bufo = cóc, dien = 2 nối đôi. Trong nhựa cóc có các chất có
cấu trúc hoàn toàn giống nhƣ aglycon của nhóm này, ví dụ bufotalin).
Các glycosid tim trong thiên nhiên thƣờng là loại cardenolid; một số ít thuộc
loại bufadienolid nhƣ scillaren A có trong Hành biển (Urginea martima L.) hellebrin
có trong cây Helleborus niger L.
b) Phần đƣờng
Phần đƣờng trong glycosid tim nối vào OH ở C-3 của aglycon. Cho đến nay
ngƣời ta biết khoảng 40 loại đƣờng monosaccharid khác nhau trong các glycosid tim.
Ngoài những đƣờng thông thƣờng nhƣ D-glucose. L-rhamnose, D-xylose, D- fucose
có gặp trong những nhóm glycosid khác, còn lại là những đƣờng đặc biệt của glycosid
tim. Trong các đƣờng này, đáng chú ý là các đƣờng 2,6-desoxy. Dƣới đây là một số
đƣờng 2,6-desoxy làm ví dụ.

Các đƣờng 2,6-desoxy có những đặc tính sau: dễ bị thủy phân, cho phản ứng
màu với thuốc thử Keller-Kiliani và thuốc thử xanthydrol.
Mạch đƣờng có thể là monosaccharid hoặc oligosaccharid. Gitoxin
cellobiosid trong Digitalis tía có mạch đƣờng với 5 đơn vị đƣờng đơn:
Gitoxincellobiosid = Gitoxigenin + (digitoxose)3 + (glucose)2

5


Luận văn thạc sĩ

Bùi Thị Tâm

Ngƣời ta nhận thấy rằng ở glycosid tim glucose bao giờ cũng ở cuối mạch

(xa aglycon) [9].
Dƣới đây là tên gọi, công thức cấu tạo của một số glycoside tim.
Bảng 1.1: Tên gọi, công thức cấu tạo của một số glycoside tim [21]
TT

Tên gọi

Công thức cấu tạo

M
(g/mol)

584
1

2

G -strophathin

872

Kstrophanthoside

550
3

Convallatoxin

4

K- trophanthin

405

6


Luận văn thạc sĩ

Bùi Thị Tâm

5

Oleandrin

576

6

Cymarin

548

7

Digoxin

780

8

Digitoxin

9

Lanatoside A

969

985
10

Lanatoside B

7


Luận văn thạc sĩ

11

Lanatoside C

12

Gitoxin

Bùi Thị Tâm

985

780

806
13

Acetyldigitoxin

823
14

Acetyldigoxin

15

Neriantin
873

8


Luận văn thạc sĩ

1.1.2.

Bùi Thị Tâm

Tác dụng của các hợp chất glycoside tim

Glycosid tim là những glycosid steroid có tác dụng đặc biệt lên tim, đặc biệt là

digoxin và digitoxin. Ở liều điều trị có tác dụng cƣờng tim, làm chậm nhịp tim và điều
hòa nhịp tim. Các tác dụng trên đƣợc gọi là tác dụng theo quy tắc 3R của Potair:
Renforcer

= cƣờng.

Ralentir

= chậm .

Regulariser = điều hoà.
Nếu quá liều sẽ gây nôn làm chảy nƣớc bọt, mờ mắt, tiêu chảy, yếu các cơ,
loạn nhịp tim, và có thể gây tử vong. [9, 21].
Glycoside tim còn đƣợc gọi là glycoisid digital vì glyciside của lá cây
Digitalis đƣợc dùng đầu tiên trên lâm sàng để chữa bệnh tim [9].
1.1.3.

Liên quan giữa cấu trúc và tác dụng

Phần quyết định tác dụng lên tim của glycosid tim là phần aglycon bao gồm
nhân steroid và vòng lacton chƣa bão hòa. Cả hai phần đều quan trọng:
- Nếu vẫn giữ vòng lacton nhƣng thay nhân steroid bằng nhân benzen,
naphtalen… tác dụng lên tim sẽ mất.
- Nếu vẫn giữ nguyên nhân steroid mà thay đổi vòng lacton nhƣ: bão hòa nối
đôi, mở vòng, thay vòng lacton bằng vòng lactam thì tác dụng mất hoặc giảm đi rất
nhiều.
Sự hấp thu qua dạ dày, tá tràng, ruột, phụ thuộc vào số lƣợng nhóm OH của
phần aglycon, nói cách khác là phụ thuộc vào tính ái dầu của nó. Digitoxin dễ hấp thu
qua đƣờng tiêu hóa, tái hấp thu qua thận, gan và có tính tích lũy trong cơ thể vì aglycon
(digitoxigenin) chỉ có 2 nhóm OH. Ouabain có nhiều nhóm OH tự do trong phần aglycon

nên khó hấp thu qua đƣờng tiêu hóa (nên phải dùng qua đƣờng tiêm tĩnh mạch) và thải
trừ nhanh.

9


Luận văn thạc sĩ

Bùi Thị Tâm

Nhóm OH ở C-14 rất quan trọng, thiếu nhóm này tác dụng trên tim sẽ giảm
đi rất nhiều.
Nhóm OH ở C-3 hƣớng α cũng làm giảm tác dụng. Qua quá trình chuyển hóa
trong cơ thể, β-OH ở vị trí C-3 bị epimer hóa sang α-OH để thải ra ngoài.
Thí nghiệm trên súc vật cho thấy một số cardenolid khi đƣa vào cơ thể sẽ
đƣợc gắn thêm OH ở C-12 chuyển thành chất có tính phân cực hơn để dễ thải ra ngoài.
Dung hợp giữa các vòng của nhân steroid cũng ảnh hƣởng đến tác dụng của
glycosid tim: C/D cấu hình cis có tác dụng quyết định lên tim. A/B trans giảm tác dụng
10 lần so với dẫn chất cis tƣơng ứng.
Vòng lacton hƣớng α cũng giảm tác dụng lên tim.
Ở dạng aglycon, hoạt tính của nhóm bufadienolid mạnh hơn dẫn chất
cardenolid tƣơng ứng. Trong hai nhóm cardenolid và bufadienolid thì nhóm đầu đƣợc
sử dụng nhiều hơn. Nhóm bufadienolid hay gây tác dụng phụ.
Phần đƣờng ít có ảnh hƣởng đến tác dụng của glycosid tim, chủ yếu là ảnh
hƣởng đến độ hòa tan, hấp thu và thải trừ của glycosid tim [9,21].
1.1.4.

Tính chất của glycoside tim

* Tính chất vật lí

Glycosid tim là những chất kết tinh đƣợc, một số ở dạng vô định hình hoặc
lỏng sánh. Đa số không mầu, một số có màu (anthraglycosid đỏ, da cam flavonoid
glycosid màu vàng). Chúng có vị đắng, có năng suất quay cực.
Độ tan: Phụ thuộc vào mạch đƣờng dài hay ngắn và các nhóm ái nƣớc trong
phần aglycon. Glycosid thƣờng tan trong nƣớc, ROH, hỗn hợp cồn - nƣớc,..Tan ít trong
Clorofom,…không tan trong dung môi hữu cơ phân cực kém nhƣ :ether,
benzen,…
* Tính chất hoá học

10


Luận văn thạc sĩ

Bùi Thị Tâm

Glycosid tim có đƣờng 2-desoxy sẽ rất dễ bị thủy phân khi đun với acid vô
cơ 0,05N trong methanol 30 phút, trong khi những glycosid khác trong điều kiện đó khó
bị thủy phân.
Glycosid tim dễ bị thủy phân bởi các enzym. Các enzym, thƣờng có sẵn
trong cây, có khả năng cắt các đơn vị đƣờng cuối mạch (xa aglycon) thƣờng là glucose
để chuyển thành các glycosid thứ cấp nhƣ enzym digilanidase trong lá Digitalis
lanata, digipurpidase trong lá Digitalis purpurea, strophanthobiase trong hạt
Strophanthus courmontii, scillarenase trong Urginea maritima.
Vòng lacton 5 cạnh hay 6 cạnh dễ bị mở bởi tác dụng của kiềm rồi tạo thành
dẫn xuất iso không tác dụng. Dƣới đây là cơ chế tạo thành dẫn xuất iso của nhóm
cardenolid [9].

Vòng lacton 5 cạnh còn phản ƣƣng với các dẫn chất nitro (thơm), tạo các sản
phẩm mau dùng để điṇ h tinh, Glycosid tim + nitro (thơm) (OH‾) màu. Ví dụ:

- Phản ứng Raymond - Marthoud:
NO2

Glycosid tim +

NaOH
NO2

11

Tím không bền → xanh dƣơng


Luận văn thạc sĩ

Bùi Thị Tâm

- Phản ứng Kedde:

NO
Glycosid tim +

- Phản ứng Baljet:

2

COOH

NaOH

Màu đỏ tía

NO
2

NO2

Glycosid tim +

OH
NO2

- Phản ứng Legal:

NO2

NaOH

màu cam
Gl
yc
osi
d
ti
m
+
Na
2{F
e(
C

N)5
}N
O
1
.
1
.
5
.
P
h
â
n
b
ố
t
r
o
n

M
à
u
đ
ỏ


g

loài bọ

yxo

t
ự

cánh

se,

cứng

allo

n
h
i
ê
n

Chryso

se,

lina

ribo

spp.

se

thu

và

nhận

một

các

agly

sterol

con

từ thức

mới

ăn thực

tron

vật rồi

g

tổng

loại

hợp

bọ

thành

nói

glycosi

trên

d tim.

[9].

Ngƣời ta tìm thấy
glycosid tim trong các họ
thực vật: Apocynaceae,
Asclepiadaceae,
Celastraceae, Clusiaceae,
Euphorbiaceae,
Leguminosae, Liliaceae,
Meliaceae, Moraceae,
Ranuculaceae,
Scrophulariaceae,

Sterculiaceae và
Tiliaceae. Glycosid tim có
thể gặp trong mọi bộ phận
của cây: lá, hoa, vỏ thân,
rễ, thân rễ, dò, nhựa mủ.

Ngƣời
ta phát
hiện 14
glycosi

Ngƣời ta còn phát
hiện thấy glycosid tim có
mặt trong một số côn
trùng nhƣ

d mới

bƣớm và sâu bƣớm nữ

h

hoàng thƣờng sống trên

i

cây Asclepias syriaca;

ế

hoặc rệp Aphis nerii sống

m

có các
đƣờng

trên cây Asclepias
curassavica. Chúng thu

n

nhận cardenolid từ cây để

h

làm chất bảo vệ chống kẻ

ƣ

thù ăn thịt. Tuy nhiên gần
đây ngƣời ta phát hiện các

l

12


Luận văn thạc sĩ

Bùi Thị Tâm

Digoxin và digitoxin là hai glycoside tim đƣợc chiết xuất từ cây mao địa
hoàng (D. purpurea và D. lanata), đây là loài cây có xuất xứ từ miền Tây châu Âu.
Trong lịch sử dƣợc, cây mao địa hoàng nổi tiếng là khám phá của William Withering,
một bác sĩ ngƣời Anh ở thế kỷ XVIII. Ngày nay cây mao địa hoàng có nhiều lông tơ (D.
lanata) là nguồn cung cấp glycosides tim.
Trong một số tài liệu [9, 19] và rất nhiều tài liệu khác cho biết trong cây trúc
anh đào cũng chứa một số glycoside tim. Đây là loại cây đƣợc trồng hoặc mọc hoang
rất nhiều ở nƣớc ta.
1.1.6.

Một số loại thuốc chứa glycoside tim.

Hiện chỉ còn digoxin và digitoxin đƣợc dùng ở lâm sàng trong điều trị bệnh
tim. Vì vậy chỉ còn một số loại thuốc chứa hoạt chất Digitoxin và digitoxin còn lƣu
hành trên thị trƣờng. Các thuốc loại này đều có 3 đặc điểm chung:
Tất cả đều có nguồn gốc từ thực vật: các loài Digitalis, Strophantus. Có cấu trúc hoá
học gần giống nhau: đều có nhân steroid nối với vòng lacton không bão hòa ở C17, gọi là
aglycon hoặc genin, và đều có tác dụng chống suy tim. Vị trí C3 nối với một hoặc nhiều
phân tử đƣờng(ose), không có tác dụng dƣợc lý nhƣng ảnh hƣởng đến dƣợc động học
của thuốc [9].
1.2. Khái quát về digoxin và digitoxin
Trong số rất nhiều loại glycoside tim có tác dụng mạnh lên tim thì digoxin và
digitoxin là hai hoạt chất hiện nay đƣợc dùng phổ biến nhất trong điều trị bệnh tim (suy
tim sung huyết và loạn nhịp tim), chúng đƣợc nghiên cứu nhiều nhất và đƣợc sử dụng
rộng rãi nhất trong các loại glicoside. Nếu không điều chỉnh phù hợp đƣợc liều lƣợng sử
dụng có thể dẫn đến tử vong. Đối với digoxin liều lƣợng điều trị cho phép từ 0,5 đến 3,0
ng/lit và thời gian bán thải từ 20 đến 60 giờ [18].
Đây cũng là hai chất mà chúng tôi phân tích, nghiên cứu trong bản luận văn

này.

13


Luận văn thạc sĩ

1.2.1.

Bùi Thị Tâm

Digoxin

Công thức: C41H64O14 (780,95)

Tính chất vật lý:
-

Là chất kết tinh không màu

-

Tan trong cồn, pyridin, hay hỗn hợp chloroform - alcolhol, tan nhiều
trong cồn nóng 80%,..

-

Độ tan trong nƣớc 64,8 mg/L ở 25 °C và điểm nóng chảy ở 249 °C.

-

Không tan trong ete, axeton….

Dƣợc tính:
- Là chất độc bảng A
- Digoxin là một glicozit tim chiết xuất từ cây mao địa hoàng (Digitalis). Nó
đƣợc sử dụng rộng rãi trong điều trị các tình trạng tim khác nhau, và có hai tác động riêng
biệt lên tim.
+ Digoxin ức chế bơm Na+-K+ ATPase ở màng tế bào cơ tim (myocyte). Điều
này làm tăng nồng độ ion natri trong tế bào cơ tim và dẫn đến tăng nồng ion canxi.
Nồng độ canxi tăng làm tăng tính co bóp của cơ tim.
+ Digoxin làm tăng sức bóp cơ tim và giảm tính dẫn truyền xung điện
qua nút nhĩ thất,do đó thƣờng dùng trong điều trị suy tim, kiểm soát nhịp tim trong rung
nhĩ, cuồng động nhĩ, nhịp nhanh kịch phát trên thất[1,2].

14


Luận văn thạc sĩ

1.2.2.

Bùi Thị Tâm

Digitoxin

Công thức: C41H64O13 (764,95)

Tính chất vật lý:
- Digitoxin là chất kết tinh không màu,

- Tan tốt trong cồn, chloroform, …
- Tan ít trong nƣớc (1gam/100 lít ở 20oC)
- Không tan trong dung môi hữu cơ benzen, ether….
Dƣợc tính:
Digoxin là một glicozit tim chiết xuất từ cây mao địa hoàng (Digitalis).
- Là chất độc bảng A
- Có cấu trúc và hiệu ứng tƣơng tự nhƣ digoxin.
1.3. Các phƣơng pháp xác định glycoside tim
1.3.1.

Phương pháp sắc kí xác định glycoside tim

Phƣơng pháp sắc kí để nghiên cứu các glycoside tim rất đƣợc quan tâm, vì:
thứ nhất các glycoside tim là các hợp chất có hoạt tính sinh học đƣợc sử dụng ngày
càng gia tăng trong thuốc, thứ hai, chúng còn đƣợc nghiên cứu về cấu trúc và thể tích
lƣu trong sắc kí. Hơn nữa điều kiện tối ƣu tách các glycoside cũng đƣợc quan tâm.
F.erni và R.W.Frei đã đƣa ra quy trình tách các glycoside tim trong thuốc
bởi sắc kí pha ngƣợc, với điều kiện: cột pha ngƣợc C18, kích cỡ hạt 10m, dài 30
cm, ID 3,5mm, pha động là 37% acetonitrin trong nƣớc, tốc độ dòng pha động 1,4
ml/phút, thể tích vòng mẫu 25l, detector đặt ở bƣớc sóng 220nm. Thời gian phân
tích là 25 phút [14]. Youichi fujii, Hitomi fukuda, Yumiko Saito và Mitsuru

15


Luận văn thạc sĩ

Bùi Thị Tâm

Yamazaki đƣa ra quy trình tách và định lƣợng các glycoside tim trong thuốc bằng

phƣơng pháp micro - HPLC với điều kiện: Cột Jasco SC-01 (165x0,5mm I.D), pha
động acetonitrin - methanol - nƣớc bằng 1:1:1, tốc độ dòng 4 l/phút, detector UV
đặt ở 220 nm, thể tích vòng mẫu 0,1l. Thứ tự ra khỏi cột là: digoxin, lanatoside B,
gitoxin, lanatoside A, digitoxin, thời gian tách thay đổi trong khoảng 30 đến 45 phút
[22]. Nhóm tác giả Youichi fujii, Hitomi fukuda, Yumiko Saito và Mitsuru Yamazaki
cũng đƣa ra quy trình xác định glycoside trong lá cây digitalis purpurea. Trong bài báo
này, các glicoside đƣợc tách bằng phƣơng pháp HPLC với điều kiện: cột 5-C8-U, pha
động acetonitrin - methanol - nƣớc (4:4:5), tốc độ dòng
0,5ml/phút, detector UV đặt ở bƣớc sóng 220 nm, thể tích voàn mẫu 10 l., Thứ tự
ra khỏi cột là: gitoxin, gitatoxin, digitoxin… thời gian phân tích mẫu 30 phút [23].
Belachew desta, E.Kwong và K.M.McErlane cũng đề cập đến việc xác định và tách các
glycoside tim. Trong bài báo này, 9 glycoside tim đựơc tách bởi phƣơng pháp HPLC
với điều kiện: cột C18, dung môi pha động nƣớc - methanol - isopropanol - diclomethane
(47:40:9:4), tốc độ dòng 1,2ml/phút, đặt ở bƣớc sóng 220nm. Thời
gian phân tích mẫu 27 phút. Thứ tự ra khỏi cột là:

digoxigenin; digoxigenin

monodigitoxoside;

digoxin;

digoxigenin

bisdigitoxoside;

digitoxigenin;

digitoxigenin monodigitoxoside; gitoxin; digitoxigenin bisdigitoxoside; digitoxin [11].
Digoxin và digitoxin cũng đựơc nhóm tác giả Federica Pellati, Renato Bruni, Maria

Grazia Bellardi, Assunta Bertaccini, Stefania Benvenuti phân tích xác định và tách trong
lá cây mao địa hoàng với phƣơng pháp HPLC trên cột LiChrospher RP- 18 (125 mm ×
4.0 mm I.D.), Zorbax SB-C18 (150 mm × 4.6 mm I.D.); SB-Aq (150 mm × 4.6 mm
I.D.,); Symmetry C 18 (75 mm × 4.6 mm I.D., For the Symmetry C18 trong điều kiện
dung môi pha động là hỗn hợp acetonitrin và nƣớc, chạy
gradient từ 0- 35phút với tỉ lệ H2O/ACN là 80:20, từ phút 35 đến 40 tỉ lệ H2O/ACN
là 70:30 và tỉ lệ H2O/CAN bằng 60:40 đựơc giữ trong 3 phút, nhiệt độ cột đặt ở 20 oC,
thể tích bơm mẫu 10l, tốc độ dòng là 1ml/phút, detector đặt ở bƣớc sóng
220nm. Tổng thời gian phân tích mẫu là 48 phút, thứ tự ra khỏi cột: digoxigenin;
2,deacetyllanatoside C; 3,digoxigenin-bis-digitoxoside; 4,gitoxigenin; 5, digoxin; 6,

16