Xác định đồng thời Arsen(III), monomethylarsonic (MMA), dimethylarsonic (DMA) và arsen (v) trong nước tiểu bằng phương pháp HPLC ICP MS

Mục lục
MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1
Chương 1. Tổng quan ...............................................................................................2
1.1. Tính chất vật lí và hóa học của Asen. ..................................................................2
1.2. Các dạng tồn tại và độc tính của Asen. ................................................................4 1.3.
Các phương pháp phân tích dạng asen...............................................................11 1.3.1.
Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao ghép nối hệ hydrua quang phổ huỳnh quang
nguyên tử (HPLC-UV-HG-AFS). ...................................................................12 1.3.2.
Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao ghép nối với hệ quang phổ hấp thụ nguyên tử
sử dụng kĩ thuật hydrua hóa (HPLC-HG-AAS). ......................................13 1.3.3. Phương
pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao ghép nối với cảm ứng cao tần và quang phổ phát xạ
nguyên tử (HPLC - ICP - AES).................................................14 1.3.4. Kỹ thuật sử dụngphương pháp kết hợp HPLC-ICP/MS. ..............................15 1.3.5. Phương pháp điện di
mao quản CE-UV. ........................................................17
Chương 2. Thực nghiệm .........................................................................................20
2.1. Hóa chất và thiết bị ............................................................................................20
2.1.1. Hóa chất ..........................................................................................................20
2.1.2. Thiết bị ............................................................................................................21 2.2.
Nội dung và phương pháp nghiên cứu ...............................................................23 2.2.1.
Nội dung nghiên cứu .......................................................................................23 2.2.2.
Phương pháp nghiên cứu ................................................................................23
Chương 3. Kết quả và thảo luận ............................................................................28
3.1. Xác định các điều kiện tối ưu trên thiết bị ICP-MS...........................................28
3.1.1. Chuẩn hóa số khối...........................................................................................28
3.1.2. Tối ưu hóa tốc độ khí mang cho bộ sol khí .....................................................28 3.1.3.
Khảo sát nguồn năng lượng (ICP)..................................................................29 3.1.4. Khảo
sát thế điều khiển thấu kính điện tử - ion ..............................................30


3.2. Khảo sát điều kiện tối ưu cho hệ ghép nối HPLC - ICP - MS..........................31
3.2.1. Xác định thời gian lưu của từng dạng asen. ...................................................31
3.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ Methanol...................................................31

3.2.3. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ photphat (PO43-) .......................................34
3.2.4. Khảo sát ảnh hưởng của pH ...........................................................................35
3.2.5. Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ dòng pha động .............................................38
3.2.6. Xác định độ phân giải .....................................................................................39
3.2.7. Khảo sát nồng độ chất nội chuẩn Ge ..............................................................40
3.2.8. Khảo sát thể tích bơm mẫu..............................................................................41
3.2.9. Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng ion clo ...................................................41
3.2.10. Khảo sát điều kiện và thời gian bảo quản mẫu nước tiểu. ...........................43 3.3.
Khảo sát độ lặp lại, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, độ thu hồi và xây dựng
đường hồi quy tuyến tính cho mỗi dạng asen, đánh giá độ đúng của phương
pháp. ..........................................................................................................................44
3.3.1. Kết quả khảo sát với As3+................................................................................46
3.3.2. Kết quả khảo sát với DMA ..............................................................................47
3.3.3. Kết quả khảo sát với MMA..............................................................................48
3.3.4. Kết quả khảo sát với As5+................................................................................49
3.3.5. Khảo sát độ thu hồi đối với mỗi dạng asen.....................................................50
3.3.6. Đánh giá độ đúng của phương........................................................................53
3.4. Ứng dụng phân tích mẫu thực tế ........................................................................54
3.4.1. Quy trình phân tích mẫu nước tiểu .................................................................54
3.4.2. Kết quả phân tích ............................................................................................56
Kết luận ....................................................................................................................58
Tài liệu tham khảo ..................................................................................................59


Danh mục hình

Hình 1.1: Sự chuyển hóa các dạng asen trong môi trường .........................................7
Hình 1.2: Nhiễm độc asen gây cản trở tổng hợp ATP ................................................9 Hình
1.3. Tiến trình phát triển của nhiễm độc mãn tính Asen .................................10 Hình 1.4:
Quá trình hấp thu và trao đổi chất trong cơ thể ........................................10 Hình 1.5: Các

quá trình xảy ra ..................................................................................10 Hình 1.6: Hệ ghép
nối HPLC-UV-HG-AFS .............................................................13 Hình 1.7: Sơ đồ ghép
nối hệ HPLC - HG - AAS.....................................................14 Hình 1.8: Sơ đồ ghép nối
giữa HPLC-HG ICP-AES ..............................................15 Hình 1.9. Sơ đồ thiết bị sắc
kí ...................................................................................16 Hình 1.10: Cấu tạo hệ điện di
mao quản...................................................................18 Hình 2.1: Hệ thống ghép nối
HPLC - ICP - MS ......................................................21 Hình 2.2: Bộ lọc 0,45 µm của
hãng Cronus..............................................................23 Hình 3.1: Kết quả hiệu chuẩn số
khối .......................................................................28 Hình 3.2: Tỉ lệ cường độ tín hiệu theo
tốc độ khí mang ...........................................29 Hình 3.3. Tín hiệu của Rh theo công suất
của máy phát cao tần ..............................30 Hình 3.4. Tín hiệu Rh phụ thuộc thế thấu kính
điện tử - ion ....................................31 Hình 3.5: Thời gian lưu của từng dạng
asen. ............................................................32 Hình 3.6: Khả năng tách các dạng asen phụ
thuộc vào nồng độ methanol...............33 Hình 3.7: Khả năng tách các dạng asen phụ thuộc
nồng độ photphat ......................35 Hình 3.8: Sự ảnh hưởng của pH tới khả năng tách các
dạng asen............................37 Hình 3.9: Ảnh hưởng tốc độ dòng của pha
động ......................................................39 Hình 3.10: kết quả phân tích 4 dạng
asen .................................................................40 Hình 3.11: Sắc đồ Ge ở các nồng độ khác
nhau .......................................................40 Hình 3.12. Khảo sát ảnh hưởng của vòng
mẫu ........................................................41 Hình 3.13: Ảnh hưởng của hàm lượng
clo................................................................42 Hình 3.14: Sắc đồ hỗn hợp chuẩn As - 2
µg/L.........................................................44


Hình 3.15: Sắc đồ hỗn hợp chuẩn As - 5 µg/L.........................................................45
Hình 3.16: Sắc đồ hỗn hợp chuẩn As - 10 µg/L.......................................................45 Hình
3.17: Sắc đồ hỗn hợp chuẩn As - 25 µg/L.......................................................46 Hình 3.18:
Sắc đồ hỗn hợp chuẩn As - 50 µg/L.......................................................46 Hình 3.19:
Đường hồi quy tuyến tính của As3+ ........................................................47 Hình 3.20:
Đường hồi quy tuyến tính của DMA ......................................................48 Hình 3.21:

Đường hồi quy tuyến tính của MMA......................................................49 Hình 3.22:
Đường hồi quy tuyến tính của As5+ ........................................................50 Hình 3.23: Mẫu
chuẩn CRM No.18 trước và sau khi pha ........................................53 Hình 3.24: Sắc đồ
phân tích mẫu CRM No.18 .........................................................54 Hình 3.25: Sơ đồ phân
tích mẫu nước tiểu trên hệ thiết bị HPLC-ICP/MS .............55 Hình 3.26: Sắc đồ đo mẫu
thực tế .............................................................................56


Danh mục bảng

Bảng 1.1: Các loại cột sắc kí hay dùng .....................................................................11
Bảng 3.1. Kết quả khảo sát công suất máy phát cao tần ...........................................30 Bảng
3.2: kết quả khảo sát thời gian bảo quản mẫu đối với MMA ..........................43 Bảng 3.3:
kết quả khảo sát thời gian bảo quản mẫu đối với DMA...........................44 Bảng 3.4: Kết
quả khảo sát với As3+ .........................................................................47 Bảng 3.5: Kết quả
khảo sát với DMA.......................................................................48 Bảng 3.6: Kết quả khảo
sát với MMA ......................................................................49 Bảng 3.7: Kết quả khảo sát
với As5+ .........................................................................50 Bảng 3.8: Kết quả khảo sát độ
thu hồi với As3+........................................................51 Bảng 3.9: Kết quả khảo sát độ thu
hồi với DMA......................................................51 Bảng 3.10: Kết quả khảo sát độ thu hồi
với MMA...................................................52 Bảng 3.11: Kết quả khảo sát độ thu hồi với
As5+......................................................52 Bảng 3.12: Hàm lượng DMA có trong mẫu
chuẩn CRM No.18 ..............................53 Bảng 3.13: Kết quả phân tíchmẫu nước tiểu
thực.....................................................56


Danh mục các từ viết tắt

MMA: Mono-methylarsonic
DMA: Dimethylarsonic

HPLC: Máy sắc kí lỏng hiệu năng cao
ICP - MS: Cảm ứng cao tần ghép nối khối phổ
TBHA: Tetrabutylammonium hydroxide
AFS: Phổ huỳnh quang nguyên tử


M Ở ĐẦU
Asen (As) là nguyên tố vi lượng cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển
của động vật và con người. Ở hàm lượng nhất định As tham gia vào quá trình trao đổi
chất, tổng hợp nucleic, protit và hemoglobin. Chính vì vậy mà các chuyên gia về thực
phẩm của tổ chức FAO/WHO đã đưa ra mức hấp thụ lượng asen vô cơ tối đa cho người
là 15µg As/kg trọng lượng cơ thể/tuần [7, 18, 19].
Mặc dù As là một nguyên tố không thể thiếu trong trong hệ thống sinh học,
nhưng nếu hấp thụ một hàm lượng vượt quá mức cần thiết, nó lại là một chất cực độc.
Độc tính của As phụ thuộc vào các dạng hợp chất tồn tại của nó, mức độ độc hại của
các hợp chất này giảm dần theo thứ tự sau: asin > các hợp chất asen vô cơ hóa trị +3 >
các hợp chất asen hữu cơ hóa trị +3 > các hợp chất asen vô cơ hóa trị +5 > các hợp chất
asen hữu cơ hóa trị +5 > các hợp chất của asen có gốc amin > nguyên tố asen [9, 10, 16].
Asen chủ yếu ở dạng các hợp chất vô cơ (có độc tính cao) được đưa vào cơ thể
từ nhiều nguồn khác nhau: thực phẩm, nước uống, không khí. Trong cơ thể, thông qua
phản ứng metyl hóa và khử liên tục các hợp chất As này được chuyển thành dạng
không độc, sau đó được bài tiết qua nước tiểu, phân, và tích lũy ở da, tóc, móng. Vì
vậy, hàm lượng As trong nước tiểu, phân, da, tóc, móng được dùng làm chỉ thị cho sự
phơi nhiễm As trong cơ thể.
Việc xác định nồng độ của từng dạng asen trong nước tiểu sẽ đánh giá được mức
độ rủi ro đến sức khỏe con người. Vì vậy, một phương pháp xác định phù hợp để có thể
tách và định lượng chính xác các dạng khác nhau của asen trong nước tiểu
là cần thiết. Do đó, luận văn này sẽ thực hiện các nghiên cứu cụ thể như sau:
-

Nghiên cứu xây dựng phương pháp ghép nối HPLC-ICP-MS để xác
định

đồng

thời

Asen

(III),

Mono-methylarsonic

(MMA),

Dimethylarsonic (DMA) và arsen (V) trong nước tiểu.
-

Áp dụng phương pháp ghép nối HPLC-ICP-MS để xác định một số
mẫu nước tiểu của người dân xã Chuyên Ngoại, Hà Nam.
1


Chương 1. Tổng quan
Asen hay còn gọi là thạch tín, ký hiệu As và số nguyên tử 33. Asen lần đầu
tiên được Albertus Magnus (Đức) đề cập tới vào năm 1250. Khối lượng nguyên tử của nó
bằng 74,92. Asen là một á kim gây ngộ độc cao và có nhiều dạng thù hình: màu vàng
(phân tử phi kim), một vài dạng màu đen và xám (á kim). Ba dạng có tính kim loại của
asen với cấu trúc tinh thể khác nhau cũng được tìm thấy trong tự nhiên (các khoáng vật
asen sensu stricto và hiếm hơn là asenolamprit cùng parasenolam- prit), nhưng nói

chung nó hay tồn tại dưới dạng các hợp chất asenua và asenat.
Người ta đã tìm thấy asen tồn tại trong khoảng 200 loại khoáng khác nhau. [1]
Asen và các hợp chất của nó được sử dụng như là thuốc trừ dịch hại, thuốc trừ
cỏ, thuốc trừ sâu và trong một loạt các hợp kim.
Trạng thái ôxi hóa phổ biến nhất của nó là -3 (asenua: thông thường trong các
hợp chất liên kim loại tương tự như hợp kim), +3 (asenat (III) hay asenit và phần lớn
các hợp chất asen hữu cơ), +5 (asenat (V): phần lớn các hợp chất vô cơ chứa ôxy của
asen ổn định). Asen cũng dễ tự liên kết với chính nó, chẳng hạn tạo
thành các cặp As-As trong sulfua đỏ hùng hoàng (α-As4S4) và các ion As43- vuông
trong khoáng coban asenua có tên skutterudit. Ở trạng thái ôxi hóa +3, tính chất hóa
học lập thể của asen chịu ảnh hưởng bởi sự có mặt của cặp electron không liên kết.
1.1. Tính chất vật lí và hóa học của Asen.
Tính chất vật lí [1, 2]
Asen có tính chất gần với các kim loại, nó có bốn dạng thù hình: dạng kim
loại, vàng, xám và nâu. Asen thường gặp ở dạng kim loại có màun sáng bạc. Asen kim
loại có ánh kim, có cấu trúc tinh thể gần giống phốt pho đen.
Sau đây là một số thông số vật lí của asen: tỉ trọng: 5,7g/cm 3, bán kính nguyên
tử: 1,21A0, năng lượng ion hoá thứ nhất: 9,81 eV,nhiệt độ nóng chảy là 817 0C, nhiệt độ
bay hơi của asen là 6150C, khi gặp lạnh nó ngưng lại thành tinh thể tà phương, hơi asen
có mùi tỏi rất độc.

2


Asen là một chất bán dẫn, dễ nghiền thành bột. Người ta có thể tạo hợp chất
bán dẫn của asen như GaAs, có tính chất bán dẫn như silic và gecmani.
Tính chất hóa học của Asen. [1, 2]
Asen là nguyên tố bán kim loại, có tính chất hoá học gần với tính chất của á
kim, cấu hình lớp vỏ điện tử hoá trị của asen là 4s24p3. Trong cấu hình điện tử của asen
có sự tham gia của các obital d vì vậy có khả năng mở rộng vỏ hoá trị, trong các hợp

chất asen có 3 giá trị số oxi hoá: -3, +3, +5. Số oxi hoá -3 rất đặc trưng cho asen.
Khi đun nóng trong không khí asen cháy tạo thành oxit, ngọn lửa màu xanh
là của As2O3. Về tính chất điện thế, asen đứng giữa hidro và đồng nên nó không tác
dụng với các axit không có tính oxi hoá, nhưng dễ dàng phản ứng với các axit
HNO3, H2SO4 đặc…
3As + 5HNO3 + 2H2O

 3H3AsO 4 + 5NO

Khi phản ứng với các halogen, các halogenua asen được tạo ra, hợp chất này
trong môi trường nước dễ bị thuỷ phân tạo axit tương ứng
2As + 5Cl2 +8 H2O  2H3AsO4 + 10HCl
Các hợp chất của As3+ rất phổ biến như As2S3, H3AsO3, AsCl3, As2O3… chúng
đều tan tốt trong axit HNO 3 đặc nóng, NaOH, NH4OH, (NH4)2S và (NH4)2CO3 .
As2S3 + 8 HNO3 + 4H2O  2H3AsO4 + 3H2SO4 + 8NO
hay As2S3 + (NH4)2S  (NH4)3AsS3
Khi cho khí H2S qua dung dịch AsCl3 có kết tủa màu vàng tươi, đó là As2S3.
Asen không tạo pentaclorua mà chỉ có triclorua asen, đây là một hợp chất quan
trọng của asen, AsCl3 dễ bay hơi, dễ bị thuỷ phân trong môi trường nước.
AsCl3 + 3H2O  2H3AsO3 + 3HCl
Khi khử H3AsO3 ta thu được khí asin:
H3AsO3 + 3Zn + 6HCl  3ZnCl2 + AsH3 + 3H2O
H3AsO3 thể hiện tính chất như một axit khi tác dụng với muối tạo thành muối
mới và axit mới.
3


H3AsO3 + CuSO4  CuHAsO3 + H2SO4
CuHAsO3 có kết tủa màu vàng lục trong môi trường kiềm nó tan trong dung
dịch màu xanh.

 CuNaAsO3 + H20

CuHAsO3 + NaOH

Một số hợp chất quan trọng của As5+ như As2S5, H3AsO4, Ag3AsO4,… Trong đó
As2S5 không tan trong nước và axit HCl, chỉ tan trong NaOH, HNO3, NH4OH, vì
vậy dựa vào tính chất này có thể xác định asen bằng phương pháp phổ khối lượng.
As2S5+ (NH4)2S  (NH4)3AsS4
Khi cho axit asenic tác dụng với molipdat amoni trong môi trường axit
HNO3 cho kết tủa màu vàng, muối này được dùng để định tính và định lượng asen.
H3AsO4 +12(NH4) 2MoO4 + 21HNO3

 (NH4)3H4[As(Mo2O7)6]

+

21NH4NO3+ 10H2O
Trong hợp chất này As5+ có vai trò như P5+, nó làm ion trung tâm điển hình
tạo phức dị đa axit, và phức này cũng có thể khử về phức dị đa màu xanh.
Trong hợp chất AsH3, asen thể hiện tính oxy hoá -3, liên kết trong asin là liên
kết cộng hoá trị, đây cũng là đặc điểm do cấu hình điện tử của asen. AsH3 thể hiện
tính khử mạnh ví dụ như khi tác dụng với H2SO4 loãng:
2AsH3 + 6H2SO4  6SO2 + As2O3 + 9H2O
hay khi tác dụng với I2:
AsH3 + 4I2 + 4H2O  H3AsO3 + 8HI
1.2. Các dạng tồn tại và độc tính của Asen.
a) Các dạng tồ tại.
Asen là một nguyên tố tồn tại khá phổ biến trong tự nhiên, nó đứng thứ 20 và
chiếm khoảng 1.10-4% tổng nguyên tố trong vỏ trái đất. Hàm lượng trung bình của asen
trong vỏ trái đất là 1,8 ppm; trong đất nó có hàm lượng từ khoảng 5,5 đến 13 ppm,

trong sông suối nhỏ hơn 2ng/ml; trong nước ngầm nhỏ hơn 100ng/ml.
Asen phân bố chủ yếu trong các quặng sunfua như pyrit có thể lên đến hàng trăm
mg/kg, hàm lượng cao của asen có thể tìm thấy trong than đá lên đên 1500 mg/kg,
ngoài ra còn trong các khoáng vật như: asenua đồng, niken, sắt,… Trong tự
4


nhiên asen tồn tại ở cả dạng vô cơ và hữu cơ.
Asen là nguyên tố có khả năng kết hợp với lưu huỳnh tạo thành hợp chất sunfua,
tạo hợp chất với selen, telua và đặc biệt là với đồng, niken, sắt, bạc. Có khoảng gần 140
khoáng vật độc lập của asen, trong đó 60% là asenat và 35% là các
sunfua. Các khoáng vật quan trọng nhất của asen là: rialga (AsS), ocpimen (As2S3),
asopyrit (FeAsS)… Asen còn kết hợp các nguyên tố khác thay thế lưu huỳnh trong
các hợp chất như:
Loellingite (FeAs2), Smartina (As2Co). Các loại hợp chất này thường được
tạo thành ở nhiệt độ thấp.
Asen thường di chuyển trong đất, trong trầm tích, trong thực động vật và trong
các vùng có hoạt động sinh học trong đại dương.
Trong nước asen thường tồn tại chủ yếu dưới các dạng asenit, asenat,
monometylasonic axit, hay dimetylasinic axit… nhưng có hàm lượng rất thấp, chủ yếu asen
bị thuỷ phân lắng xuống bùn. Môi trường nước có tính oxi hoá, As thường ở dạng asenat,
nhưng dưới điều kiện khử thì asenit lại là chủ yếu. Hàm lượng asen trung bình trong
nước chỉ khoảng 10µg/l, tuy nhiên có thể cao hơn do ảnh hưởng của chất thải công
nghiệp, thuốc diệt cỏ… Sự metyl hoá asen vô cơ sang metyl và dimetyl asenic là được tạo bởi
các hoạt động của các vi sinh vật trong nước. Một vài sinh vật biển có khả năng chuyển
asen vô cơ sang hợp chất asen hữu cơ phức tạp, chẳng hạn như arsenobetaine,
arsenocholine, arsoniumphospholiphid. Metylasin được chuyển hóa vào không khí từ
việc xử lí các loại hợp chất của asen. Dimetylasin và trimetylasin được phát hiện trong
các khu vực có sử dụng các hợp chất metylasen.
Từ các mỏ tập trung, asen bị phong hoá cùng các kim loại khác và sau đó được

vận chuyển đi phân tán trong môi trường. Một phần lớn asenat được kết tủa trở lại hoặc
hấp phụ trên các hạt kiểu phù sa và được các dòng sông, suối mang từ trên núi xuống
bồi đắp các đồng bằng châu thổ của các con sông. Cùng với nhôm, sắt và các kim loại
khác và khoảng 6% các vật chất hữu cơ trong trầm tích chứa một lượng đáng kể asen.
Trong điều kiện yếm khí (ở trong lòng đất), các vi sinh vật
5


phân huỷ các chất hữu cơ nói trên, tạo ra môi trường khử CO2. Tiếp đó là quá trình
khử, hoà tan sắt và giải phóng asen đã bị hấp phụ trên đó. Đồng thời với quá trình
giải phóng asen là quá trình khử As (V) về As (III) và chúng đi vào nước ngầm.
Asen tồn tại trong môi trường chủ yếu ở các dạng As−3, As0, As+3 and As+5 trong
cả dạng vô cơ và hữu cơ. Trong nước tự nhiên asen tồn tại chủ yếu là ở dạng vô cơ, và
lượng nhỏ asen hữu cơ chủ yếu là MMA(V), DMA(V) [17, 34, 36]. Các
dạng asen vô cơ tồn tại chủ yếu dạng H3AsO3 trong môi trường chất khử và H2AsO4
trong môi trường chất oxihoa còn dạng hữu cơ thì rất ít trong môi trường nước tự
nhiên vì có sự chuyển hóa sinh học [44]. trong nước mặt, nước thải thì asen tồn tại ở
nhiều dạng khác nhau [49]:
Tên của dạng asen

Viết tắt

Công thức phân tử

Các hợp chất phổ biến
Asen vô cơ:
Axit Asenous

As (III)

As(OH)3

Axit Asenic

As(V)

AsO(OH)3

Axit mono methyl asenat

MMA (V)

CH3AsO(OH)2

Axit đimethyl asenat

DMA (V)

(CH3)2AsO(OH)

Asenobetaine

AsB

(CH3)3As+CH2COOH

Asenocholine

AsC

(CH3)3As+CH2CH2OH

Trimethyl asenic oxit

TMAO

(CH3)3AsO

Axit p-arsanilic

p-ASA

C6H8AsNO3

Axit dimethyl dithio asenic

DMDTA (V)

(CH3)2AsS(SH)

Axit dimethyl monothio asenic

DMMTA (V)

(CH3)2AsS(OH)

Axit dimethyl asenic

DMA (III)

(CH3)2As(OH)

Axit mono methyl asenic

MMA(III)

(CH3)3As(OH)2

Axit diphenyl asenic

DPAA

(C6H5)2AsO(OH)

Axit phenyl asenic

PhAs, PAA

C6H5AsO(OH)2

Asen hữu cơ:

Các hợp chất hiếm

6


Trong môi trường asen chuyển hóa thành các dạng khác nhau rất phức tạp,
phụ thuộc vào điều kiện môi trường khác nhau. Sự chuyển hóa các dạng asen trong môi
trường được thể hiện trong Hình 1.1 [17].

Hình 1.1: Sự chuyển hóa các dạng asen trong môi trường
b) Độc tính và cơ chế gây độc của Asen.
Độc tính của Asen
Độc tính của các hợp chất As → arsenat → Arsenit → đối với sinh vật dưới
nước tăng dần theo dãy Asen hợp chất As hữu cơ. Trong môi trường sinh thái, các dạng
hợp chất As hóa trị (III) có độc tính cao hơn dạng hóa trị (V). Môi trường khử là điều kiện
thuận lợi để cho nhiều hợp chất As hóa trị V chuyển sang As hóa trị III.
Trong những hợp chất As thì H3AsO3 độc hơn H3AsO4. Dưới tác dụng của các yếu
tố oxi hóa trong đất thì H3AsO3 có thể chuyển thành dạng H3AsO4. Thế oxy hóa
khử, độ pH của môi trường và lượng kaloit giàu Fe3+…, là những yếu tố quan trọng
tác động đến quá trình oxy hóa - khử các hợp chất asen trong tự nhiên. Những yếu tố
này có ý nghĩa làm tăng hay giảm sự độc hại của các hợp chất asen trong môi trường
sống.
As tự do cũng như hợp chất của nó rất độc. Trong hợp chất thì hợp chất của
As(III) là độc nhất. Tổ chức Y tế thế giới (WHO) đã xếp asen vào nhóm độc loại A gồm:
Hg, Pb, Se, Cd, As. Con người có thể bị phơi nhiễm asen qua hít thở không khí, hấp thu
thức ăn và qua nước uống. Một lượng nhỏ asen trong nước có thể đe
7


dọa đến sức khỏe con người bởi vì phần lớn các hợp chất asen trong nước uống đều
ở dạng vô cơ rất độc [20]. Trong cơ thể người, cũng như hầu hết động vật có vú, asen
vô cơ bị methyl hóa tạo thành acid monomethylarsonic và dimethylarsinic bởi phản ứng
khử luôn phiên asen từ hóa trị V thành hóa trị III và gắn thêm một nhóm methyl.
Asen còn được biết là hợp chất có khả năng tạo nên các superoxide, một hợp chất
có tính oxi hóa mạnh. Nếu một lượng lớn superoxide được tạo ra trong tế bào tuyến tụy,
thì quá trình tiết insuline sẽ bị ảnh hưởng.
Đối với màng tế bào, có một vài báo cáo chỉ ra rằng các hợp chất asen gây ảnh
hưởng đến cấu trúc và chức năng của màng, đặc biệt là đối với màng tế bào hồng cầu.

Người bị nhiễm độc asen thường có tỷ lệ bị đột biến nhiễm sắc thể rất cao. Ngoài việc
gây nhiễm độc cấp tính asen còn gây độc mãn tính do tích luỹ trong gan với các mức độ
khác nhau và Asen có thể gây 19 loại bệnh khác nhau, trong đó có các bệnh nan y như
ung thư da, phổi. Sự nhiễm độc asen được gọi là arsenicosis. Đó là một tai họa môi
trường đối với sức khỏe con người. Những biểu hiện của bệnh nhiễm độc asen là chứng
sạm da (melanosis), dày biểu bì (kerarosis), từ đó dẫn đến hoại thư hay ung thư da,
viêm răng, khớp... Hiện tại trên thế giới chưa có phương pháp hữu hiệu chữa bệnh
nhiễm độc asen.
Cơ chế gây độc Asen
Asen xâm nhập vào cơ thể thông qua quá trình hô hấp và thông qua đường
tiêu hoá, khi hấp thụ vào cơ thể asen tích tụ trong gan, thận, tim và phổi. Một lượng nhỏ
asen cũng được tìm thấy trong các cơ và các mô thần kinh [26]. Sự tích tụ asen trên các
mô thần kinh này gây ra nhiều căn bệnh khác nhau như: ung thư, tiểu đường, nhiễm độc
gan, nhiễm độc thần kinh, rối loạn chức năng tim. Quá trình trao đổi chất với asen là rất
quan trọng, giúp asen phát huy được khả năng gây độc của nó thông qua việc ức chế
khoảng 200 enzym tham gia vào quá trình tái tạo năng lượng cho tế bào, quá trình sửa
chữa và tổng hợp AND và nó cản trở quá trình tổng hợp ATP (Hình 1.2). Khi bị nhiễm
độc asen cấp tính thường có các biểu hiện buồn nôn, nôn, đau bụng, và tiêu chảy nặng
[40].
8


Khi bị nhiễm độc asen mạn tính thường gây ra các bệnh như: xơ vữa động
mạch, cao huyết áp, bệnh tim mạch, thiếu máu cục bộ, bệnh tiểu đường, nhiễm độc gan,
thận, ung thư da, bàng quang, và phổi [14, 15, 23, 24, 33, 39]. Hình 1.3 biểu diễn quá
trình nhiễm độc asen mạn tính và các biểu hiện thường gặp.
Tuy nhiên, không phải tất cả hàm lượng asen hấp thụ vào cơ thể người đều có
thể tích lũy và gây bệnh. Khi hấp thụ vào cơ thể, nhờ có quá trình methyl hóa, chuyển
hóa thành các dạng không độc và bài tiết ra ngoài môi trường thông qua đường nước
tiểu. Hình 1.4 biểu diễn quá trình hấp thu và trao đổi chất trong cơ thể người, Hình 1.5

biểu diễn các quá trình xảy ra trong quá trình trao đổi chất.

Hình 1.2: Nhiễm độc asen gây cản trở tổng hợp ATP
9


Hình 1.3. Tiến trình phát triển của nhiễm độc mãn tính Asen (Nguồn : UNICEF)

Hình 1.4: Quá trình hấp thu và trao đổi chất trong cơ thể [31]

Hình 1.5: Các quá trình xảy ra [25].
Ghi chú:
GSH: glutathione; GST - omega: glutathione S-transferase omega;
SAHC: S-adenosylhomocysteine; SAM: S-adenosylmethionine
10


1.3. Các phương pháp phân tích dạng asen.
Hiện nay có rất nhiều phương pháp xác định dạng asen trong mẫu môi
trường, nước tiểu cũng như các đối tượng mẫu khác, nhưng hầu như các phương pháp
này đều trải qua 2 quá trình chính: quá trình tách các dạng asen có trong mẫu và quá
trình định lượng từng dạng asen đã tách được trên các thiết bị phân tích phù hợp. Hiện
nay cột sắc kí được sử dụng phổ biến để tách các dạng asen trong nước tiểu cũng như
trong các dung dịch mẫu khác. Trong bảng 1.1 giới thiệu một số loại cột tách và các
phương pháp phân tích dạng asen đang được sử dụng rộng rãi.
Bảng 1.1: Các loại cột sắc kí hay dùng
Tài
Loại cột

Pha động

Phenomenex ODS 3

5mM TBHA,

(150x4.6mm, 3µm)

4mM axit malonic,

Tốc độ

Phương

dòng

pháp xác

(ml/ph)

định

1 ,5

Các dạng asen

liệu

được xác định

tham

khảo

HG-AFS

As[III], As[V],

27

MMA[V], DMA[V]

5% methanol, pH 5.9
5mM TBHA, 4mM axit

Cột trao đổi aion

As[III], As[V],

malonic, 5% methanol,

MMA[V], DMA[V],

p H 5 .8 5

MMA[III]

5mM TBHA,

Hamilton PRP X100

1 ,2

1 ,2

As[III], As[V],

3mM axit malonic, 5%

MMA[V], MA[V],

methanol, pH 5.85

MMA[III], MA[III]

Gradient

1 ,0

elution

1 ,5

hoặc

ICP-MS

(250x4.1mm) 10µm

29

28

AsB, AsC,As[III],

13, 45,

AsV, MMA[V],

48

DMA[V]

Shodex Asahipak

15mM axit citric và điều

1 ,0

AsB, AsC,As[III],

ES‐502N 7C

chỉnh pH 1.0 bằng axit

As[V], MMA[V],

Cột trao đổi aion

HNO310%

DMA[V], MA[III],

(100x7.6mm)

35

DMA[III]

Shodex Asahipak

36mM axit formic

0 ,8

AsB, As[III], As[V]

NN‐614 Cột trao đổi

2mM ammoniumformate

MMA[V], DMA[V]

caion (150x6.0mm)

p H 2 .8

MMA[III],DMA[III]

Hamilton PRP1

0.5 mM

LC

resinbased,

tetrabutylammonium

ICP-MS

Cột pha đảo,

phosphate, đệm 4 mM

-

AsB, AsC,As[III],
As[V], MMA[V],
DMA[V]

11

43

46


250_4.6 mm.

Na2HPO4 và điều chỉnh
pH đến 9 bằng dung dịch

ammonia.

Phenomenex

Various ion pairing

LC

µBondclone

reagents and

ICP-MS

Cột pha đảo C18,

mobilephase

300_3.9mm hoặc cột

compositions evaluated

-

AsB, AsC,As[III],

30

As[V], MMA[V],
DMA[V]

Waters
Bondpack C18
300mm_3.9mm
Reversed-phase

0.1% axit trifluoroacetic

15-40

LC

micro-

và 5-10% methanol

ml/phút

ICP-MS

HPLC used. Isco

trong nước. TBHA (1-

Spherisorb 3 µm C18

5mM) cặp thuốc thử trao

material, 150_1mm

đổi ion i.d.

Cột trao đổi aion

2mM TBHA, 10mM

Dionex

ammonium carbonate

-

Dạng asen trong phụ

37

gia thức ăn chăn
nuôi

1 ,5

HPLC-

AsB, As[III],

ICPMS

As[V], MMA[V],

IonPac AS14 4mm

32

DMA[V]

Cột trao đổi aion

80% NaH2PO4, 20%

Waters

Na2HPO4, pH 6

0 ,5

IC-PAK (75_4.6 mm)

HPLC-

AsB, AsC,As[III],

ICPMS

As[V], MMA[V],

12

DMA[V]

Trong phân tích định dạng asen, ngoài việc tách được các dạng asen thì đòi

hỏi phải có một phương pháp phân tích phù hợp, phải có một detector đủ nhậy để nhận
biết được hàm lượng nhỏ asen. Có rất nhiều phương pháp có thể xác định được asen
nhưng để có đủ độ nhạy để áp dụng phân tích dạng asen thì chỉ có một số detctor đáp ứng
được độ nhạy như: ICP - MS, HG - AFS, AES và AAS. Trong số những phương pháp
này thì phương pháp ICP-MS là phù hợp nhất, nó có thể ghép nối trực tiếp với cột sắc kí
và có khả năng phát hiện hàm lượng asen ở mức ppt. Tuy nhiên phương pháp này đòi hỏi
phải đầu tư trang thiết bị và chi phí vận hành khá đắt tiền, người vận hành cũng phải có
kinh nghiệm và trình độ nhất định.
1.3.1. Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao ghép nối hệ hydrua quang phổ
huỳnh quang nguyên tử (HPLC-UV-HG-AFS).
Hệ thống LC bao gồm một bơm (DIONEX P580) 4 cổng với một hệ thống
12


loại bỏ khí trực tiếp và một bơm Reodyne sáu cổng với vòng loop 100 µl, cột sắc kí
loại DIONEX AS7 (250mm × 4 mm) có cột bảo vệ là DIONEX AG7. (hình 1.6)
Các dung dịch oxihoa được bơm bằng bơm nhu động (Gilson Minipuls 2)
với tốc độ bơm 0,5 ml/phút và được đấu nối vào cổng T ở đầu ra cột sắc kí.
Phản ứng quang hóa xảy ra trong đoạn ống PTFE được quấn quanh đèn Philips
TUV-15 (253,7 nm, 15W, dài 44 cm). Chiều dài và đường kính trong của bóng đèn
được chọn sau khi quá trình tối ưu vì thời gian chiếu xạ trực tiếp phụ thuộc vào kích
thước hình học của ống dây[42].
Dung dịch HCl và NaBH4 sử dụng cho quá trình hydrua hóa asen được bơm
vào bằng bơm nhu động Labcraft qua các cổng chữ T ở tốc độ 0,3 ml/phút. Hơi asin
được dẫn sang detector huỳnh quang nguyên tử bằng dòng khí Ar [47].
Một trong những ưu điểm của phương pháp này là độ nhạy cao, tuy nhiên giới
hạn phát hiện phân tử đơn đạt được với kĩ thuật huỳnh quang phân tử thì không khả thi
với huỳnh quang nguyên tử truyền thống trên mẫu lỏng. Điểm hạn chế của phương
pháp là ánh sáng đơn sắc và hiệu ứng nền là nguyên nhân chính gây hiệu ứng nhiễu
xuất hiện khi phân tích mẫu thực. Tuy nhiên ảnh hưởng của thành phần nền được loại

bỏ bằng cách tách khí asin do đó độ nhạy của detector AFS được tăng lên đáng kể [21].

Hình 1.6: Hệ ghép nối HPLC-UV-HG-AFS
1.3.2. Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao ghép nối với hệ quang phổ hấp thụ
nguyên tử sử dụng kĩ thuật hydrua hóa (HPLC-HG-AAS).
Phương pháp này cho phép xác định được các dạng asen độc như As(III), As
(V), MMA và DMA trong nước tiểu. Tuy nhiên phương pháp này không xác định được
asenobetain và arsenocholine không xác định được bằng phương pháp này vì
13


hai chất này không bị hydrua hóa bởi hydro nguyên tử [11, 30].
Nguyên tắc của phương pháp: các dạng asen được tách trên cột trao đổi ion của
thiết bị HPLC sau đó được dẫn trực tiếp vào bộ hydrua hóa của thiết bị AAS. Ở
đây asen được chuyển thành hơi asin bởi NaBH4 trong môi trường axit HCL. Hơi
asin tiếp tục được dẫn sang bộ nguyên tử hóa mẫu bằng khí Ar, hơi asin được
nguyên tử hóa tạo thành những đám hơi nguyên tử tự do. Một chùm ánh sáng đơn sắc
chiếu qua đám hơi nguyên tử tự do này, tiến hành đo cường độ dòng của chùm
sáng chiếu qua ta thu được phổ hấp thụ của nguyên tố [11, 30]. (hình 1.7)
Giới hạn phát hiện của phương pháp: As(III) 0,9 µg/L; DMA 2,3 µg/L; MMA
1,4 µg/L và As(V) 2,0 µg/L.

Hình 1.7: Sơ đồ ghép nối hệ HPLC - HG - AAS
1.3.3. Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao ghép nối với cảm ứng cao tần và
quang phổ phát xạ nguyên tử (HPLC - ICP - AES).
Phương pháp này dựa trên khả năng tách các dạng asen của cột sắc kí lỏng
LC được ghép nối với hệ thống hydrua hóa và detetector phát xạ nguyên tử sử dụng dòng
cảm ứng cao tần để nguyên tử hóa mẫu. Bốn dạng asen trong nước tiểu bao gồm:
arsenite As (III), arsenate As (V), monomethylarsonate (MMA), và dimethylarsinate
(DMA) được tách trên cột không phân cực C18 mà không cần phải xử lý mẫu rồi sau đó

phân tích bằng hệ HG-ICP-AES [8].
Nguyên tắc của sự kết nối giữa HPLC-HG- ICP-AES được biểu diễn trên hình
1.8.
14


Hình 1.8: Sơ đồ ghép nối giữa HPLC-HG ICP-AES
Các dạng asen sau khi được tách trên thiế bị HPLC được dẫn vào hệ thống
hydrua hóa bằng một bơm nhu động. Tại vòng phản ứng các dạng asen được hydro
mới sinh do phản ứng giữa NaBH4 và HCl khử thành hơi asin và hơi này được dòng
khí Ar cuốn sang ngọn lửa plasma. Ở đây hơi asin được nguyên tử hóa thành đám
hơi nguyên tử tự do và bị kích thích lên mức năng lượng cao hơn. Khi trở về mức năng
lượng bền chúng phát ra những bức xạ đặc trưng của mỗi nguyên tố và tạo thành phổ
phát xạ nguyên tử [8].
1.3.4. Kỹ thuật sử dụng- phương pháp kết hợp HPLC-ICP/MS.
Nguyên tắc của phương pháp: các dạng asen hữu cơ và vô cơ được tách ra
khỏi nhau trên các cột sắc kí tương ứng theo pha động bằng hệ thống HPLC và từng
dạng asen được nguyên tử hóa, ion hóa bằng dòng cảm ứng cao tần sau đó được xác
định bằng detector khối phổ.
+ Hệ thống HPLC:
Bổ sung cho các kĩ thuật phân tích hiện đại, hệ thống HPLC được biết đến
như một phương pháp có giá thành hợp lí, sẵn có trong các phòng thí nghiệm. Các loại
đối tượng ứng dụng kĩ thuật này khá đa dạng, các nghiên cứu ghi nhận các loại mẫu sau
đã được phân tích: nước biển, nước mưa, nước ngầm, nước bề mặt, bùn thải, trầm tích,
các hạt trong không khí, dung dịch phân bón và máu tổng.
Nguyên tắc hoạt động của phương pháp gồm bốn bước: Dung dịch mẫu cần

15

xác định được bơm vào hệ thống qua van bơm mẫu 6 cổng; bơm cao áp đẩy pha
động liên tục qua cột sắc kí, mẫu được chuyển vào hệ thống nhờ van bơm mẫu vào cột
phân tích; các chất phân tích được tách ra nhờ cột tách và được phát hiện trên các dạng
detector (phổ UV, detector độ dẫn, detector huỳnh quang, v.v…); một thiết bị trung
gian nối detetor với 1 bộ xử lí số liệu, sắc phổ được hiển thị trên màn hình của máy này
[50].

Hình 1.9. Sơ đồ thiết bị sắc kí
+ Lựa chọn cột tách: Có rất nhiều loại cột sắc kí của các hãng trên thị trường có
thể tách được các dạng của Asen (bảng 1.1), với mỗi loại cột khác nhau phải lựa chọn pha
động phù hợp và thời gian tách cũng như thứ tự các Peak được tách ra khỏi hỗn hợp
khác nhau.
- Ưu nhược điểm của phương pháp: Tốc độ cao, độ chọn lọc cao, đo đồng thời
nhiều thành phần trong cùng một mẫu, các thông tin về chất cần phân tích thu được
trong một thời gian ngắn, độ bền cột tách cao. Trong đề tài này nếu sử dụng các loại
detetor của hệ thống HPLC để xác định bốn dạng asen thì không đạt đủ độ nhạy theo
QCVN 01- 2009 BYT là 0,01mg/L.
+ Hệ thống Cảm ứng cao tần ghép nối khối phổ (ICP-MS)
ICP là nguồn năng lượng kích thích phổ có nhiệt độ cao và ổn định hơn so với
các loại nguồn kích thích khác, được phối hợp với các máy đo phổ nhằm nâng cao hiệu
quả phân tích. Hai phương pháp phân tích ICP phổ biến hiện nay là ICP16


AES và ICP-MS. Hai kĩ thuật này có ưu điểm vượt trội so với các phương pháp
khác nhờ có nguồn plasma có thể tạo nhiệt độ từ 5000 - 10000oC, so với 3000oC ở
phương pháp hấp thụ nguyên tử, ngọn lửa N2O + C2H2. Nhiệt lượng lớn như vậy
đảm bảo sự hóa hơi và phân li hoàn toàn của mẫu phân tích. Đây cũng là nguồn
năng lượng kích thích phổ phát xạ đảm bảo cho quá trình phân tích có độ nhạy rất cao, có
thể đạt n.10-4 đến 10-6 (0,1 - 5 ng/mL) đối với hầu hết các nguyên tố. Không những thế,
nó còn có độ ổn định cao, cho sai số nhỏ (< 10% trong vùng nồng độ n.10-3 đến n.10-5).

1.3.5. Phương pháp điện di mao quản CE-UV.
Nguyên tắc của sự tách: là dựa trên cơ sở tính chất điện di (sự di chuyển Linh động) của các phần tử chất tan (các ion chất tan, chất phân tích) trong mao
quản (đường kính 25 - 100 m ID) trên nền của dung dịch chất điện giải và có chất
đệm pH thích hợp, dưới tác dụng của một từ trường điện E nhất định được cung cấp
bởi một nguồn thế cao một chiều (V: 15 - 40 kV) đặt vào hai đầu mao quản. Nghĩa là
CEC là kỹ thuật tách được thực hiện trong mao quản nhờ lực từ trường điện E điều
khiển sự tách của các chất. Việc dùng cột mao quản có nhiều ưu việt, như tốn ít
mẫu và các hoá chất khác phục vụ cho sự tách, nhưng số đĩa hiệu dụng Nef lớn, sự
tách các chất xẩy ra nhanh và hiệu quả cao. [3, 4]
Cơ chế điện di: Sự điện di của các phần tử chất tan (các ion) trong ống mao quản
là cơ chế di chuyển khác nhau của chất tan (chất phân tích), dưới tác dụng của lực điện
trường E nhất định (Electric Field Force: EFF) và tính chất (đặc trưng) của dòng điện di
thẩm thấu (Electro-Osmotic Flow: EOF), trong sự phụ thuộc vào điện tích và kích thước
của chúng. (Trong đó dòng EOF gọi là dòng điện di thẩm thấu,
hay dòng điện thẩm) [3, 4]
Cấu tạo của một hệ điện di mao quản: (hình 1.10)
Mao quản tách: thường làm bằng vật liệu silic (gọi là mao quản silica, là loại
mao quản phổ biến nhất), teflon, PEEK, với đường kính ngoài (OD) 365 µm, đường
kính trong (ID) từ 10 đến 150 µm (phổ biến nhất là 50 µm). Tổng chiều dài mao quản có thể
từ 10 đến 100 cm (thường là 60 cm). Chiều dài hiệu dụng (là chiều
17


dài tính từ đầu bơm mẫu của mao quản đến vị trí đặt detector) thường dao động từ
25 - 50 cm đối với mao quản dài 60 cm. Trong quá trình điện di, mao quản được nạp
đầy dung dịch đệm điện di.
Dung dịch đệm điện di: dùng để tạo môi trường cho quá trình điện di xảy ra khi áp
thế cao vào hai đầu mao quản. Trong quá trình điện di, hai đầu mao quản được được đặt
trong hai bình chứa dung dịch đệm điện di. Lưu ý: Hai lọ đựng dung dịch đệm tại hai đầu
mao quản phải ở độ cao ngang bằng nhau.

Nguồn điện thế cao: thường dao động từ 5 đến 30 kV, dùng để áp vào hai đầu
mao quản nhằm sinh ra điện trường lớn cho quá trình điện di xảy ra. Để phân tích các
cation thì cực áp cực dương vào đầu bơm mẫu của mao quản và ngược lại để phân tích
các anion thì áp cực âm vào đầu bơm mẫu của mao quản.
Detector (cảm biến): bộ phận phát hiện và ghi nhận tín hiệu của chất phân tích
sau quá trình phân tách điện di mao quản, do đó thường được đặt ở phần cuối (gần cuối
hoặc cuối) của mao quản tuỳ theo loại cảm biến. Các loại cảm biến thông dụng trong
phương pháp CE bao gồm: hấp thụ phân tử (UV-Vis), huỳnh quang
phân tử, phát xạ hoặc hấp thụ nguyên tử, khối phổ, đo dòng, đo thế và đo độ dẫn.
Bộ phận điều khiển: thường là máy tính sử dụng phần mềm chuyên dụng phù hợp,
để ghi nhận, hiển thị và xử lý kết quả phân tích. Hiện nay, bộ phận này còn có thể thực
hiện chức năng điều khiển tự động hoá quá trình phân tích từ khâu bơm
mẫu đến khâu cho ra kết quả cuối cùng của quá trình phân tích điện di mao quản.

Hình 1.10: Cấu tạo hệ điện di mao quản
18


Kết luận chương 1
Chương 1 trình bày tổng quan giới thiệu các dạng tồn tại của asen trong một
số đối tượng mẫu, trong một số môi trường, đặc biệt là mẫu nước tiểu. trong chương này
cũng đã giới thiêu được độc tính và cơ chế gây độc của asen. Các dạng chuyển hóa của
asen trong môi trường, sự chuyển hóa và trao đổi chất trong cơ thể. Sự ức chế trong quá
trình tổng hợp ATP của tế bào và các biểu hiện thường gặp khi bị nhiễm độc asen.
Trong chương này chúng tôi cũng đã giới thiệu về các phương pháp tách các
dạng asen, các loại cột và pha động thường dùng trong HPLC để tách các dạng asen.
Đặc biệt chúng tôi đã giới thiệu được một số phương pháp hiện đại cho phép xác định
đồng thời các dạng asen trong mẫu nước tiểu, mẫu môi trường, các phương pháp này đều
có độ nhạy cao, độ lặp tốt và cho kết quả ổn định.

19