XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH AMYLASE THEO WOHGEMUTH KHẢO sát các yếu tố ẢNH HƯỞNG đến HOẠT TÍNH AMYLASE

BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HÓA SINH
Bài số: 9
TỂN BÀI: XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH AMYLASE THEO
WOHGEMUTH & KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH
HƯỞNG ĐẾN HOẠT TÍNH AMYLASE
I.

XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH AMYLASE
1. Nguyên tắc
- Enzym Amylase là enzym thủy phân tinh bột. Nó phân cắt
amilose và amilopectin của tinh bột thành các dextrin và các
loại đường maltose, glucose…
- Phương pháp Wohgemuth dựa vào việc tìm nồng độ enzym
thấp nhất để thủy phân tinh bột đến các sản phẩm không
màu với Iod.
- Đơn vị Wohgemuth là lượng enzym cần thiết để thủy phân
1mg tinh bột sau 30 phút ở 370C có Cl- làm chất hóa.
2. Tiến hành
- Chuẩn bị chiết Amylase
- Chuẩn bị 10 ống nghiệm

Thứ tự
ống
nghiệm
Độ pha
loãng
Nồng độ
enzym

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

2

4

8

16

32

64

128

256

512

1024

n/
2

n/
4

n/8

n/1
6

n/3
2

n/6 n/12 n/25 n/51
4
8
6
2

n/10
24

3. Kết quả

Thứ tự
ống
nghiệm
Độ pha
loãng
Nồng
độ
enzym
Màu

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

2

4

8

16

32

64

128

256

512

1024

n/2

n/4

n/8

n/16

n/3
2

n/6
4

n/12 n/25 n/51
8
6
2

n/10
24

Vàn
g

Vàn
g

Vàn
g

Vàn
g

Đỏ

xan

h

xan
h

xanh

xan
h

xan
h


(Từ phải qua trái số thứ tự ống nghiệm lần lượt từ 1 đến 10)

Tính toán kết quả
- Lượng enzym cho vào ống [1]

Trong đó:
V1: thể tích dd amylase cho vào ống nghiệm [1] (1 mL)
V2: thể tích dd amylase tổng (100 mL)
m: lượng mẫu cân vật phẩm (malt) chứa enzym [mg] ( 9,8563 g)
- Một đơn vị Wohgemuth (W)

Với F là độ pha loãng của ống nghiệm có nồng độ enzym nhỏ
nhất thủy phân hoàn toàn tinh bột (ống nghiệm đã chọn từ bảng
kết quả là ống số 4 nên độ pha loãng là 16)
- Số đơn vị Wohgemuth có trong 1 mL dịch chiết enzym (N w)

4. Bàn luận
- Ống nghiệm có nồng độ enzyme nhỏ nhất xảy ra thủy phân

-

II.

hoàn toàn tinh bột là ống nghiệm số 4. Vì dd chuyển từ màu
vàng sang đỏ và sắp chuyển dần sang màu xanh khi gặp
I2/KI
Vai trò của NaCl là có gốc Cl- làm chất hoạt hóa enzyme.
Thí nghiệm dễ bị sai xót do hóa chất có thể bị hỏng hoặc
trong quá trình lọc lấy enzym không lọc được dd trong mà
còn cặn.

KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HOẠT TÍNH AMYLASE
1. Ảnh hưởng của nhiệt độ


a. Nguyên tắc
- Nhiệt độ là tá nhân vật lý ảnh hưởng đến vận tốc hóa học

cũng như phản ứng của enzym. Đa số enzym có nhiệt độ tối
thích (Topt) khoảng 40-500C, ở nhiệt độ này vận tốc phản ứng
rất lớn, một số enzym có Topt khoảng 50-600C. Khi nhiệt độ
trên 800C hấu hết các enzym đều bị biến tính không thuận
nghịch
b. Tiến hành
STT
Dd

Nhiệt độ
ống
Amyla
cần đạt
nghiệ
se
được
m
1
2 mL
1
1 mL
900C
2
2 mL
2
1 mL
650C
3
2 mL
3
1 mL T0 phòng
4
2 mL
4
1 mL
00C
Giải thích hiện tượng và tìm Topt trong các nhiệt

STT ống

nghiệm

Tinh
bột 1%

Thời
gian ủ

Dd
I2/KI

5 phút
5 phút
5 phút
5 phút
độ khảo

3 giọt
3 giọt
3 giọt
3 giọt
sát

c. Kết quả
-

-

-

Ống 1: ở 90oC, vì nhiệt độ quá cao amylase bị biến tính không
thuận nghịch nên không thể thủy phân tinh bột, màu tím là
màu của Iot
Ống 2: ở 65oC, dd có màu vàng nâu đã xảy ra phản ứng thủy
phân tinh bột, tuy nhiên vẫn chưa phải là nhiệt độ tương thích
để phản ứng xảy ra hoàn toàn.
Ống 3: ở nhiệt độ phòng, dd có màu xanh tím nhạt hơn của
ống 1
Ống 4: ở 0oC dd ban đầu có màu tím đậm nhưng nhạt dần khi ở
môi trường nhiệt độ phòng

(Từ phải qua trái số thứ tự ống nghiệm lần lượt là 1234)
d. Bàn luận
-

Ống 2 nhiệt độ 65oC tương đối là thích hợp để phản ứng được
xảy ra ổn định. Đa số enzym có nhiệt độ tối thích (T opt) khoảng
50-600C


2. Ảnh hưởng của pH
a. Nguyên tắc
- Hoạt tính của enzym phụ thuộc rất nhiều vào pH môi trường,

khi giảm hay tăng pH đều dẫn đến giảm hoạt tính của
enzym, pH thích hợp nhất cho hoạt động của enzym là pH
tối thích (pHopt). Mỗi enzym có 1 pH tối thích, ngoài vùng pH
tối thích hoạt động của enzym giảm.

b. Tiến hành

STT

Na2HPO
4 0,2M
(mL)

1

1,34

2

1,54

3

1,74

4

1,94
Giải thích

Acid
nitric
0,1M
(mL)

pH

đạt
được

Amyla
se
(mL)

Tinh
bột
1%
(mL)

Thời
gian
ủ

5
phút
Lắc
đều
5
0,46
6,6
0,5
2,0
phút
5
0,26
7,2
0,5

2,0
phút
5
0,06
8,0
0,5
2,0
phút
hiện tượng và tìm pHopt trong các pH khảo sát
0,66

5,6

0,5

2,0

Dd
I2/KI
3
giọt
3
giọt
3
giọt
3
giọt

c. Kết quả
- Ống 124 dường như không xảy ra hiện tượng vì pH không

-

thích hợp cho hoạt động của enzyme
Ống 3 dd nhạt hơn những ống nghiệm còn lại chính là pH tối
thích (7,2) cho hoạt động của enzyme.


(Từ trái qua phải số thứ tự ống nghiệm lần lượt là 1234)
d. Bàn luận
- Tuy nhiên, do ảnh hưởng nồng độ hoặc do enzyme hoạt

động không tốt làm ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm.
Chính xác hơn thì pH đạt được nằm trong khoảng từ 5,6-6,6
3. Ảnh hưởng của chất hoạt hóa và chất kìm hãm
a. Nguyên tắc
- Chất hoạt hóa là các chất có vai trò làm tăng hoạt độ xúc

tác của enzym, mạnh nhất là các ion, các anion Cl-, Br-,I- làm
tăng hoạt độ α amylase, các ion kim loại như Mn 2+, Zn2+… lại
thúc đẩy hoạt độ của protease. Chất kìm hãm là chất làm
giảm tốc độ phản ứng của enzym. Chúng có thể là những
ion, các phân tử hữu cơ, protein…

b. Tiến hành

Nước
NaCl
CuSO4
Tinh
Amyla

cất
1%
1%
bột 1%
se
(mL)
(mL)
(mL)
(mL)
(mL)
1,0
0,0
0,0
2,0
0,2
0,6
0,4
0,0
2,0
0,2
0,6
0,0
0,4
2,0
0,2
Giải thích hiện tượng và đánh giá ảnh hưởng

STT
1
2

3

Thời
gian

Dd
I2/KI

5 phút 3 giọt
5 phút 3 giọt
5 phút 3 giọt
của các dd muối

c. Kết quả
- Ống 1: dd có màu xanh dùng làm mẫu để so sánh màu về
-

chất hoạt hóa và chất kìm hãm.
Ống 2: dd màu xanh nhưng dạt dần do gốc Cl- làm tăng hoạt
hóa của enzyme.


-

Ống 3: dd màu xanh đậm và đặc hơn so với ống 2 vì có ion
kim loại Cu2+ kìm hãm làm giảm tốc độ phản ứng của
enzyme.

(Từ phải qua trái số thứ tự ống nghiệm lần lượt là 123)
d. Bàn luận

Anion Cl- làm tăng hoạt độ của α amylase
- Ion Cu2+ thúc đẩy hoạt độ của protease kìm hãm làm giảm

tốc độ phản ứng enzyme.