Định lượng vitamin B12 bằng sắc ký lỏng cao áp

Học phần: PPPT trong CNSH

GVHD: PGS.TS Quản Lê Hà

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
VIỆN CN SINH HỌC & CN THỰC PHẨM
BỘ MÔN: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
*******************

TIỂU LUẬN MÔN HỌC
ĐỀ TÀI: Định lượng vitamin B12 bằng sắc ký lỏng cao áp
Sinh viên thực hiện.
Họ và tên: Trần Quang Đôn

MSSV: 20141060

Lớp: KTSH 01-K59

Giảng viên hướng dẫn: PGS.TS Quản Lê Hà.
Hà Nội, 1 tháng 05 năm 2017.

1

SVTH: Trần Quang Đôn

MSSV: 20141060


Hc phn: PPPT trong CNSH

GVHD: PGS.TS Qun Lờ H

Mở đầu:
Vitamin là một nhóm chất hữu cơ có phân tử lợng tơng đối lớn và có bản
chất lý, hoá học khác nhau. Nhóm chất hữu cơ này đặc biệt cần thiết cho hoạt
động sống bình thờng của các cơ thể sinh vật dị dỡng.Trong cơ thể, Vitamin đảm
nhiệm vai trò nh những chất xúc tác. Vitamin là những chất mà cơ thể con ngời
không thể tổng hợp đợc. Phần lớn phải đa từ ngoài vào trong bằng con đờng ăn,
uống. Vitamin có tác dụng lợng nhỏ, đóng vai trò rất quan trọng trong đời sống
của con ngời, là những chất xúc tác không thể thiếu đợc trong chuyển hoá các
chất. Nhu cầu Vitamin hàng ngày của cơ thể rất ít, nhng nếu thiếu sẽ gây ra những
rối loạn trầm trọng, sinh bệnh và nếu kéo dài có thể chết.
Cho đến nay ngời ta đã tách ra đợc khoảng 30 loại chất thuộc nhóm
Vitamin, đa số đã đợc xác định đầy đủ cả cấu trúc hoá học cũng nh tính chất lý
hoá học và sinh lý học.
Nguyên nhân thiếu Vitamin thờng do thành phần thức ăn không đầy đủ
hoặc cơ thể mắc bệnh, không chuyển hoá đợc qua thức ăn. Khi đó phải bù đắp
Vitamin cho cơ thể bằng các con đờng dẫn thuốc thích hợp nh: uống, tiêm, truyền.
Cơ thể con ngời thờng thiếu nhiều Vitamin một lúc, nên điều trị cần phối hợp
nhiều Vitamin. Trừ A, D, E dùng liều cao và dài ngày có thể gây bệnh còn các
Vitamin nếu thừa, cơ thể sẽ tự đào thải qua mồ hôi, nớc tiểu. Về cảnh giác thuốc,
vẫn cần lu ý dùng đúng liều chỉ định và đờng dùng cho mồi Vitamin, nhiều khi có
tác dụng không mong muốn (nh Vitamin PP, C, B1).
Chính vì việc dùng Vitamin là rất cẩn trọng nên chúng ta phải hết sức chú ý
khi dùng thuốc. ở tiu lun ny em định lợng Vitamin B12 trong mu thuc viờn
3B trờn th trng kim chng nng ghi nhón
Nhiệm vụ của đề tài:
Nghiên cứu các điều kiện Sắc kí khi Vitamin B12 tồn tại trong hỗn hợp
áp dụng các điều kiện đã chọn để định lợng trong viên nén Vitamin 3B

2

SVTH: Trn Quang ụn

MSSV: 20141060


Hc phn: PPPT trong CNSH

GVHD: PGS.TS Qun Lờ H

Phần I. Tổng quan
I. Vitamin B12
I.1. Nguồn gốc
- Vitamin B12 là loại Vitamin hầu nh độc nhất đợc tổng hợp bởi các sinh vật.
- Thực vật chỉ chứa rất ít Vitamin B12, Vitamin B12 chỉ phát hiện thấy một
lợng nhỏ ở hạt cũng là nguồn vi sinh vật phát triển trên bề mặt của hạt.
- ở một số loài tảo cũng có Vitamin B12 do các vi sinh vật cộng sinh tạo ra.
- ở động vật, các vi khuẩn của ruột có khả năng tổng hợp Vitamin B12 và
cung cấp nó cho động vật chủ, vì vậy các sản phẩm động vật thờng giàu Vitamin
B12. Gan, thịt, cá, trứng, sữa là các sản phẩm giàu Vitamin B12.
- Năm 1948 thu đợc Vitamin B12 ở dạng kết tinh từ dịch gan.
I.2. Tính chất
- Công thức nguyên: C63H88CoN14O14P
- Khối lợng phân tử: 1355
- Vitamin B12 đợc dùng làm thuốc ở 2 dạng chính: Cyanocobalamin và
Hyđroxocobalamin. Riêng Hyđroxocobalamin đợc dùng ở 3 dạng muối kết hợp
với axit: axit axetic, axit sufuric, axit clohiđric.
Cấu trúc hoá học của Cyanocobalamin và Hyđroxocobalamin
H2N COCH2 CH2

H

Me

CH2 CONH2

Me

H2 NCOCH2

CH2 CH2 CONH2

CN

Me

H

N
N

Me

Co

N

Me

H

N

N
Me

H
H2 NCOCH2

N

Me

Me
H

Me

CH2 CH2 CONH2

NH2

OO

P

N

H

H

Me

O

H

OH
H
O

H
H

O

CH2OH

3

SVTH: Trn Quang ụn

MSSV: 20141060


Hc phn: PPPT trong CNSH

GVHD: PGS.TS Qun Lờ H
Cyanocobalamin

H2N COCH2 CH2

Me

H

CH2 CONH2

Me

H2 NCOCH2

CH2 CH2 CONH2
o

CN

Me

R

H

N
N

Me

Co

N

Me

H
N

N
Me

H
H2 NCOCH2

N

Me

Me
H

Me

CH2 CH2 CONH2

NH2

O-

O

H

H
OH

O

P

N

H
H

H

O

Me

O

O
H

CH2OH

Hydroxo Cyanocobalamin
H.axetat R là CH3COOH
H. sunfat R là H2SO4

H. cloric R là HCL
- Vitamin B12 tồn tại ở dạng bột kết tinh hoặc tinh thể màu đỏ đậm
- Hoà tan trong nớc và trong etanol 96%, không hoà tan trong axeton và ete.
- Dạng khan rất hút ẩm.
- Vitamin B12 bền trong tối và ở nhiệt độ thờng; ở ngoài ánh sáng nó lại dễ
dàng bị phân huỷ.
Bảng độ hấp thụ quang của các dạng.
1%
Dạng
Cực đại hấp thụ (nm)
Độ hấp thụ riêng ( E1cm
)
Cyanocobalamin
278; 361; 550
ở 361nm: 207
Hyđroxocobalamin axetat
274; 351; 525
ở 351nm: 187
Hyđroxocobalamin sunfat
274; 351; 525
ở 351nm: 188
Hyđroxocobalamin clorit
274; 351; 525
ở 351nm: 190
- Vitamin B12 chuyển vào cơ thể gắn với một hợp chất glucoprotit của dạ
dày để tạo nên một phức hợp dễ hấp thụ cho cơ thể.
- Vai trò của Vitamin B12 đợc nghiên cứu rất nhiều, song vẫn còn những
chi tiết cha rõ.
+ Nhiều dẫn liệu đã chứng minh rằng nó tham gia vào quá trình tổng hợp
protein ở cơ thể.

4

SVTH: Trn Quang ụn

MSSV: 20141060


Hc phn: PPPT trong CNSH

GVHD: PGS.TS Qun Lờ H

+ Vitamin B12 là thành phần của các coenzim, xúc tác cho các quá trình
tổng hợp protein ở trên.
+ Vitamin B12 cũng tham gia vào sự trao đổi các hợp chất chứa một cacbon
và thờng phối hợp, tác dụng với axit folic trong các phản ứng metyl hoá; Ví dụ
trong quá trình tổng hợp metionin từ homo xistin.

S

S

S

+ 2H

(CH2)2

(Vitamin B12)

CHNH2

(CH2)2

(CH2)2

CHNH2

CHNH2

COOH

COOH

HCHO

AX tetra hydro folic

COOH
Homoxistein

Homoxistin
O
S

(CH2)2

C

S

H

CH3

+ 2H
(CH2)2

(Vitamin B12)

CHNH2

CHNH2

COOH

COOH

- Các phản ứng chuyển hoá Metyl hoá khác trong đó có sự tham gia của
Vitamin B12 là phản ứng tổng hợp N-Metyl Nico Tiamit hoặc tổng hợp Creatin,...
- Vitamin B12 còn liên quan tới sự chuyển hoá của các hợp chất Sunfidryl,
nó tham gia vào sự khử các hợp chất Đisunfit thành các hợp chất Sunfidryl do đó
nó duy trì hoạt tính của các Enzim chứa nhóm SH và ảnh hởng tới sự trao đổi
Protein, Gluxit cũng nh Lipit.
- Khi bảo quản các sản phẩm giàu Vitamin B12 nh: sữa, gan, trứng,... ngời
ta nhận thấy, hàm lợng Vitamin B12 trong sản phẩm có thể thay đổi ít nhiều tuỳ

5

SVTH: Trn Quang ụn

MSSV: 20141060


Hc phn: PPPT trong CNSH

GVHD: PGS.TS Qun Lờ H

theo điều kiện xử lý trớc khi bảo quản và trong khi bảo quản. Những dẫn chứng
cho ta biết:
+ Khi tiệt trùng sữa bằng phơng pháp làm nóng trực tiếp (hoặc sục hơi nớc
vào sữa) hoặc gián tiếp (hấp trong các thiết bị vô trùng) sự hao hụt Vitamin B12
thay đổi từ 40 - 20%. Khi quấy sữa cô đặc không thêm đờng ở nhiệt độ thấp, sau 4
năm sẽ mất đi khoảng 35% lợng Vitamin B12.
+ Trứng cũng là sản phẩm rất quan trọng về phơng diện Vitamin nói chung
và Vitamin B12 nói riêng. Trong 7 tháng đầu khi bảo quản trứng, Vitamin B12
khá bền, trứng sau thời gian đó hàm lợng Vitamin B12 sẽ giảm đi rõ rệt và mất đi
tới 32%. Sau 1 năm ở lòng trắng trứng chỉ có ít Vitamin B12.
Do trọng lợng phân tử của Vitamin B12 lớn nên không có sự di chuyển từ
lòng đỏ sang lòng trắng trong quá trình bảo quản.
- Trong kỹ nghệ, ngời ta lợi dụng khả năng sinh tổng hợp Vitamin B12 bởi
hàng loạt vi sinh vật, đặc biệt các loại xạ khuẩn, nấm mốc loại Streptomyces, các
vi khuẩn lên men Propinic để sản xuất Vitamin B12.
* Trong quá trình ủ thức ăn cho gia súc, các vi sinh vật phát triển ở thức ăn
cũng tổng hợp đợc một lợng đáng kể Vitamin B12. Thêm muối Cacbon vào đó
nuôi cấy của chúng hoặc thức ăn ủ kích thích sự tổng hợp Vitamin B12.
- Vitamin B12 có ý nghĩa quan trọng đối với chăn nuôi gia súc. Nó làm
tăng sự hấp thụ thức ăn Protein thực vật, tăng trởng và tích luỹ mỡ. Vitamin B12
cũng làm tăng sinh sản đẻ trứng và nở trứng ở gà mái. Ngoài ra còn có những dẫn
liệu chứng minh rằng tác dụng của Vitamin B12 sẽ tăng lên nhiều nếu phối hợp
thêm vào thức ăn của gia súc một ít chất khoáng sinh Biomixin.

I.3. Công dụng
- ở ngời, thiếu Vitamin B12 sẽ gây rối loạn sản xuất máu ở trong xơng, dẫn
đến thiếu máu nguyên bào khổng lồ (Biermen) do hồng cầu không trởng thành đợc.
- Theo những nghiên cứu mới đây cho thấy:
+ ở những phụ nữ mang thai có hàm lợng Vitamin B12 trong máu thấp, thai
nhi rất dễ tật nứt đốt sống - hiện tợng này gây liệt chân và chậm phát triển trí não
ở trẻ.
+ Uống bổ sung Vitamin B12 là một trong các phơng pháp hữu hiệu để
ngăn ngừa hội chứng Alzheimer (suy giảm trí nhớ) ở ngời cao tuổi.
+ Nghiên cứu của Israel cho thấy phụ nữ thiếu Vitamin B12 có nguy cơ bị
vô sinh hay sẩy thai liên tiếp. Đa số họ đã có thai và sinh con bình thờng sau khi
điều trị bằng Vitamin B12.

6

SVTH: Trn Quang ụn

MSSV: 20141060


Hc phn: PPPT trong CNSH

GVHD: PGS.TS Qun Lờ H

- Vitamin B12 thờng đợc dùng chữa chứng thiếu máu nguyên bào khổng lồ,
rối loạn về thần kinh, viêm đa dây thần kinh (thờng đợc dùng phối hợp với
Vitamin B1, Vitamin B6) nhất là ở ngời nghiện rợu hoặc đái tháo đờng, cũng đợc
dùng cho bệnh nhân suy nhợc.
- Vitamin B12 có tác dụng tốt với nhiều quá trình, nó tham gia gia vào phản
ứng tổng hợp Thymidylate, một thành phần trong phân tử AND, cung cấp nguyên

liệu để tổng hợp AND, góp phần vào quá trình phân chia và trởng thành của tế bào
trong cơ thể.
II. Các phơng pháp định lợng Vitamin B12.
II.1. Vitamin B12 trong thuốc đơn thành phần.
Hoà tan 25,00 mg chế phẩm trong nớc và pha loãng đến 1000,0 ml bằng
dung môi. Đo độ hấp thụ tử ngoại ở bớc sóng cực đại 361 nm đối với Cyano
Cobalamin và 351 nm đối với Hiđroxo Cobalamin, tính kết quả dựa vào độ hấp
thụ riêng (E1%/1cm ).
Phơng pháp này chính xác, áp dụng cho các chế phẩm, tá dợc tan trong nớc
không hấp thụ tử ngoại.
II.2. Vitamin B12 trong thuốc đa thành phần.
II.2.1. Phơng pháp vi sinh vật.
Phơng pháp này dựa vào nguyên tắc: Vitamin B12 làm phát triển nhanh
chóng chủng vi sinh vật Lactobacililus bichmanic trong môi trờng và điều kiện
nuôi cấy thích hợp đã quy định, tiến hành song song với một dãy mẫu chuẩn:
0.01ng đến 0.04 ng Vitamin B12.
Để tính kết quả ngời ta đo độ đục của mẫu thử và mẫu chuẩn so với mẫu
trắng là chủng vi sinh vật đợc nuôi cấy trong cùng môi trờng nuôi cấy không có
Vitamin B12.
Phơng pháp này đợc sử dụng để định lợng Vitamin B12 trong các chế phẩm
có hàm lợng Vitamin B12 rất nhỏ : từ hàng ng đến hàng à g/ viên, ml.
Tuy nhiên chủng vi sinh vật Lactobacililus bichmanic rất hiếm và khó nuôi
cấy. Nên không phải phòng thí nghiệm nào cũng có đợc để thực hiện phơng pháp
này cho nên phơng pháp này rất hạn chế.
II.2.2. Phơng pháp quang phổ khả kiến.
Phơng pháp quang phổ khả kiến có thể dùng để tính hay định lợng Vitamin
B12 trong các chế phẩm dợc.
Phơng pháp này dựa trên nguyên tắc đo quang phổ ở bớc sóng khả kiến
(548 2 nm) song song với chuẩn.
Dung dịch thử đợc chiết trong môi trờng Etanol 95 % và làm sạch để loại

7

SVTH: Trn Quang ụn

MSSV: 20141060


Hc phn: PPPT trong CNSH

GVHD: PGS.TS Qun Lờ H

bớt Vitamin B1 và Vitamin B6. Không làm lạnh hoặc chiết trong môi trờng đệm
Axetat.
Phơng pháp này không có tính chọn lọc do không loại trừ đợc chất màu,
nhất là phẩm màu hồng thờng có trong chế phẩm và vấn còn nhiều Vitamin B1,
B6 trong mẫu thử. Do đó phơng pháp này chỉ áp dụng đợc với các chế phẩm có
hàm lợng Cyano cobanlamin lớn (trên 500 à g/viên.ml) và tá dợc không có chất
màu.
II.2.3. Phơng pháp đo quang phổ tử ngoại.
- Phơng pháp này dựa trên nguyên tắc đo quang phổ ở cực đại vùng tử ngoại
361 1nm, song song với chuẩn.
Dung dịch thử đợc chiết nhiều lần trong hỗn hợp Phenol + Butanol hoặc chỉ
với Butanol trong môi trờng Axit Boric.
- Phơng pháp này có khả năng áp dụng hạn chế vì kiểm nghiệm viên phải
tiếp xúc lâu với dung môi độc và Vitamin B1, B6 vẫn còn ảnh hởng lớn.
Chỉ nên áp dụng với các chế phẩm có hàm lợng Cyano cobanlamin cao (từ
1000 à g/viên,ml).
II.2.4. Phơng pháp sắc kí định lợng Vitamin B12.
Phơng pháp sắc kí là phơng pháp rất căn bản để đạt tới việc định lợng

Vitamin B12 trong các nguyên liệu thiên nhiên, và nh vậy cả phơng pháp sắc kí
lớp mỏng, phơng pháp sắc kí lỏng hiệu suất cao.
II.2.4.1. Sắc kí lớp mỏng.
Trong sắc kí lớp mỏng, quá trình tách hỗn hợp các chất xẩy ra khi cho pha
động chuyển qua pha tĩnh. Chất hấp thụ (pha tĩnh) đợc rải thành lớp mỏng trên
tấm kính hoặc tấm kim loại. Trong quá trình chuyển giao chất hấp thụ, nhờ các
quá trình hấp thụ - giải hấp thụ đợc lặp đi lặp lại và do hệ số phân bố khác nhau
các cấu tử đợc dịch chuyển trên lớp mỏng theo hớng chuyển động, với những tốc
độ khác nhau. Kết quả ta thu đợc một sắc đồ trên lớp mỏng. Sắc kí lớp mỏng đợc
thực hiện theo phơng pháp rửa giải. Có thể tóm tắt nguyên tắc tiến hành nh sau:
+ Rải một lớp chất hấp thụ trên một tấm kính (hoặc tấm kim loại) rồi chấm
một giọt dung dịch các chất phân tích lên gần một đầu mép lớp mỏng (điểm xuất
phát). Sau đó, nhúng kính đã có lớp mỏng (bản mỏng) chất hấp thụ vào dung môi
đến mức dới điểm xuất phát.
+ Do tác dụng của lực mao quản, đun thấm theo lớp mỏng giao điểm xuất
phát. Kết quả là mỗi chất trong hỗn hợp đợc phân chia theo 1 vùng riêng.
Sơ đồ tách bằng sắc kí lớp mỏng.

8

SVTH: Trn Quang ụn

MSSV: 20141060


Hc phn: PPPT trong CNSH

GVHD: PGS.TS Qun Lờ H

B

A

B
A

Điểm xuất phát

a

b

Dung môi

c

II.2.4.2. Phơng pháp sắc kí lỏng hiệu suất cao.
Đợc dùng để tách các Vitamin hoà tan trong nớc.
+ Với Đelecter uv/vis
+ Cột tách: Lichrosorla 18 (5 - 10 à m, 250 x 4 mm)
+ Pha tĩnh (chất nhồi ) Silicagel
+ Dung môi: Meltanol + nớc (35: 65)
+ Tốc độ dòng: 1.5 ml/phút
+ Thể tích tiêm: 20 ml
+ Nồng độ dung dịch tiêm: 1mg/ml
Phơng pháp này có u điểm là xác định nhanh và tốt các Vitamin cùng một
lúc. Hiện nay ngời ta thờng dùng phơng pháp này trong kiểm định dợc phẩm.
II.2.5. Kết luận chọn phơng pháp phân tích Vitamin B12.
Thông qua tổng quan về các phơng pháp xác định Vitamin B12 trong viên
nén Vitamin3B, chúng ta thấy nó khá phong phú. Mỗi phơng pháp có một u nhợc
điểm riêng và khả năng áp dụng khác nhau.

- Phơng pháp vi sinh vật có độ chọn lọc và độ nhạy cao nên áp dụng cho
các mẫu Vitamin 3B có hàm lợng Vitamin B12 rất nhỏ mà các phơng pháp khác
không định lợng đợc.
- Phơng pháp đo quang tử ngoại khả kiến có thể áp dụng khi phòng kiểm
nghiệm không có máy HPLC, với các mẫu Vitamin3B có hàm lợng Vitamin B12
cao nhng đòi hỏi kỹ thuật chiết tách cao để tránh ảnh hởng của Vitamin B1, B6 và
tá dợc chất màu.

9

SVTH: Trn Quang ụn

MSSV: 20141060


Hc phn: PPPT trong CNSH

GVHD: PGS.TS Qun Lờ H

- Phơng pháp HPLC với các chơng trình sắc kí lỏng pha đảo khác nhau
chiếm tỷ lệ lớn trên 80% trong số các tiêu chuẩn cơ sở của thuốc 3B đang l u hành
hiện nay. Phơng pháp HPLC có độ chính xác và tin cậy cao, tiến hành đơn giản,
khả năng áp dụng rộng rãi trên nhiều loại chế phẩm.
Với ý nghĩa này, đề tài này đợc thực hiện bằng phơng pháp sắc kí lỏng hiệu
suất cao. Chúng tôi hy vọng rằng các kết quả thu đợc đáp ứng yêu cầu của phép
phân tích và có độ tin cậy cao.
III. Một số vấn đề khi áp dụng phơng pháp sắc kí lỏng hiệu suất cao để
xác định Vitamin B12 trong viên nén Vitamin 3B.
III.1. Cơ sở lý thuyết của phơng pháp HPLC.
III.1.1. Khái niệm:

Sắc kí lỏng hiệu năng cao là một phơng pháp chia tách trong đó pha động là
chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là một chất mang rắn đã đợc phân chia dới
dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang
đợc biến đổi bằng liên kết hoá học với các nhóm hữu cơ. Quá trình sắc kí lỏng dựa
trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi Ion hay phân loại theo kích cỡ.
III.1.2. Nguyên tắc của quá trình sắc kí trong cột.
- Pha tĩnh là một yếu tố quan trọng quyết định bản chất của quá trình sắc kí
và loại sắc ký.
+ Nếu pha tĩnh là chât hấp phụ thì ta có sắc kí hấp phụ pha thuận hoặc pha
đảo.
+ Nếu pha tĩnh là chât trao đổi Ion thì ta có sắc kí trao đổi Ion.
+ Nếu pha tĩnh là chất lỏng thì ta có sắc kí phân bố hay sắc kí chiết.
+ Nếu pha tĩnh là gen thì ta có sắc kí gen hay sắc kí Rây phân tử.
- Cùng với pha tĩnh, để rữa giải chất phân tích ra khỏi cột, chúng ta cần có
một pha động.
Nh vậy nếu ta nạp mẫu phân tích gồm hỗn hợp chất phân tích A, B, C,... vào
cột tách, kết quả là các chất A, B, C,.. sẽ đợc tách ra khỏi nhau sau khi đi qua cột.
Quyết định hiệu quả của sự tách sắc kí ở đây là tổng của các tơng tác.
III.1.3. Các đặc trng của Pic sắc kí.
Đờng cong rữa giải (tín hiệu phụ thuộc thời gian). Sau một quá trình sắc kí
tách đợc gọi là sắc đồ, nó thờng có các dạng sau:

10

SVTH: Trn Quang ụn

MSSV: 20141060


Hc phn: PPPT trong CNSH

GVHD: PGS.TS Qun Lờ H

Trong đó:
t0: Thời gian chết là thời gian cần thiết để pha động chảy qua hệ thống tách.
tR: Thời gian lu: thời gian cần thiết kể từ khi chất đợc bơm vào cột cho đến
khi đạt đợc nồng độ cực đại của nó, xuất hiện ở thời điểm cuối của hệ thống tách.
tR: thời gian lu thực bằng thời gian lu tR - thời gian chết t0
t : độ lệch chuẩn = độ rộng rữa Pic tại các điểm uốn tơng ứng.
0.5 : độ rộng Pic ở nửa chiều cao = 2.354 t
b : độ rộng đáy Pic

Từ các thông số của các Pic trên đây, nhiều đại lợng đặc trng về lý thuyết đợc đa ra để đánh giá một quá trình sắc kí. Sau đây chúng tôi chỉ đề cập đến những
đại lợng thờng dùng trong thực tế và cách làm thay đổi giá trị các đại lợng có lợi
cho việc phân tích bằng HPLC.
III.1.3.1. Thời gian lu tR
Thời gian lu của một chất là thời gian tính từ lúc bỏ mẫu vào cột đến khi
chất đó ra khỏi cột đạt giá trị cực đại.
Thời gian lu của mỗi chất là hằng định và các chất khác nhau thì thời gian
lu sẽ khác nhau trên cùng một điều kiện HPLC đã chọn. Vì vậy thời gian lu là đại
lợng đặc trng để phát hiện định tính các chất.
Thời gian lu phụ thuộc vào các yếu tố:
+ Bản chất sắc kí của pha tĩnh
+ Bản chất thành phần, tôc độ của pha động
+ Cấu tạo và bản chất phân tích của chât tan.
+ Trong một số trờng hợp còn phụ thuộc và PH của pha động.

11

SVTH: Trn Quang ụn

MSSV: 20141060


Hc phn: PPPT trong CNSH

GVHD: PGS.TS Qun Lờ H

tR = to (dd) (1 + K)
- Trong một phép phân tích nếu tR nhỏ quá thì sự tách kém, còn tR lớn quá
(tR> 20phút) thì Pic bị loãng và độ lặp lại kém, thời gian phân tích dài. Để thay đổi
thời gian lu ta tìm cách thay đổi một hoặc nhiều yếu tố trong các yếu tố phụ thuộc
trên đây.
III.1.3.2. Hệ số dung lợng K
Hệ số dung lợng của một chất cho biết khả năng phân bố của chất đó trong
2 pha cộng với sức chứa của cột, tức là tỷ lệ số giữa lợng chất tan trong pha tĩnh
và lợng chất tan trong pha động ở thời điểm cân bằng.
Hệ số dung lợng K phụ thuộc vào bản chất của chất phân tích, đặc tính của
pha tĩnh và pha động, K thờng đợc tính theo công thức:

K' =

t R t R to t R
=
= 1
to
to
to

Nếu K nhỏ thì tR cũng nhỏ và sự tách kém. K lớn thì Pic bị loãng, độ nhạy

kém. Trong thực tế K từ 1 đến 5 là tối u.
III.1.3.3. Độ chọn lọc
Độ chọn lọc cho biết hiệu quả tách của hệ thống sắc kí, khi hai chất A, B
có KA và KB khác nhau thì mới có khả năng tách , mức đọ tách biểu thị ở độ chon
lọc .

t t
K A'
= ' = RB o
K B t RA to (K > K )
A
B
III.1.3.4. Số đĩa lý thuyết N
Số đĩa lý thuyết là đại lợng biểu thị hiệu năng của cột trong một điều kiện
sắc kí nhất định. Mỗi đĩa lý thuyết trong cột sắc kí nh là một lớp pha tĩnh có chiều
cao là H, tất nhiên lớp này có tính chất động, tức là một khu vực của hệ phân tách
mà trong đó một cân bằng nhiệt động đợc thiết lập giữa nồng độ trung bình của
chất tan trong pha tĩnh và pha động.
Vì vậy với một điều kiện sắc kí xác định thì chiều cao H cùng hằng định
đối với một chất phân tích và số đĩa lý thuyết của cột cũng xác định:
Số đĩa lý thuyết N đợc tính theo công thức:
2

2

2
t
t
tR
N = ữ = 5,54 R ữ = 16 R ữ

ữ

b
0,5

III.1.3.5. Độ phân giải R.

12

SVTH: Trn Quang ụn

MSSV: 20141060


Hc phn: PPPT trong CNSH

GVHD: PGS.TS Qun Lờ H

Độ phân giải là một đại lợng biểu thị độ tách của các chất ra khỏi nhau trên
điều kiện sắc kí đã cho. Độ phân giải của 2 Pic cạnh nhau đợc tính theo công
thức:

R=

2 ( t R 2 tR1 )

b,1 b,2

=

1,177 ( tR 2 tR1 )

0,5.1 0,5.2

Nếu nồng độ ở đáy Pic b,1 và b,2 xấp xỉ bằng nhau thì độ phân giải biểu
thị bằng số lần độ rộng của Pic.
ở độ phân giải R = 0,5, các đỉnh của Pic vẫn có thể thu đợc một cách riêng
biệt. Đối với các Phơng pháp phân tích định lợng ngời ta mong muốn độ phân giải
1,5. Các giá trị của R lớn hơn 1,5 cũng không cần thiết vì thời gian phân tích dài.
Độ phân giải phụ thuộc vào các hằng số K2 (hệ số dung lợng của cấu tử ra
sau), độ chọn lọc và số đĩa lý thuyết N của cột.
R=

N 1 K 2
.
.
4
1 + K2

Nếu R nhỏ thì các Pic cha tách hẳn, việc tính diện tích Pic sẽ không chính
xác, lúc này phải tìm cách tăng R theo 3 cách sau đây:
+ Làm thay đổi K bằng cách thay đổi lực rữa giải của pha động (thay đổi
độ phân cực nếu là RP-HPLC, thay đổi cờng độ nếu là IE-HPLC,...)
+ Làm tăng số đĩa lý thuyết của cột bằng cách dùng cột dài hơn hoặc cột có
kích thớc hạt nhỏ hơn,...
+ Làm tăng độ chọn lọc bằng cách dùng cột khác phù hợp hơn với quá
trình tách, hoặc thay đổi thành phần pha động.
Nếu R lớn quá thì thời gian phân tích sẽ lâu, tốn nhiều pha động, dộ nhạy
sẽ kém, lúc này phải tìm cách làm giảm R bằng cách: ứng dụng quá trình rữa giải
Gradient để cho chất thứ 2 ra nhanh hơn, nếu thiết bị không có khả năng này thì

phải thay đổi thành phần hoặc tỷ lệ pha động.
III.1.3.6. Hệ số không đối xứng T.
Hệ số đối xứng T cho biết mức độ không đối xứng của Pic trên sắc độ thu
đợc. T đợc tính bằng tỷ số độ rộng của 2 nữa Pic tại điểm 1/10 hoặc 1/20 chiều
cao của Pic

13

SVTH: Trn Quang ụn

MSSV: 20141060


Hc phn: PPPT trong CNSH

GVHD: PGS.TS Qun Lờ H

T = b/a
Pic dạng đối xứng hình Gaus trên thực tế khó đạt đợc, vì vậy phải quan tâm
đến hệ số không đối xứng T, khi T 2,5 thì phép định lợng đợc chấp nhận, nếu T
> 2,5 thì điểm cuối của Pic rất khó xác định, vì vậy cần thay đổi các điều kiện sắc
kí để làm cho Pic cân xứng hơn theo các cách sau:
+ Làm giảm thể tích chết, tức là đoạn nối từ cột đến Đetecter.
+ Thay đổi thành phần pha động sao cho khả năng rữa giải tăng lên.
+ Giảm bớt lợng mẫu đa vào cột bằng cách pha loãng mẫu phân tích hoặc
giảm thể tích thân.
III.2. Đánh giá Pic (diện tích, chiều cao) và các phơng pháp định lợng
thờng dùng trong HPLC.
III.2.1. Đánh giá diện tích Pic.
Diện tích Pic của một chất là tơng ứng với lợng chất đó. Để tính diện tích

Pic, hiện nay ngời ta thờng dùng tích phân kế. Phơng pháp này có thể dùng cho
các Pic không bị trôi đờng nền và cả Pic có đờng nền bị trôi. Phơng pháp này đo
chỉ cần điểm đầu và cuối của Pic đợc nhận ra chính xác và nó cho kết quả tốt đối
với nồng độ trung bình và cao.
Việc xác định diện tích Pic phải đợc sử dụng trong các trờng hợp yếu tố
dung lợng không thay đổi vì ảnh hởng của các chất khác.
Việc tính toán diện tích Pic sẽ không gặp khó khăn khi Pic có cờng độ quá
cao hoặc quá loãng, không đối xứng và Đetecter bị nhiễu.
III.2.2. Xác định chiều cao Pic.
- Khi Pic có dạng không đổi thì chiều cao Pic (khoảng cách giữa đờng nền
và đỉnh Pic) là một đại lợng tỷ lệ với diện tích và nó cũng có thể đợc dùng để đánh
giá sắc phổ.
- Chiều cao Pic đợc xác định dễ dàng bằng tay vì thế nó là phơng pháp đợc
chọn nếu sắc đồ đợc vẽ trên một máy ghi.
- Một điều kiện để áp dụng việc đánh giá bằng chiều cao Pic là các chỉ số
K hằng định.
- Để đo độ tuyến tính, việc đo chiều cao Pic chỉ thích hợp khi nồng độ mẫu

14

SVTH: Trn Quang ụn

MSSV: 20141060


Hc phn: PPPT trong CNSH

GVHD: PGS.TS Qun Lờ H

từ thấp đến trung bình. Khoảng tuyến tính sẽ rộng hơn đối với các cấu tử đợc rữa

giải chậm hơn so với trờng hợp các cấu tử này đợc rữa giải nhanh.
- Với các Pic có đờng nền bị nhiễu, việc xác định chiều cao Pic sẽ dễ dàng
hơn xác định diện tích Pic.
III.2.4. Phơng pháp chuẩn ngoại.
- So sánh trực tiếp độ lớn của các tín hiệu (diện tích Pic hoặc chiều cao Pic)
trong mẫu thử cho biết với một dung dich chuẩn của chất đó là một phơng pháp
phổ biến trong sắc kí.
- Phơng pháp này yêu cầu bơm các thể tích xác định trong điều kiện sắc kí.
Các chất đợc bơm vào dới dạng dung dich chuẩn có khoảng nồng độ nh trong mẫu
thử.
- Phơng pháp này có thể tiến hành ở các nồng độ khác nhau ( chuẩn hoá
một điểm, 2 điểm, nhiều điểm). Trong phơng pháp chuẩn 1 điểm nồng độ của mẫu
có thể đợc tính nh sau:

Ca = S a .

Cst
S st

Trong đó: Ca : nồng độ mẫu thử
Cst : nồng độ mẫu chất chuẩn
Sa : độ lớn của Pic mẫu thử (diện tích hoặc chiều cao Pic)
S st : độ lớn của Pic mẫu chuẩn.

- Với phơng pháp xác định 2 điểm hay nhiều điểm, phân tích chuẩn phải đợc xác định đầu tiên. Thờng đợc mô tả bằng đờng chuẩn thu đợc từ các điểm đo,
cùng với Phơng pháp phân tích hồi quy.

S st = So + mC st
So : Giao điểm của đờng chuẩn và trục tung

m: độ dốc của đờng chuẩn
Trong thí nghiệm này, nồng độ của mẫu thử đợc tính theo công thức sau:

Ca =

S a So
m

Độ lớn của Pic mẫu thử Sa nên nằm giữa độ lớn của Pic chuẩn thấp nhất và
cao nhất bởi vì đờng chuẩn đợc xác định trong vùng nồng độ đã nghiên cứu này.
III.2.4. Phơng pháp chuẩn nội.

15

SVTH: Trn Quang ụn

MSSV: 20141060


Hc phn: PPPT trong CNSH

GVHD: PGS.TS Qun Lờ H

- Để giảm sai số và đạt độ lặp lại cao trong định lợng bằng HPLC, ngời ta
sử dụng Phơng pháp chuẩn hoá với chất thứ hai thêm vào chất chuẩm ngoại và
mẫu thử. Chất này gọi là chuẩn nội
- Trong cùng điều kiện sắc kí nó có thời gian lu gần thời gian lu của chất
cần phân tích trong mẫu thử. Nó đợc tách hoàn toàn, và có nồng độ gần bằng nồng
độ của chất cần phân tích và có cấu trúc hoá học tơng ứng.
- Độ nhạy của chất chuẩn nội và chất cần phân tích là khác nhau, vì thể yếu

tố hiệu chỉnh Fx phải đợc xác định đầu tiên với dung dịch chuẩn tinh khiết.
Nếu gọi: Cx là nồng độ của dung dich chuẩn
Cis là nồng độ của dung dich chất chuẩn nội
Sx là độ lớn Pic chuẩn (chuẩn ngoại)
Sis là độ lớn Pic chuẩn nội
Thì:

Fx =

Sis .C x
S x .C is

- Nếu yếu tố hiệu chỉnh Fx là hằng số trong vùng nồng độ nghiên cứu, nồng
độ Ca của một mẫu mà trong đó ngời ta thêm chất chuẩn nội có thể tính nh sau:

Ca =

Sa
.Cis .Fx
Sis

III.2.5. Phơng pháp thêm chuẩn.
- Phơng pháp thêm chuẩn đợc sử dụng trong HPLC chủ yếu khi có vấn đề
ảnh hởng của chất phụ.
- Dung dịch mẫu thử đợc thêm vào một lợng xác định chất chuẩn.
- Các Pic thu đợc của cả 2 dung dich mẫu thử và mẫu thử thêm chất chuẩn
phải đợc đo trong cùng một điều kiện sắc kí.
- Phơng pháp thêm chất chuẩn có thể đợc thực hiện 1 lần, 2 lần, nhiều lần:
+ Trong trờng hợp đơn giản nhất đối với một lần chất thêm chuẩn , nồng độ
cho biết của mẫu Ca đợc tính bằng sự chênh lệch nồng độ

thêm vào) và độ tăng của độ lớn Pic
Ca =S a .

s

c (lợng chất chuẩn

theo công thức sau:

c
s

+ Với phơng pháp thêm nhiều lần, nồng độ của mẫu chuẩn đợc ít tốn kém
bằng Phơng pháp phân tích hồi quy.

16

SVTH: Trn Quang ụn

MSSV: 20141060


Hc phn: PPPT trong CNSH

GVHD: PGS.TS Qun Lờ H

- u điểm của phơng pháp thêm chất chuẩn là có độ chính xác cao và loại trừ
đợc các yếu tố ảnh hởng khác. Sự thay đổi về nhiệt độ, áp suất đã đợc mô tả bù trừ
trong đồ thị chuẩn và ảnh hởng đến kết quả đo đạc.
- Nhợc điểm: đòi hỏi nhiều thời gian phân tích vì phải chuẩn hoá đối với

từng mẫu mà không chuẩn hoá định kỳ nh khi dùng Phơng pháp chuẩn ngoại.
III.2.6. Phơng pháp quy về 100% diện tích Pic.
- Kỹ thuật này đơn giản nhng trong HPLC thì việc ứng dụng bị hạn chế, thờng hay đợc dùng trong sắc kí khí. Nó đòi hỏi cấu tử trong hỗn hợp chất cần phân
tích đều đợc rửa giải và đợc phát hiện.

%X =

AX .100
AX + AY + AZ

%X: giá trị % của cấu tử X trong hỗn hợp X, Y, Z
AX, AY, AZ: diện tích Pic của cấu tử X, Y, Z
- Trong HPLC, các công thức này chỉ đúng khi sự đáp ứng của Detector trên
các cấu tử X, Y, Z là nh nhau. Nếu không nh nhau, mỗi cấu tử cần có hệ số điều
chỉnh f(x), f(y), f(z)

%X =

AX . f ( x ) .100
AX . f ( x ) + AY . f ( y ) + AX . f ( z )

Muốn xác định f(x) phải có chuẩn cho các các cấu tử.
Ví dụ:
f( x ) =

Ac .Wx . f ( x )
AX .Wc

Ac, Ax: diện tích Pic của chuẩn và cấu tử X
Wc, WX: lệch chuẩn và lợng cấu tử X đã dùng

f(x): hệ số điều chỉnh của chuẩn.

17

SVTH: Trn Quang ụn

MSSV: 20141060


Hc phn: PPPT trong CNSH

GVHD: PGS.TS Qun Lờ H

Phần II. Thực nghiệm
I. Dụng cụ - hoá chất
I.1. Dụng cụ:
I.1.1. Máy sắc kí:
- Máy sắc kí lỏng cao áp (HPLC của hãng Shimadzu Nhật Bản)
+ Detecter: uv/vis
+ Cột tách: Lichrosorb RP 18 (5-10 à m, 150 x 4 mm)
+ Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút
+ Bớc sóng phát hiện: 550 nm
+ Thể tích tiêm: 20 à l
+ Cột nhồi Silicagel
+ Pha tĩnh: Silicagel
Sơ đồ:

Thiết bị có thể hiện một khối hay nhiều khối riêng biệt lắp ráp vào nhau.
Các bộ phận của thiết bị gồm:
+ (1), (4) Bộ phận kiểm tra bơm và chơng trình hoá

+ (2) Bình chứa dung môi
+ (3) Bơm cao áp
+ (4) Bộ phận bão hoà dung môi
+ (6) áp kế
+ (7) Bộ phận đa mẫu
+ (8) Buồng điều nhiệt
+ (9) Cột tách
18

SVTH: Trn Quang ụn

MSSV: 20141060


Hc phn: PPPT trong CNSH

GVHD: PGS.TS Qun Lờ H

+ (10) Bộ phận đo dòng
+ (11) Detecter
+ (12) Máy ghi
+ (13) Máy tính xử lý các kết quả do bộ phận ghi đa đến
+ (14) Bộ phận để thu các cấu tử cần tách.
I.1.2. Các dụng cụ khác
- Bình cầu
- ống nghiệm
- Giấy lọc
- Máy lắc siêu âm
- Cân phân tích
- Máy hút chân không

I.2. Hoá chất.
- Thuốc viên nén Vitamin 3B
- Dung dịch Cyanocobanlanic chuẩn: 5 à g/ml
- Etanol: 2%
- Nớc cất 2 lần
- Metanol: 2%
II. Kỷ thuật sắc kí lỏng cao áp
- Sơ đồ sắc kí lỏng cao áp đợc mô tả trên. Thiết bị gồm một bơm cao áp (3)
đẩy chất lỏng pha trộn qua cột tách, bình chứa dung môi (2), bộ phận bão hoà
dung môi vật chất lỏng pha tĩnh hoặc với nớc (5) trớc khi vào cột tách để làm
giảm sự thay đổi tính chất của cột tách do pha động gây nên, bộ phận đa mẫu (7),
cột tách (9) detecter (11), máy ghi 12.
- Khi rữa giải Gradien ngời ta lắp ráp thêm bộ phận (1) và (4) để kiểm tra
bơm và chơng trình hoá. áp suất vào cột tách đợc đo bằng áp kế 6. Cột tách và hệ
thống đa mẫu vào cột tách qua bộ phận bơm mẫu (7). Để chính xác ngời ta lắp
thêm phân đoạn (14) để thu các cấu tử cần tách, bộ phận máy tính (13) để xử lý
các kết quả đo đạc do bộ phận ghi đa đến.
- Khi sử dụng ta cần có kỹ thuật từ việc sử dụng bơm cho đến yêu cầu của
pha động rồi tốc độ dòng, áp suất, cách đa mẫu vào cột tách, rồi cột tách, cột nhồi
phải nh thế nào, cách sử dụng lợng mẫu, rồi cách tăng tốc độ, các loại detecter khi
dùng trong sắc kí lỏng cho hợp lý. Vậy ta xét lần lợt các bộ phận.
II.1. Bơm
Trong sắc kí lỏng cao áp, bơm áp suất cũng nh detecter là những bộ phận
rất quan trọng. Rất nhiều hệ tách phải tiến hành với áp suất lớn hơn 100 atm.
19

SVTH: Trn Quang ụn

MSSV: 20141060

Hc phn: PPPT trong CNSH

GVHD: PGS.TS Qun Lờ H

Dung môi rữa giải (pha động) cần phải chuyển thành dòng qua cột tách liên
tục và không có xung ở áp suất cao.
Công suất cần thiết của bơm cho mục đích phân tích (đờng kính bên trong
cột tách 5 mm) khoảng 0,1 - 10ml/phút ở áp suất 300 - 400 atm, còn mục đích
điều chế công suất đòi hỏi lớn hơn nhiều (100 ml/phút).
Với bơm pitông cơ học, tốc độ dòng đạt đợc một giá trị ứng với áp suất tơng ứng. Thay thế bơm bằng áp suất khi đầy dung môi thì áp suất bên trong là
thông số kiểm tra và tốc độ dòng có thể thay đổi theo áp suất.
Bơm kiểu Pitông nhỏ tao ra xung không mong muốn ví ảnh hởng đến độ ổn
định của detecter, độ phân giải của cột tách và độ lặp lại của quá trình làm việc.
Để loại trừ nhiều của đờng nền thờng ngời ta có thể sử dụng bơm nhiều
Pitông, để làm phẳng nền là sử dụng ống nilong có đờng kính trong 1,5 mm và dài
vài mét lắp giữa bơm và cột sắc kí.
Loại bơm ở máy này đợc dùng là bơm xi lanh lợng lớn, xi lanh lớn có đệm
(teflon), xi lanh thép không gỉ có thể vận hành dới áp suất vài trăm atm.
Ta sẽ sử dụng bánh răng cơ học để điều chỉnh pitông thì thu đợc tốc độ
dòng ổn định và lặp lại cao.
Dùng bơm kiểu MSF của hãng Schimit, áp suất làm việc có thể thay đổi từ
0 - 650.10-5 atm. ống nhồi với dung dich khoảng 18 ml.
Lấy 18 ml n-Heptan còn lại để chuẩn bị dung dịch huyền phù có chứa 2,5g
Lichrosorb 100 cỡ hạt 5 à m chất nhồi này đợc làm khô trong nớc 24h ở 100oC. Xử
lý huyền phù (rung) tối thiểu 3 phút trong bể siêu âm, sau đó đổ ngay vào ống
nhồi, làm đầy cột nhồi với n-Heptan sao cho 6 - 10 giây đạt đợc áp suất 550 atm
(tốc độ dòng vào khoảng 8ml/phút). Tiếp tục bơm khoảng 100 ml n- heptan ở áp
suất trên. Loại bơm này dùng cho nguyên tắc ngng dòng.
Dùng loại bơm cùng dòng với dung môi.

Trộn lẫn 9 ml n- heptan với 9 ml Isopropanol và đổ vào 3 ml hỗn hợp này
vào trong cột tách đã gắn với ống nhồi. Phần 15 ml còn lại để chuẩn bị dung dịch
huyền phù chứa 2,5 g lichrosorb RP -18 cỡ hạt 5 à m, chất này đợc khô trớc trong
2 giờ ở 80oC.
Xử lý huyền phù trong bể siêu âm tối thiểu 3 phút rồi để ngay vào ống nhồi,
làm đầy cột bằng n - heptan rồi nối với bơm. Bơm n-heptan trong khoảng 6 giây
đạt đợc áp suất 500.10-3 atm (tốc độ dòng 5 ml/phút). Bơm khoảng 100ml nheptan qua cột ở áp suất trên Etanol đợc sử dụng làm dung môi trung gian trớc khi
dùng nớc làm dung môi.
II.2. Pha động, tốc độ dòng, áp suất.

20

SVTH: Trn Quang ụn

MSSV: 20141060


Hc phn: PPPT trong CNSH

GVHD: PGS.TS Qun Lờ H

Trong Sắc kí lỏng áp cao thành phần của dung môi rữa giải (pha động) là
một trong những yếu tố ảnh hởng đến sự tách. Pha động thờng là các dung môi
hữu cơ hoặc dung dịch nớc.
Pha động cần phải đạt những yêu cầu sau:
+ Không làm già hoá cột tách và các đặc tính của nó
+ Phù hợp với detector.
+ Hoà tan mẫu cần tách
+ Có độ nhớt thấp
+ Cho phép thu hồi lại mẫu nếu cần thiết

+ Tinh khiết, không độc
+ Rẻ tiền và giá cả vừa phải
ở luận văn này chúng tôi sử dụng hệ thống bơm dung môi Gradien 1524.4
Piston nối tiếp.
+ Số đờng dung môi:
0.2 dòng
+ Tốc độ dòng:
0.001 đến 10.000 ml/phút
+ Mức phân giải:
0.001ml/phút < 0.1%
+ Độ chính xác:
1,0 %
+ Tự động bổ chỉnh áp suất
+ Độ ổn định áp suất:
1% cho toàn bộ thang cho
một chu trình bơm ở 1ml/phút.
+ áp suất bơm
0 - 600. 10-5 atm
+ Độ ồn
< 70 dB (A)
+ Khối lợng
32g
+ Điện áp
80 V
+ Tần số
47 63 Hz
+ Nhiệt độ thao tác
40 - 400oC
+ Độ ẩm thao tác trong khoảng
20 - 50 %

Loại van bơm bằng tay 7725- injector, có sẵn vòng bơm màu
+ Kiểm soát vòng liên tục
+ Nhiệt độ thao tác tối đa
50oC
Hầu hết trong quá trình chạy sắc kí lỏng cao áp không dùng dung môi vì lợng dung môi không lớn lắm và việc tái sử dụng không kinh tế.
Dung môi phải đợc làm sạch khí, không khí hoà tan trong dung môi sẽ tạo
bọt khí trong detecter và gây nhiễu.
+ Loại khí bằng các phơng pháp đun nóng, hút chân không hoặc bằng cách
lắc siêu âm.
Hiệu quả cột tách phụ thuộc vào tốc độ dòng.
+ Đối với cột tách có độ phân giải cao, đờng kính trong 2 mm thờng vận
hành ở tốc độ 10 - 60 ml/giờ 30 - 300. 10-5 atm. áp suất phụ thuộc vào sự thẩm
thấu của cột, độ nhớt của pha động, đờng kính các chất mang và độ dài cột tách.

21

SVTH: Trn Quang ụn

MSSV: 20141060


Hc phn: PPPT trong CNSH

GVHD: PGS.TS Qun Lờ H

+ Tốc độ dòng và áp suất ảnh hởng đến thời gian phân tích.
Tốc độ pha động đợc xác định bằng cách đo thời gian cần thiết để thu đợc
một thể tích đặc trng của chất lỏng trong ống chia độ.
II.3. Đa mẫu vào cột tách.
Khi đa mẫu vào cột tách không đợc làm xáo trộn chất nhồi trong cột. Có

hai kiểu cơ bản đa mẫu vào cột tách.
+ Bơm ngừng dòng chảy
+ Bơm không phải ngừng dòng chảy
Với kiểu bơm thứ nhất có thể thực hiện nhờ một bơm tiêm mẫu qua đệm
ngăn vào trong dòng dung môi. Cấu trúc của bộ phận bơm mẫu phải tránh đợc thể
tích chết.
Kiểu bơm này thờng làm việc trong điều kiện áp suất thấp cỡ
50 m450 . 10-5 atm. ở áp suất cao hơn 600 . 10 -5 atm cần sử dụng các bơm đặc
biệt.
Trong hệ thống bơm mẫu đệm ngăn là một vấn đề lớn, nó không những
chẳng chịu đợc áp suất co bền với dung môi mà còn không đợc chứa các chất dẻo
hoá, chất chống oxi hoá...
Đệm ngăn thờng đợc đun với dung môi làm pha động trớc khi dùng.
Mỗi lần thay đệm ngay phải lấy tất cả mảnh vụn ra khỏi lối vào cột tách, để
tiện lợi ngời ta đậy đầu cột tách bằng bông thuỷ tinh để loại dễ dàng mảnh vụn
của đệm ngăn, đồng thời tách đợc hiện tợng chất nhồi cột làm tách xi lanh bơm
mẫu.
Để bơm mẫu lớn hơn 10 à l và đặc biệt trong sắc khí lỏng thẩm thấu qua
gen. Mẫu là các Polime có độ nhớt cao ngời ta sử dụng kiểu van quang gắn với
vòng chứa mẫu có dung tích đã biết.
Khi làm việc với áp suất cao, mẫu đợc đa vào cột tách bằng phơng pháp thứ
2 dựa trên nguyên tắc ngng dòng.
+ Mẫu đợc đa vào cột tách khi dòng dung môi ngừng lại không chịu áp
suất, sau khi mẫu đã đa vào cột tách dung môi lại tiếp tục đợc bơm.
+ Sau một thời gian ngắn áp suất sẽ đạt cân bằng.
+ Việc xác định thời gian lu của mẫu ở Phơng pháp này là bằng cách gián
tiếp cho chất chuẩn nội và xác định thời gian lu tơng đối.
+ Nhợc điểm của phơng pháp này là có thể làm cho độ nhồi của cột tách
thay đổi do áp suất dao động lúc ngng dòng.
II.4. Cột tách

- Cột tách trong HPLC đợc coi là trái tim của cả hệ thống thiết bị.
Điều kiện cột tách:
22

SVTH: Trn Quang ụn

MSSV: 20141060


Hc phn: PPPT trong CNSH

GVHD: PGS.TS Qun Lờ H

+ Phải trơ
+ Có thành phẳng
+ Đồng nhất về bề mặt
+ Có thể chịu đợc áp suất cao
Các chất sử dụng làm cột tách
+ Thuỷ tinh
+ Thép không gỉ
+ Tan tan
+ Đồng
+ Nhôm
Đờng kính là : 2 - 4 mm
Hạt nhồi có đờng kính 80 à m thích hợp cho cột tách có đờng kính
3 -4 mm thì sẽ cho hiệu suất và độ lặp tốt.
Cột tách có đờng kính nhỏ hơn 1 mm rất khó nhồi.
Chiều dài cột tách: 12,5 - 25 cm.
Đờng kính trong 2 - 4 mm.
Cấu hình cột tách có thể thẳng hay cong không ảnh hởng lớn lắm đến quá

trình tách.
Trớc khi dùng cột tách bằng thép không gỉ đợc làm sạch bằng HNO3 50%,
sửa sạch nớc nhiều lần rồi bằng Axeton và cuối cùng làm khô bằng khí N 2 hoặc
không khí nóng.
- Nhồi cột: có 2 cách nhồi
+ Nhồi khô: sử dụng với những hạt chất nhồi có đờng kính > 20 à m.
+ Nhồi ớt : sử dụng với những hạt chất nhồi có đờng kính < 20 à m.
(Trong luận văn này chúng tôi sử dụng cách nhồi ớt).
- Sau khi cột đã làm xong cần phải kiểm tra và khảo sát đặc trng của độ
tách nh độ cân đối của Pic, thời gian đo tính bằng biểu thức:

Lr 2 T
To =
F
Trong đó:

L- chiều dài cột tách (cm)
r - bán kính của cột tách (cm)
F - Tốc độ dòng (cm3/s)
T - hằng số giới hạn
Độ rỗng tổng cộng T đối với chất mạng hoàn toàn rỗng (không phụ thuộc
vào phơng pháp nhồi) là 0,4 (5%). ở loại pha liên kết hoá học (và ở chất trao đổi
ion) thì T nhỏ hơn.
23

SVTH: Trn Quang ụn

MSSV: 20141060

Hc phn: PPPT trong CNSH

GVHD: PGS.TS Qun Lờ H

Trờng hợp giới hạn T = 0.42.
Ví dụ hạt thuỷ tinh ở hệ pha thuận nghịch T = 0,75.
Đờng kính hạt của pha chất nhồi cũng phải đợc kiểm tra bằng biểu thức:

DP = 41

FnL
rP

( à m)

Chiều cao đĩa lý thuyết đợc H
6 d2 p
H = 3dp + +
.u
n 16
u - thời gian chết
'

Trong đó:

P - áp suất (atm)

Phơng trình chỉ đúng cho chất rữa giải không phân cực với độ phân cực
thấp nh n-heptan và các mẫu có phân tử lợng thấp nh Benzen, dẫn xuất của
benzen. Dung lợng cột tách trong đa số trờng hợp khoảng 10 - 4g mẫu/gam pha

động.
Khi tăng lợng mẫu, nó sẽ phụ thuộc vào chiều cao địa lý thuyết và thời gian
lu, việc xác định thời gian lu bằng các loại phơng pháp sắc kí khác. Trong sắc kí
lỏng cao áp chất nhồi quan trọng và phổ biến là Silicagen, sau đó là axit nhồi, các
loại pha ngợc (RP-2, RP-8)
Cột nhồi tốt (điều kiện hạt chất nhồi 30 - 40 à m) ở tốc độ rữa giải 30cm/s
và chiều cao đĩa lý thuyết của cột tách khoảng 1mm.
II.5. Lợng mẫu.
Lợng mẫu cực tiểu phụ thuộc vào độ nhạy của detecter.
Dung lợng mẫu của cột tách phụ thuộc vào chất nhồi cột.
Việc sử dụng chất nhồi lớp mỏng xốp làm giảm lợng mẫu.
Lợng mẫu, độ phân giải và tốc độ phân tích có quan hệ với nhau theo sơ đồ
tam giác:

24

SVTH: Trn Quang ụn

MSSV: 20141060


Hc phn: PPPT trong CNSH

GVHD: PGS.TS Qun Lờ H

Tốc độ

Tách
phân tích
A

Lợng mẫu

B

Tách điều
chế

Độ phân
giải

Dung lợng mẫu cột tách phụ thuộc vào cột nhồi. Các hạt xốp có bề mặt
Dung lợng mẫu cột tách phụ thuộc vào chất nhồi hạt xốp so với loại không
điển hình nhất là chất hấp phụ xốp có diện tích bề mặt đến 200 - 400 m 2/g đối với
chất hấp phụ xếp với chiều dài 1 m đờng kính trong 2,1mm có thể bơm vào
khoảng 2 -5 mg lợng mẫu là một trong những u điểm lớn của sắc kí lỏng cao áp so
với sắc kí khí.
Việc sử dụng nhồi lớp mỏng xốp làm giảm lợng mẫu, thí dụ cột tách có
điều kiện trong 1 mm đợc nhồi với nhựa trao đổi ion 270 - 325 mest phủ trên các
hạt thuỷ tinh có dung lợng chỉ bằng 10 -8 mol.
II.6. Pha tĩnh (hay còn gọi là chất nhồi cột)
Trong sắc kí lỏng cao áp pha tĩnh đóng vai trò quan trọng tạo nên sự tơng
tác cần thiết để các cấu tử tách ra khỏi nhau. Vì vậy sự trao đổi pha tĩnh hoặc các
thông số làm việc ở cột sẽ ảnh hởng đến lực tơng tác trong quá trình tách, mỗi một
pha tĩnh đều có chế độ làm việc riêng.
Nhiệt độ ở ngỡng thấp nhất đợc xác định ở điểm nóng chảy, còn nhiệt độ ở
ngỡng cao nhất đợc xác định bởi áp suất hơi và độ bền nhiệt của nó, nhiệt độ sử
dụng làm pha tĩnh: cho đến nay đã tìm ra 700 chât.
Một vài ví dụ về pha tĩnh:

25

SVTH: Trn Quang ụn

MSSV: 20141060