Nghiên Cứu Chuyển Gen Mã Hóa Protein Bề Mặt Của Virus H5n1 Vào Cây Đậu Tương Phục Vụ Sản Xuất Vaccine Thực Vật

Header Page 1 of 126.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
––––––––––––––––––

NGUYỄN THU HIỀN

NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN MÃ HÓA PROTEIN
BỀ MẶT CỦA VIRUS H5N1 VÀO CÂY ĐẬU TƢƠNG
PHỤC VỤ SẢN XUẤT VACCINE THỰC VẬT

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN - 2014

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
Footer Page 1 of 126.

/>

Header Page 2 of 126.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
––––––––––––––––––

NGUYỄN THU HIỀN

NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN MÃ HÓA PROTEIN
BỀ MẶT CỦA VIRUT H5N1 VÀO CÂY ĐẬU TƢƠNG

PHỤC VỤ SẢN XUẤT VACCINE THỰC VẬT

Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 62 42 01 21

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:
1. PGS.TS. CHU HOÀNG HÀ
2. GS. TS. CHU HOÀNG MẬU

THÁI NGUYÊN - 2014
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
Footer Page 2 of 126.

/>

Header Page 3 of 126.

i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết
quả cùng cộng tác với các cộng sự khác. Các số liệu và kết quả trình bày
trong luận án là trung thực, một phần đã đƣợc công bố trên các Tạp chí khoa
học chuyên ngành và trong Kỷ yếu Hội nghị Khoa học-Công nghệ với sự
đồng ý và cho phép của các đồng tác giả. Phần còn lại chƣa đƣợc ai công bố
trong bất kỳ công trình nào khác.

Tác giả

Nguyễn Thu Hiền

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
Footer Page 3 of 126.

/>

Header Page 4 of 126.

ii

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới GS.TS Chu Hoàng Mậu, PGS.TS Chu
Hoàng Hà đã tận tình hƣớng dẫn, chỉ bảo và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi
trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án.
Tôi xin cảm ơn Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen, xin chân
thành cảm ơn TS. Lê Văn Sơn cùng toàn thể cán bộ phòng Công nghệ tế bào
thực vật, Viện Công nghệ Sinh học đã tận tình giúp đỡ, truyền đạt những kinh
nghiệm quý báu cho tôi trong quá trình nghiên cứu và thực hiện đề tài luận án.
Xin cảm ơn sự giúp đỡ của nhóm nghiên cứu và các đồng nghiệp.
Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Nguyễn Thị Tâm cùng tập thể cán
bộ Bộ môn Di truyền & Sinh học hiện đại đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận
lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu đề tài luận án.
Tôi xin cảm ơn các thầy cô khoa Sinh-Kỹ thuật Nông nghiệp và Phòng
Quản lý sau đại học, trƣờng Đại học Sƣ phạm – Đại học Thái Nguyên, xin
cảm ơn lãnh đạo trƣờng Đại học Sƣ phạm và lãnh đạo Đại học Thái Nguyên.
Tôi xin cảm ơn sự giúp đỡ và tạo điều kiện của Ban chủ nhiệm khoa Khoa

học cơ bản, Ban giám hiệu Trƣờng Đại học Y Dƣợc – Đại học Thái Nguyên.
Tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên, giúp đỡ tôi trong
suốt quá trình học tập và thực hiện thành công luận án này.

Nghiên cứu sinh

Nguyễn Thu Hiền
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
Footer Page 4 of 126.

/>

Header Page 5 of 126.

iii

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ............................................................................................................................................................................................1
1. Đặt vấn đề....................................................................................................................................................................................1
2. Mục tiêu nghiên cứu........................................................................................................................................................2
3. Nội dung nghiên cứu.......................................................................................................................................................2
4. Những đóng góp mới của luận án....................................................................................................................3
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn .............................................................................................................................4
Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU...........................................................................................................5
1.1. BỆNH CÚM GIA CẦM VÀ VIRUS CÚM A/H5N1 .........................................................5
1.1.1. Bệnh cúm gia cầm và dịch bệnh cúm A/H5N1 .....................................................................5
1.1.2. Virus cúm A/H5N1 ................................................................................................................................................6
1.2. VACCINE PHÒNG CHỐNG BỆNH CÚM A/H5N1.............................................................. 19
1.2.1. Các loại vaccine phòng chống bệnh cúm A/H5N1 ....................................................... 19
1.2.2. Nghiên cứu sản xuất vaccine phòng chống bệnh cúm A/H5N1 .................... 22

1.3. ỨNG DỤNG KỸ THUẬT CHUYỂN GEN TRONG NGHIÊN CỨU SẢN
XUẤT VACCINE THỰC VẬT ................................................................................................................................ 27
1.3.1. Nghiên cứu chuyển gen ở cây đậu tƣơng ................................................................................. 27
1.3.2. Thành tựu ứng dụng kỹ thuật chuyển gen trong chọn giống đậu tƣơng..................38
1.3.3. Ứng dụng kỹ thuật chuyển gen trong nghiên cứu sản xuất vaccine thực
vật ............................................................................................................................................................................................................. 43
Chƣơng 2: VẬT LIỆ

...............................

48

2.1. VẬT LIỆU......................................................................................................................................................................... 48
ực vật ........................................................................................................................................ 48
ại vector ................................................................................................... 48
2.1.3. Hóa chất .......................................................................................................................................................................... 48
2.1.4. Thiết bị.............................................................................................................................................................................. 48

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
Footer Page 5 of 126.

/>

Header Page 6 of 126.

iv

2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................................................................................... 49
2.2.1. Nhóm phƣơng pháp sử dụng để thiết kế vector chuyển gen................................... 50
2.2.2. Các phƣơng pháp sử dụng trong xây dựng mô hình tái sinh và chuyển gen in

vitro ......................................................................................................................................................................................................... 56
ển gen .................................................................................... 61
2.3. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU VÀ HOÀN THÀNH LUẬN ÁN............................. 62
Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .......................................... 63
3.1. THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN MANG GEN HA VÀ ĐOẠN
GEN HA1 CỦA VIRUS H5N1............................................................................................................................. 63
3.1.1. Kết quả thiết kế vector chuyển gen mang gen HA ........................................................ 63
3.1.2. Kết quả thiết kế vector chuyển gen mang đoạn gen HA1..................................... 77
3.2.HOÀN THIỆN QUY TRÌNH TÁI SINH VÀ CHUYỂN GEN THÔNG
QUA VI KHUẨN A.TUMEFARACIENS Ở CÂY ĐẬU TƢƠNG .............................. 85
3.2.1. Phát triển hệ thống tái sinh phục vụ chuyển gen ở hai giống đậu tƣơng
ĐT12 và DT84 .......................................................................................................................................................................... 86
3.2.2. Kết quả chuyển gen gus vào cây đậu tƣơng thông qua vi khuẩn................. 94
3.2.3. Kết quả chuyển cấu trúc đoạn gen HA1 vào cây đậu tƣơng ............................ 99
3.3. KẾT QUẢ CHUYỂN ĐOẠN GEN HA1 VÀO CÂY ĐẬU TƢƠNG ....101
3.3.1. Phân tích sự có mặt của đoạn gen HA1 ở các dòng cây đậu tƣơng
chuyển gen ở thế hệ T0 .................................................................................................................................................101
3.3.2. Phân tích các dòng cây đậu tƣơng chuyển gen ở thế hệ T1 ..............................103
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .................................................................................................................................107
CÁC BÀI BÁO ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN.........................109
TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................................................................................110

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
Footer Page 6 of 126.

/>

Header Page 7 of 126.

v

DANH MỤC NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT
AS

Acetosyrigone

A. tumefaciens

Agrobacterium tumefaciens

BAP

6-benzyladenine purin

bp

Base pair

CCM

Cocultivation medium

DNA

Deoxyribonucleic acid

dNTP

Deoxynucleoside triphosphate

đtg

Đồng tác giả

EDTA

Ethylene diamine tetraacetic acid

E. coli

Escherichia coli

GA3

Gibberellic acid

GM

Môi trƣờng nảy mầm

gus

Gen mã hóa enzyme β-Glucuronidase

IAA

Indoleacetic acid

IBA

Indole-3-butyric acid

kb

Kilo base

LB

Luria and Bertani

MS

Môi trƣờng cơ bản theo Murashige và Skoog (1962)

NAA

α-Naphthaleneacetic acid

nptII

Neomycin phosphotransferase gene

OD

Optical density

PCR

Polymerase Chain Reaction

PPT

Phosphinothricin

RM

Môi trƣờng ra rễ

SDS

Sodium dodecylsulfat

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
Footer Page 7 of 126.

/>

Header Page 8 of 126.

vi
SIM

Môi trƣờng tạo chồi

SEM

Môi trƣờng kéo dài chồi

Taq

Thermus Aquaticus

T-DNA

Vùng DNA plasmid chuyển vào thực vật

Ti- plasmid

Plasmid tạo khối u

T0, T1, T2

Các thế hệ cây đậu tƣơng chuyển gen

T0

Cây đậu tƣơng chuyển gen tái sinh từ chồi

T1

Hạt của cây chuyển gen T0 nảy mầm thành cây T1

T2

Hạt của cây chuyển gen T1 nảy mầm thành cây T2

Vir

Virulence Region

v/p

vòng/phút

X-gluc

5-bromo-4-chloro-3-indolyl glucuronide

YEP

Yeast extract peptone

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
Footer Page 8 of 126.

/>

Header Page 9 of 126.

vii

DANH MỤC BẢNG

TT

Tên bảng

Trang

Bảng 2.1 Thành phần phản ứng PCR

50

Bảng 2.2 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR

50

Bảng 2.3 Thành phần phản ứng ligation

52

Bảng 2.4 Thành phần hóa chất tách plasmid

52

Bảng 2.5 Thành phần phản ứng LR

54

Bảng 2.6 Thành phần phản ứng cắt bằng enzyme hạn chế

55

Bảng 2.7 Thành phần môi trƣờng nuôi khuẩn

56

Bảng 2.8 Thành phần các loại môi trƣờng nuôi cấy in vitro

57

Bảng 3.1 Trình tự cặp mồi XhoI-HA/HindIII-HA

66

Bảng 3.2 Trình tự cặp mồi XhoI-HA1/HindIII-HA1

78

Bảng 3.3 Ảnh hƣởng của thời gian khử trùng đến khả năng nảy

86

mầ
89

Bảng 3.4

Bảng 3.5 Ảnh hƣởng củ

ến khả năng kéo dài chồi

91

Bảng 3.6 Ảnh hƣởng của IBA đến khả năng tạo rễ

92

Bảng 3.7 Kết quả chuyển gen gus vào nách lá mầm đậu tƣơng

95

thông qua vi khuẩn A. tumefacines
Bảng 3.8 Khả năng tái sinh thông qua nách lá mầm của giống đậu
tƣơng ĐT12 sau khi biến nạp cấu trúc gen HA1

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
Footer Page 9 of 126.

/>
100


Header Page 10 of 126.

viii

DANH MỤC HÌNH
TT

Tên hình

Trang

Hình 1.1

Hình thái, mô hình cấu tạo, cấu trúc ribonucleoprotein

11

của virus cúm A/H5N1
Hình 1.2

Mô hình cấu trúc protein Hemagglutinin

15

Hình 1.3

Sơ đồ xâm nhiễm của virus cúm A/H5N1 trong tế bào chủ

18

Hình 1.4

Khối u thực vật do A. tumefaciens

30

Hình 1.5

Cấu trúc Ti- Plasmid

32

Hình 1.6

Mô hình chuyển gen gián tiếp nhờ A. tumefaciens

34

Hình 2.1

Sơ đồ thí nghiệm tổng quát

49

Hình 2.2

Sơ đồ

ậu tƣơng

59
64

3.1
(SLHEP) (B)
HA

Hình 3.2
Hình 3.3

(HAop)

Hình ảnh điện di kiểm tra kết quả PCR nhân đoạn gen

65
67

HAop bằng XhoI-HA/HindIII-HA
Hình 3.4

Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm thôi gel

68

Hình 3.5

Sơ đồ thí nghiệm ghép nối gen HA/HA1 vào vector

69

p201-SLEHP tạo p201-SLEHP-HA/HA1
Hình 3.6

Hình ảnh khuẩn lạc sau khi biến nạp plasmid tái tổ hợp

70

vào E.coli
Hình 3.7

Hình ảnh điện di kiểm tra kết quả chọn dòng plasmid
tái tổ hợp p201-SLHEP-HA

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
Footer Page 10 of 126.

/>

71


Header Page 11 of 126.

ix

3.8

-

o vector

72

-HAop

73

pPhaso-dest tạo pPhaso-dest-HA/HA1
3.9

Hình ả

3.10

Hình ảnh điện di sản phẩ

75

A. tumefaciens CV58
Hình 3.11

Sơ đồ mô tả sự tái sinh và chuyển gen HA ở cây thuốc lá

76

Hình 3.12

Hình ảnh điện di sản phẩ

77

HA
Hình 3.13

Hình ảnh điện di kiểm tra kết quả PCR nhân đoạn gen

78

HA1 bằng XhoI-HA1/HindIII-HA1
eotide và trình tự amino acid suy diễn của

Hình 3.14

80

đoạn gen HA1
Hình 3.15

Hình ảnh điện di kiểm tra kết quả chọn dòng plasmid

81

tái tổ hợp p201-SLHEP-HA1
3.16

Hình ả

ển gen mang cấu

82

trúc pPhaso-SLEHP-HA1
3.17. Hình ảnh điện di sản phẩ

84

58
3.18

Kết quả điện di sản phẩ

85

1
Hình 3.19

Hạt nảy mầm sau các thời gian khử trùng khác nhau

88

Hình 3.20

Cụm chồi tạo đƣợc sau 4 tuần nuôi cấy trên SIM

90

Hình 3.21

Cụm chồi trên môi trƣờng kéo dài SEM

91
95

3.22
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
Footer Page 11 of 126.

/>

Header Page 12 of 126.

x
(B)
3.23

Hình ảnh kết quả nhuộm X-gluc để kiểm tra

96

gen gus
Hình 3.24

Sơ đồ mô tả quy trình tái sinh phục vụ chuyển gen ở

98

cây đậu tƣơng ĐT12
Hình 3.25

Quy trình chuyển gen ở giống đậu tƣơng ĐT12

100

Hình 3.26

Các cây đậu tƣơng chuyển gen thế hệ T0 đƣợc trồng

101

trong nhà lƣới
Hình 3.27

Phân tích cây đậu tƣơng chuyển gen mang đoạn gen

102

HA1 ở thế hệ T0
Hình 3.28

Phân tích sản phẩm PCR bằng cặp mồi đặc hiệu XhoI-

104

HA/ HindIII-HA với các dòng cây đậu tƣơng thế hệ T1
Hình 3.29

Hình ảnh protein HA1 hiện phim đƣợc phân tích bằng
Western blot từ protein tổng số chiết từ hạt của dòng
đậu tƣơng chuyển gen H11.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
Footer Page 12 of 126.

/>
105


Header Page 13 of 126.

1

MỞ ĐẦU

1. Đặt vấn đề
Cúm là một căn bệnh nguy hiểm gây tử vong cao và hằng năm trên thế
giới đã có hơn nửa tỷ ngƣời mắc bệnh. Hiện nay, virus cúm A/H5N1- chủng
virus nguy hiểm nhất ở
Trung đông, châu Âu và châu Phi

ền trên 40 quốc gia ở châu Á,
ớc ta, dịch cúm gia cầm H5N1 xảy ra

từ những tháng cuối năm 2003 gây thiệt hại nghiêm trọng cho ngành chăn
nuôi gia cầm và ảnh hƣởng đến sức khoẻ con ngƣời. Việt Nam và Indonesia
là hai quốc gia có số ngƣời nhiễm virus cúm A/H5N1 và có tỷ lệ tử vong cao
nhất so với các quốc gia trên thế giới. Chính vì vậy nghiên cứu làm sáng tỏ
bệnh cúm A/H5N1 và nhân tố gây bệnh để xây dựng biện pháp phòng và
khống chế bệnh là yêu cầu thực tiễn đặt ra.
Dịch cúm gia cầm diễn biến ngày càng phức tạp vì hệ gen của virus cúm
A luôn biến đổi. Bên cạnh đó, nguồn tàng trữ và lây lan bệnh là chim di cƣ và
thủy cầm rất khó kiểm soát và khống chế. Hiện nay, việc phòng chống virus
cúm A nói chung và H5N1 nói riêng, bên cạnh các biện pháp phòng chống
dịch nhƣ tiêu độc, xử lý gia cầm bị bệnh, thanh lý gia cầm nhiễm hoặc nguy
cơ nhiễm thì biện pháp sử dụng vaccine vẫn là hƣớng thiết yếu nhất để khống
chế và ngăn chặn sự lây lan dịch sang ngƣời. Ngoài các loại vaccine truyền
thống, vaccine thế hệ mới đƣợc tạo ra bằng các phƣơng pháp tái tổ hợp và di
truyền ngƣợc đang đƣợc sử dụng rộng rãi, tuy nhiên,
nhƣ

mức độ an toàn thấp

,

các nhà khoa học trên thế giới vẫn đang tiếp tục phát triển những loại vaccine
mới có tính ƣu việt hơn, rẻ hơn, dễ bảo quản, an toàn và hiệu quả hơn.
Vaccine ăn đƣợc từ thực vật là vaccine tác động vào thể dịch, kích thích cả hệ

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

Footer Page 13 of 126.

/>

Header Page 14 of 126.

2
thống miễn dịch thể dịch và miễn dịch tế bào. Vaccine thực vật có hoạt tính
tƣơng tự nhƣ vaccine thông thƣờng, chỉ khác là vaccine này đƣợc thực vật sản
xuất trong những phần ăn đƣợc nhƣ lá, củ, quả và hạt. Vaccine thực vật có
một số ƣu điểm nổi bật so với các loại vaccine khác ở chỗ có thể ăn tƣơi hoặc
nấu chín; dễ dàng sản xuất khối lƣợng lớn bằng cách tăng diện tích trồng cây
chuyển gen có khả năng sản xuất kháng nguyên; vaccine thực vật
định,

ổn

, dễ bảo quản, dễ sử dụng và có hiệu quả kinh tế.
Ở Việt Nam, đậu tƣơng là cây có giá trị kinh tế cao, hạt đậu tƣơng là

nguồn thực phẩm chính cho vật nuôi và con ngƣời. Sự biểu hiện thành công
gen gus trên cây đậu tƣơng là cơ sở của việc ứng dụng kỹ thuật chuyển gen để
sản xuất các chất có dƣợc tính nhƣ vaccine trong hạt đậu tƣơng. Với ƣu điểm
nổi bật nhƣ sản xuất đơn giản, giá thành thấp, hiệu quả cao trong phòng bệnh
và có độ an toàn, vaccine sản xuất từ thực vật đƣợc xem là hƣớng đi phù hợp
trong chiến lƣợc chăm sóc sức khoẻ cộng đồng ở các quốc gia đang phát triển.
Xuất phát từ lý do trên chúng tôi đã tiến hành đề tài luận án là: “Nghiên
cứu chuyển gen mã hóa protein bề mặt của virus H5N1 vào cây đậu tương
phục vụ sản xuất vaccine thực vật”.
2. Mục tiêu nghiên cứu

Thiết kế đƣợc vector mang cấu trúc gen HA, đoạn gen HA1 của virus
cúm A/H5N1.
Tạo đƣợc cây đậu tƣơng chuyển gen mang cấu trúc đoạn gen HA1 và
biểu hiện đƣợc protein tái tổ hợp HA1 ở hạt đậu tƣơng.
3. Nội dung nghiên cứu
3.1. Thiết kế và tổng hợp gen HA và đoạn gen HA1 có khả năng biểu hiện tối
ƣu ở thực vật, nhân dòng gen HA và đoạn gen HA1 trong tế bào vi khuẩn
E.coli và tạo vector chuyển gen mang cấu trúc gen HA và đoạn gen HA1.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
Footer Page 14 of 126.

/>

Header Page 15 of 126.

3
3.2. Biến nạp cấu trúc vector chuyển gen mang gen HA và đoạn gen HA1 vào
vi khuẩn A. tumefaciens. Lây nhiễm vi khuẩn A. tumefaciens tái tổ hợp vào
mô lá thuốc lá và tái sinh tạo cây thuốc lá chuyển gen mang gen HA và đoạn
gen HA1;
3.3. Phát triển hệ thống tái sinh đa chồi phục vụ chuyển gen ở cây đậu tƣơng;
3.4. Chuyển cấu trúc vector mang gen gus biểu hiện ở hạt vào cây đậu tƣơng.
Đánh giá hiệu quả chuyển gen gus ở giống đậu tƣơng ĐT12 và DT84;
3.5. Chuyển cấu trúc vector mang đoạn gen HA1 vào cây đậu tƣơng và phân
tích sự có mặt của đoạn gen chuyển HA1 ở cây đậu tƣơng của thế hệ T0;
3.6. Phân tích dòng cây đậu tƣơng chuyển gen ở thế hệ T1 bằng kỹ thuật PCR
và lai Western blot để xác định sự biểu hiện của protein HA1 ở hạt đậu tƣơng.
4. Những đóng góp mới của luận án
4.1. Hai cấu trúc vector mang gen HA và mang đoạn gen HA1 biểu hiện trong
hạt thực vật đã đƣợc thiết kế thành công và tạo đƣợc chủng vi khuẩn

Agrobacterium tumefaciens mang cấu trúc gen HA, đoạn gen HA1 của virus
cúm A/H5N1.
4.2. G

ĐT12

n gen gus
giai đoạn hạt là

ĐT12

4,3 % với giống DT84.

4.3. Chuyển thành công cấu trúc SLHEP-HA1 vào cây đậu tƣơng và thu đƣợc 8
dòng cây đậu tƣơng ở thế hệ T0 mang cấu trúc SLHEP-HA1 biểu hi
trong hạt. pPhân tích cây đậu tƣơng ở thế hệ T1và T2 đã xác định đƣợc sự di
truyền của gen chuyển HA1 qua 3 thế hệ T0, T1 và T2
4.4. Ở thế hệ T1 đã thu đƣợc dòng đậu tƣơng H11 chuyển gen mang đoạn gen
HA1 và biểu hiện thành công protein HA1 trong hạt của dòng đậu tƣơng H11.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
Footer Page 15 of 126.

/>

Header Page 16 of 126.

4

5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Về khoa học: Đã thiết kế đƣợc vector chuyển gen mang cấu trúc gen HA và
đoạn gen HA1 biểu hiện ở hạt thực vật. Biểu hiện thành công gen gus ở hạt.
Đã hoàn thiện đƣợc quy trình tái sinh đa chồi ở cây đậu tƣơng. Với việc lây
nhiễm vi khuẩn A. tumefaciens tái tổ hợp vào mô đậu tƣơng đã tổn thƣơng,
tạo cây đậu tƣơng chuyển gen và đã biểu hiện thành công protein HA1 của
virus H5N1 trong hạt đậu tƣơng.
Về thực tiễn: Với kết quả protein HA1 đã đƣợc biểu hiện thành công trong hạt
đậu tƣơng ở thế hệ T1 là cơ sở của việc tiếp tục kiểm tra đáp ứng khả năng
miễn dịch của gia cầm, đồng thời làm tiền đề cho việc nghiên cứu sản xuất
vaccine ăn đƣợc ở thực vật.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
Footer Page 16 of 126.

/>

Header Page 17 of 126.

5

Chƣơng 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. BỆNH CÚM GIA CẦM VÀ VIRUS CÚM A/H5N1
1.1.1. Bệnh cúm gia cầm và dịch bệnh cúm A/H5N1
Cúm gia cầm (Avian Influenza, AI) là bệnh truyền nhiễm cấp tính của
gia cầm, do nhóm virus cúm A thuộc họ Orthomyxoviridae gây ra [38]. Đây
là nhóm virus có biên độ rộng, đƣợc phân chia thành nhiều phân type khác
nhau dựa trên kháng nguyên HA và NA có trên bề mặt capsid của hạt virus.
Nhóm virus cúm A có 16 phân type HA (từ H1 đến H16) và 9 phân type NA

(từ N1 đến N9) và sự tái tổ hợp giữa các phân type HA và NA sẽ tạo ra nhiều
phân type khác nhau về độc tính và khả năng gây bệnh [42].
Virus cúm A/H5N1 có độc lực cao và gây bệnh trên ngƣời vào những
năm 1996-2008 [106]. Chủng virus cúm A/H5N1 đƣợc phát hiện lần đầu tiên
gây bệnh dịch trên gà tại Scotland vào năm 1959. Sau đó, cúm A/H5N1 đã tái
xuất hiện tại Quảng Đông (1996) và Hồng Kông (1997) với sự biến đổi sâu
sắc, không những gây chết gia cầm mà còn thích ứng trên ngƣời và gây chết
ngƣời bệnh [142]. Năm 2003, virus H5N1 gây ra dịch cúm trên gia cầm tại
Hồng Kông, Trung Quốc và lây lan sang hàng chục quốc gia ở châu Á, châu
Âu và châu Phi, trong đó có Việt Nam. Cấu trúc virus cúm A/H5N1 vẫn nhƣ
trƣớc đó, nhƣng xét về độc lực, loài vật chủ nhiễm bệnh, tính kháng nguyênmiễn dịch và mức độ truyền lây có nhiều nét đặc trƣng hơn và khác với những
biến chủng H5N1 trƣớc đây. Các chủng virus cúm A/H5N1 thuộc phân dòng
Thanh Hải (nguồn gốc vùng Bắc Trung Quốc) xuất hiện cuối năm 2005, bắt
đầu lan sang một số nƣớc vùng Trung Á, Nga rồi tràn ngập vào các nƣớc

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
Footer Page 17 of 126.

/>

Header Page 18 of 126.

6
vùng Tây Á, bao gồm cả Thổ Nhĩ Kỳ, các nƣớc Bắc-Trung Phi, trong đó Ai
Cập và Nigeria là các nƣớc chịu thiệt hại nhiều nhất [25].
Theo thống kê của Tổ chức Y tế thế giới (WHO) đến tháng 3/2013, đã
có tới 622 trƣờng hợp mắc cúm A/H5N1, trong đó có 371 trƣờng hợp đã tử
vong, chiếm 59,65%. Trong đó quốc gia có số ngƣời mắc bệnh và số tử vong
cao là các nƣớc Ai cập, Indonesia và Việt Nam. Kết quả điều tra dịch tễ học
cho thấy, hầu hết những ca nhiễm cúm gia cầm H5N1 trên ngƣời đều có liên

quan đến tiếp xúc với gia cầm bị bệnh hoặc trung gian qua thực phẩm chế
biến từ gia cầm bị bệnh hoặc qua tiếp xúc trực tiếp nhƣ giết mổ, vận chuyển,
mua bán gia cầm.
Việt Nam đƣợc WHO xác định là quốc gia “điểm nóng” do virus cúm
A/H5N1 có các điều kiện thuận lợi để tiến hóa thích nghi lây nhiễm và trở thành
virus của ngƣời. Ở Việt Nam, đại dịch bùng phát từ năm 2003, đã tái phát qua
bốn đợt dịch. Đợt thứ nhất xảy ra ở 57 tỉnh, thành phố; đợt dịch thứ tƣ gần đây
nhất xảy ra ở 21 tỉnh, thành phố, đã tiêu hủy trên 50 triệu gia cầm các loại, thiệt
hại lên đến hàng ngàn tỷ đồng [9].
Qua điều tra dịch tễ, các trƣờng hợp nhiễm cúm A/H5N1 trên ngƣời
đƣợc ghi nhận đồng thời với thời điểm có dịch cúm trên gia cầm. Mặc dù số
ca nhiễm ít nhƣng tỷ lệ tử vong rất cao (59%) và chi phí điều trị rất tốn kém,
do vậy biện pháp tốt nhất là dự phòng để tránh mắc bệnh [7].
1.1.2. Virus cúm A/H5N1
1.1.2.1. Đặc tính của virus cúm A/H5N1
Virus cúm A/H5N1 mẫn cảm với nhiệt độ, với các dung môi hòa tan
lipid, với các loại hóa chất sát trùng và oxy hóa, với formaldehyde và với các
tia phóng xạ. Các hạt virus tồn tại trong pH từ 6,5 đến 7,9. Trong điều kiện
quá acid hoặc quá kiềm đều làm giảm khả năng lây nhiễm. Virus A/H5N1 bị
bất hoạt dƣới ánh sáng trực tiếp sau 40 giờ, tồn tại đƣợc 15 ngày ánh sáng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
Footer Page 18 of 126.

/>

Header Page 19 of 126.

7
thƣờng, tia tử ngoại bất hoạt đƣợc virus nhƣng không phá hủy đƣợc kháng

nguyên của virus. Tuy nhiên, virus bị phá hủy hoàn toàn ở 100oC hoặc 30
phút ở 60oC, tồn tại 3 tháng ở nhiệt độ thấp (trong phân gia cầm), và hàng
năm ở -70 oC. Trong phủ tạng gia cầm (40oC) tồn tại đƣợc 25-30 ngày, nhƣng
trong cơ thể ngƣời (37oC) chỉ sống đƣợc 7-8 ngày, còn ở nƣớc 30oC tồn tại
đƣợc 4 ngày [24] [26] [75].
Về mặt dịch tễ học, virus cúm A có nhiều biến chủng khác nhau. Các phân
type (subtype) là kết quả tái tổ hợp của 15 HA (H1-H15) và 9 NA (N1-N9).
Hemagglutinin mới, dạng thứ 16 (H16), đƣợc tìm thấy năm 2005 từ con mòng
biển đầu đen. Trình tự H16 có độ tƣơng đồng cao với H13 [25] [32]. Các phân
type gây nhiễm cho hầu hết các loài sinh vật bao gồm loài ngƣời, các loài lông
vũ (gà, thủy cầm), lợn, ngựa, chim, chồn đất, hải cẩu, cá voi... Chúng thích ứng
hầu hết với mọi loại vật chủ và hệ gen luôn luôn biến đổi, định kỳ gây nên
những vụ dịch cúm kinh hoàng trong lịch sử ở động vật và ngƣời [140]. Do đặc
tính biến đổi gen nhanh chóng và trao đổi gen để tái tổ hợp tạo biến thể mới lan
truyền trong quần thể sinh vật, cúm A là nhóm virus nguy hiểm truyền bệnh từ
động vật sang ngƣời .Virus A/H5N1 đƣợc coi là loại biến chủng có mức độ độc
lực cao nhất đối với các loài động vật và ngƣời, có nhiều minh chứng khoa học
cho thấy chủng này bắt nguồn từ H6N2 hoặc và trao đổi gen thông qua H9N2
trên lợn [77].
Về danh pháp, để ký hiệu và lƣu trữ một cách khoa học và đầy đủ, các
chủng virus cúm sau khi phân lập phải đƣợc ký hiệu theo danh pháp quy định
với trật tự nhƣ sau: tên serotype/loài bị nhiễm/nơi phân lập/số hiệu chủng/thời
gian phân lập/loại hình subtype (HA (H) và NA (N)) [35][25]. Ví dụ: virus
cúm có ký hiệu A/chicken/Vietnam/HG4/ 2005(H5N1) có thông tin về danh
pháp là cúm nhóm A, loài nhiễm là gà (chicken), nơi phân lập là Việt Nam, số

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
Footer Page 19 of 126.

/>

Header Page 20 of 126.

8
hiệu chủng là HG4 – Hậu Giang 4, thời gian phân lập là năm 2005, phân type
là H5N1.
Tính gây bệnh hay độc lực của virus cúm A đƣợc chia làm hai loại: (1)
loại độc lực cao (HPAI - Highly pathogenic avian influenza) và (2) loại độc
lực thấp (LPAI - Low pathogenic avian influenza). Cả hai loại đều cùng tồn
tại trong tự nhiên [30]. HPAI là loại virus cúm A có khả năng gây tổn thƣơng
nhiều cơ quan nội tạng trong cơ thể nhiễm, trên gia cầm chúng thƣờng gây chết
100% số gia cầm bị nhiễm trong vòng 48 giờ sau nhiễm. Loại này rất nguy
hiểm gây lo ngại cho cộng đồng. Virus loại HPAI phát triển tốt trên tế bào phôi
gà và tế bào thận chó trong môi trƣờng nuôi cấy không có trypsin [29]. LPAI là
loại virus khi phát triển trong cơ thể nhiễm, có thể gây bệnh cúm nhẹ không có
triệu chứng lâm sàng điển hình và không làm chết vật chủ. Đây là loại virus lây
truyền rộng rãi và tạo nên các ổ bệnh trong tự nhiên của virus cúm A, loại này
có thể trao đổi gen với các chủng virus có độc lực cao đồng nhiễm trên cùng
một tế bào và trở thành loại virus HPAI nguy hiểm [68] [155].
1.1.2.2. Cấu trúc hệ gen của virus cúm A/H5N1
Hệ gen của virus cúm A/H5N1 có khoảng 13500 nucleotide, gồm 8 phân
đoạn gen mã hoá cho 8 phân tử protein [34]. Các phân đoạn 1, 2 và 3 là những
phân đoạn mã hóa tổng hợp các enzyme trong phức hợp polymerase (RNA
transcriptase) của virus, có độ dài ổn định và có tính bảo tồn cao, cụ thể là:
Phân đoạn 1 (gen PB2) mã hóa tổng hợp enzyme PB2, là tiểu đơn vị
thành phần trong phức hợp polymerase của virus, chịu trách nhiệm khởi đầu
phiên mã RNA virus. PB2 có khối lƣợng phân tử 87.103 Da [38]. Tính thích
nghi nhiệt độ cơ thể loài vật chủ đƣợc cho là có liên quan đến vị trí amino
acid 627 ở protein PB2 (ở virus cúm gia cầm vị trí này là Glu - thích ứng với
nhiệt độ cơ thể gia cầm khoảng 40oC, còn ở virus thích nghi trên ngƣời là Lys

- thích ứng nhiệt độ cơ thể ngƣời khoảng 37oC) [7] [19] [63].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
Footer Page 20 of 126.

/>

Header Page 21 of 126.

9
Phân đoạn 2 (gen PB1) mã hóa tổng hợp enzyme PB1 - tiểu đơn vị xúc
tác của phức hợp enzym polymerase trong quá trình tổng hợp RNA virus, chịu
trách nhiệm gắn mũ RNA [38]. Gần đây, đã có phát hiện thêm một protein
(PB1-F2) đƣợc mã hóa bởi một khung đọc mở khác của PB1, có vai trò gây ra
hiện tƣợng apoptosis (hiện tƣợng tế bào chết theo chƣơng trình) [38].
Phân đoạn 3 (gen PA) là phân đoạn gen bảo thủ cao, mã hóa tổng hợp
protein enzyme PA có khối lƣợng phân tử là 96.103 Da. PA là một tiểu đơn vị
của polymerase chịu trách nhiệm kéo dài sự phiên mã RNA trong quá trình
tổng hợp RNA của virus [8].
Các phân đoạn 4 và 6 mã hóa cho các protein (HA và NA) bề mặt capsid
của virus, có tính kháng nguyên đặc trƣng theo từng chủng virus cúm A, cụ
thể nhƣ sau:
Phân đoạn 4 (gen HA) có độ dài thay đổi tuỳ theo từng chủng virus cúm
A Gen HA mã hóa tổng hợp protein HA - kháng nguyên bề mặt virus cúm,
gồm hai tiểu phần là HA1 và HA2. Vùng nối giữa HA1 và HA2 gồm một số
amino acid mang tính kiềm đƣợc mã hóa bởi một chuỗi oligonucleotide, đó là
điểm cắt của protease và đây là vùng quyết định độc lực của virus [8].
Protein HA có khối lƣợng phân tử khoảng 63.103 Da (nếu không đƣợc
glycosyl hóa) và 77.103 Da (nếu đƣợc glycosyl hóa, trong đó HA1 là 48.103 Da
và HA2 là 29.103 Da) [29].

Phân đoạn 6 (gen NA) là một gen kháng nguyên của virus, có kích thƣớc
thay đổi theo từng chủng virus cúm A. Đây là gen mã hóa tổng hợp protein
NA, kháng nguyên bề mặt capsid của virus, có khối lƣợng phân tử là 50 60.103 Da. Các nghiên cứu phân tử gen NA của virus cúm cho thấy phần đầu
5‟- của gen (hay phần tận cùng N của polypeptide NA) có tính biến đổi cao và
phức tạp giữa các chủng virus cúm A, sự thay đổi này liên quan đến quá trình
thích ứng và gây bệnh của virus cúm trên nhiều đối tƣợng vật chủ khác nhau [

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
Footer Page 21 of 126.

/>

Header Page 22 of 126.

10
93]. Đặc trƣng biến đổi của gen NA trong virus cúm A là hiện tƣợng đột biến
trƣợt-xóa một đoạn gen là 57 nucleotide, rồi sau đó là 60 nucleotide [42].
Các phân đoạn gen M, NP và NS mã hóa tổng hợp các protein chức năng
khác nhau của virus, có độ dài tƣơng đối ổn định giữa các chủng virus cúm A,
cụ thể:
Phân đoạn 5 (gen NP) mã hóa tổng hợp nucleoprotein (NP) - thành phần
của phức hệ phiên mã, chịu trách nhiệm vận chuyển RNA giữa nhân và bào
tƣơng tế bào chủ. NP là một protein đƣợc glycosyl hóa, có đặc tính kháng
nguyên biểu hiện theo nhóm virus, tồn tại trong các hạt virus ở dạng kết hợp
với mỗi phân đoạn RNA, có khối lƣợng phân tử theo tính toán khoảng 56.10 3
Da (trên thực tế là 50 - 60.103 Da) [38].
Phân đoạn 7 (gen M) mã hóa cho protein đệm (matrix protein - M) của
virus (gồm hai tiểu phần là M1 và M2 đƣợc tạo ra bởi những khung đọc mở
khác nhau của cùng một phân đoạn RNA), cùng với HA và NA có khoảng
3000 phân tử MP trên bề mặt capsid của virus cúm A, có mối quan hệ tƣơng

tác bề mặt với hemagglutinin. Protein M1 là một protein nền, là thành phần
chính của virus có chức năng bao bọc RNA tạo nên phức hợp RNP và tham gia
vào quá trình “nảy chồi” của virus [38]. Protein M2 là chuỗi polypeptide bé, có
khối lƣợng phân tử là 15.103 Da, là protein chuyển màng - kênh ion (ion
channel) cần thiết cho khả năng lây nhiễm của virus, chịu trách nhiệm “cởi áo”
virus trình diện hệ gen ở bào tƣơng tế bào chủ trong quá trình xâm nhiễm trên
vật chủ.
Phân đoạn 8 (gen NS), là gen mã hóa protein không cấu trúc (non
structural protein), có độ dài ổn định nhất trong hệ gen của virus cúm A mã
hóa tổng hợp hai protein là NS1 và NS2 (còn gọi là NEP, nuclear export
protein), có vai trò bảo vệ hệ gen của virus [42]. Độc tính của virus có sự liên
quan với gen không cấu trúc (non-structural gen) này đƣợc tìm thấy ở biến

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
Footer Page 22 of 126.

/>

Header Page 23 of 126.

11
chủng A/H5N1/97 [24 ], trong tự nhiên, việc đột biến xóa đi một phần gen có
liên quan đến giảm độc lực [25]. NS1 có khối lƣợng phân tử là 25.103 Da,
chịu trách nhiệm vận chuyển RNA thông tin của virus từ nhân ra bào tƣơng tế
bào nhiễm, và tác động lên các RNA vận chuyển cũng nhƣ các quá trình cắt
và dịch mã của tế bào chủ. NEP hay NS2, là gen hình thành từ hai đoạn gen
(30 nucleotit và 336 nucleotit) mã hóa loại protein có khối lƣợng phân tử là
12x103 Da, đóng vai trò vận chuyển các RNP của virus ra khỏi nhân tế bào
nhiễm để lắp ráp với capsid tạo nên hạt virus mới [42].
Nhƣ vậy, virus cúm A/H5N1 có hệ gen đƣợc cấu trúc từ 8 phân đoạn

riêng biệt và không có gen mã hóa enzyme sửa chữa RNA. Do vậy, trong thực
tế dễ xuất hiện các đột biến điểm trong mỗi phân đoạn gen và trong hệ gen
qua quá trình sao chép nhân lên của virus, hoặc trao đổi các phân đoạn gen
giữa các chủng virus cúm đồng nhiễm trên cùng một tế bào, rất có thể dẫn đến
thay đổi đặc tính kháng nguyên tạo nên các chủng virus mới [29].

C

A

Hình 1.1. Hình thái, mô hình cấu tạo, cấu trúc ribonucleoprotein
của virus cúm A/H5N1 [7]
A: Các dạng hình thái khác nhau của virus cúm A dƣới kính hiển vi điện tử; B: Mô hình
cấu tạo hạt virus cúm A (Hemagglutinin: phân tử kháng nguyên HA, Neuraminidase:
phân tử kháng nguyên NA; PB2, PB1, PA: ba tiểu phầndƣới đơn vị phức hợp enzyme
polymerase của virus). C: Cấu trúc của phức hợp ribonucleoprotein (RNP)

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
Footer Page 23 of 126.

/>

Header Page 24 of 126.

12
Nucleic acid và protein của virus sắp xếp theo kiểu xoắn lò so xung
quanh một trục tạo nên cấu trúc đối xứng xoắn hình cầu (đƣờng kính 89 – 120
nm) hoặc hình sợi kéo dài (tới vài μm) của virion. Nucleocapsid đƣợc bao bọc
bởi màng protein nền M1, phía ngoài màng là lớp lipid kép có nguồn gốc từ
màng sinh chất của tế bào chủ, có chức năng chính là ổn định cấu trúc của virus.

Lớp vỏ ngoài của virus còn có các glycoprotein (protein đã đƣợc glycosyl hoá).
Những protein này thực chất là protein của màng tế bào nhiễm đã đƣợc chuyên
hoá để gắn protein màng của virus vào, gồm protein M2 đâm xuyên và nhô ra
khỏi vỏ ngoài và 2 protein gai nhô ra ngoài bề mặt (HA và NA).
1.1.2.3. Đặc trưng của kháng nguyên HA và NA
HA và NA là các protein chính bề mặt capsid đặc trƣng cho bản chất của
từng chủng virus cúm A [38] [19].
Protein HA (Hemagglutinin)
Gen HA có kích thƣớc thay đổi tùy theo từng chủng virus cúm. Gen
HA mã hóa cho protein kháng nguyên ngƣng kết hồng cầu có độ dài 568-569
amino acid. Gen HA đƣợc phân lập từ chủng H1N1 (1934) Tây Ban Nha,
chủng H5N1 (1996) ở Quảng Đông, Trung Quốc nhƣ các chủng nguyên thủy
[42]. Nhiều gen HA phân lập từ các chủng trong giai đoạn 1997-2003 là các
biến chủng có khả năng gây bệnh rất cao. Hệ gen của virus biến đổi nhanh,
trong đó, những biến đổi gen HA thƣờng xảy ra nhiều và sử dụng chính sự
biến đổi này để phân định nhóm kháng nguyên, phân type và phân tích mối
quan hệ tiến hóa của các chủng H5N1. Các chủng phân lập trong giai đoạn từ
1997-2002 vẫn mang tính đồng kháng nguyên, nhƣng các chủng thu đƣợc
trong giai đoạn từ 2003 -2005 đã có bằng chứng của sự lệch kháng nguyên
của A/H5N1. Virus cúm A/H5N1 có 12 genotype, những dạng cũ (A, B, C,
D) trƣớc 2002 không còn tồn tại, mà tồn tại 8 dạng mới (V, W, X1, X2, X3,
Y, Z và Z+). Các chủng H5N1 phân lập tại Việt Nam từ 2004 đến 2006 đều

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
Footer Page 24 of 126.

/>

Header Page 25 of 126.

13
thuộc dòng Quảng Đông, tập trung chủ yếu ở genotype Z, nhƣng phân thành 2
nhóm: Nhóm N – miền Bắc và nhóm S - miền Nam thuộc nhóm tiến hóa
(clade) 1. Năm 2007 đã phát hiện thêm dƣới dòng Phúc kiến thuộc clade 2.3.4
[4]. Gen HA đƣợc phân lập từ chủng A/Ck/Vietnam/HG4/2005 (Hậu Giang)
có 9 vị trí nucleotide sai khác hoàn toàn so với các chủng khác phân lập ở
Việt Nam và Đông Nam Á, đƣợc xác định thuộc nhóm dƣới dòng Quảng
Đông và clade 1 [7].
Hemagglutinin (HA) có thể đƣợc coi là một loại protein vừa quyết định
tính kháng nguyên, vừa quyết định tính độc lực của virus cúm A. Protein HA
là một glycoprotein thuộc protein màng type I (lectin), có khả năng gây ngƣng
kết hồng cầu gà trong ống nghiệm (in vitro), kháng thể đặc hiệu với HA có
thể phong tỏa sự ngƣng kết đó, đƣợc gọi là kháng thể ngăn cản ngƣng kết
hồng cầu (HI-Hemagglutinin Inhibitory andibody). Có 16 phân type HA đã
đƣợc phát hiện (H1-H16), ba phân type (H1, H2 và H3) thích ứng lây nhiễm
gây bệnh ở ngƣời liên quan đến các đại dịch cúm trong lịch sử [102]. Có
khoảng 400 phân tử HA trên bề mặt capsid của một virus và khởi động quá
trình xâm nhiễm của virus vào tế bào chủ [9] [7]. Phân tử HA có dạng hình
trụ, dài khoảng 130Å, thƣờng ở dạng kết 3 (trimer), mỗi chuỗi polypeptid
đƣợc tạo thành từ HA1 (36 kDa) và HA2 (27 kDa) và các chuỗi polypeptid
liên kết với nhau bởi các cầu nối disulfide (-S-S-). Các chuỗi polypeptid sau
khi tổng hợp đã đƣợc glycosyl hóa và gắn vào mặt ngoài capsid là chuỗi HA2,
phần đầu tự do hình chỏm cầu đƣợc tạo bởi hạt HA1 chứa đựng vị trí gắn với
thụ thể thích hợp của HA trên bề mặt màng tế bào đích. Sự kết hợp của HA
với thụ thể đặc hiệu (glycoprotein chứa sialic acid) trên bề mặt màng tế bào,
khởi đầu quá trình xâm nhiễm của virus trên vật chủ giúp cho virus xâm nhập,
hòa màng và giải phóng RNA hệ gen thực hiện quá trình nhân lên ở tế bào
cảm nhiễm 150 . Quá trình kết hợp phụ thuộc vào sự phù hợp cấu hình không

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

Footer Page 25 of 126.

/>