Nghiên Cứu Tách Dòng Và Biểu Hiện Gen Mã Hóa Kháng Nguyên Bề Mặt Của Tiên Mao Trùng (Trypanosoma Evansi) Lưu Hành Ở Việt Nam

Header Page 1 of 126.

i

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

NGUYỄN THỊ THU HIỀN

NGHIÊN CỨU TÁCH DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA
KHÁNG NGUYÊN BỀ MẶT CỦA TIÊN MAO TRÙNG
(TRYPANOSOMA EVANSI) LƢU HÀNH Ở VIỆT NAM

TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ THÚ Y
Chuyên ngành: Thú y
Mã số: 60.64.01.01

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: 1. GS.TS Nguyễn Thị Kim Lan
2. TS Phạm Thị Tâm

Thái Nguyên, năm 2013

Footer Page 1Số
of hóa
126.bởi Trung tâm Học liệu

/>

Header Page 2 of 126.

ii

Công trình đƣợc hoàn thành tại:
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học : 1. GS.TS Nguyễn Thị Kim Lan
2. TS Phạm Thị Tâm

Phản biện 1: PGS.TS Đặng Xuân Bình
Phản biện 2: TS. Phan Hồng Phúc

Luận văn sẽ đƣợc bảo vệ trƣớc Hội đồng chấm luận văn họp tại:
Vào hồi...... giờ...... ngày....... tháng........ năm 2013

Có thể tìm hiểu luận văn tại trung tâm học liệu Đại học Thái Nguyên
Và thƣ viện Trƣờng/Khoa:…………………………….

Footer Page 2Số
of hóa
126.bởi Trung tâm Học liệu

/>

Header Page 3 of 126.

iii

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu này là của chúng tôi.
Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn này mà tôi sử dụng chƣa từng
đƣợc công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác.

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Thu Hiền

Footer Page 3Số
of hóa
126.bởi Trung tâm Học liệu

/>

Header Page 4 of 126.

iv

LỜI CẢM ƠN
Trong thời gian thực hiện đề tài, ngoài sự nỗ lực của bản thân, tôi đã nhận
đƣợc rất nhiều sự giúp đỡ, hƣớng dẫn tận tình của các thầy giáo, cô giáo, các tập
thể, cá nhân, bạn bè đồng nghiệp trong và ngoài trƣờng.
Nhân dịp hoàn thành luận văn Thạc sĩ khoa học nông nghiệp chuyên ngành
Thú y tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến GS.TS. Nguyễn Thị Kim Lan. Trƣờng
Đại học Nông lâm Thái Nguyên và TS. Phạm Thị Tâm, khoa Công nghệ sinh học, Viện
Đại học Mở Hà Nội, đã trực tiếp hƣớng dẫn, tận tình chỉ bảo, tạo mọi điều kiện tốt nhất
cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu khoa học.
Tôi xin trân trọng cảm ơn:
- Các thầy cô giáo trong Khoa Chăn nuôi Thú y, Trƣờng Đại học Nông lâm
Thái Nguyên đã giúp tôi hoàn thành khóa học và nâng cao chất lƣợng luận văn.
- Phòng quản lý đào tạo sau đại học đã tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá
trình học tập tại trƣờng.
Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến những ngƣời thân, gia đình đã động
viên, giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này.

Xin trân trọng cảm ơn!
Thái Nguyên, tháng 08 năm 2013
Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Thu Hiền

Footer Page 4Số
of hóa
126.bởi Trung tâm Học liệu

/>

Header Page 5 of 126.

v

Mục lục
Trang
MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1
1. Tính cấp thiết của đề tài .....................................................................................1
2. Mục tiêu của đề tài.............................................................................................2
3. Điểm mới của đề tài ...........................................................................................2
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài...........................................................3
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................4
1.1. TIÊN MAO TRÙNG VÀ BỆNH TIÊN MAO TRÙNG Ở GIA SÚC ...........4
1.1.1. Đặc điểm hình thái, cấu trúc và phân loại tiên mao trùng ...........................4
1.1.2. Dịch tễ học bệnh tiên mao trùng..................................................................8
1.1.3. Đặc điểm bệnh lý và lâm sàng của bệnh ...................................................10
1.1.4. Chẩn đoán bệnh tiên mao trùng .................................................................13
1.1.5. Phƣơng pháp phát hiện ADN của tiên mao trùng bằng phản ứng

PCR (Polymerase Chain Reaction) .....................................................................19
1.1.6. Phòng trị bệnh tiên mao trùng cho trâu, bò, ngựa .....................................19
1.2. VECTOR TÁCH DÒNG ..............................................................................22
1.2.1. Khái niệm ..................................................................................................22
1.2.2. Các loại vector tách dòng ..........................................................................23
1.2.3. Plasmid pCR 2.1 ........................................................................................24
1.3. VECTOR BIỂU HIỆN .................................................................................27
1.3.1. Khái niệm ..................................................................................................27
1.3.2. Các hệ thống biểu hiện gen .......................................................................27
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU ........................................................................................................30
2.1. VẬT LIỆU ....................................................................................................30
2.1.1. Sinh phẩm trong nghiên cứu ......................................................................30
2.1.2. Hóa chất và môi trƣờng .............................................................................30
2.1.3. Thiết bị .......................................................................................................33

Footer Page 5Số
of hóa
126.bởi Trung tâm Học liệu

/>

Header Page 6 of 126.

vi

2.1.4. Cặp mồi dùng trong nghiên cứu. ...............................................................34
2.2. ĐỊA ĐIỂM, THỜI GIAN NGHIÊN CỨU ...................................................34
2.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU.........................................................................34
2.3.1. Nghiên cứu các điều kiện tách dòng gen mã hóa kháng nguyên bề

mặt của Trypanosoma evansi ..............................................................................34
2.3.2. Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên bề mặt của
Trypanosoma evansi ............................................................................................34
2.4. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...............................................................35
2.4.1. Sơ đồ nghiên cứu .......................................................................................35
2.4.2. Tách chiết ADN tổng số ............................................................................35
2.4.3 Kiểm tra ADN hệ gen bằng máy đo quang phổ. ........................................36
2.4.4 Khuếch đại đoạn gen mã hóa kháng nguyên RoTAT 1.2 bằng
phƣơng pháp PCR (Polymerase Chain Reaction). ..............................................37
2.4.5 Phƣơng pháp điện di trên gel agarose.........................................................38
2.4.6 Tạo dòng gene mã hóa kháng nguyên RoTAT 1.2 .................................39
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................47
3.1. Tách dòng và xác định trình tự gen mã hóa kháng nguyên RoTAT 1.2 ......47
3.2 Biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên RoTAT 1.2 ........................................57
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .....................................................................................64
1. Kết luận............................................................................................................64
2. Đề nghị ............................................................................................................65
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................66

Footer Page 6Số
of hóa
126.bởi Trung tâm Học liệu

/>

Header Page 7 of 126.

vii

CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU

ADN

Acid deoxyribonucleic

CATT

Card Agglutination Test for Trypanosomiasis

cDNA

DNA bổ xung (complementary DNA)

dNTP

Deoxynucleotid triphotphat

ddNTP

Dideoxynucletid triphotphat

EDTA

Ethylen Diamin Tetra Acetic

IFAT

Indirect Fluorescent Antibody Test

IPTG

Isopropyl β – D – thiogalactoside

MCS

Multi clonding site

PBS

Phosphat Buffered Saline

RNA

Ribonucleic acid

SDS

Sodium Dodecyl Sulfat

SDS – PAGE

Sodium Dodecyl Sulfat Poly Acrylamide

TEA

Tris – axit acetic - EDTA

VAT

Variant Antigen Tupe

VSG

Variant Surface Glucoprotein

Footer Page 7Số
of hóa
126.bởi Trung tâm Học liệu

/>

Header Page 8 of 126.

viii

DANH MỤC BẢNG BIỂU
Trang
Bảng 3.1. Thành phần và điều kiện phản ứng PCR sàng lọc khuẩn lạc mang
đoạn chèn RoTAT 1.2 ..............................................................................52
Bảng 3.2. Thành phần và điều kiện phản ứng giải trình tự gen ................................54
Bảng 3.3. Tổng hợp mức độ tƣơng đồng của gen RoTAT 1.2 của các chủng
T.evansi phân lập với các trình tự của NCBI .........................................56
Bảng 3.4. Thành phần và điều kiện cho phản ứng cắt sản phẩm PCR chứa gen
RoTAT 1.2/ pET32a (+) bằng enzyme Bam HI .......................................59
Bảng 3.5. Thành phần và điều kiện cho phản ứng cắt sản phẩm PCR chứa gen
RoTAT 1.2/ pET32a (+) bằng enzyme Xho I ...........................................59
Bảng 3.6. Thành phần và điều kiện phản ứng nối gen ..............................................59

Footer Page 8Số
of hóa

126.bởi Trung tâm Học liệu

/>

Header Page 9 of 126.

ix

DANH MỤC HÌNH VẼ
Trang
Hình 1.1. Vector tách dòng pCR 2.1 .........................................................................25
Hình 1.2. Sơ đồ thiết kế vector tái tổ hợp pJET1.2-RoTAT 1.2 ..............................26
Hình 3.1. Hình ảnh ký sinh trùng trong máu chuột bạch ..........................................47
Hình 3.2. Kết quả tách chiết ADN tổng số ...............................................................48
Hình 3.3. Kết quả sản phẩm PCR trên gel agarose 1,5%.........................................49
Hình 3.4. Kết quả biến nạp gen RoTAT 1.2 vào vi khuẩn E.coli DH10b ................51
Hình 3.5. Kết quả tách chiết ADN plasmid ..............................................................51
Hình 3.6. Kết quả kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng phản ứng PCR với cặp
mồi F1.2 /R1.2 ..........................................................................................53
Hình 3.7. So sánh trình tự gen RoTAT 1.2 của chủng T.evansi HB với trình tự
GeneBank .................................................................................................54
Hình 3.8 So sánh trình tự gen RoTAT 1.2 của chủng T.evansi LS với trình tự
GeneBank .................................................................................................55
Hình 3.9. So sánh trình tự gen RoTAT 1.2 của chủng T.evansi TN với trình tự
GeneBank .................................................................................................55
Hình 3.11. Hình ảnh điện di gen RoTAT 1.2 cắt bằng các anzyme giới hạn
Bam HI và Xho I ......................................................................................58
Hình 3.12. Hình ảnh điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp bằng enzyme
Bam HI và Xho I ......................................................................................60
Hình 3.13 Sơ đồ cấu trúc của vector pET 32a(+) .....................................................61

Hình 3.14 Kết quả điện di protein tái tổ hợp RoTAT 1.2 trên gel SDS-PAGE .......62
Hình 3.15 Kết quả Western blot giữa protein tái tổ hợp RoTAT 1.2 với
kháng thể kháng 6xHis ............................................................................63
Hình 3.16 Kết quả Western blot giữa protein tái tổ hợp RoTAT 1.2 với
kháng thể kháng T.evansi ........................................................................63

Footer Page 9Số
of hóa
126.bởi Trung tâm Học liệu

/>

Header Page 10 of 126.

1

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Bệnh do Trypanosoma (Trypanosomiasis) là bệnh truyền lây giữa ngƣời và
gia súc do ký sinh trùng đơn bào (Protozoa) lớp trùng roi (Flagellata) gây ra. Có
nhiều loài thuộc giống Trypanosoma, nhƣ: Trypanosoma brucei, Trypanosoma
cruzi, Trypanosoma evansi, Trypanosoma congolense, Trypanosoma gambiense,
Trypanosoma vavax, Trypanosoma siminae…
Bệnh tiên mao trùng do Trypanosoma evansi thấy ở những loài động vật,
trong đó trâu, bò là các động vật khá mẫn cảm với động vật đơn bào này. Trâu, bò
mắc bệnh thể cấp tính thƣờng sốt cao 41 – 41,70C với các triệu chứng thần kinh nhƣ
ngã quỵ, kêu rống, đi vòng tròn, thuỷ thũng ở hầu, ức, nách, chân, háng. Trƣờng
hợp bệnh nặng, con vật đột ngột sốt cao, bụng chƣớng to rồi lăn ra chết.
Trâu, bò mắc bệnh ở thể cấp tính có thể chết sau 7 – 15 ngày. Ở thể mãn
tính, triệu chứng lâm sàng nhẹ hơn và bệnh kéo dài 1 – 2 tháng, con vật ngày càng

gầy, da khô mốc, niêm mạc mắt tụ máu màu đỏ tía, đôi khi có chấm máu, chảy nƣớc
mắt và mắt có nhiều dử đặc nhƣ keo, niêm mạc mắt vàng nhạt hay sẫm. Sức khoẻ
trâu, bò suy yếu dần, kém ăn, kém nhai lại, đi phân táo có lẫn máu hoặc đi tháo
phân lỏng, mùi thối khắm, có khi con vật ỉa ra cả màng ruột, nát từng đoạn.
Theo số liệu của Phạm Sỹ Lăng (1982), Phan Địch Lân và cs (2004), Phan
Văn Chinh (2006), bệnh tiên mao trùng xuất hiện ở nhiều vùng trên cả nƣớc, với tỷ
lệ mắc khá cao: trên trâu là 13 – 30%, trên bò là 7 – 14%, trong đó tỷ lệ gia súc
chết/gia súc mắc lên tới 6,3 – 20%.
Cũng theo báo cáo của các tác giả trên, tỷ lệ mắc Trypanosoma evansi ở gia
súc vùng núi và trung du cao hơn các vùng đồng bằng và ven biển. Trong khi đó, ở
nƣớc ta, chăn nuôi gia súc nhai lại để cung cấp sức kéo, thịt, sữa lại tập trung chủ
yếu ở các tỉnh miền núi và trung du là các vùng có điều kiện tự nhiên thích hợp cho
sự phát triển chăn nuôi gia súc nhai lại, nhƣng cơ sở hạ tầng phục vụ công tác chẩn
đoán và điều trị tại địa phƣơng còn yếu kém; dẫn tới hệ quả là bệnh tiên mao trùng
trở nên phổ biến hơn, nghiêm trọng hơn và gây thiệt hại lớn hơn.

Sốofhóa
bởi Trung tâm Học liệu
Footer Page 10
126.

/>

Header Page 11 of 126.

2

Hiện nay nƣớc ta đã sử dụng nhiều phƣơng pháp chẩn đoán bệnh tiên mao trùng
nhƣ: phƣơng pháp chẩn đoán truyền thống, phƣơng pháp chẩn đoán huyết thanh học,
phƣơng pháp chẩn đoán sinh học phân tử. Trong đó, phƣơng pháp chẩn đoán huyết

thanh học đƣợc đánh giá là có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, cho kết quả nhanh và có khả
năng chẩn đoán với số lƣợng mẫu lớn, trong thời gian ngắn.
Các phƣơng pháp chẩn đoán huyết thanh học bệnh tiên mao trùng đƣợc thực
hiện dựa trên nguyên tắc phát hiện, kháng nguyên hoặc kháng thể trong máu gia súc
bệnh. Tuy vậy, kháng nguyên bề mặt của tiên mao trùng lại rất đa dạng với nhiều
epitop biến đổi khác nhau. Việc lựa chọn một epitop kháng nguyên có tính ổn định và
tính đặc hiệu với nhiều serotype của tiên mao trùng là công việc cần thiết để đảm bảo
phƣơng pháp chẩn đoán có độ nhạy và đặc hiệu cao.
Theo nghiên cứu của Dia và cs (1997), Verloo và cs (1998 - 2000), kháng
nguyên Ro-TAT 1.2 có mặt ở hầu hết các VAT (Variable Antigen Type) của
Trypanosoma evansi. Kháng nguyên này có thể chế tạo đƣợc bằng công nghệ gen cho
khả năng phát hiện đặc hiệu kháng thể kháng tiên mao trùng đạt 98% (Verloo và cs,
2000). Trong khuôn khổ của đề tài này, chúng tôi tiến hành: “Nghiên cứu tách dòng
và biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên bề mặt của tiên mao trùng (Trypanosoma
evansi) lưu hành ở Việt Nam”.
2. Mục tiêu của đề tài
- Xác định đƣợc gen mã hóa kháng nguyên bề mặt của tiên mao trùng
- Tạo đƣợc dòng tế bào vi khuẩn biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên bề mặt
của tiên mao trùng
3. Điểm mới của đề tài
- Đề tài xác định đƣợc gen mã hóa kháng nguyên Ro-TAT 1.2 của tiên mao
trùng phân lập ở Việt Nam tạo cơ sở cho việc xác định cấu trúc kháng nguyên.
- Kháng nguyên Ro-TAT 1.2 đƣợc chế tạo bằng công nghệ gen ở Việt Nam sẽ
phục vụ việc sản xuất Kit chẩn đoán có khả năng phát hiện đặc hiệu với bệnh tiên mao
trùng ở Việt Nam do tính tƣơng đồng kháng nguyên.

Sốofhóa
bởi Trung tâm Học liệu
Footer Page 11
126.

/>

Header Page 12 of 126.

3

4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
4.1. Ý nghĩa khoa học
Đề tài thực hiện tách dòng, xác định trình tự gen mã hóa kháng nguyên bề
mặt RoTAT 1.2 và biểu hiện đƣợc gen mã hóa kháng nguyên bề mặt RoTAT 1.2 của
tiên mao trùng Trypanosoma evansi phân lập ở Việt Nam.
4.2. Ý nghĩa thực tiễn
Sản phẩm của đề tài là cơ sở cho nghiên cứu sản xuất kháng nguyên tái tổ
hợp, phục vụ chế tạo Kit chẩn đoán có khả năng phát hiện đặc hiệu bệnh tiên mao
trùng gia súc ở Việt Nam do tính tƣơng đồng kháng nguyên.

Sốofhóa
bởi Trung tâm Học liệu
Footer Page 12
126.

/>

Header Page 13 of 126.

4

Chƣơng 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. TIÊN MAO TRÙNG VÀ BỆNH TIÊN MAO TRÙNG Ở GIA SÚC
Bệnh tiên mao trùng đƣợc Blanchard (1888) phát hiện đầu tiên ở Việt Nam.
Sau đó, bệnh đƣợc xác định là phổ biến ở hầu hết các tỉnh thành trong cả nƣớc. Bệnh
do loài tiên mao trùng Trypanosoma evansi gây ra. Trâu, bò, ngựa mắc bệnh dễ chết
hoặc thiếu máu, suy nhƣợc, giảm hoặc mất khả năng sinh sản và sức sản xuất.
1.1.1. Đặc điểm hình thái, cấu trúc và phân loại tiên mao trùng
1.1.1.1. Vị trí của tiên mao trùng Trypanosoma trong hệ thống phân loại động vật
nguyên sinh
Theo Levine và cs (1980) (dẫn theo Lƣơng Văn Huấn và cs, 1997) [4], vị trí
của tiên mao trùng trong hệ thống phân loại nguyên bào (Protozoa) nhƣ sau:
Ngành Sarcomastigophora
Phân ngành Mastigophora
Lớp Zoomastigophorasida
Bộ Kinetoplastorida
Phân bộ Trypanosomatorida
Họ Trypanosomatidae Donein, 1901
Giống Trypanosoma Gruby, 1843
Giống phụ Megatrypanum Hoare, 1964
Loài Trypanosoma (M) theileria
Giống phụ Herpetosoma Donein, 1901
Loài Trypanosoma (H) leisi
Giống phụ Schizotrypanum Chagas, 1909
Loài Trypanosoma (S) cruzi
Giống phụ Duttonella Chalmers, 1918
Loài Trypanosoma (D) vivax
Loài Trvpanosoma (D) uniform

Sốofhóa
bởi Trung tâm Học liệu
Footer Page 13

126.

/>

Header Page 14 of 126.

5

Giống phụ Nalmomonas Hoare, 1964
Loài Trypanosoma (N) congolense
Loài Trypanosoma (N) siminae
Loài Trypanosoma (N) vanhogi
Giống phụ Trypanozoon Liihe, 1906
Loài Trypanosoma (T) brucei
Loài Trypanosoma (T) gambience
Loài Trypanosoma (T) rhodesiense
Loài Trypanosoma (T) equiperdum
Giống phụ Pycnomonas Hoare, 1964
Loài Trypanosoma (P) suis
Giống phụ Trypanosoma Gruby, 1843
Loài Trypanosoma evansi (Steel, 1885)
Trong các loài tiên mao trùng trên, có 7 loài đƣợc tổ chức dịch tễ quốc tế
(OIE) thông báo là có khả năng gây bệnh cho ngƣời và động vật có vú, đó là: T.
brucei, T. congolense, T. cruzi, T. evansi, T. gambiense, T. siminae, T. vivax.
1.1.1.2. Đặc điểm hình thái, cấu tạo của tiên mao trùng
Tiên mao trùng T. evansi đƣợc xếp vào loại đơn hình thái, cơ thể chỉ là một
tế bào, có kích thƣớc nhỏ, chiều dài 18 - 34 μm (trung bình là 25 μm), chiều rộng
1,5 - 2μm. Cơ thể có hình suốt chỉ mảnh hoặc hình thoi, cuối thân nhọn. Nhìn
chung, cấu trúc cơ bản của T. evansi cũng giống nhƣ cấu trúc của các loài tiên mao
trùng khác thuộc họ Trypanosomatidae. Cấu trúc từ ngoài vào trong đƣợc chia

thành 3 phần chính:
- Vỏ: ngoài cùng là lớp vỏ dày 10 - 15 nm, vỏ đƣợc chia làm 3 lớp (lớp ngoài
và lớp trong cùng tiếp giáp với nguyên sinh chất dầy hơn lớp giữa). Lớp vỏ ngoài
cùng đƣợc cấu tạo từ các phân tử glycoprotein luôn biến đổi (Vanant Glycoprotein
Surface -VGS). Tiếp giáp với lớp trong cùng là 9 cặp vi ống xếp song song dọc theo
chiều dài thân tiên mao trùng. Chính nhờ sự sắp xếp của các cặp vi ống nên tiên
mao trùng có dạng hình suốt chỉ mảnh (Hoare, 1972 [21]; Phạm Sỹ Lăng, 1982 [6];
Nguyễn Quốc Doanh, 1999 [3]).

Sốofhóa
bởi Trung tâm Học liệu
Footer Page 14
126.

/>

Header Page 15 of 126.

6

- Nguyên sinh chất: gồm lớp trong và lớp ngoài. Trong nguyên sinh chất có chứa
các nội quan: ribosome có màu thẫm xen kẽ vùng không bào màu sáng, kinetoplast (thể
cơ động), mitochrondno, reticulum (lƣới nội bào) và mạng lƣới golgi.
- Nhân: nhân tiên mao trùng có chứa ADN, hình bầu dục hoặc hình trứng.
Nhân thƣờng nằm ở vị trí trung tâm hoặc gần vị trí trung tâm cơ thể. Ngoài nhân, về
phía cuối thân còn có thể kinetoplast chứa AND (KADN). Từ kinetoplast có một roi
chạy vòng quanh thân lên đầu và ra phía ngoài cơ thể thành một roi tự do. Roi của
tiên mao trùng có lớp vỏ ngoài cùng giống lớp vỏ của thân. Trong roi có 9 cặp vi
ống ở xung quanh và một cặp ở trung tâm, xếp song song dọc chiều dài roi (Hoare,
1972 [21]; Nguyễn Quốc Doanh, 1999 [3]).

1.1.1.3. Cấu trúc kháng nguyên của tiên mao trùng Trypanosoma evansi
Kháng nguyên của T. evansi gồm hai loại: kháng nguyên ổn định (kháng
nguyên không biến đổi) và kháng nguyên biến đổi
* Kháng nguyên ổn định (kháng nguyên không biến đổi)
Phần lớn các thành phần kháng nguyên tiên mao trùng không biến đổi trong
quá trình sống ký sinh. Bằng phƣơng pháp điện di miễn dịch huyết thanh thỏ tối
miễn dịch với T. evansi, Kageruka (1982) đã phát hiện tới 30 thành phần kháng
nguyên khác nhau. Có ba loại kháng nguyên không biến đổi ở màng nguyên sinh
chất tế bào (ISG: Invanant Surface Glycoprotein): ISG 65, ISG 75 và ISG 100. Do
cấu trúc không gian ba chiều và đặc tính ƣa nƣớc, các loại này không kết hợp với
kháng thể của vật chủ (Nolan, 1997).
* Kháng nguyên biến đổi
Về kháng nguyên biến đổi, cần đề cập đến sự biến đổi lớp vỏ bề mặt VSG
(Variant Surface Glycoprotein), những quan điểm mới về sự xuất hiện kháng nguyên
biến đổi của tiên mao trùng và cơ chế di truyền của kháng nguyên biến đổi.
Nhờ kháng thể đặc hiệu đƣợc đánh dấu mà Vickerman và Luckins (1969) đã
phát hiện ra sự biến đổi của lớp kháng nguyên bề mặt. Cross (1975) đã mô tả lớp áo
bề mặt của tiên mao trùng có thành phần là glycoprotein bao phủ toàn bộ bề mặt tế
bào bằng một lớp phân tử giống nhau (mỗi tiên mao trùng có 107 phân tử). Lớp áo

Sốofhóa
bởi Trung tâm Học liệu
Footer Page 15
126.

/>

Header Page 16 of 126.

7

bề mặt này kích thích cơ thể vật chủ tạo ra kháng thể đặc hiệu với từng type kháng
nguyên biến đổi VAT (Variable Antigen Type). Chỉ có kháng nguyên biến đổi mới
có khả năng kích thích vật chủ tạo miễn dịch chủ động. Ngƣời ta ƣớc lƣợng rằng,
một con tiên mao trùng có ít nhất vài trăm hoặc vài nghìn VSG, nghĩa là 5 - 10% số
gen của tiên mao trùng cung cấp cho kháng nguyên bề mặt này.
Nhiều tác giả nghiên cứu về miễn dịch học cho rằng, tiên mao trùng biến đổi
kháng nguyên bề mặt để né tránh đáp ứng miễn dịch đặc hiệu của vật chủ. Tuy nhiên,
Van Meirvenne (1975) cho biết, sự biến đổi kháng nguyên bề mặt của ký sinh trùng đã
có ngay ở pha đầu tiên của quá trình nhiễm (trƣớc khi xuất hiện đáp ứng miễn dịch của
cơ thể vật chủ). Theo Hajduc và Vickernlan (1981), hiện tƣợng biến đổi kháng nguyên
bề mặt của tiên mao trùng còn thấy ở gia súc đã bị tiêm thuốc làm suy giảm miễn dịch.
Những quan điểm này là hoàn toàn mới để lý luận về sự xuất hiện kháng nguyên biến
đổi của tiên mao trùng. Nhƣ vậy, quan điểm về sự biến đổi kháng nguyên lớp vỏ của
tiên mao trùng cho đến nay vẫn chƣa thống nhất.
* Cơ chế di truyền của kháng nguyên biến đổi
Khi kháng thể đặc hiệu kết hợp với phân tử của kháng nguyên bề mặt (VSG),
làm tiêu tan tiên mao trùng thì đó cũng là nguyên nhân chính thúc đẩy sự hoạt hoá
của gen. Kết quả là các phân tử kháng nguyên VSG đƣợc thay đổi hoàn toàn bằng
các phân tử VSG mới. Lúc này, kháng thể đặc hiệu lúc trƣớc đã không còn tác dụng
đối với kháng nguyên mới này.
Theo Barry và Tumer (1991) [16], các VSG đƣợc mã hoá nhờ các gen
chuyên biệt. Từ kho chứa hàng nghìn VSG khác nhau, một gen VSG đƣợc hoạt hoá
một cách chọn lọc, dẫn đến tổng hợp ra một loại kháng nguyên VSG mới. Mỗi VSG
mới tạo ra một loại kháng nguyên VSG mới. Trong bộ gen của tiên mao trùng tồn
tại một số lớn gen VSG, các gen này sử dụng nhiều cơ chế sắp xếp khác nhau, do
vậy tiên mao trùng đã tạo ra nhiều VSG khác nhau ở gia súc bị bệnh mãn tính. Cơ
chế biến đổi kháng nguyên theo 2 cách: cách thứ nhất là, sử dụng lần lƣợt các điểm
biểu hiện trên (expression si de) khác nhau, không có sự sắp xếp của ADN. Các
điểm biểu hiện khác nhau sẽ mang các gen VSG khác nhau, sự luân phiên này dẫn

Sốofhóa
bởi Trung tâm Học liệu
Footer Page 16
126.

/>

Header Page 17 of 126.

8

đến sự thay đổi type kháng nguyên. Cơ chế này quan sát đƣợc chủ yếu ở giai đoạn
đầu của quá trình cảm nhiễm. Có lẽ ở giai đoạn đầu này chƣa có đáp ứng miễn dịch
của vật chủ đối với VSG, chính điều này không gây ra một cản trở hoạt hoá tự nhiên
của các điểm biểu hiện gen này. Cách thứ hai là, tập hợp lại các đoạn ADN khác
nhau để tái tổ hợp gen, mà việc tái tổ hợp này cho phép thay thế hoàn toàn hoặc
từng phần gen; hoặc việc thay thế diễn ra dựa vào sự chuyển đổi gen chứ không
phải dựa vào tái tổ hợp gen. Trƣờng hợp này đƣợc diễn giải nhƣ sau: một gen hoạt
hoá đƣợc thay thế bằng bản sao chép của một gen khác. Do có sự thay thế một phần
của gen nên đã tạo ra loại gen phức hợp và đặc trƣng.
1.1.2. Dịch tễ học bệnh tiên mao trùng
1.1.2.1. Phân bố của bệnh
Bệnh tiên mao trùng phân bố rất rộng, từ phía Tây sang phía Đông bán cầu.
Phía Tây bán cầu thuộc châu Mỹ, phía Đông bán cầu trải dài từ châu Phi cho đến
Philippine.
Ở Việt Nam, bệnh tiên mao trùng thấy ở hầu hết các vùng sinh thái khác
nhau: miền núi, trung du, đồng bằng, ven biển. Theo Phạm Sỹ Lăng (1982) [6],
bệnh tiên mao trùng có ở tất cả các tỉnh miền Bắc (Bắc Kạn, Lạng Sơn, Tuyên
Quang, Thái Nguyên, Ninh Bình, Hà Tây). Trâu, bò nhiễm bệnh với tỷ lệ cao và

thay đổi giữa các vùng khác nhau (trâu, bò ở đồng bằng nhiễm tiên mao trùng cao
hơn vùng trung du và miền núi, đặc biệt ở trâu, bò có nguồn gốc từ miền núi chuyển
xuống vùng đồng bằng).
Lê Ngọc Mỹ và cs (1994) [7] đã điều tra tình hình nhiễm tiên mao trùng ở
trâu bò Việt Nam. Kết quả cho thấy, trâu bò nhiễm tiên mao trùng với tỷ lệ cao
(21,27%), trong đó trâu bò nuôi ở các tỉnh miền núi phía Bắc nhiễm T. evansi cao
hơn ở đồng bằng.
1.1.2.2. Vật chủ và vật môi giới truyền bệnh tiên mao trùng
Trong tự nhiên, tiên mao trùng ký sinh ở hầu hết các loài thú nuôi và thú hoang,
thấy nhiều hơn ở trâu, bò, ngựa, trâu bò rừng, hƣơu, nai, hổ, báo, sƣ tử, chó, mèo, lạc
đà, voi thỏ, chuột cống, chuột lang, chuột bạch..., nhƣng không ký sinh ở ngƣời.

Sốofhóa
bởi Trung tâm Học liệu
Footer Page 17
126.

/>

Header Page 18 of 126.

9

Chen Qijun (1992) cho biết: T. evansi gây bệnh cho hầu hết các loài động vật
nhƣ trâu, bò, ngựa, la, chó… ở Trung Quốc.
Theo Sukanto I. P (1992): tỷ lệ lƣu hành bệnh tiên mao trùng ở trâu
Indonesia cao hơn ở bò và tỷ lệ lƣu hành bệnh ở bò lại cao hơn ở ngựa.
Sự lây truyền tiên mao trùng từ trâu, bò ốm sang trâu, bò khoẻ là nhờ các loài
ruồi hút máu (thuộc họ phụ Stomoxydinae) và các loài mòng hút máu (thuộc họ
Tabanidae). Ruồi và mòng hút máu của gia súc bị bệnh, hút luôn cả tiên mao trùng

vào vòi hút, sau đó lại hút máu gia súc khoẻ, trong khi hút máu sẽ truyền tiên mao
trùng từ vòi hút vào máu con vật khoẻ. Sự lây truyền này mang tính chất cơ học.
Nhƣ vậy, ruồi và mòng hút máu là những vật môi giới truyền bệnh tiên mao trùng
quan trọng.
Hình thái tiên mao trùng khi ở trong vòi ruồi, mòng biến đổi theo thời
gian: từ 1 - 34 giờ có hình thái, kích thƣớc bình thƣờng; 35 - 45 giờ: tiên mao
trùng có hình dạng thay đổi, tăng kích thƣớc chiều rộng và thô dần; 46 - 53
giờ: tiên mao trùng trƣơng to, duỗi thẳng, mất khả năng di động và ngừng hẳn
hoạt động.
Thực nghiệm đã chứng minh khả năng gây bệnh của tiên mao trùng sau khi
xâm nhập vào mòng Tabanus rubidus nhƣ sau: Thời gian từ giờ thứ 1 đến thứ 5,
tiên mao trùng có khả năng gây bệnh và làm chết chuột bạch tƣơng tự nhƣ khi
truyền thẳng máu có tiên mao trùng cho chuột; từ giờ thứ 6 đến thứ 7 chỉ còn 30%
số chuột thí nghiệm phát bệnh, thời gian gây bệnh kéo dài và thời gian chết của
chuột cũng dài. Điều này có thể giải thích là do độc lực của tiên mao trùng giảm dần
và số lƣợng tiên mao trùng còn hoạt lực gây bệnh cũng giảm dần sau khi chúng xâm
nhập vào mòng Tabanus rubidus.
1.1.2.3. Tuổi vật chủ, mùa mắc bệnh
Trâu, bò và các loài gia súc khác ở mọi lứa tuổi đều nhiễm tiên mao trùng và
đều phát bệnh, có thể dẫn đến tử vong hoặc suy nhƣợc, thiếu máu, giảm sức đề
kháng, giảm khả năng sinh đẻ và sức sản xuất.

Sốofhóa
bởi Trung tâm Học liệu
Footer Page 18
126.

/>

Header Page 19 of 126.

10

1.1.3. Đặc điểm bệnh lý và lâm sàng của bệnh
1.1.3.1. Đặc điểm bệnh lý
Khi ruồi trâu, mòng đốt, hút máu và truyền tiên mao trùng vào trâu, bò,
ngựa, tiên mao trùng xâm nhập vào da, gây ra vết viêm trên mặt da. Theo có thể
quan sát đƣợc phản ứng viêm ở da của thỏ, cừu, dê và bò gây nhiễm thực nghiệm
tiên mao trùng, kích thƣớc chỗ viêm phụ thuộc vào số lƣợng tiên mao trùng đƣợc
tiêm truyền (ƣớc chừng khoảng 108 tiên mao trùng có thể gây viêm da - ở vị trí
tiêm truyền), một số lƣợng lớn tiên mao trùng phát triển ở tại chỗ viêm này.
Vào máu, tiên mao trùng nhân lên theo cấp số nhân ở trong máu, trong bạch
huyết và ở trong các mô khác của cơ thể vật chủ theo cách phân chia theo chiều dọc.
Số lƣợng tiên mao trùng trong máu không phải lúc nào cũng nhƣ nhau. Mật độ tiên
mao trùng thay đổi theo ngày. Biểu đồ sóng tiên mao trùng cho thấy, xen kẽ giữa
những sóng tiên mao trùng mạnh là những đợt sóng yếu. Mỗi đợt sóng tiên mao
trùng bắt đầu bằng sự tăng số lƣợng tiên mao trùng trong máu, sau đó giảm và khó
phát hiện thấy tiên mao trùng. Mỗi đợt tiên mao trùng tăng lên trong máu là biểu
hiện sự xuất hiện một quần thể tiên mao trùng có tính kháng nguyên bề mặt mới,
quần thể này có thể tiếp tục sinh sản và tồn tại một thời gian cho đến khi cơ thể xuất
hiện kháng thể đặc hiệu với chúng.
Tiên mao trùng phát triển nhanh trong máu, tiêu thụ Glucose, các chất đạm,
chất béo và khoáng chất trong máu ký chủ bằng phƣơng thức thẩm thấu qua bề mặt
cơ thể để duy trì hoạt động và sinh sản. Ở súc vật bị bệnh, trong 1 ml máu có thể có
10.000 - 30.000 tiên mao trùng. Với số lƣợng nhiều nhƣ vậy, tiên mao trùng chiếm
đoạt dinh dƣỡng nhiều, làm cho súc vật bệnh gây còm, thiếu máu và mất dần khả
năng sản xuất sữa, thịt, mất dần khả năng sinh sản và giảm sức đề kháng với các
bệnh khác.
Sống trong máu vật chủ, tiên mao trùng còn tạo ra độc tố Trypanotoxin, độc tố
này gồm: độc tố do tiên mao trùng tiết ra qua màng thân trong quá trình sống và độc

tố do xác chết của tiên mao trùng phân huỷ trong máu sau 15 - 30 ngày. Độc tố của
tiên mao trùng tác động lên hệ thần kinh trung ƣơng làm rối loạn trung khu điều hoà

Sốofhóa
bởi Trung tâm Học liệu
Footer Page 19
126.

/>

Header Page 20 of 126.

11

thân nhiệt, gây sốt cao và gián đoạn (lúc sốt, lúc hết sốt xen kẽ nhau). Khi sốt thƣờng
có rối loạn về thần kinh (kêu rống, run rẩy, ngã vật xuống). Độc tố cũng phá huỷ
hồng cầu, ức chế cơ quan tạo máu làm cho vật chủ thiếu máu và suy nhƣợc dần. Độc
tố còn tác động tới bộ máy tiêu hoá, gây rối loạn tiêu hoá, làm con vật ỉa chảy. Hội
chứng tiêu chảy thƣờng xảy ra khi xuất hiện tiên mao trùng trong máu con vật bệnh.
Khi tăng lên với số lƣợng lớn trong máu, tiên mao trùng còn làm tắc các mao
mạch, làm tăng tính thấm thành mạch, dần dần tạo ra các ổ thuỷ thũng chất keo
vàng dƣới da.
1.1.3.2. Triệu chứng lâm sàng của bệnh tiên mao trùng ở trâu, bò, ngựa
* Ở trâu, bò:
Trâu, bò bị bệnh thể hiện các triệu chứng lâm sàng chủ yếu nhƣ sau:
- Sốt cao và gián đoạn: sau 14 - 30 ngày bị ruồi, mòng hút máu truyền tiên
0

mao trùng, trâu bò thƣờng đột ngột lên cơn sốt (40 - 41,7 C) kéo dài 2 - 4 ngày rồi
giảm, thời gian sau nhiệt độ lại tăng lên. Thời gian gián đoạn giữa hai cơn sốt dài hay

ngắn tuỳ theo thể trọng con vật. Khi sốt, kiểm tra máu thƣờng thấy tiên mao trùng.
- Hội chứng thần kinh: ở một số trâu, bò khi lên cơn sốt còn thể hiện hội
chứng thần kinh nhƣ điên loạn, mắt đỏ ngầu, húc đầu vào tƣờng, chạy vòng quanh
kêu rống lên. Trƣờng hợp nhẹ thấy run rẩy từng cơn, mắt trợn ngƣợc rồi đổ ngã vật
xuống, sùi bọt mép giống nhƣ trâu bị cảm nắng. Sau 20 - 30 phút con vật lại đứng
dậy đi lại đƣợc. Những trâu bò mắc bệnh có triệu chứng lâm sàng nhƣ trên thƣờng
là mắc bệnh ở thể cấp tính.
Trâu, bò bị bệnh mạn tính thƣờng kéo dài, cơ thể suy yếu, liệt hai chân sau,
nằm tƣ thế quỳ và không đi lại đƣợc. Mặc dù nằm liệt nhƣng vẫn ăn và nhai lại cho
đến khi sắp chết.
- Phù thũng dƣới da: phù thũng thƣờng thấy ở vùng thấp của cơ thể nhƣ ở
bốn chân (từ khớp khuỷu trở xuống), phần yếm, ngực, bộ phận sinh dục.
- Viêm giác mạc và kết mạc mắt: triệu chứng này thấy ở hầu hết trâu, bò
bệnh. Mắt có dử trắng hay vàng, chảy liên tục, nếu nặng thì mắt sƣng đỏ ngầu. Khi
khỏi bệnh, mắt có màng trắng (củi nhãn) kéo che kín giác mạc.

Sốofhóa
bởi Trung tâm Học liệu
Footer Page 20
126.

/>

Header Page 21 of 126.

12

- Hội chứng tiêu hoá: một số trâu, bò bệnh bị ỉa chảy nặng, phân lỏng, màu
vàng, sau chuyển màu xám, có lẫn bọt và chất nhầy. Các đợt ỉa chảy tiếp theo
những cơn sốt cách quãng. Ỉa chảy trong bệnh tiên mao trùng thƣờng dai dẳng và

con vật vẫn ăn đƣợc.
- Gầy yếu, suy nhƣợc: ở thể bệnh cấp tính trâu, bò gầy sút nhanh, chỉ sau 7 –
14 ngày từ khi phát bệnh con vật đã gầy rộc, mắt trũng sâu. Nếu bệnh kéo dài thì
con vật gầy xơ xác, lông dựng ngƣợc, da khô nhăn nheo, niêm mạc mắt nhợt nhạt,
lông dễ rụng, dần dần suy nhƣợc cơ thể nặng, mất khả năng cày kéo và sinh sản.
Nếu gặp điều kiện bất lợi nhƣ thiếu ăn, rét mƣớt thì trâu, bò dễ chết. Trong thực tế,
có khoảng 3% trâu bệnh ở thể ẩn vẫn béo khoẻ, làm việc bình thƣờng khi đƣợc
chăm sóc nuôi dƣỡng tốt.
Tình trạng thiếu máu thể hiện rõ trong bệnh do T. evansi gây ra. Theo Silva
Rams và cs (1995), Smith R. D. (1995), số lƣợng hồng cầu và hàm lƣợng huyết sắc
tố giảm, số lƣợng bạch cầu tăng, thành phần bạch cầu thay đổi: bạch cầu lymphô,
bạch cầu ái toan tăng nhƣng bạch cầu trung tính giảm, protein tổng số và Albumin
giảm rõ rệt.
* Ở ngựa
Sau khi ruồi, mòng hút máu và truyền T. evansi, ngựa phát bệnh sau 1 - 2
0

tuần. Triệu chứng rõ nhất là ngựa sốt 40 - 41 C, sốt gián đoạn, khi sốt có tiên mao
trùng ở máu ngoại vi. Khi bị bệnh nặng, ngựa thƣờng sốt cao đột ngột, các triệu
chứng khác chƣa kịp thể hiện thì con vật đã lăn lộn điên cuồng rồi chết. Thể bệnh
cấp tính diễn ra khoảng 1 - 3 tuần, thể mãn tính kéo dài 2 - 4 tháng (tuy nhiên, thể
mãn tính thƣờng ít gặp).
Hiện tƣợng thuỷ thũng xuất hiện ở vùng thấp của cơ thể (ngực, bụng, âm hộ, vú)
sau 1 - 2 tuần kể từ khi phát bệnh. Ngựa đi đứng xiêu vẹo, gầy sút rất nhanh, ăn kém, da
khô, lông dựng, bốn chân run rẩy, hay nằm, dần dần liệt chân, nằm một chỗ rồi chết.
1.1.3.3. Bệnh tích của bệnh tiên mao trùng
Trâu, bò bị bệnh tiên mao trùng khi chết gầy xơ xác, mổ khám thấy có những
biến đổi bệnh tích đại thể rõ rệt ở hệ tuần hoàn và hô hấp: tim nhão, xoang bao tim

Sốofhóa

bởi Trung tâm Học liệu
Footer Page 21
126.

/>

Header Page 22 of 126.

13

tích nƣớc vàng; phổi xung huyết và tụ máu từng đám nhỏ; gan sƣng to, nhạt màu;
lách sƣng, mềm nhũn và nhạt màu; hạch lâm ba sƣng và có tụ máu trong hạch; cơ
nhão, màu nhợt nhạt, nhát cắt rỉ nƣớc; xoang ngực và xoang bụng tích dịch màu vàng
nhạt; có những đám keo nhầy vàng dƣới vùng da thuỷ thũng.
1.1.4. Chẩn đoán bệnh tiên mao trùng
1.1.4.1. Chẩn đoán lâm sàng
Các biểu hiện lâm sàng đặc trƣng của bệnh tiên mao trùng ở trâu, bò, ngựa
không phải lúc nào cũng phát hiện đƣợc. Rất nhiều gia súc mang bệnh nhƣng khó
phát hiện các triệu chứng đặc trƣng, nhất là đối với những gia súc mắc bệnh tiên
mao trùng mãn tính. Đối với gia súc mắc bệnh ở thể cấp tính, các biểu hiện bệnh
đặc trƣng là sốt cao, bỏ ăn, có triệu chứng thần kinh (điên loạn) và chết nhanh. Trâu
bị bệnh mãn tính có thể thấy triệu chứng: sốt gián đoạn, gầy còm, thiếu máu kéo
dài, viêm giác mạc, phù thũng ở bụng và chân sau, chết do kiệt sức (Phạm Sỹ Lăng,
1982 [6]). Triệu chứng sẩy thai có thể thấy ở trâu, bò bị bệnh tiên mao trùng
(Nguyễn Đăng Khai, 1995 [5]; Kashiwazaki, 1998).
1.1.4.2. Chẩn đoán thí nghiệm
Có nhiều phƣơng pháp chẩn đoán tiên mao trùng trong phòng thí nghiệm,
mục đích là phát hiện tiên mao trùng trong máu gia súc. Tùy từng trƣờng hợp bệnh,
tuỳ điều kiện mà có thể làm cùng lúc một số phƣơng pháp hoặc lựa chọn một
phƣơng pháp phù hợp và có độ chính xác cao.

* Phương pháp phát hiện tiên mao trùng trực tiếp:
Muốn phát hiện tiên mao trùng trực tiếp, có thể áp dụng những phƣơng
pháp sau:
- Phƣơng pháp xem tƣơi (Direct smear)
Khi bệnh súc sốt, T. evansi thƣờng xuất hiện trong mao quản ngoại vi; vì
vậy, nên lấy máu vùng ngoại vi để xem tƣơi. Cho 1 giọt máu nhỏ lên phiến kính đã
có sẵn 1 giọt EDTA 1%; dùng góc của la men khuấy đều, đậy la men lên để máu
dàn theo la men thành một lớp mỏng. Soi dƣới kính hiển vi (độ phóng đại 10 x 10
và 10 x 20) để phát hiện tiên mao trùng sống.

Sốofhóa
bởi Trung tâm Học liệu
Footer Page 22
126.

/>

Header Page 23 of 126.

14

- Phƣơng pháp nhuộm Giemsa tiêu bản máu khô (Romanovsky)
+ Phƣơng pháp giọt dầy: Đặt 1 giọt máu to vào giữa phiến kính, dùng một
góc của đầu một phiến kính khác ria tròn giọt máu với đƣờng kính khoảng 1 - 1,25
cm. Để khô tự nhiên trong khoảng 1 giờ, rồi cố định bằng cồn Methanol, nhuộm
Giemsa [1 giọt Giemsa + 1 ml dung dịch PBS (Phosphat Buffered Saline) pH = 7,2]
trong 25 phút. Rửa tiêu bản dƣới vòi nƣớc chảy mạnh, để khô rồi soi dƣới kính hiển
vi (độ phóng đại 10 x 100 hoặc 10 x 90).
Phƣơng pháp này có nhƣợc điểm là dễ làm tổn thƣơng tiên mao trùng, do đó
khó phân biệt đƣợc các loài khác nhau trong trƣờng hợp nhiễm nhiều loài tiên mao

trùng cùng một lúc.
+ Phƣơng pháp giọt mỏng: Đặt 1 giọt máu cách 1 đầu phiến kính 2 cm, dùng
la men ria máu thành một lớp mỏng. Để khô, cố định bằng cồn Methanol trong 2
phút. Nhuộm Giemsa trong 25 phút (l giọt Giemsa + 1 ml dung dịch PBS pH = 7,2).
Rửa tiêu bản dƣới vòi nƣớc chảy mạnh, để khô, soi dƣới kính hiển vi (độ phóng đại
10 x 100 hoặc 10 x 90).
Ƣu điểm của phƣơng pháp giọt mỏng là có thể phân biệt đƣợc hình thái các
loài tiên mao trùng khác nhau.
+ Phƣơng pháp làm tan hồng cầu: dung dịch SDS (Sodium Dodecyl Sulfat)
là chất làm tan hồng cầu. Nhờ dung dịch SDS, tiên mao trùng dễ dàng đƣợc phát
hiện trong máu. Dung dịch SDS rất độc nên tránh tiếp xúc với da và tránh hút bằng
pipet. Dung dịch SDS dễ bảo quản ở nhiệt độ thƣờng trong nhiều tháng (Van
Meirvenne, 1989).
* Phương pháp tập trung tiên mao trùng:
Ngƣời ta đã sử dụng phƣơng pháp ly tâm tập trung tiên mao trùng bằng ống
Haematocrit hoặc tách tiên mao trùng bằng gen DEAE - cellulose.
- Phƣơng pháp ly tâm tập trung bằng ống Haematocrit (WOO, 1971): cho
máu động vật nghi mắc bệnh vào ống Haematocrit, một đầu ống đƣợc bịt kín bằng
chất dẻo matit, một đầu ống để hở. Ly âm với tốc độ 14000 vòng/phút trong 5 phút.
Sau đó kiểm tra sự tập trung của tiên mao trùng tại vị trí tiếp giáp giữa huyết tƣơng
và hồng cầu (độ phóng đại 10 x 10).

Sốofhóa
bởi Trung tâm Học liệu
Footer Page 23
126.

/>

Header Page 24 of 126.

15

Phƣơng pháp này đơn giản, phát hiện tiên mao trùng tốt hơn phƣơng pháp
xem tƣơi và nhuộm Giemsa. Song, tỷ lệ phát hiện chƣa cao.
Với ống Haematocrit trên, có thể thực hiện phƣơng pháp Darkground: dùng
cƣa y tế cắt ống ở vị trí tiên mao trùng tập trung (ranh giới giữa huyết tƣơng và
hồng cầu), nhỏ 1 giọt huyết tƣơng lên phiến kính, đậy la men và kiểm tra dƣới kính
hiển vi (độ phóng đại 10 x 40).
* Phương pháp tiêm truyền động vật thí nghiệm:
Đây là phƣơng pháp phổ biến, hiệu quả, chính xác và thƣờng đƣợc ứng dụng
nhiều để chẩn đoán bệnh tiên mao trùng ở Việt Nam. Phƣơng pháp này có ƣu điểm
là chính xác, do trực tiếp phát hiện thấy tiên mao trùng sau khi nhân chúng lên trong
động vật thí nghiệm mẫn cảm. Song, nhƣợc điểm của phƣơng pháp tiêm truyền
động vật thí nghiệm là khi cần chẩn đoán nhanh, với số lƣợng nhiều và thời gian
ngắn thì phƣơng pháp này không thể đáp ứng đƣợc (Lê Ngọc Mỹ, 1994 [7]; Đoàn
Văn Phúc và cs, 1994 [9]).
* Phương pháp chẩn đoán huyết thanh học:
Bằng phƣơng pháp huyết thanh học, có thể phát hiện kháng thể hoặc kháng
nguyên tiên mao trùng. Đây là các phƣơng pháp huyết thanh học đặc hiệu.
- Các phương pháp phát hiện kháng thể kháng tiên mao trùng
Khi tiên mao trùng ký sinh, cơ thể vật chủ sinh ra kháng thể đặc hiệu chống
lại tiên mao trùng. Những phƣơng pháp sau cho phép phát hiện kháng thể kháng
tiên mao trùng trong máu vật chủ:
+ Phƣơng pháp ngƣng kết trên phiến kính (SAT: Slice Agglutination Test):
hoà tan 1 giọt huyết thanh gia súc nghi mắc bệnh vào 1 giọt nƣớc muối sinh lý trên
phiến kính, sau đó cho 1 giọt máu chuột bạch có nhiều tiên mao trùng vào, trộn đều,
đậy la men và soi dƣới kính hiển vi (độ phóng đại 10 x 20 hoặc 10 x 40). Nếu thấy
ngƣng kết hình hoa cúc là (+) và ngƣợc lại là (-). Phƣơng pháp này đơn giản, dễ làm
và có thể áp dụng trên diện rộng.

+ Phƣơng pháp LATEX (Latex Agglutination Test)
LATEX là phƣơng pháp đƣợc dùng để phát hiện kháng thể lƣu động có trong
máu của gia súc mắc bệnh tiên mao trùng.

Sốofhóa
bởi Trung tâm Học liệu
Footer Page 24
126.

/>

Header Page 25 of 126.

16

Nguyên lý của phƣơng pháp LATEX: khi kháng nguyên bề mặt T. evansi
gắn lên các hạt latex kết hợp với kháng thể đặc hiệu kháng tiên mao trùng ở trên bản
nhựa, thì sẽ xảy ra phản ứng ngƣng kết giữa kháng nguyên với kháng thể. Hiện tƣợng
ngƣng kết có thể quan sát đƣợc bằng mắt thƣờng, và đƣợc giải thích là do kháng
nguyên bề mặt tiên mao trùng đƣợc gắn lên các hạt latex là loại kháng nguyên hữu
hình, có nhiều điểm quyết định tính kháng nguyên bề mặt (epitop surface). Còn kháng
thể đặc hiệu kháng tiên mao trùng lại có nhiều điểm thụ thể (receptor) tƣơng ứng, đặc
hiệu với các điểm quyết định của kháng nguyên. Do đó, khi kháng nguyên tiên mao
trùng gặp kháng thể đặc hiệu kháng tiên mao trùng, sẽ có hiện tƣợng một phân tử
kháng thể đặc hiệu liên kết với nhiều phân tử kháng nguyên và ngƣợc lại. Kết quả là
các hạt latex cùng với kháng nguyên chụm lại, tạo thành đám ngƣng kết có thể quan
sát bằng mắt thƣờng. Kháng nguyên dùng cho phản ứng là kháng nguyên bề mặt
đƣợc tinh chế từ chủng T. evansi không nhuộm màu.
Phƣơng pháp này có thể ứng dụng trong kiểm tra dịch tễ và có thể ứng dụng ở
cơ sở. Tuy nhiên tỷ lệ phát hiện bệnh không cao do phƣơng pháp này cho kết quả

dƣơng tính cả khi con vật khỏi bệnh nhƣng vẫn còn kháng thể tồn tại trong huyết
thanh; mặt khác, đối với những súc vật mới nhiễm bệnh TMT trong huyết thanh chƣa
có kháng thể nên khi kiểm tra bằng phƣơng pháp LATEX sẽ cho kết quả âm tính.
* Phƣơng pháp CATT (Card Agglutination Test for Trypanosomiasis)
Đây là phƣơng pháp ngƣng kết trực tiếp giữa kháng nguyên và kháng thể
trên bản nhựa, đƣợc dùng để phát hiện kháng thể lƣu động trong máu động vật
nhiễm bệnh.
Nguyên lý: kháng nguyên TMT đã đƣợc nhuộm màu kết hợp với kháng thể
tạo thành những đám kết tủa li ti màu xanh.
Cách tiến hành: dùng ống hút 2,5 ml dung dịch buffer cho vào lọ kháng
nguyên chuẩn đã đƣợc nhuộm màu (CATT reagent), lắc đều. Cho vào lọ kháng
nguyên đối chứng (đối chứng dƣơng, đối chứng âm) mỗi lọ 0,5 ml dung dịch buffer,
lắc đều. Dùng micropipette pha loãng huyết thanh theo tỷ lệ cần chẩn đoán (1/8).
Cho các mẫu huyết thanh cần chẩn đoán đã đƣợc pha loãng lần lƣợt vào các vòng

Sốofhóa
bởi Trung tâm Học liệu
Footer Page 25
126.

/>