Thiết Kế Baculovirus Tái Tổ Hợp Mang Gen Mã Hóa Protein M1 Của Virus Cúm AH5n1 Để Tạo Chủng Sản Xuất Vaccine Thế Hệ Mới Bằng Công Nghệ Virus-Like Particle

Header Page 1 of 126.

ĐẠI HỌC THÁI NGUN
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUN SINH VẬT
----------------------------------------

Nguyễn Thị Phương

THIẾT KẾ BACULOVIRUS TÁI TỔ HỢP MANG GEN MÃ HĨA
PROTEIN M1 CỦA VIRUS CÚM A/H5N1 ĐỂ TẠO CHỦNG SẢN
XUẤT VACCINE THẾ HỆ MỚI BẰNG CƠNG NGHỆ VIRUSLIKE PARTICLE

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Hà Nội – 2013

Footer Page 1 of 126.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

Header Page 2 of 126.

ĐẠI HỌC THÁI NGUN
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUN SINH VẬT
----------------------------------------

Nguyễn Thị Phương

THIẾT KẾ BACULOVIRUS TÁI TỔ HỢP MANG GEN MÃ

HĨA PROTEIN M1 CỦA VIRUS CÚM A/H5N1 ĐỂ TẠO
CHỦNG SẢN XUẤT VACCINE THẾ HỆ MỚI BẰNG CƠNG
NGHỆ VIRUS-LIKE PARTICLE
Chun ngành: Hóa sinh
Mã số : 06 42 01 14

LUẬN VĂN THẠC SĨ
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. ĐỒNG VĂN QUYỀN

Hà Nội – 2013

Footer Page 2 of 126.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

Header Page 3 of 126.

LỜI CẢM ƠN
Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Đồng Văn
Quyền – Trưởng phòng Vi sinh vật học phân tử, Viện Cơng nghệ sinh học đã
dìu dắt, hướng dẫn, chỉ bảo tận tình và giúp đỡ tơi hồn thành luận văn tốt
nghiệp của mình. Đồng thời, TS ln tạo mọi điều kiện tốt nhất để tơi có thể
hồn thành các cơng việc chun mơn tại phòng.
Tơi xin gửi lời cảm ơn tới PGS.TS. Đinh Duy Kháng và các anh chị,
các bạn đồng nghiệp tại phòng Vi sinh vật học phân tử đã quan tâm, chia sẻ
và giúp đỡ tơi trong suốt thời gian qua.
Tơi xin gửi lời cảm ơn tới Ban Lãnh đạo Viện Cơng nghệ sinh học, Ban
Giám đốc Phòng thí nghiệm trọng điểm, Viện Cơng nghệ sinh học đã giúp đỡ

và tạo điều kiện cho tơi sử dụng các thiết bị hiện đại để có thể thực hiện đề tài
này.
Tơi xin gửi lời cảm ơn tới các thầy, cơ giáo tham gia cơng tác và giảng
dạy tại Phòng đào tạo sau đại học, trường Đại học Thái Ngun – Viện Sinh
thái và Tài ngun Sinh vật đã giúp đỡ tơi rất nhiều trong q trình học tập.
Cuối cùng, tơi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã giúp đỡ và
động viên để tơi có thể hồn thành khóa học của mình.

Hà Nội, ngày 11 tháng 11 năm 2013
Học viên

Nguyễn Thị Phương

Footer Page 3 of 126.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

Header Page 4 of 126.

MỤC LỤC
MỤC LỤC ..............................................................................................................4
ĐẶT VẤN ĐỀ.........................................................................................................1
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU.......................................................................3
1.1. Khái qt về bệnh cúm gia cầm.....................................................................3
1.1.1. Tình hình dịch bệnh trên thế giới ............................................................3
1.1.2. Tình hình dịch bệnh tại Việt Nam ...........................................................4
1.1.3. Con đường lây nhiễm và triệu chứng bệnh..............................................5
1.1.4. Chẩn đốn, phòng và điều trị bệnh do virus H5N1..................................7

1.2. Virus cúm A/H5N1 gây bệnh trên gia cầm ....................................................8
1.2.1. Đặc điểm cấu tạo ....................................................................................8
1.2.2. Cấu trúc hệ gen.......................................................................................9
1.2.3. Cơ chế gây bệnh của virus cúm A trong tế bào vật chủ .........................12
1.2.4. Các kháng ngun quan trọng của Virus cúm A/H5N1 .........................14
1.3.1. Nguồn gốc, sự phát triển của vaccine....................................................17
1.3.2. Vaccine VLP ........................................................................................20
1.3.2.1. Khái qt về VLP ...........................................................................20
3.2.2. Phương pháp tạo VLP.......................................................................21
3.2.3. Đặc điểm của vaccine VLP ............................................................... 23
3.2.4. Cơ chế tạo đáp ứng miễn dịch của VLP ............................................24
Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............................... 27
2.1. Vật liệu .......................................................................................................27
2.2. Phương pháp ............................................................................................... 27
2.2.1. Tách chiết RNA tổng số ........................................................................27
2.2.2. Phương pháp tổng hợp cDNA............................................................... 28
2.2.3. Thiết kế hộp gen m1 của virus cúm A/H5N1 .........................................29
2.2.4. Phương pháp gắn đoạn DNA ngoại lai vào vector................................ 30
2.2.5. Biến nạp DNA plasmid vào tế bào E.coli .............................................30
2.2.6. Tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn.....................................................31

Footer Page 4 of 126.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

Header Page 5 of 126.

2.2.7. Phương pháp cắt DNA bằng enzyme giới hạn.......................................32

2.2.8. Tinh sạch plasmid.................................................................................32
2.2.9. Xác định trình tự gen bằng máy giải trình tự gen tự động .....................32
2.2.10. Tách chiết DNA tổng số từ baculovirus tái tổ hợp............................... 34
2.2.11. Chuẩn bị tế bào Sf9 cho q trình đồng chuyền nạp ...........................34
2.2.12. Phương pháp cấy chuyển tế bào cơn trùng..........................................35
2.2.13. Đồng chuyển nạp (co-transfection) .....................................................35
2.2.14. Kiểm tra sự có mặt gen m1 trong tế bào cơn trùng Sf9 bằng PCR.......36
2.2.15. Kiểm tra sự biểu hiện của protein M1 bằng Western blot....................37
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.............................................................. 38
3.1. Kết quả tách chiết RNA ..............................................................................38
3.2. Khuếch đại gen m1 .....................................................................................38
3.2.2. Tách dòng gen m1 ................................................................................39
3.2.3. Thiết kế vector trung gian baculovirus mang hộp gen m1 .....................43
3.3. Chuẩn bị tế bào cơn trùng Spodoptera frugiperda (Sf9) ............................... 47
3.4. Đồng chuyển nạp tạo baculovirus tái tổ hợp mang hộp gen m1 ...................48
3.5. Kiểm tra sự có mặt của gen m1 trong virus tái tổ hợp bằng phương pháp PCR
..........................................................................................................................52
3.6. Kiểm tra sự biểu hiện của protein M1 ở tế bào Sf9......................................53
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...............................................................................56
DANH SÁCH CÁC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ LIÊN QUAN.............................. 57
TÀI LIỆU THAM KHẢO .....................................................................................58
PHỤ LỤC..............................................................................................................65
LỜI CAM ĐOAN..................................................................................................68

Footer Page 5 of 126.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

Header Page 6 of 126.

DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT
Từ viết tắt

Tên đầy đủ

Nghĩa tiếng Việt

Amp

Ampicillin

Ampixilin

DNA

Deoxyribonucleic acid

Axit deoxyribonucleic

APS

Amonium persulphate

Amonium persunphat

ARN

Ribonucleic Acid

Axit ribonucleic

bp

Base pair

Cặp bazơ nitơ

BSA

Bovine Serum Albumin

Albumin huyết thanh bò

CPE

Cytopathic effect

Các tác động gây bệnh tế bào

CBB

Comassie Brillant Blue

Comassie Brillant Blue

dNTP

2’-deoxyribonucleoside 5’triphosphate

2’-deoxyribonucleozid 5’triphosphat

ĐC

Lane

Đường chạy

E.coli

Escherichia coli

Vi khuẩn Escherichia coli

EDTA

Ethylen Diamin Tetraacetic
Acid

Axit ethylen diamin tetraaxetic

EtBr

Ethidium Bromite

Ethidium Bromit

HA

Hemagglutinin

Hemagglutinin

Kb

Kilo base

Kilo bazơ

KDa, Da

Kilo Dalton, Dalton

Kilo Dalton, Dalton

LB

Lauria-betani medium

Mơi trường LB

LBA

Lauria broth containing
ampicillin

Mơi trường LB có bổ sung
ampixilin

mg

Miligram

Miligam

NA

Neuraminidase

Neuraminidase

ng

Nanogram

Nanogam

Footer Page 6 of 126.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

Header Page 7 of 126.

OD

Optical density

Mật độ quang học

PBS

Phosphate Buffered Saline

Đệm PBS

PCR

Polymerase Chain Reaction

Phản ứng chuỗi trùng hợp

PVDF

Polyvinylidene difluoride

Polyvinylidin difluorit

RNA

Ribonucleic acid

Axít ribonucleic

RNP

Ribonucleoprotein

Ribonucleoprotein

SDS

Sodium dodecyl sulphat

Natri dodexin sunphat

SDS-PAGE

Sodium dodecyl sulphatPolyacrylamid gel

Điện di trên gel polyacrylamit có
chứa SDS

electrophoresis
TAE

Tris - Acetate – EDTA

Tris - Acetat – EDTA

Taq

Thermus aquaticus

Vi khuẩn Thermus aquaticus

TBS

Tris Buffered Saline

Đệm Tris

TE

Tris – EDTA

Tris – EDTA

Footer Page 7 of 126.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

Header Page 8 of 126.

1

Luận văn thạc sĩ

ĐẶT VẤN ĐỀ
Đại dịch cúm gia cầm đã và đang là mối nguy hiểm đe dọa kinh tế
chăn ni và sức khỏe cộng đồng. Sự xuất hiện của chủng virus cúm độc lực
cao H5N1 tại Hồng Kơng vào năm 1997 và các biến chủng H5N1 khác trong
những năm gần đây cùng với sự lây lan nhanh chóng của chúng ở Đơng Nam
Á, châu Phi, Trung Đơng và châu Âu đã cảnh báo mối đe dạo của một đại
dịch cúm tồn cầu [30]. Điều đặc biệt nguy hiểm là các chủng virus cúm gia
cầm này đã biến đổi, dẫn đến tăng khả năng lây nhiễm sang người cũng như

độc lực của virus. Để ngăn chặn sự lan truyền của virus cúm và những thiệt
hại do virus cúm gây ra, biện pháp hiệu quả nhất hiện nay vẫn là tiêm chủng
vaccine [28] [10]. Theo thơng báo của Tổ chúc Y tế thế giới (WHO), nếu đại
dịch cúm xảy ra, số người mắc trên tồn cầu có thể lên tới 2 tỷ. Tuy nhiên,
cơng nghệ sản xuất vaccine hiện nay bằng ni cấy virus trên trứng gà có
phơi chỉ có thể tạo ra khoảng 300 triệu liều/năm, sẽ khơng thể đủ cung cấp
cho tồn thế giới. Chính vì vậy, việc phát triển các cơng nghệ mới để nhanh
chóng tạo ra các vaccine an tồn, hiệu quả cao đang rất được quan tâm. Cơng
nghệ tạo hạt giả virus (virus-like particle, VLP) hiện được xem là cơng nghệ
mới hứa hẹn bổ sung/thay thế các cơng nghệ truyền thống để tạo ra các
vaccine thế hệ mới với hiệu lực cao hơn, an tồn hơn [2], [13].
VLP hay hạt giả virus được tạo ra bởi các protein cấu trúc của virus.
Các protein này khi được đồng biểu hiện ở một hệ thống tái tổ hợp như tế bào
nấm men, tế bào động vật, tế bào thực vật hoặc tế bào cơn trùng…sẽ tự động
lắp ghép lại với nhau để hình thành lên các hạt có cấu trúc giống với cấu trúc
tự nhiên của virus. Vaccine VLP có độ an tồn cao do khơng chứa vật liệu di
truyền là DNA/RNA nên khơng có khả năng lây nhiễm, tuy nhiên lại tạo ra
đáp ứng miễn dịch mạnh [5]. Một ưu điểm quan trọng nữa của vaccine VLP

Nguyễn Thị Phương – K15
Footer Page 8 of 126.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

Header Page 9 of 126.

2

Luận văn thạc sĩ

đó là thời gian sản xuất nhanh hơn so với các cơng nghệ sản xuất vaccine
truyền thống, có thể đáp ứng kịp thời nhu cầu vaccine khi có đại dịch [6].
Matrix protein M1 là một protein quan trọng của virus cúm A/H5N1 có
chức năng bao bọc RNA tạo nên phức hợp RNP (ribonucleoprotein) và tham
gia vào q trình “nảy chồi” của virus [4], [41]. Protein M1 cùng với HA
(Hemagglutimin) và NA là những kháng ngun quan trọng quyết định tính
sinh miễn dịch của virus và là 3 cấu phần quan trọng để tạo VLP của virus
cúm A/H5N1 [17]. Với mục tiêu nghiên cứu phát triển vaccine VLP cúm
A/H5N1 bằng cơng nghệ VLP, chúng tơi thực hiện đề tài “Thiết kế
baculovirus tái tổ hợp mang gen mã hóa protein M1 của virus cúm A/H5N1
để tạo chủng sản xuất vaccine thế hệ mới bằng cơng nghệ Virus-like
Particle”.
Đề tài được thực hiện với sự hỗ trợ kinh phí của đề tài cấp Viện Hàn
lâm khoa học và Cơng nghệ Việt Nam “Nghiên cứu tạo chủng Baculovirus
tái tổ hợp mang gen kháng ngun virus cúm phục vụ mục tiêu sản xuất chế
phẩm miễn dịch thế hệ mới”. Đề tài được thực hiện tại phòng Vi sinh vật học
phân tử, Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Hàn lâm khoa học và Cơng nghệ
Việt Nam.

Nguyễn Thị Phương – K15
Footer Page 9 of 126.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

Header Page 10 of 126.

3

Luận văn thạc sĩ

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Khái qt về bệnh cúm gia cầm.
Cúm gia cầm (Avian Influenza, AI) là bệnh truyền nhiễm cấp tính của
gia cầm do nhóm virus cúm A, thuộc họ Orthomyxoviridae gây ra [25]. Họ
Orthomyxoviridae đã được phát hiện bao gồm 4 nhóm virus đó là: nhóm virus
cúm A (Influenza A); nhóm virus cúm B (Influenza B); nhóm virus cúm C
(Influenza C) và nhóm Thogotovirus. Các nhóm virus khác nhau bởi các
kháng ngun trên bề mặt capsid, ở virus cúm A và B là Hemagglutinin (HA),
ở virus cúm C là Hemagglutinin Esterase Fusion (HEF), và ở Thogotovirus là
Glycoprotein (GP).
Nhóm virus cúm A (Influenza A) có biên độ vật chủ rộng và được chia
thành nhiều phân type khác nhau dựa trên kháng ngun HA và NA có trên
bề mặt capsid của hạt virus [7], gồm có 16 phân type HA (từ H1 đến H6) và 9
phân type NA (từ N1 đến N9). Sự tái tổ hợp giữa các phân type HA và NA sẽ
tạo ra nhiều phân type khác nhau về độc tính và khả năng gây bệnh. Chủng
virus cúm H5N1 có độc lực cao (HPAI) là chủng có khả năng lây nhiễm và tỷ
lệ gây tử vong cao trên 50% số gia cầm bị nhiễm [10].
1.1.1. Tình hình dịch bệnh trên thế giới
Chủng virus cúm A/H5N1 cổ điển được phát hiện lần đầu tiên gây bệnh
dịch trên gà tại Scotland vào năm 1959. Từ đó cho đến nay, các tiểu phần H5
và N1 đã có thay đổi lớn xét về cấu trúc thành phần gen và kháng ngun
miễn dịch [14]. Sau gần 40 năm khơng phát hiện, cúm A/H5N1 xuất hiện tại
Quảng Đơng (1996) và Hồng Kơng (1997) với biến đổi di truyền khơng
những gây chết gia cầm mà còn thích ứng và gây chết trên người. Đặc biệt, từ
2003 đến nay, chủng virus H5N1 cơ bản về cấu trúc vẫn như trước đó, nhưng
xét về độc lực (tính gây bệnh), lồi vật chủ nhiễm bệnh, tính kháng ngun miễn dịch và mức độ truyền lây có nhiều nét đặc trưng hơn và khác với nhiều

Footer Page 10 ofNguyễn
126. Thị Phương – K15

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

Header Page 11 of 126.

4

Luận văn thạc sĩ

biến chủng H5N1 trước đây [51], chúng chính là thủ phạm gây ra dịch cúm
trên gia cầm tại Hồng Kơng, Trung Quốc và lây lan sang hàng chục quốc gia
trên thế giới ở châu Á, châu Âu và châu Phi.
Những năm gần đây dịch cúm A/H5N1 vẫn hồnh hành ở nhiều nơi
trên thế giới gây thiệt hại về người và kinh tế, đặc biệt ở những nước nghèo
và nước đang phát triển như: Bangladesh, Campuchia, Trung Quốc, Ấn Độ,
Indonesia, Iran, Israel, Nhật Bản, Mơng Cổ, Myanmar, Hàn Quốc, Hy Lạp,
và Việt Nam. Tính đến tháng 8/2012 theo số liệu thống kê của WHO, từ năm
2003 đến 3/2012 đã có 594 người nhiễm bệnh cúm H5N1 tại trong đó 349
người đã tử vong. Các quốc gia có số người nhiễm và tử vong cao nhất là
Indonesia (134/186), Việt Nam (61/122), Ai Cập (60/168), Trung Quốc
(28/43) [51].
Trong năm 2013, dịch cúm cũng bùng phát ở Campuchia và một số tỉnh
miềm nam Việt Nam gây tử vong 9 người và phải tiêu hủy nhiều đàn gia súc.
Bên cạnh đó sự xuất hiện của dịch cúm A/H7N9 tại Trung Quốc với tỉ lệ gây
tử vong cao (27/127 trường hợp) đang trở thành mối lo ngại của nhiều quốc

gia trong khu vực.
1.1.2. Tình hình dịch bệnh tại Việt Nam
Việt Nam với vị trí địa lý giáp danh Trung Quốc là một quốc gia có
nhiều dịch bệnh lớn xảy ra, kết hợp với khí hậu nhiệt đới gió mùa ẩm đã tạo
điều kiện thuận lợi cho virus cúm A/H5N1 lây lan và phát triển thành đại dịch
gây thiệt hại lớn về kinh tế và sức khỏe con người. Dịch cúm gia cầm bùng
phát lần đầu tiên tại Việt Nam vào cuối tháng 12/2003 ở các tỉnh phía Bắc và
Long An, sau đó nhanh chóng lan tới 57/64 tỉnh thành trong cả nước. Tổng số
gia cầm bị mắc bệnh, chết và thiêu hủy hơn 43,9 triệu con. Đặc biệt đã có 3
người nhiễm virus cúm A/H5N1 và cả 3 đã tử vong trong đợt dịch này.

Footer Page 11 ofNguyễn
126. Thị Phương – K15

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

Header Page 12 of 126.

5

Luận văn thạc sĩ

Sang đến năm 2004, dịch bệnh cúm gia cầm tái phát ở 17 tỉnh thành, số
gia cầm tiêu hủy là 84.078 con và đã có tới 27 người mắc bệnh cúm A/H5N1
trong đó có 9 bệnh nhân tử vong. Năm 2005 dịch cúm xảy ra trên 36 tỉnh
thành trong cả nước gây thiệt hại 1,846 triệu gia cầm.
Giai đoạn từ năm 2006 đến 2012 dịch bệnh tuy được khống chế và
phòng ngừa những vẫn xảy ra rải rác ở nhiều nơi trên cả nước gây tổn thất

nhiều cho ngành sản xuất chăn ni. Đặc biệt theo báo cáo của tổ chức lương
thực thế giới FAO năm 2012 [9], sự xuất hiện của nhiều biến chủng mới như
calde 2.3.2.1 ở Bangladesh, Hàn Quốc, Nhật Bản, Myanmar, Nepanl,
Indonesia và Việt Nam, calde 2.3.4 tại Trung Quốc là chủng virus chưa có
vaccine phòng bệnh hiệu quả.
Tháng 1/2013 dịch cúm gia cầm xuất hiện tại hai hộ gia đình ở Tây
Ninh với tổng số gia cầm phải thiêu hủy là 3.438 con. Đến tháng 2-3/2013
dịch bệnh tiếp tục xuất hiện ở Khánh Hòa, Cà Mau và Bình Định khiến nhiều
gia cầm bị chết và thiêu hủy. Ngồi ra có một cháu bé đã tử vong do nhiễm
cúm virus cúm A/H5N1. Tháng 4/2013 virus cúm tiếp tục được phát hiện ở
chim yến một lồi động vật có giá trị kinh tế cao của Việt Nam. Tháng 7/2013
virus cúm tiếp tục tấn cơng chim cút ở Tiền Giang khiến 10 nghìn con chim
phải thiêu hủy. Như vậy, trong 7 tháng đầu năm 2013 tuy cúm gia cầm khơng
bùng phát thành đại dịch lớn nhưng nó vẫn diễn ra ở một số tỉnh thành phía
Nam và gây thiệt hại kinh tế khơng nhỏ cho các hộ chăn ni [53].
1.1.3. Con đường lây nhiễm và triệu chứng bệnh
Các vật chủ tự nhiên của virus cúm A là các lồi chim hoang dã (vịt
trời) và gia cầm (vịt, gà, ngan, ngỗng...), chúng thường khơng bị gây bệnh
hoặc chỉ nhiễm bệnh nhẹ bởi virus cúm A. Một số biến thể cường độc (H5,
H7) đã xuất hiện gần đây do tái tổ hợp nhiều gen khác nhau có thể gây dịch
cúm nguy hiểm làm chết hàng loạt ở chim và gia cầm [23]. Tuy nhiên, virus

Footer Page 12 ofNguyễn
126. Thị Phương – K15

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

Header Page 13 of 126.

6

Luận văn thạc sĩ

cúm A đặc biệt là chủng virus A/H5N1 hiện đang lưu hành có thể xâm nhiễm
gây bệnh ở các lồi động vật có vú khác như hổ, mèo, ngựa, lợn và người.
Khi gia cầm nhiễm virus cúm, virus được nhân lên trong đường hơ hấp và
đường tiêu hóa. Sự lây truyền bệnh được thực hiện theo hai phương thức [1]
[39].
+ Lây trực tiếp: do con vật mẫn cảm tiếp xúc với con vật mắc bệnh.
+ Lây gián tiếp: qua các hạt khí dung trong khơng khí với khoảng cách
gần hoặc những dụng cụ chăn ni, phân, thức ăn, nước uống quần áo, giầy
dép, phương tiện vận chuyển, lồng nhốt, chim, thú, cơn trùng có mang mầm
bệnh.
Như vậy, virus cúm dễ dàng lây truyền tới vùng khác do con người,
phương tiện vận chuyển, dụng cụ và thức ăn chăn ni. Bệnh chủ yếu truyền
ngang, chưa có bằng chứng cho thấy bệnh có thể truyền dọc (qua phơi thai) vì
những phơi bị nhiễm virus thường chết mà khơng phát triển được.
Khi gia cầm mắc bệnh cúm A/H5N1 thường có các biểu hiện thường
gặp là: mào, yếm sưng to, phù quanh mí mắt; ở các xoang bị viêm cata, lắng
đọng fibrin và có mủ; có thể viêm dính buồng trứng với xoang bụng; xuất
huyết điểm trên bề mặt niêm mạc và tương mạc nội tạng, xuất huyết ở hầu hết
đường ống tiêu hóa; tụy sưng to có những vạch vàng hoặc đỏ sẫm; túi
Fabricius ở gà bị xung huyết và xuất huyết. Ở người, virus xâm nhập vào
niêm mạc phế nang, phế quản, chúng nhân lên và gây hủy hoại các biểu mơ
túi khí, gây xung huyết và tràn dịch phổi ở bệnh nhân.. Bên cạnh đó, virus có
khả năng gây nhiễm khí quản, ruột, não và có thể xun qua nhau thai xâm
nhập vào bào thai, gây mất cân bằng điều hòa miễn dịch do hiện tượng tăng
cytokine khơng kiềm chế (cytokine storm) xảy ra dẫn đến cơ thể bị suy sụp và

tử vong [20].

Footer Page 13 ofNguyễn
126. Thị Phương – K15

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

Header Page 14 of 126.

7

Luận văn thạc sĩ

1.1.4. Chẩn đốn, phòng và điều trị bệnh do virus H5N1
Để chẩn đốn bệnh cúm gia cầm và bệnh cúm ở người thường dựa chủ
yếu và các dấu hiệu lâm sàng, dịch tễ học và các xét nghiệm phát hiện sự hiện
diện của virus cúm trong cơ thể bệnh như phản ưng ngưng kết hồng cầu (HA
hemagglutination test) hoặc các xét nghiệm huyết thanh miễn dịch học và
phân lập virus [29]. Hiện nay với sự phát triển của sinh học phân tử, các
phương pháp real time PCR, RT-PCR (Reverse transcription PCR) và
multiplex PCR đã được sử dụng trong chẩn đốn phát hiện virus cúm có độ
chính xác và độ tin cậy cao.
Việc tiêm phòng được xem là lựa chọn đầu tiên để chống lại sự xâm
nhiễm và lây lan của dịch cúm. Trên thế giới có nhiều quốc gia tham gia vào
việc nghiên cứu sản xuất vaccine phòng cúm, chủ yếu tập trung ở những nước
phát triển như: Mỹ, Pháp, Đức, Hà Lan, …. Với mỗi loại vaccine, u cầu cơ
bản là phải có tính miễn dịch bảo hộ, tính kháng ngun, tính đặc hiệu và tính
khơng độc. Việt Nam đang trong giai đoạn sản xuất thử nghiệm vaccine

phòng chống cúm A/H5N1. Các vaccine ngừa bệnh cúm mùa trước đây
khơng có hiệu quả đối với cúm A /H5N1 mới. Các vaccine phòng bệnh hiện
nay dựa trên cơ sở hai loại chính: vaccine truyền thống và vaccine thế hệ mới.
Mỗi khi dịch cúm bùng phát, các quốc gia thường có những biện pháp
kiểm sốt vệ sinh như đeo khẩu trang, rửa tay bằng xà phòng đặc biệt là sau
khi ho, hắt hơi. Virus cúm A/H5N1 có sức đề kháng yếu, dễ bị bất hoạt bởi
bức xạ mặt trời, tia cực tím và các chất tẩy rửa thơng thường (xà phòng, chất
tẩy natri hypochlorite 0,05%, Ethanol 70 %). Đồng thời tiến hành tiêu hủy
gia súc bị nhiễm bệnh hoặc nghi là bị nhiễm tại khu vực có dịch. Tuy nhiên,
việc làm này là chưa đủ để ngăn chặn sự lây lan của dịch bệnh, đặc biệt là
những khu đơng dân cư và có mật độ động vật ni cao vì virus cúm A/H5N1

Footer Page 14 ofNguyễn
126. Thị Phương – K15

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

Header Page 15 of 126.

8

Luận văn thạc sĩ

có thể tồn tại hàng giờ ở bên ngồi, đặc biệt khi thời tiết lạnh. Trên thực tế,
thế giới đã sử dụng phổ biến một số loại thuốc dùng trong điều trị cúm A như:
+ Amantadine và Rimantadine - loại thuốc cản trở sự hoạt động của
kênh ion M2. Dẫn tới ức chế q trình cởi bỏ lớp vở ngồi của virus và vRNP
khơng được đưa vào nhân cài xen vào gemone của tế bào chủ.

+ Leptomycine B- loại thuốc ngăn cản sự vận chuyển vRNP ra khỏi
nhân tế bào.
+ Zanamivir ( Relenza) và Tamiflu (Oseltmavir)- thuốc này có cấu hình
khơng gian tương tự như NA. Do vậy, chúng ngăn cản sự liên kết của NA với
các thụ thể sialic acid, cản trở q trình giải phóng virus, ức chế sự lan nhiễm
virus.
1.2. Virus cúm A/H5N1 gây bệnh trên gia cầm
1.2.1. Đặc điểm cấu tạo
Virus cúm H5N1 thuộc type A, họ Orthomyxoviridae. Họ này gồm 4
nhóm virus: Nhóm virus cúm A, nhóm virus cúm B, nhóm virus nhóm C và
nhóm Thogotovirus. Chúng là tác nhân chủ yếu gây bệnh đường hơ hấp trên ở
người, động vật, gia cầm và chim. Cúm C là loại thường gặp nhất ở người
nhưng hiếm khi gây bệnh trầm trọng, cúm B thỉnh thoảng bùng phát thành
dịch ở trẻ em, còn virus cúm A là loại có độc lực cao nhất có thể gây nên đại
dịch nguy hiểm trên cả gia cầm và con người trên tồn cầu. Virus họ này rất
nhạy cảm với nhiệt độ, các dung mơi hồ tan lipid, các loại hố chất sát trùng
và oxi hố, formaldehyt, và với các tia phóng xạ [25] [44].
Các hạt virus cúm A (virion) có hình cầu hoặc hình khối đa diện, đường
kính 80 -120 nm, đơi khi cũng có dạng hình sợi, khối lượng phân tử khoảng
250 triệu Da. Hạt virus có cấu tạo đơn giản gồm lớp vỏ bọc ngồi envelope và
lõi là RNA sợi đơn âm - negative single strand (hình 1.1).

Footer Page 15 ofNguyễn
126. Thị Phương – K15

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

Header Page 16 of 126.

9

Luận văn thạc sĩ

Hình 1.1. Ảnh chụp kính hiển vi điện tử (A), mơ hình (B), và phức hợp
ribonucleoprotein RNP (C) của virus cúm A.

Vỏ virus có chức năng bao bọc và bảo vệ vật chất di truyền RNA của
virus, bản chất cấu tạo là màng lipid kép, có nguồn gốc từ màng tế bào nhiễm
được đặc hiệu hóa gắn các protein màng của virus. Trên bề mặt có khoảng
500 “gai mấu” nhơ ra và phân bố dày đặc, mỗi gai mấu dài khoảng 10 - 14 nm
có đường kính 4 - 6 nm, đó là những kháng ngun bề mặt vỏ virus có bản
chất cấu tạo glycoprotein gồm: HA, NA, MA (matrix) và các dấu ấn phân tử
khác của virus [52]. Phân tử NA và HA là hai loại protein kháng ngun có
vai trò quan trọng trong q trình xâm nhiễm của virus ở tế bào cảm nhiễm,
tuy nhiên sự phân bố của chúng khơng đồng đều (tỉ lệ khoảng 1NA/4HA) [25]
[45], protein M2 nằm xun qua màng lipid kép và hoạt động như kênh vận
chuyển ion. Xen giữa hạt virus và vỏ là lớp protein nền M1 (matrix).
1.2.2. Cấu trúc hệ gen
Hệ gen virus cúm A có vật chất di truyền là RNA sợi đơn âm (-) ssRNA,
bao gồm 8 phân đoạn gen riêng biệt mã hóa cho 11 protein khác nhau của
virus gồm: HA, NA, M (M1 và M2), NP, NS (NS1 và NS2), PA, PB1, PB1F2 và PB2 [25] [35]. Mỗi phân đoạn RNA của virus cúm A có cấu trúc xoắn

Footer Page 16 ofNguyễn
126. Thị Phương – K15

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

Header Page 17 of 126.

10

Luận văn thạc sĩ

bậc 2 α đối xứng dài 50 - 100 nm, đường kính 9 - 10 nm, được bao bọc bởi
nucleoprotein (NP) – có bản chất là lipoprotein để tạo thành cấu trúc
ribonucleoprotein (RNP). Mỗi RNP kết hợp với 3 protein enzyme polymerase
(PA, PB1 và PB2) chịu trách nhiệm trong q trình phiên mã và sao chép
RNA của virus. Các phân đoạn của hệ gen virus cúm A nối với nhau bằng các
cầu nối peptid tạo nên vòm (loop) tại giới hạn cuối của mỗi phân đoạn, và tạo
thành một sợi RNA duy nhất có tổng độ dài từ 10.000 - 15.000 bp (tuỳ theo
từng chủng virus cúm A), chứa đựng khoảng 13,5 kb thơng tin di truyền và có
cấu trúc xoắn α (α-helix) bên trong vỏ virus (hình 1.1). Hai đầu 5’- và 3’- sợi
RNA hệ gen virus có gắn thêm chuỗi nucleotide có tính bảo tồn cao giữa các
phân type là: 5’-AGUAGAACAAGG… và 3’- UCG(U/C)UUUCGU CC [12]
[47] [38].
- Phân đoạn 1 (gen PB2) có kích thước 2431 bp, mã hóa tổng hợp
protein enzyme PB2, là tiểu đơn vị thành phần trong phức hợp enzyme
polymerase của virus, chịu trách nhiệm khởi đầu phiên mã RNA virus.
Protein PB2 có khối lượng phân tử theo tính tốn khoảng 84 kDa có vai trò
thích nghi nhiệt độ cơ thể lồi vật chủ của virus cúm A/H5N1.
- Phân đoạn 2 (gen PB1) cũng có kích thước 2431 bp, mã hóa tổng hợp
enzyme PB1 - tiểu đơn vị xúc tác của phức hợp enzyme polymerase trong q
trình tổng hợp RNA virus, chịu trách nhiệm gắn mũ RNA.
- Phân đoạn 3 (gen PA) có kích thước 2233 bp, là phân đoạn gen bảo
tồn cao, mã hóa tổng hợp protein enzyme PA có khối lượng phân tử theo tính
tốn khoảng 83 kDa (trên thực tế là 96 kDa). PA là một tiểu đơn vị của

polymerase chịu trách nhiệm kéo dài sự phiên mã RNA trong q trình tổng
hợp RNA của virus.
- Phân đoạn 5 (gen NP) kích thước khoảng 1556 bp, mã hóa tổng hợp
nucleoprotein (NP) - thành phần của phức hệ phiên mã, chịu trách nhiệm vận

Footer Page 17 ofNguyễn
126. Thị Phương – K15

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

Header Page 18 of 126.

11

Luận văn thạc sĩ

chuyển RNA giữa nhân và bào tương tế bào chủ. NP là một protein được
glycosyl hóa, có đặc tính kháng ngun biểu hiện theo nhóm virus, tồn tại
trong các hạt virus ở dạng kết hợp với mỗi phân đoạn RNA, có khối lượng
phân tử khoảng 56 kDa.
- Phân đoạn 4 (gen HA) có độ dài thay đổi tuỳ theo từng chủng virus
cúm A (ở A/H1N1 là 1778 bp, ở H9N1 là 1714 bp, ở H5N1 là khoảng 1704 1707 bp). Đây là gen chịu trách nhiệm mã hóa tổng hợp protein HA - kháng
ngun bề mặt virus cúm, gồm hai tiểu phần là HA1 và HA2. Vùng nối giữa
HA1 và HA2 gồm một số amino acid mang tính kiềm được mã hóa bởi một
chuỗi oligonucleotide, đó là điểm cắt của enzyme protease, và đây là vùng
quyết định độc lực của virus.
- Phân đoạn 6 (gen NA) là một gen kháng ngun của virus, có chiều
dài thay đổi theo từng chủng virus cúm A (ở A/H6N2 là 1413 bp, ở A/H5N1

thay đổi khoảng từ 1350 - 1410 bp). Đây là gen mã hóa tổng hợp protein NA,
kháng ngun bề mặt capsid của virus, có khối lượng phân tử khoảng 50 kDa.
Các nghiên cứu phân tử gen NA của virus cúm cho thấy phần đầu 5’- của gen
này (hay phần tận cùng N của polypeptide NA) có tính biến đổi cao và phức
tạp giữa các chủng virus cúm A, sự thay đổi này liên quan đến q trình thích
ứng và gây bệnh của virus cúm trên nhiều đối tượng vật chủ khác nhau.
- Phân đoạn 7 (gen M) có kích thước khoảng 1027 bp, mã hóa cho
protein M (matrix protein - M) của virus (gồm hai tiểu phần là M1 và M2
được tạo ra bởi những khung đọc mở khác nhau của cùng một phân đoạn
RNA), cùng với HA và NA có khoảng 3000 phân tử MP trên bề mặt capsid
của virus cúm A, có mối quan hệ tương tác bề mặt với hemagglutinin. Protein
M1 là một protein nền, là thành phần chính của virus có chức năng bao bọc
RNA tạo nên phức hợp RNP và tham gia vào q trình “nảy chồi” của virus.
Protein M2 là chuỗi polypeptide bé, có khối lượng phân tử khoảng 11 kDa, là

Footer Page 18 ofNguyễn
126. Thị Phương – K15

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

Header Page 19 of 126.

12

Luận văn thạc sĩ

protein chuyển màng - kênh ion (ion channel) cần thiết cho khả năng lây
nhiễm của virus, chịu trách nhiệm “cởi áo” virus trình diện hệ gen ở bào

tương tế bào chủ trong q trình xâm nhiễm trên vật chủ.
- Phân đoạn 8 (gen NS) là gen mã hóa protein khơng cấu trúc (non
structural protein), kích thước khoảng 890 bp, mã hóa tổng hợp hai protein là
NS1 và NS2 (còn gọi là NEP, nuclear export protein). Độc tính của virus có
sự liên quan với gen khơng cấu trúc (non-structural gene) đã được tìm thấy ở
biến chủng A/H5N1/97, trong tự nhiên, việc đột biến xóa đi một phần gen có
liên quan đến giảm độc lực. NS1 có khối lượng phân tử là 27 kDa, chịu trách
nhiệm vận chuyển RNA thơng tin của virus từ nhân ra bào tương tế bào
nhiễm và tác động lên các RNA vận chuyển cũng như các q trình cắt và
dịch mã của tế bào chủ. NEP hay NS2, là gen hình thành từ hai đoạn gen (30
bp và 336 bp) mã hóa loại protein có khối lượng phân tử khoảng 14 kDa (trên
thực tế là 12 kDa), đóng vai trò vận chuyển các RNP của virus ra khỏi nhân tế
bào nhiễm để lắp ráp với capsid tạo nên hạt virus mới [20].
Như vậy, virus cúm A (cụ thể: cúm A/H5N1) có hệ gen được cấu trúc
từ 8 phân đoạn riêng biệt và khơng có gen mã hóa enzyme sửa chữa RNA, tạo
điều kiện thuận lợi cho sự xuất hiện các đột biến điểm trong các phân đoạn
gen/hệ gen qua q trình sao chép nhân lên của virus, hoặc trao đổi các phân
đoạn gen giữa các chủng virus cúm đồng nhiễm trên cùng một tế bào, rất có
thể dẫn đến thay đổi đặc tính kháng ngun tạo nên các chủng virus cúm A
mới [8] [42].
1.2.3. Cơ chế gây bệnh của virus cúm A trong tế bào vật chủ
Virus cúm A/H5N1 kí sinh nội bào bắt buộc, q trình xâm nhiễm và
nhân lên của virus xảy ra chủ yếu ở các tế bào biểu mơ đường hơ hấp, đường
tiêu hóa của cơ thể nhiễm [29] như sau:

Footer Page 19 ofNguyễn
126. Thị Phương – K15

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

Header Page 20 of 126.

13

Luận văn thạc sĩ

- Q trình xâm nhiễm của virus cúm A được mở đầu bằng sự kết hợp
của HA và thụ thể thích ứng của nó trên bề mặt các tế bào đích, sau đó giải
phóng hệ gen của virus vào trong bào tương của tế bào nhiễm (hình 1.2).

Hình1. 2. Chu trình nhân lên của virus cúm A/H5N1 trong tế bào vật chủ
Sau khi được giải phóng vào trong bào tương tế bào nhiễm, hệ gen của
virus sử dụng bộ máy sinh học của tế bào tổng hợp các protein của virus và
các RNA vận chuyển phụ thuộc RNA (RNA-dependent RNA transcription).
Phức hợp protein – RNA của virus được vận chuyển vào trong nhân tế bào
[4].
- Trong nhân tế bào các RNA hệ gen của virus tổng hợp nên các sợi
dương từ khn là sợi âm của hệ gen virus, từ các sợi dương này chúng tổng
hợp nên RNA hệ gen của virus mới nhờ RNA-polymerase. Các sợi này khơng
được Adenine hóa (gắn thêm các Adenine - gắn mũ) ở đầu 5’- và 3’-, chúng
kết hợp với nucleoprotein (NP) tạo thành phức hợp ribonucleoprotein (RNP)
hồn chỉnh và được vận chuyển ra bào tương tế bào. Đồng thời, các RNA
thơng tin của virus cũng sao chép nhờ hệ thống enzyme ở từng phân đoạn gen
của virus, và được enzyme PB2 gắn thêm 10 - 12 nucleotide Adenin ở đầu 5’,

Footer Page 20 ofNguyễn
126. Thị Phương – K15

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

Header Page 21 of 126.

14

Luận văn thạc sĩ

sau đó được vận chuyển ra bào tương và dịch mã tại lưới nội bào có hạt để
tổng hợp nên các protein của virus (Hình 1.2).
- Các phân tử NA và HA của virus sau khi tổng hợp được vận chuyển
gắn lên mặt ngồi của màng tế bào nhiễm nhờ bộ máy Golgi, gọi là hiện
tượng “nảy chồi” của virus. NP sau khi tổng hợp được vận chuyển trở lại
nhân tế bào để kết hợp với RNA thành RNP của virus. Sau cùng các RNP của
virus được hợp nhất với vùng “nảy chồi”, tạo thành các “chồi” virus gắn chặt
vào màng tế bào chủ bởi liên kết giữa HA với thụ thể chứa sialic acid. Các
NA phân cắt các liên kết này và giải phóng các hạt virus trưởng thành tiếp tục
xâm nhiễm các tế bào khác [26].
1.2.4. Các kháng ngun quan trọng của Virus cúm A/H5N1
2.4.1. Kháng ngun bề mặt HA
Protein hemagglutinin (HA) là một glycoprotein thuộc protein màng
type I (lectin), có khả năng gây ngưng kết hồng cầu gà trong ống nghiệm (in
vitro). Có 16 phân type HA đã được phát hiện (H1 - H16, phân type H16 mới
được tìm thấy ở virus gây bệnh cho Hải Âu đầu đen - Thụy Điển, ba phân
type (H1, H2 và H3) thích ứng lây nhiễm gây bệnh ở người liên quan đến các
đại dịch cúm trong lịch sử [25]. Có khoảng 400 phân tử HA trên bề mặt
capsid của một virus và mỗi phân tử HA có dạng hình trụ, dài khoảng 130
ăngstron (Å), cấu tạo gồm 3 đơn phân (trimer), mỗi đơn phân (monomer)

được tạo thành từ hai dưới đơn vị HA1 (36 kDa) và HA2 (27 kDa), liên kết với
nhau bởi các cầu nối disulfide (-S-S-). Các đơn phân sau khi tổng hợp đã
được glycosyl hóa (glycosylation) và gắn vào mặt ngồi capsid là dưới đơn vị
HA2, phần đầu tự do hình chỏm cầu được tạo bởi dưới đơn vị HA1 chứa đựng
vị trí gắn với thụ thể thích hợp của HA trên bề mặt màng tế bào đích [45].
Sự kết hợp của HA với thụ thể đặc hiệu (glycoprotein chứa sialic acid)
trên bề mặt màng tế bào, khởi đầu q trình xâm nhiễm của virus trên vật chủ

Footer Page 21 ofNguyễn
126. Thị Phương – K15

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

Header Page 22 of 126.

15

Luận văn thạc sĩ

giúp cho virus xâm nhập, hòa màng và giải phóng RNA hệ gen thực hiện q
trình nhân lên ở trong tế bào cảm nhiễm. Q trình kết hợp phụ thuộc vào sự
phù hợp cấu hình khơng gian của thụ thể chứa acid sialic của tế bào đích với
vị trí gắn với thụ thể này trên phân tử HA của virus cúm, quyết định sự xâm
nhiễm dễ dàng của virus ở các lồi vật chủ khác nhau. Protein HA là kháng
ngun bề mặt quan trọng của virus cúm A, kích thích cơ thể sinh ra đáp ứng
miễn dịch dịch thể đặc hiệu với từng type HA, và tham gia vào phản ứng
trung hòa virus, được coi là protein vừa quyết định tính kháng ngun, vừa
quyết định độc lực của virus, là đích của bảo vệ miễn dịch học nhằm ngăn

chặn sự xâm nhiễm của virus ở cơ thể nhiễm, cơ sở điều chế các vaccine
phòng cúm hiện nay [18] [14].
2.4.2. Kháng ngun bề mặt NA (neuraminidase)
Protein neurominidase còn gọi là sialidase là một protein enzyme có
bản chất là glycoprotein được gắn trên bề mặt capsid của virus cúm A, mang
tính kháng ngun đặc trưng theo từng phân type NA [3]. Có 9 phân type (từ
N1 đến N9) được phát hiện chủ yếu ở virus cúm gia cầm, hai phân type N1 và
N2 được tìm thấy ở virus cúm người liên quan đến các đại dịch cúm trong lịch
sử [49]. Trên bề mặt capsid của hạt virus có khoảng 100 phân tử NA xen giữa
các phân tử HA và phân tử có dạng nút lồi hình nấm, đầu tự do (chứa vùng
hoạt động) gồm 4 dưới đơn vị giống như hình cầu nằm trên cùng một mặt
phẳng, và phần kị nước gắn vào lớp vỏ capsid.
Protein NA có vai trò là một enzyme cắt đứt liên kết giữa gốc sialic
acid của màng tế bào nhiễm với phân tử cacbonhydrate của protein HA, giải
phóng hạt virus ra khỏi màng tế bào nhiễm, đẩy nhanh sự lây nhiễm của virus
trong cơ thể vật chủ, và ngăn cản sự tập hợp của các hạt virus mới trên màng
tế bào. NA tham gia vào phân cắt liên kết này trong giai đoạn “hòa màng”,
đẩy nhanh q trình cởi áo “uncoating” giải phóng hệ gen của virus vào trong

Footer Page 22 ofNguyễn
126. Thị Phương – K15

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

Header Page 23 of 126.

16

Luận văn thạc sĩ

bào tương tế bào nhiễm, giúp cho q trình nhân lên của virus diễn ra nhanh
hơn. Ngồi ra, NA còn phân cắt các liên kết glycoside, giải phóng neuraminic
acid làm tan lỗng màng nhầy bề mặt biểu mơ đường hơ hấp, tạo điều kiện
cho virus nhanh chóng tiếp cận tế bào biểu mơ và thốt khỏi các chất ức chế
khơng đặc hiệu [45].
2.4.3. Protein nền M1
Protein M1 là loại protein chiếm tỷ lệ cao nhất trong hạt virion virus, là
một protein nền có chức năng bao bọc RNA tạo nên phức hợp RNP và tham
gia vào q trình “nảy chồi” của virus [4]. M1 là một protein khá bền vững
gồm 252 amino acid có trọng lượng khoảng 27,8 kDa. Đơn phân của M1 là
các cấu trúc hình que dài khoảng 60A0. Các nghiên cứu về protein M1 đã chỉ
rằng M1 chứa hai cấu trúc cơ bản là α – Helicase (được đánh dấu từ H1 đến
H9) và cấu trúc cặp tóc – loop (được đánh dấu từ L1 đến L8). Theo tính chất
hóa sinh M1 được phân chia thành hai vùng acidamine tạo cấu trúc hình cầu.
Vùng thứ nhất từ acidamine số 1 đến 164 và vùng thứ hai từ acidamine 165
đến 252, hai vùng này được nối với nhau bởi vùng nhạy cảm với protease. M1
là protein cấu trúc quan trọng của hạt virion và là kháng ngun đặc hiệu
tp, nó có vai trò quan trọng trong chu trình sống của virus [24], [47].
i, Tương tác với vRNP và NS2 và vận chuyển vRNP ra vào nhân, M1
là yếu tố điều chỉnh q trình xuất nhập này. Sau khi virus đi vào endosome
dưới tác dụng của pH thấp do sự vận chuyển của ion H+ qua kênh ion M2 của
virus và phức hợp M1-vRNP bị phân tách hồn tồn cho phép vRNP đi vào
nhân. Ngược lại, khi các vRNP mới được tạo thành trong nhân thì M1 và NS2
sẽ đi vào nhân và kết hợp với vRNP cùng được vận chuyển ra khỏi nhân. Sự
tương tác của M1 với RNP đã được nghiên cứu khá rõ. Hai domain trong M1
bám vào RNA được xác định ở hai vùng độc lập: ngón tay kẽm (a zinc finger

Footer Page 23 ofNguyễn

126. Thị Phương – K15

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

Header Page 24 of 126.

17

Luận văn thạc sĩ

motif, ở vị trí amino acid 148 tới 162) và một chuỗi amino acid RKLKR (ở vị
trí amino acid 101 tới 105).
ii, Điều hồ sao chép vRNP; vRNP chỉ được sao chép khi tách khỏi
M1.
iii, Tương tác với protein vỏ của virus: HA, NA, M2 trong q trình
nảy chồi.
iv, Huy động các thành phần của virus tới vị trí lắp ráp và khởi đầu nảy
chồi. M1 là yếu tố trung tâm trong việc lắp ráp các thành phần của virus. Phân
tử M1 liên kết với vRNP, màng tế bào qua các đi hướng tế bào chất của cả
hai glycoprotein bề mặt HA và NA, các phân tử M1 khác thì tạo thành một
lớp dưới lớp vỏ bọc của virus. Liên kết của M1 với màng dựa vào sự tổ hợp
của cả hai tương tác tĩnh điện và kị nước cũng như sự tương tác của protein
đặc hiệu với protein vỏ.
v, Huy động các thành phần tế bào chủ cho việc hồn thành nảy chổi và
giải phóng virus.
vi, Tỉ lệ M1/NP của phân tử virus ảnh hưởng đến hình thái của virion
và sự lan truyền của virus khi được giải phóng.
1.3. Vaccine phòng chống cúm

1.3.1. Nguồn gốc, sự phát triển của vaccine
Vaccine là chế phẩm có tính kháng ngun dùng để tạo miễn dịch đặc
hiệu chủ động, nhằm tăng sức đề kháng của cơ thể đối với một hoặc một số
tác nhân gây bệnh cụ thể [54]. Các nghiên cứu mới còn mở ra hướng dùng
vaccine để điều trị một số bệnh (vaccine liệu pháp, một hướng trong các miễn
dịch liệu pháp). Thuật ngữ vaccine xuất phát từ vaccinia, loại virus gây bệnh
đậu bò nhưng khi đem chủng tiêm cho người lại giúp ngừa được bệnh đậu
mùa (tiếng Latinh vacca nghĩa là "con bò cái").

Footer Page 24 ofNguyễn
126. Thị Phương – K15

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

Header Page 25 of 126.

18

Luận văn thạc sĩ

Vaccine đầu tiên gắn với tên tuổi của Edward Jenner, một bác sĩ người
Anh [50]. Năm 1796, châu Âu đang có dịch đậu mùa, Jenner đã thực hiện
thành cơng thử nghiệm vắc-xin ngừa căn bệnh này. Thời của Jenner, các virus
vẫn chưa được khám phá, còn vi khuẩn tuy đã được tìm ra nhưng vai trò gây
bệnh của chúng chưa được biết. Thời điểm 1798, khi Jener cơng bố kết quả
thí nghiệm của mình, người ta chỉ hình dung là có các "mầm bệnh" gây nên
sự truyền nhiễm.
Năm 1878, Louis Pasteur sau nghiên cứu dịch bệnh tả gây tàn sát trên

gà đã xác nhận các giả thuyết của Jenner là đúng và từ đó mở đường cho khoa
miễn dịch học hiện đại. Vaccine đã đẩy lùi nhiều bệnh tật trên thế giới như:
triệt tiêu bệnh đậu mùa trên tồn cầu, thanh tốn gần như hồn tồn bệnh bại
liệt, giảm đáng kể các bệnh sởi, bạch hầu, ho gà, bệnh ban đào, thủy đậu, quai
bị, thương hàn và uốn ván…vv. Ngun tắc vẫn khơng có gì thay đổi: gây
miễn dịch bằng một vi khuẩn hoặc virus giảm độc lực, hoặc với một protein
đặc hiệu có tính kháng ngun để gây ra một đáp ứng miễn dịch, rồi tạo một
trí nhớ miễn dịch đặc hiệu, tạo ra hiệu quả đề kháng cho cơ thể về sau khi tác
nhân gây bệnh xâm nhập với đầy đủ độc tính.
Có nhiều cách để phân loại vaccine, tuy nhiên dựa vào đặc điểm
vaccine được phân thành các loại chính sau và cách phân loại này được hiện
được nhiều người chấp nhận [55].
+, Vaccine truyền thống như: vaccine bất hoạt và vaccine giảm động
lực với ưu điểm là dễ sản xuất và bảo quản, giá thành rẻ, độ an tồn cao. Tuy
nhiên, nhược điểm lớn của loại vaccine này là gây đáp ứng miễn dịch ngắn
hạn, cần tiêm nhắc lại nhiều lần, khả năng sinh đáp ứng miễn dịch chậm,
lượng vaccine tiêm mỗi lần nhiều và hiệu quả khơng cao đối với vaccine bất
hoạt và vaccine giảm động lực thì khơng an tồn do có khả năng biến đổi lại
thành chủng cường độc.

Footer Page 25 ofNguyễn
126. Thị Phương – K15

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>