ĐỀ TÀI: ỨNG DỤNG DẤU ẤN MIỄN DỊCH TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH BẠCH CẦU CẤP

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG

BÁO CÁO KẾT QUẢ
THỰC TẬP TỐT NGHIỆP

ĐỀ TÀI: ỨNG DỤNG DẤU ẤN MIỄN DỊCH TRONG
CHẨN ĐOÁN BỆNH BẠCH CẦU CẤP
CHUYÊN NGÀNH:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CƠ SỞ THỰC TẬP:

BỆNH VIỆN UNG BƯỚU ĐÀ NẴNG

Đà Nẵng – Năm 2017



LỜI CẢM ƠN


MỤC LỤC


I.

NỘI DUNG VÀ TIẾN ĐỘ THỰC TẬP

STT

Nội dung công việc

1

Tìm hiểu về cơ quan thực tập

2

Tìm hiểu kiến thức chuyên môn xét
nghiệm

3

Nghỉ Tết

4

Tìm hiểu trang thiết bị tại cơ quan

5

Tìm hiểu về một qui trình xét nghiệm

6

Thực nghiệm qui trình xét nghiệm

7

Viết báo cáo thực tập tốt nghiệp

5

Tiến độ thực hiện
Tuần 1
(09/01/2017 đến 15/01/2017)
Tuần 2
(16/1/2017 đến 22/01/2017)
Tuần 3-4
(23/01/2017 đến 05/02/2017)
Tuần 5
(06/02/2017 đến 12/02/2017)
Tuần 6
(13/02/2017 đến 19/02/2017)
Tuần 7-9
(20/02/2017 đến 12/03/2017)
Tuần 10
(13/03/2017 đến 19/03/2017)


II.

CÁC KẾT QUẢ CỤ THỂ

1. Giới thiệu về cơ sở thực tập
1.1. Giới thiệu chung về bệnh viện
1.1.1. Lịch sử thành lập
Bệnh viện Ung bướu Đà Nẵng ( Danang Cancer Hospital- DCH) là một bệnh viện

chuyên khoa ung thư loại 1 hoàn chỉnh của thành phố Đà Nẵng, quy mô 500 giường
bệnh nội trú. Bệnh viện được đặt tại Phường Hòa Minh, Quận Liên Chiểu, Thành phố
Đà Nẵng, trên diện tích 15 hecta.
Bệnh viện Ung bướu Đà Nẵng được thành lập theo quyết định số 5898/QĐ-UBND
ngày 15/8/2015 của UBND thành phố Đà Nẵng, trên cơ sở tổ chức lại Khoa Ung bướu
thuộc Bệnh viện Đà Nẵng và tiếp nhận nguyên trạng tổ chức bộ máy, người lao động,
trụ sở, cơ sở vật chất, trang thiết bị, tài chính, tài sản của Bệnh viện Ung bướu Đà Nẵng
(thuộc Hội Bảo trợ phụ nữ và trẻ em nghèo bất hạnh thành phố).
Bệnh viện là đơn vị sự nghiệp công lập, chịu sự quản lý, chỉ đạo trực tiếp của
Giám đốc Sở Y tế Đà Nẵng.

6


Hình 1.1: Bệnh viện Ung bướu Đà Nẵng

1.1.2. Mục tiêu, nhiệm vụ
•

Mục tiêu:

Xây dựng một bệnh viện chuyên khoa ung bướu đạt trình độ cao, để làm tốt
công tác phòng chống ung bướu trong khu vực và từng bước phát triển bệnh viện thành
Viện ung bướu.
Bệnh viện sẽ đem lại lợi ích thiết thực cho bệnh nhân ung bướu trong khu vực.
Đặc biệt, bệnh nhân ung bướu nghèo tại Đà Nẵng và khu vực Miền Trung có cơ hội
được khám chữa bệnh miễn phí với chất lượng tốt.
•

Nhiệm vụ

 Bệnh viện thực hiện 6 nhiệm vụ do Bộ Y tế quy định:

(1) Cấp cứu, khám bệnh, chữa bệnh,
(2) Đào tạo cán bộ y tế,
(3) Nghiên cứu khoa học y học,
(4) Phòng bệnh,
(5) Hợp tác quốc tế về y học,
(6) Quản lý kinh tế trong bệnh viện.
 Lãnh đạo thành phố Đà Nẵng giao cho bệnh viện 3 nhiệm vụ chính là:

(1) Làm tốt công tác khám, chữa bệnh cho bệnh nhân ung thư trong khu vực,
7


(2) Tầm soát và phát hiện sớm bệnh ung thư
(3) Triển khai các chương trình nghiên cứu khoa học về bệnh ung thư.
1.1.3. Cơ cấu và tổ chức
Thầy thuốc nhân dân, bác sĩ Chuyên khoa 2 Nguyễn Út, phó Giám đốc Sở Y tế Đà
Nẵng, kiêm nhiệm chức vụ Giám đốc Bệnh viện Ung bướu Đà Nẵng.
Bệnh viện được đầu tư xây mới hoàn chỉnh các công trình hạ tầng với 3 khối nhà
chính:
- Khối hành chính và hội trường,
- Khối điều trị nội trú
- Khối kỹ thuật nghiệp vụ
Tổng diện tích sàn khoảng 54.000m2
Diện tích xây dựng trung bình cho mỗi giường bệnh gần 110m2.
Bệnh viện được thiết kế theo mô hình bệnh viện khách sạn với cảnh quan trong
bệnh viện rất hài hòa, tiện nghi và thân thiện. Mọi phòng bệnh đều có phòng vệ sinh
riêng, hệ thống điều hòa trung tâm và hệ thống khí trung tâm. Bệnh viện dành 1 khu

nhà nghỉ gần 50 phòng ( khoảng 400 giường) để người nhà bệnh nhân có điều kiện
nghỉ ngơi trong thời gian chăm sóc bệnh nhân tại bệnh viện. Bệnh viện cũng có 1 khu
nhà dành cho nhân viên, sinh viên đến thực tập và khu nhà dành cho chuyên gia trong
và ngoài nước đến giúp đỡ bệnh viện
 Bệnh viện gồm:
o 8 phòng:
•

Phòng hành chính quản trị.
8


•

Phòng kế hoạch tổng hợp.

•

Phòng tổ chức cán bộ.

•

Phòng công nghệ thông tin.

•

Phòng điều dưỡng.

•

Phòng chỉ đạo tuyến và QLCLBV.

•

Phòng vật tư và thiết bị y tế.

o 18 khoa:

Các khoa lâm sàng:
•

Khoa khám bệnh và cấp cứu

•

Khoa chăm sóc giảm nhẹ

•

Khoa hóa trị I

•

Khoa hóa trị II

•

Khoa huyết học

•

Khoa gây mê hồi sức

•

Khoa ngoại 1

•

Khoa ngoại 2

•

Khoa ngoại 3

•

Khoa xạ trị

9


•

Khoa y học hạt nhân.

Các khoa cận lâm sàng:
•

Khoa dược

•

Khoa chẩn đoán hình ảnh

•

Khoa nội soi và TDCN

•

Khoa kiểm soát nhiễm khuẩn

•

Khoa xét nghiệm-truyền máu

•

Khoa giải phẫu bệnh

•

Khoa kỹ thuật phóng xạ.

Bệnh viện có hệ thống trang thiết bị hiện đại và đồng bộ, đáp ứng tốt nhu cầu khám
chữa bệnh ung bướu. Các hệ thống chẩn đoán và theo dõi điều trị ung bướu như máy
CT-scan đa lát cắt, máy MRI 3.0T, máy tăng sáng truyền hình, máy siêu âm màu 4
chiều, máy nội soi can thiệp, máy SPECT, PET-CT, máy đếm tế bào tự động 40 thông
số, máy xét nghiệm sinh hóa tự động, ELISA tự động, FACS, miễn dịch hóa tổ chức,

máy cắt lạnh, hệ thống phân tích gen… Các hệ thống trang thiết bị xạ trị ung thư kỹ
thuật cao như máy xạ trị gia tốc, máy xạ phẫu, xạ trị áp sát liều cao, CT mô phỏng,…
Các cơ sở điều trị hiện đại như 10 phòng mổ chuẩn, khu hậu phẫu 40 giường bệnh, khu
hồi sức cấp cứu và chăm sóc giai đoạn cuối 50 giường bệnh và khu ghép tủy xương 6
phòng ghép chuẩn…
1.2. Giới thiệu về khoa xét nghiệm – truyền máu
- Địa điểm: Tầng 2 – Khu nhà D – Bệnh Viện Ung bướu Đà Nẵng
Tổ 14 Phường Hòa Minh, Quận Liên Chiểu,TP. Đà Nẵng.
- Điện thoại: 02363.717361 ( Hành chính)
10


02363.717362 ( ThS.BS Lê Văn Hùng – Trưởng khoa)

Hình 1.2: Khoa xét nghiệm và truyền máu
1.2.1. Chức năng, nhiệm vụ
 Quản lý các hoạt động khoa học và công nghệ trong Bệnh viện:

- Quản lý các đề tài và các dự án khoa học công nghệ các cấp của Bệnh viện.
- Tổ chức và quản lý các hình thức sinh hoạt khoa học công nghệ trong Bệnh viện.
- Tổ chức và quản lý hoạt động của Thư viện chuyên khoa.
 Quản lý và triển khai các chương trình nghiên cứu khoa học công nghệ:

- Nghiên cứu và triển khai các chương trình nghiên cứu khoa học công nghệ trong công
tác dịch tể học, tầm soát, chẩn đoán, điều trị và phòng chống bệnh ung thư.
- Nghiên cứu dược lâm sàng các thuốc chống ung thư mới và ứng dụng các loại thuốc
đông y trong điều trị bệnh nhân ung thư.
- Nghiên cứu và đưa ra những tác động của môi trường và xã hội đến việc phòng chống
bệnh ung thư và các biện pháp giáo dục sức khoẻ phòng chống bệnh ung thư.
 Ứng dụng và triển khai các dịch vụ khoa học kỹ thuật của Trung tâm, bệnh viện

- Ứng dụng và triển khai các dịch vụ khoa học kỹ thuật mới về chẩn đoán và điều trị
của Bệnh viện.
11


- Triển khai các dịch vụ đào tạo liên quan đến lĩnh vực chuyên môn của Trung tâm. Tổ
chức đào tạo, đào tạo lại nhằm nâng cao trình độ cho cán bộ nhân viên của Trung tâm
và Bệnh viện.
 Hợp tác trong và ngoài nước.

- Thiết lập các mối quan hệ, hợp tác, ký kết các văn bản ghi nhớ, thoả thuận về đầu tư
nghiên cứu khoa học với các Bệnh viện, trung tâm, cá nhân và tổ chức đơn vị trong
nước và quốc tế.

12


1.2.2. Cơ cấu tổ chức khoa xét nghiệm – truyền máu
TRƯỞNG KHOA

KTV TRƯỞNG

ĐƠN VỊ TRUYỀN MÁU

TỔ CTM – ĐÔNG MÁU

TỔ VI SINH

ĐƠN VỊ

XÉT NGHIỆM TỔNG HỢP

TỔ
HÓA SINH

ĐƠN VỊ
MIỄN DỊCH - DI TRUYỀN - SHPT

TỔ LẤY– NHẬN VÀ XỬ LÝ MẪU

TỔ
TẾ BÀO

1.3. Giới thiệu về đơn vị thực tập: Miễn dịch – Di truyền – Sinh học phân tử
1.3.1.

Nhân sự
Hiện tại đơn vị có 05 nhân lực chuyên môn cơ hữu, 01 cố vấn kiêm nhiệm là

PGS. TS BS Nguyễn Hữu Toàn.

STT

HỌ VÀ TÊN

1

Lê Văn Hùng

2

Hồ Ngọc Dương

3

Hoàng Ngọc Thanh

CHỨC DANH CHUYÊN NGÀNH
ThS.BS
Cử nhân
KTYH
Cao đẳng
KTYH
13

CHỨC VỤ

Y học phân tử

Trưởng khoa

Xét nghiệm

KTV Trưởng

Xét nghiệm

Nhân viên

1.3.2.

4

Lê Thị Trân Nhi

5

Nguyễn Hương Trang

Thạc sỹ
Cử nhân
KTYH

Công nghệ sinh học

Nhân viên

Xét nghiệm

Nhân viên

Lãnh đạo đơn vị

- ThS.BS. Lê Văn Hùng: Trưởng khoa.
Điện thoại:
Cơ quan: 05113.717.362
Di động: 0903.566159
Email:

- CN. Hồ Ngọc Dương: Kỹ thuật viên Trưởng
Điện thoại:
Cơ quan: 05113.717.374
Di động: 0918.998199
Email:
- PGS.TS.BS. Nguyễn Hữu Toàn: Cố vấn chuyên môn
Điện thoại:
Cơ quan 0511 371 7 373
Di động 0935 219659
Email:

14


1.3.3.

2.

Các kĩ thuật đã triển khai

STT

DỊCH VỤ

1

Xét nghiệm gene chẩn đoán Lao, HBV, HCV, vi khuẩn các loại

2
3

4
5

Xét nghiệm gene ung thư các loại
Xét nghiệm Di truyền (Nhiễm sắc thể)
Xét nghiệm phân tích CD
Các xét ngiệm miễn dịch khác

Ứng dụng dấu ấn miễn dịch trong chẩn đoán bệnh Bạch cầu cấp

2.1. Bệnh bạch cầu cấp
2.1.1. Giới thiệu
Bệnh bạch cầu cấp là bệnh ung thư tủy xương – là tình trạng cấp tính của bệnh lý
ác tính tại tủy xương.
Bệnh bạch cầu cấp xảy ra khi cơ thể bắt đầu tích tụ bạch cầu bất bình thường. Vì
vậy, số lượng và khả năng của tế bào máu trưởng thành bị giảm bớt. Tế bào trở thành “
bất bình thường” vì chúng không thể trưởng thành trọn vẹn. Tình trạng không thể
trưởng thành trọn vẹn này là yếu tố chính gây ra bệnh bạch cầu cấp. Những tế bào “em
bé”, hay còn non, tích tụ trong cơ thể, vì chúng không chết và không bị tiêu hao dần.
Khi phát bệnh bạch cầu, các tế bào bệnh bạch cầu tích tụ trong tủy xương. Cuối
cùng tất cả bạch cầu, hồng cầu và tiểu cầu bình thường hết chỗ trú ngụ hay không đổi
mới nữa. Tủy xương khỏe mạnh bị thay thế bằng những tế bào còn non, rồi cuối cùng
những tế bào này nhập vào dòng máu và đi khắp nơi trong cơ thể. Do đó, khi số lượng
tế bào còn non gia tăng, thì số lượng hồng cầu, bạch cầu và tiểu cầu giảm bớt.
Bốn dạng bệnh bạch cầu chính là:
• Bệnh bạch cầu dòng tủy ác tính (Acute Myeloid Leukaemia - AML)

• Bệnh bạch cầu dòng tủy mãn tính (Chronic Myeloid Leukaemia- CML)
• Bệnh bạch cầu lympho ác tính (Acute Lymphoblastic Leukaemia - ALL)
• Bệnh bạch cầu lympho mãn tính (Chronic Lymphocytic Leukaemia - CLL)

15


 Bệnh Bạch cầu cấp (Acute Leukaemia) là bệnh tăng sinh ác tính các tế bào máu chưa

biệt hóa hay đã biệt hóa một phần thành các tế bào đầu dòng của tế bào bạch cầu, xảy
ra khi các tế bào trong thời kỳ phát triển ban đầu bị ảnh hưởng. Do đó, các tế bào này
không trưởng thành được và hoàn toàn vô dụng. Bệnh nhân bị bệnh bạch cầu dạng cấp
tính dễ bị viêm nhiễm, chảy máu, thiếu máu, và hầu như phải được trị liệu ngay. Bạch
cầu cấp, còn gọi là bệnh lơ xê mi cấp, là bệnh ung thư phổ biến nhất ở trẻ em trên thế
giới, bệnh chiếm khoảng một phần tư các bệnh ung thư ở trẻ em dưới 15 tuổi. Bạch cầu
cấp thể lympho chiếm 75% các bệnh bạch cầu cấp
2.1.2.

Nguyên nhân
Cho đến nay, y học đang tìm kiếm nguyên nhân cụ thể gây nên bệnh bạch cầu

cấp. Tuy nhiên, các nhà nghiên cứu ghi nhận các yếu tố liên quan đến bệnh lý này như
sau:
- Hóa chất : Các chất nhóm Alkyl, nhóm benzen (những hóa chất có cấu trúc hóa học
nhân vòng).
- Tia xạ hay tia ion hóa: tỷ lệ bệnh bạch cầu cấp gặp nhiều ở những người tiếp xúc với
tia xạ lâu ngày hay ở trong vùng nhiễm xạ nặng.
- Virus: nhiều nghiên cứu ghi nhận một số virus gây bệnh trên người một thời gian dài
cũng gây ung thư. Ví dụ: EBV gây ung thư vòm, HTLV1,2 gây bệnh bạch cầu cấp
dòng lympho T….
- Bất thường nhiễm sắc thể: đây là nguyên nhân thường gặp trên bệnh nhân bạch cầu
cấp.
- Yếu tố di truyền: có một số bệnh bẩm sinh di truyền như Hội chứng Down, hội chứng
thiếu hụt miễn dịch bẩm sinh, hội chứng Poland… gây người bệnh dễ mắc thêm bệnh

bạch cầu cấp.
- Yếu tố môi trường: môi trường bị nhiễm độc do hóa chất, thuốc trừ sâu, tia xạ…gây
nên tình trạng nhiễm độc nguồn nước, thức ăn…và các chất độc này gây đột biến
nhiễm sắc thể, gây ung thư máu.
2.1.3. Đối tượng
Tiêu chuẩn chọn bệnh:
•

Khám lâm sàng hướng đến bệnh bạch cầu cấp
16


- Cấp tính và sốt thường gặp nhất (50-60%)
- Thiếu máu: da xanh, niêm mạc nhợt nhạt, trẻ mệt mỏi tim đập nhanh, khó thở đôi
khi có biểu hiện suy tim.
- Giảm bạch cầu trung tính: sốt, viêm loét niêm mạc miệng, nhiễm khuẩn.
- Giảm tiểu cầu: xuất huyết dưới da, chấm, nốt xuất huyết, bầm máu, chảy máu niêm
mạc, đôi khi chảy máu nội tạng (tiêu hóa, nội sọ, phổi)
- Gan, lách, hạch to.
- Các triệu chứng khác có thể gặp do tế bào ác tính xâm lấn các cơ quan phì đại lợi
răng, lồi mắt, tăng áp lực sọ não, sưng tinh hoàn, buồng trứng, có u trung thất, đau
xương khớp…
•

Có kết quả huyết đồ

- Hồng cầu giảm
- Số lượng bạch cầu có thể thấp, bình thường hay tăng cao.
- Tiểu cầu giảm khá rõ rệt ngay từ đầu.
•

Có kết quả tủy đồ chuẩn đoán bệnh bạch cầu cấp

- Số lượng tế bào tủy tăng, song có thể bình thường hoặc giảm.
- Tăng sinh rất nhiều lymphoblast, thường có thể tới 60-90% tế bào tủy.
- Có hiện tượng lấn át các tế bào tủy bình thường.
2.2.

Mục đích của dấu ấn miễn dịch tế bào
Kỹ thuật khảo sát dấu ấn miễn dịch trên các tế bào ung thư ( Leukemia
phenotyping) nhằm mục đích là xác định bản chất dòng tế bào ung thư này và mức độ
biệt hóa của nó. Trong một số trường hợp, kỹ thuật này giúp xác định một quần thể tế
bào tăng sinh là bình thường hay ác tính.
2.3. Phương pháp
- Sử dụng kỹ thuật phân tích tế bào dòng chảy để xét nghiệm bệnh bạch cầu cấp ( flow
cytometry ): kỹ thuật phân loại tế bào dựa vào việc sử dụng ánh sáng huỳnh quang (đèn
argon) và phát triển thiết bị phân loại tế bào dựa trên kích hoạt huỳnh quang (FACS –
Flourescent Activated Cell Sorter).
+ Sử dụng bộ kit Acute Leukemia Phenotyping khảo sát trên máy BD FACS Canto
II của hãng Becton Dickinson - Mỹ (hiện đại nhất Việt Nam hiện nay) cùng với
17


dàn kháng thể đơn dòng phong phú đủ để đáp ứng những yêu cầu chẩn đoán và
nghiên cứu trong lĩnh vực huyết học.

Hình 2.1: Máy BD FACS Canto II

Hình 2.2: Bộ kit Acute Leukemia Phenotyping
18

Hình 2.3: Lọ chứa kháng thể đơn dòng

19


Dòng tế bào

Kháng thể đơn dòng

Các dấu ấn non

Dòng lympho B

CD34, CD38, CD117( dòng tủy)
TdT và CD10 ( dòng lympho)
HLA.Dr (dòng hạt và lympho T)
CD19, cyCD22, smCD22, cyCD79a, CD79b, CD20,
CD5, HLA.DR, CD38, CD138, CD23, CD24, CD25,
Cd103, Igk/, IgM, CD43, FMC-7
CD2, CyCD3, smCD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD1a

Dòng lympho T
Tế bào giết tự
nhiên
(NK cell)

CD56, CD57, CD16, CD2, CD7, CD8
MPO, CD13, CD16, CD2, CD7, CD8

Dòng hạt
Tương tự dòng hạt và đặc trưng riêng
CD14, CD36, CD64, CD4, HLA.DR

Dòng mono
Dòng hồng cầu
Dòng mẫu tiểu
cầu

CD71, Cd235a, CD36
CD61, CD41, CD42

Bảng 2.1: Tổng hợp những kháng thể đơn dòng trong
chẩn đoán bệnh bạch cầu cấp và lympho
 Để đạt được kết quả chính xác và khách quan cần áp dụng một dàn kháng thể

đơn dòng đủ lớn và bao quát để có thể phân biệt được các dòng tế bào với
nhau, đồng thời đánh giá được giai đoạn trưởng thành của từng dòng.
2.3.1. Nguyên lý hoạt động của máy tế bào dòng chảy
Nguyên lý cơ bản của máy đếm tế bào dòng chảy ( flow cytometry - FC) là
nguyên lý biến đổi điện trở của dòng hạt đi qua cửa sổ có tế bào quang điện và một

20


điện trường. Nguyên lý này giúp phân tích sự khác biệt về kích thước các loại tế bào
khác nhau, nhưng không nhận diện chính xác từng loại tế bào.
Các máy đếm tế bào hiện đang được sử dụng có thể chia làm hai loại:
- Máy đếm tế bào nguyên lý tổng trở: phân biệt từng loại tế bào dựa vào kích thước tế

bào.
- Các máy thế hệ sau: ứng dụng laser và xung điện đa chiều nên có tốc độ cao và phân
loại tế bào chính xác hơn. Với những máy sản xuất trước 1996 khả năng phân loại
chính xác các thành phần bạch cầu nói chung không quá 90%. Các máy model gần
đây, với việc áp dụng tổng hợp các cơ chế tổng trở, xung điện đa chiều, laser và
scatter nên khả năng nhận diện tế bào được nâng đến 95%. Một số serie máy có thể
phân biệt được các loại bạch cầu ưa a xít, ưa baso, hồng cầu lưới bằng việc kết hợp
với các phương pháp nhuộm men peroxydase, nhuộm RNA/DNA, nhuộm huỳnh
quang, phân tích huyết sắc tố (CellDyn 4000 của hãng ABBOTT, SE-Advance của
hãng Sysmex…).
2.3.2. Các bộ phận chính của máy flow cytometry

Hình 2.4 : Hệ thống Flow Cytormetry
21


•

Hệ thống tạo dòng chất lỏng (fluidics system)

Hệ thống tạo dòng chất lỏng gồm có 2 vùng chất lỏng có áp lực khác nhau.
Dòng dịch lỏng bên ngoài (sheath fluid) còn được gọi là dung dịch tạo dòng bao: có tác
dụng “nắn chỉnh” dòng dịch lỏng chứa mẫu bên trong (core fluid) còn gọi là dòng lõi
thành một dòng hẹp tới mức các tế bào/hạt vật chất trong mẫu chỉ có thể đi qua khe hẹp
đó từng cái một từ đó giúp tập trung tế bào/vật thể nhỏ có trong mẫu thành dòng tế bào
đơn và vận chuyển dòng tế bào đơn này đi qua hệ thống quang học với tốc độ rất cao,
khoảng 1000 tế bào/giây. Điều chỉnh mức độ chênh lệnh áp lực giữa dòng bao và dòng
lõi có thể mở rộng hoặc thu hẹp tiết diện dòng lõi, phù hợp với yêu cầu phân tích (ví dụ
phân tích tế bào máu thì cần dòng lõi lớn, phân tích ADN thì cần dòng lõi hẹp). Nhờ cơ
chế này hệ thống mới có thể phân tích đồng thời nhiều đặc tính trên từng tế bào một

cách chính xác, giảm được yếu tố nhiễu.
•

Hệ thống quang học

Hệ thống quang học bao gồm nguồn phát tia sáng (thường là các đèn laser hoặc
đèn hồ quang), hệ thống kính lọc và các kênh thu tín hiệu quang học và tính hiệu
huỳnh quang (FSC dùng thu nhận tín hiệu ánh sáng tán xạ góc thẳng; SSC dùng thu
nhận tín hiệu ánh sáng tán xạ góc bên, các FL (Fluoressen Light), dùng thu nhận tín
hiệu ánh sáng huỳnh quang từ kênh màu huỳnh quang và số kênh màu huỳnh quang có
thể dao động từ 2 đến 18 FL tùy dòng máy; PMT – Photo Multiplier Tube, các ống
nhân quang tương ứng với các kênh màu huỳnh quang có vai trò khuếch đại tín hiệu
ánh sáng huỳnh quang).
•

Hệ thống điện tử:

Về bản chất là một hệ thống có trong máy, các tín hiệu của ánh sáng tán xạ và tín
hiệu huỳnh quang sau khi được khuếch đại sẽ được hệ thống điện tử chuyển thành tín
hiệu số đo đếm được và được biểu hiện dưới dạng biểu đồ cột, biểu đồ mật độ hay biểu
đồ điểm trên máy tính thông qua các phần mềm chuyển đổi chuyên dụng theo máy.

22


2.4. Quá trình thực hiện
2.4.1. Hóa chất thuốc thử

STT
1

2
3
4
5
6
7

TÊN HÓA CHẤT
Bộ kháng thể đơn dòng
gắn huỳnh quang
FACS lysing solution
Sheath (FACS flow)
FACS clean
CST Bead
BD compbead
Intrasure

ĐÓNG GÓI

SỐ LƯỢNG/1
XÉT
NGHIỆM

ĐƠN VỊ
TÍNH
Test

Lọ/100
Thùng/20
Thùng/5

Lọ/50
Lọ/50
Kit/50 test

0.5
0.5
0.1
0.1
0.1
0.2

ML
L
L
Test
Test
Test

Bảng 2.2: Hóa chất, thuốc thử
2.4.2. Nguyên lý xét nghiệm
Kháng nguyên có trên bề mặt hoặc bên trong tế bào kết hợp với kháng thể đặc
hiệu được đánh dấu bằng huỳnh quang, sau đó được phân tích trên hệ thống FC với
phần mềm FACSDivaTM giúp phân loại và chuẩn đoán bệnh BCC.
2.4.3. Quy trình thực hiện

Mẫu nghiệm

•

Xử lý mẫu

Thu thập mẫu

Kiểm tra và phân tích

Kết quả

Bước 1: Lấy mẫu bệnh phẩm

Bệnh phẩm là máu, dịch hút tủy xương, các loại dịch khác theo yêu cầu của lâm
sàng. Chất chống đông EDTA. Số lượng mẫu: 2ml.
•

Bước 2: Xử lý mẫu

•

Xử lý mẫu xét nghiệm: các loại mẫu tươi được giữ ở dạng huyền phù bằng
thuốc chống đông, tốt nhất là EDTA;

23


Mẫu nghiệm được nhuộm với những kháng thể gắn huỳnh quang nào phụ thuộc
vào số lượng và hiện trạng hóa chất cũng như thuốc nhuộm mà mỗi bộ phận xét
nghiệm đang có. Người ta thường nhập về các kháng thể phổ biến, dùng được cho
nhiều người.
•

Nhuộm ngoại bào:

-

Đánh dấu các tube chuẩn bị thực hiện.

-

Cho 50 μl máu/ dịch tủy xương (số lượng bạch cầu khoảng 2-5.10 5 / tube) vào
các tube.

-

Cho 3 μl kháng thể đơn dòng (theo panel).

-

Votex đều các tube 5 giây.

-

Ủ các tube trong tối, nhiệt độ phòng trong 15 phút.

-

Votex đều các tube trong 5 giây.

-

Cho 1 ml lysing vào mỗi tube.

-

Votex các tube 5 giây.

-

Ủ các tube 10 phút trong tối, nhiệt độ phòng. Chú ý votex các tube mỗi 5
phút/lần.

-

Ly tâm các tube 300g/5 phút.

-

Đổ bỏ dịch nổi, thấm bằng giấy thấm.

-

Cho tiếp 2 ml sheath vào các tube. Votex.

-

Ly tâm 300g/ 5 phút.

-

Đổ bỏ dịch nổi.

-

Tái huyền dịch các tube bằng 0.2 ml sheath. Votex.

•

Nhuộm nội bào:

-

Đánh dấu các tube chuẩn bị thực hiện

-

Cho 50 μl máu/ dịch tủy xương (số lượng bạch cầu khoảng 2-5.10 5 / tube) vào
các tube

-

Cho 3 μl kháng thể đơn dòng nhuộm kháng nguyên bề mặt tế bào (theo panel)

-

Votex đều các tube 5 giây

-

Ủ các tube trong tối, nhiệt độ phòng trong 15 phút.

-

Votex đều các tube trong 5 giây.
24


-

Cho 100 μl dung dịch FIX vào mỗi tube nhuộm nội bào. Votex đều, ủ trong tối
15 phút.

-

Cho 2 ml sheat vào các tube. Votex đều.

-

Ly tâm các tube 300g/5 phút.

-

Đổ bỏ dịch nổi nhẹ nhàng, thấm bằng giấy thấm (chú ý tránh để mất tế bào).

-

Cho 100 μl dung dịch Perm vào mỗi tube nhuộm nội bào, tiếp tục cho 3 μl
kháng thể nhuộm nội bào, Votex đều. Ủ trong tối 20-30 phút. (Votex các tube
mỗi 5 phút/ lần).

-

Cho 2 ml sheat vào các tube. Votex đều.

-

Ly tâm các tube 300g/5 phút.

-

Đổ bỏ dịch nổi nhẹ nhàng.

-

Cho 2 ml sheat vào các tube. Votex đều.

-

Ly tâm các tube 300g/5 phút.

-

Đổ bỏ dịch nổi.

-

Tái huyền dịch các tube bằng 0.2 ml sheat. Votex.

Lưu ý:
Mẫu được nhuộm càng sớm càng tốt để tránh tế bào bị chết quá nhiều làm ảnh
hưởng đến kết quả. Phương pháp nhuộm với nhiều màu huỳnh quang được đánh giá
cao vì cho phép phát hiện nhiều DAMD tế bào cùng lúc và phản ánh mối quan hệ mật
thiết giữa các dấu ấn đó.

Thông thường để quan sát các kháng nguyên trên bề mặt tế bào, chỉ cần ủ mẫu
tủy hoặc mẫu máu với kháng thể đơn dòng có gắn huỳnh quang khoảng 10-15 phút.
Vì chẩn đoán bệnh BCC chủ yếu tập trung vào nghiên cứu tế bào có nhân, nên phải
sử dụng ammonium chloride hoặc các dung dịch có tác dụng tương tự để loại bỏ hồng
cầu trưởng thành (HC không nhân). Các tế bào thuộc dòng hồng cầu chưa trưởng
thành có nhân sẽ không bị phá hủy vì đề kháng với ammonium chloride.
Khi cần khảo sát thêm những dấu ấn nằm trong bào tương hay trong nhân tế bào,
người ta cần làm tăng tính thấm bề mặt tế bào để đưa kháng thể xuyên qua màng tế
bào đến gắn với kháng nguyên đích bên trong tế bào. Các kháng nguyên bên trong tế
25