Bước đầu nghiên cứu phương pháp phát hiện nhanh trực trùng mủ xanh (pseudomonas aeruginosa) kháng thuốc kháng sinh nhóm β lactam bằng kỹ thuật PCR

i

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

NGUYỄN TUẤN ANH
Tên đề tài :
BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU PHƢƠNG PHÁP PHÁT HIỆN NHANH
TRỰC TRÙNG MỦ XANH (Peudomonas aeruginosa) KHÁNG THUỐC
KHÁNG SINH NHÓM β-LACTAM BẰNG KỸ THUẬT PCR

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Hệ đào tạo

:

CHÍNH QUY

Chuyên ngành

:

Công nghệ sinh học

Khoa

:

CNSH - CNTP

Lớp

:

K43 - CNSH

Khóa học

:

2011 - 2015

Giảng viên hƣớng dẫn : 1. BS. Nguyễn Thị Huyền
2. TS. Nguyễn Văn Duy

THÁI NGUYÊN – 2015


i
LỜI CẢM ƠN
Tôi xin chân thành cảm ơn:
Ban Giám Hiệu Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã tạo mọi
điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập tại trường.
Các thầy cô Khoa Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm cùng
các thầy cô đã trực tiếp giảng dạy và đã tận tình truyền đạt kiến thức cho tôi
trong suốt những năm học vừa qua.
Tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới:
TS. Nguyễn Văn Duy, Khoa Công nghệ sinh học và Công nghệ thực
phẩm, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận
lợi và hướng dẫn tận tình tôi trong quá trình thực hiện đề tài.
BS. Nguyễn Thị Huyền, CN. Trần Trung Anh và các KTV. Nguyễn Thị

Thủy, Trương Thùy Vi, Dương Minh Phương, Khoa Vi sinh vật, Bệnh viện
đa khoa Trung Ương Thái Nguyên đã hỗ trợ, giúp đỡ tôi tận tình và đã cung
cấp cho tôi các chủng vi sinh vật để thực hiện đề tài.
Tôi xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn ở bên cạnh động
viên và giúp đỡ tôi học tập làm việc và hoàn thành khóa luận.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Thái Nguyên, ngày 28 tháng 5 năm 2015
Sinh viên

Nguyễn Tuấn Anh


ii
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 3.1: Các cặp mồi sử dụng trong đề tài nghiên cứu ................................ 18
Bảng 3.2: Các hóa chất sử dụng trong đề tài nghiên cứu ............................... 18
Bảng 3.3: Các dụng cụ, thiết bị sử dụng trong đề tài nghiên cứu ................... 19
Bảng 4.1: Bảng khảo sát tỷ lệ vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa kháng thuốc
trên bệnh nhân điều trị tại Bệnh viện Đa khoa Trung Ương Thái Nguyên .... 30
Bảng 4.2: Kiểu hình của 9 chủng Pseudomonas aeruginosa phân lập được tại
Bệnh viện Đa khoa Trung Ương Thái Nguyên ............................................... 33
Bảng 4.3: Nồng độ DNA tổng số tách chiết từ 9 chủng Pseudomonas
aeruginosa ..................................................................................................... 38
Bảng 4.4: So sánh sự có mặt của gene kháng metallo β-lactamase với kiểu
hình kháng β-lactam của các chủng Pseudomonas aeruginosa thu thập được
......................................................................................................................... 41


iii
DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 4.1: Khảo sát tỷ lệ vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa kháng thuốc trên
bệnh nhân điều trị tại Bệnh viện Đa khoa Trung Ương Thái Nguyên.…... 31
Hình 4.2: Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm tách chiết DNA tổng số của
một số mẫu Pseudomonas aeruginosa ............................................................ 36
Hình 4.3: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi OPRLFOPRLR ............................................................................................................ 38
Hình 4.4: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm của phản ứng multiplex PCR sử
dụng cặp mồi blaIMPF-blaIMPR và blaVIMF-blaVIMR .............................. 40


iv
DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT
Nghĩa đầy đủ của từ, thuật ngữ

Từ, thuật ngữ viết tắt
CIAA
DNA
dNTPs
OD

Hỗn hợp gồm 24 chloroform : 1 isoamylalcohol
(v/v)
Deoxyribonucleic Acid
Deoxyribonucleotide triphosphates (Hỗn hợp gồm
dATP, dGTP, dCTP, dTTP)
Optical Density - Mật độ quang
Polymerase Chain Reaction – Phản ứng tổng hợp

PCR

chuỗi trùng hợp – chỉ quá trình tổng khuếch đại

vùng DNA đặc hiệu in vitro

RNA
ELISA

Ribonucleic Acid
Enzyme Linked Immunosorbent Assay – Kỹ thuật
hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme


v

MỤC LỤC
Phần 1: MỞ ĐẦU ............................................................................................ 1
1.1. Đặt vấn đề................................................................................................... 1
1.2. Mục tiêu và yêu cầu của đề tài ................................................................... 3
1.3. Ý nghĩa của đề tài ....................................................................................... 3
Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................. 5
2.1. Tổng quan về trực trùng mủ xanh (Pseudomonas aeruginosa) ................. 5
2.1.1. Lịch sử nghiên cứu trực trùng mủ xanh (Pseudomonas aeruginosa) ..... 5
2.1.2. Đặc điểm sinh học ................................................................................... 6
2.2. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước ................................................ 8
2.2.1. Tình hình kháng thuốc của Pseudomonas aeruginosa trên thế giới ....... 8
2.2.2. Tình hình kháng thuốc của Pseudomonas aeruginosa trong nước ......... 9
2.3. Cơ chế kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn .......................................... 11
2.3.1. Cơ chế enzyme khử hoạt tính của thuốc kháng sinh............................. 11
2.3.2. Cơ chế thay đổi đích của thuốc kháng sinh .......................................... 11
2.3.3. Cơ chế ngăn sự xâm nhập của kháng sinh vào trong tế bào ................. 12
2.3.4. Cơ chế kháng thuốc kháng sinh của Pseudomonas aeruginosa ........... 13
2.4. Các phương pháp phát hiện Pseudomonas aeruginosa kháng thuốc ...... 14

2.4.1. Kỹ thuật khoanh giấy kháng sinh khuếch tán trên đĩa thạch ................ 14
2.4.2. Kỹ thuật xác định nồng độ tối thiểu của kháng sinh (MIC) ................. 15
2.4.3. Kỹ thuật PCR ........................................................................................ 15
Phần 3: ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. 17
3.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ............................................................ 17
3.1.1. Đối tượng nghiên cứu............................................................................ 17
3.1.2. Phạm vi nghiên cứu ............................................................................... 17
3.2. Địa điểm và thời gian tiến hành ............................................................... 17
3.2.1. Địa điểm nghiên cứu ............................................................................. 17


vi

3.2.2. Thời gian nghiên cứu ............................................................................ 17
3.3. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................. 17
3.3.1. Các cặp mồi sử dụng trong đề tài .......................................................... 17
3.3.2. Hóa chất sử dụng trong đề tài .............................................................. 18
3.3.3. Dụng cụ, thiết bị .................................................................................... 19
3.4. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 19
3.5. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 19
3.5.1. Phương pháp phân lập Pseudomonas aeruginosa từ bệnh nhân .......... 19
3.5.2. Phương pháp xác định kháng sinh đồ ................................................... 24
3.5.3. Phương pháp nghiên cứu phát hiện Pseudomonas aeruginosa kháng
thuốc bằng kỹ thuật PCR................................................................................. 25
Phần 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................ 29
4.1. Khảo sát tỷ lệ kháng thuốc kháng sinh của các chủng Pseudomonas
aeruginosa trên các bệnh nhân điều trị tại Bệnh viện Đa khoa Trung Ương
Thái Nguyên .................................................................................................... 29
4.2. Kết quả phân lập chủng Pseudomonas aeruginosa kháng thuốc kháng
sinh tại Bệnh viện Đa khoa Trung Ương Thái Nguyên .................................. 32

4.3. Thử nghiệm khả năng phát hiện nhanh Pseudomonas aeruginosa kháng
thuốc ................................................................................................................ 35
4.3.1. Tách chiết DNA tổng số ........................................................................ 35
4.3.2. Kiểm định các chủng Pseudomonas aeruginosa .................................. 37
4.3.3. Nghiên cứu khả năng phát hiện nhanh vi khuẩn Pseudomonas
aeruginosa kháng thuốc .................................................................................. 39
Phần 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................ 44
5.1. Kết luận .................................................................................................... 44
5.2. Kiến nghị .................................................................................................. 45
TÀI LIỆU THAM KHẢO


1
Phần 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Trực trùng mủ xanh (Pseudomonas aeruginosa) là một trong những
nguyên nhân hàng đầu gây nhiễm khuẩn bệnh viện. Chúng gây nên những
bệnh lí với nhiều mức độ khác nhau như viêm phổi, nhiễm khuẩn vết thương,
nhiễm khuẩn huyết nặng với tỉ lệ tử vong khá cao.
Tỉ lệ nhiễm khuẩn bệnh viện do trực trùng mủ xanh (P. aeruginosa) đã
tăng dần trong những năm gần đây trên thế giới và cả Việt Nam. Cùng với sự
gia tăng về tỉ lệ nhiễm khuẩn khả năng kháng kháng sinh cũng tăng cao. Theo
báo cáo của CDC ước tính rằng mỗi năm ở Hoa Kì có hơn hai triệu người
mắc bệnh với bệnh nhiễm trùng kháng thuốc kháng sinh thì có ít nhất 23.000
người chết và có khoảng 51.000 ca nhiễm bệnh liên quan đến P. aeruginosa.
Trong các ca nhiễm bệnh liên quan đến P. aeruginosa có hơn 6000 (13%) là
đa kháng thuốc, với khoảng 400 ca tử vong do nhiễm trùng (Fatima A. và cs,
2012) [22]. Theo kết quả một nghiên cứu khác (2013), trong 112 mẫu P.
aeruginosa phân lập được từ bệnh nhân điều trị bỏng tại một bệnh viện năm

2012 cho thấy tỷ lệ kháng tương đối cao như Gentamicine (59,6%),
Piperacillin (36,8%) và Ciprofloxaxin (33,3%) (Joseph N. M. và cs, 2013)
[26].
Ở Việt Nam, một nghiên cứu ở 36 bệnh viện các tỉnh phía Bắc từ Trung
Ương đến địa phương trong năm 2006 – 2007 đã công bố có tới 7,8% bệnh
nhân mắc nhiễm trùng bệnh viện (HAIs). Có 3 loại nhiễm khuẩn bệnh viện
chính gồm viêm phổi, nhiễm khuẩn vết mổ và nhiễm khuẩn tiêu hóa trong đó
P. aeruginosa là nguyên nhân chính (chiếm 31,5%) (Nguyễn Văn Hùng và cs,
2008) [8]. Theo kết quả nghiên cứu từ 4 bệnh viện tại Hà Nội: Việt Đức,


2
Xanh Pôn, Bệnh viện 108 và Bệnh viện 103 từ năm 2005 – 2008 cho thấy P.
aeruginosa phân lập từ các bệnh phẩm đề kháng rất cao với các loại kháng
sinh như Tetracycline (92,1%), Ceftriaxone (58,5%) và Gentamicin (54%)
(Bùi Khắc Hậu và cs, 2008) [6].
Tình hình đề kháng đa kháng sinh của P. aeruginosa được ghi nhận trong
những nghiên cứu trên cho thấy sự gia tăng về tình hình nhiễm khuẩn bệnh
viện do P. aeruginosa cũng như khả năng kháng lại kháng sinh của vi khuẩn
này gây nên, làm tăng tỉ lệ bệnh tật, tăng tỉ lệ tử vong và tăng chi phí điều trị.
Để phát hiện P. aeruginosa kháng thuốc phương pháp thường được sử
dụng hiện nay là nuôi cấy trên môi trường thạch kết hợp với các thử nghiệm
hóa sinh và làm kháng sinh đồ. Đây là phương pháp phức tạp và tốn nhiều
thời gian, chậm cho kết quả (4 - 6 ngày). Sự phát hiện chậm P. aeruginosa
kháng thuốc là một trong những nguyên nhân làm chậm hướng điều trị và góp
phần làm giúp cho những tác nhân gây bệnh này có cơ hội lây lan trong cộng
đồng, ảnh hưởng đến sức khỏe của nhiều người.
Với sự phát triển của sinh học phân tử, các vùng gene đặc hiệu cho tính
kháng thuốc của các loài vi sinh vật đã được hiểu biết ngày càng đầy đủ. Nhờ
đó, nhiều kỹ thuật sinh học phân tử đã được ứng dụng trong việc phát hiện

nhanh và đồng thời nhiều tác nhân gây bệnh trong mẫu phân tích dựa trên các
dấu hiệu phân tử mang tính đặc hiệu. Các kỹ thuật này bao gồm kỹ thuật PCR,
ELISA, DNA arrays…
PCR là kỹ thuật cho phép phát hiện tác nhân gây bệnh kháng thuốc chỉ
trong một phép phân tích. Đây là kỹ thuật đơn giản, không yêu cầu thiết bị
phức tạp nên rất thuận lợi trong việc áp dụng thực tiễn chẩn đoán.
Xuất phát từ thực tiễn đời sống, trên cơ sở căn cứ vào năng lực nghiên
cứu của Khoa CNSH và CNTP - Đại học Nông Lâm Thái Nguyên - Đại học
Thái Nguyên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Bƣớc đầu nghiên cứu


3
phƣơng pháp phát hiện nhanh trực trùng mủ xanh (Pseudomonas
aeruginosa) kháng thuốc kháng sinh nhóm β-lactam bằng kỹ thuật PCR”.
Trong khuôn khổ khóa luận này, chúng tôi chỉ tiến hành khảo sát mức độ
kháng thuốc kháng sinh của Pseudomonas aeruginosa tại các bệnh nhân điều
trị tại Bệnh viện Đa khoa Thái Nguyên trong thời gian từ tháng 12 năm 2014
đến tháng 5 năm 2015 và bước đầu nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR trong
phát hiện nhanh vi khuẩn này kháng các thuốc kháng sinh thuộc nhóm βlactam.
1.2. Mục tiêu và yêu cầu của đề tài
- Mục tiêu của đề tài
Bước đầu nghiên cứu được phương pháp phát hiện nhanh trực trùng mủ
xanh (Pseudomonas aeruginosa) kháng thuốc bằng kỹ thuật PCR.
- Yêu cầu của đề tài
+ Khảo sát được tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa
kháng thuốc trên bệnh nhân điều trị tại Bệnh viện Đa khoa Trung Ương
Thái Nguyên.
+ Phân lập được vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa kháng thuốc.
+ Bước đầu nghiên cứu được phương pháp phát hiện nhanh
Pseudomonas aeruginosa kháng thuốc bằng kỹ thuật PCR.

1.3. Ý nghĩa của đề tài
- Ý nghĩa trong khoa học
Bước đầu xây dựng thành công một kỹ thuật PCR phát hiện
Pseudomonas aeruginosa kháng thuốc.
- Ý nghĩa trong thực tiễn
+ Phục vụ công tác điều trị, khám chữa bệnh. Tạo tiền đề cho việc xây
dựng bộ kit chẩn đoán nhanh Pseudomonas aeruginosa kháng thuốc dựa trên
kỹ thuật PCR.


4
+ Kết quả nghiên cứu cung cấp góp phần bổ sung các phương pháp
chẩn đoán nhanh và đặc hiệu Pseudomonas aeruginosa kháng thuốc, phục vụ
cho việc bảo vệ sức khỏe cộng đồng.


5
Phần 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Tổng quan về trực trùng mủ xanh (Pseudomonas aeruginosa)
2.1.1. Lịch sử nghiên cứu trực trùng mủ xanh (Pseudomonas aeruginosa)
Năm 1872, P. aeruginosa được Schroeter mô tả lần đầu tiên với tên gọi
là Bacterium aeruginosa (Lê Huy Chính và cs, 2001) [3].
Năm 1900, Migula đã nghiên cứu và phân loại vi khuẩn này vào chi
Pseudomonas; từ đó vi khuẩn này mang tên Pseudomonas aeruginosa (Lê
Huy Chính và cs, 2001) [3].
Nghiên cứu nhiễm khuẩn huyết bỏng do P. aeruginosa gây ra tại Viện
Bỏng Quốc gia (6/1996 - 12/1998) đã cho thấy P. aeruginosa là vi khuẩn gây
nhiễm khuẩn huyết bỏng hàng đầu (chiếm khoảng 66,7%) (Nguyễn Quốc
Định và cs, 1999) [4].

Năm 2003, theo kết quả giám sát của Bộ y tế về các vi khuẩn gây bệnh
thường gặp ở Việt Nam thì P. aeruginosa là vi khuẩn đứng đầu trong số các
vi khuẩn đó chiếm tỷ lệ 22,3% (Lê Đăng Hà và cs, 2003) [5].
Lê Thu Hồng, Hoàng Ngọc Hiện (bộ môn vi sinh - Học viện quân y)
đã nghiên cứu chế tạo huyết thanh kháng P. aeruginosa đa giá, tinh chế và
đánh giá hiệu quả điều trị tại chỗ của chế phẩm trên động vật và bệnh nhân
bỏng (Lê Thu Hồng và cs, 2002) [7].
Nghiên cứu tình hình kháng kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh phân lập
tại bệnh viện Thống Nhất (8/2002 - 8/2005) của Hoàng Kim Tuyến và cộng
sự đã chứng minh được P. aeruginosa là nguyên nhân hàng đầu gây viêm
phổi tại bệnh viện với tỷ lệ kháng thuốc khá cao (>60%) (Hoàng Kim Tuyến
và cs, 2006) [13].


6
2.1.2. Đặc điểm sinh học
- Hình thái và cấu tạo
Trực khuẩn Gram âm, hình que, thẳng, hơi cong, hai đầu tròn, kích thước
0.5 - 1μm x 1 - 5 μm, đứng một mình hay thành đôi hoặc kết hợp thành chuỗi
ngắn. Di động nhờ tiên mao đơn cực, ít khi có vỏ, không sinh bào tử (Balcht và
cs, 1994) [18].
- Cấu trúc tế bào
+ Vỏ Polysaccharide
Pseudomonas aeruginosa tiết ra chất nhầy có cấu tạo là polysaccharide
gồm nhiều tiểu phần mannuronic acid và glucuronic acid hay còn được gọi là
alginate. Các dạng alginate này kết hợp với nhau tạo thành dạng cấu trúc
biofilm giúp bảo vệ che chở vi khuẩn tồn tại được trong môi trường tự nhiên
cũng như tránh được hệ miễn dịch của cơ thể vật chủ.
+ Màng sinh chất:
Hầu hết các chủng P. aeruginosa có khả năng tổng hợp một loại protein

trên bề mặt màng sinh chất (pr F). Protein F vận chuyển có chọn lọc các chất
qua lại màng trong giới hạn khoảng 500Da. Vì vậy, nó làm giảm tính thấm
của màng, ngăn không cho các chất có hại đi vào bên trong tế bào giúp cho P.
aeruginosa có khả năng đề kháng cao với nhiều loại kháng sinh (Mutharia L.
M. và cs, 1982) [33].
+ Tiên mao:
Pseudomonas aeruginosa có một tiên mao duy nhất ở một cực, tiên
mao giúp cho vi khuẩn di động. Về cấu tạo hoá học, tiên mao được cấu tạo
bởi các protein gọi là Flagellin. Các Flagellin mang tính chất kháng nguyên
gọi là kháng nguyên lông H.
+ Tiêm mao:


7
Là những sợi lông rất mảnh, dài khoảng 6nm, mọc quanh bề mặt tế
bào. Có vai trò giúp cho vi khuẩn bám vào môi trường lỏng hay bề mặt biểu
mô của tế bào vật chủ trong quá trình lây nhiễm.
+ Nhân:
Vật chất di truyền của P. aeruginosa là một phân tử DNA trần, dạng
vòng tồn tại trong nguyên sinh chất. Kích thước DNA từ 5,2 - 7 triệu cặp base
chứa khoảng 65% là (Guanine + Cytosine). Ngoài ra, P. aeruginosa cũng có
chứa vật chất di truyền ngoài nhân đó là các plasmid. Các plasmid chứa các
đoạn gene như TEM, OXA, PSE mã hóa sinh ra enzyme β-lactamase làm phá
huỷ vòng β-lactam của chất kháng sinh dẫn tới P. aeruginosa kháng lại với
hầu hết các kháng sinh thuộc nhóm này. Do vậy mà rất khó khăn trong việc
lựa chọn thuốc điều trị nhiễm khuẩn do P. aeruginosa gây ra.
- Tính chất nuôi cấy
Trực trùng mủ xanh (P. aeruginosa) mọc dễ dàng trên các môi trường
nuôi cấy thông thường, hiếu khí như thạch dinh dưỡng, thạch máu, canh thang
nhưng thích hợp nhất là môi trường SS (shigella salmonella). Nhiệt độ thích

hợp 37oC nhưng phát triển được ở nhiệt đố 5 - 42oC, pH thích hợp 7,2 - 7,5
nhưng phát triển được ở pH 4,5 - 9,0 (Đái Duy Ban và cs, 2009) [1].
Trên môi trường đặc: Có thể gặp 2 loại khuẩn lạc: một loại to, nhẵn,
dẹt, trung tâm hơi lồi (khuẩn lạc S). Một loại xù xì bờ không đều (khuẩn lạc
R), đôi khi có loại khuẩn lạc nhầy. Trên môi trường thạch máu đa số gây tan
máu. Trong các nuôi cấy từ bệnh phẩm thường gặp loại khuẩn lạc thứ nhất.
Trong các nuôi cấy từ môi trường thường gặp loại khuẩn lạc thứ hai.
Trong môi trường lỏng vi khuẩn mọc thành váng ở trên.


8
2.2. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc
2.2.1. Tình hình kháng thuốc của Pseudomonas aeruginosa trên thế giới
Lateef A. (2005), khảo sát tính kháng thuốc của vi khuẩn trên các mẫu
bệnh phẩm, thực phẩm, nước uống cho thấy: P. aeruginosa được tìm thấy
trong các mẫu bệnh phẩm, dược phẩm, đất bị nhiễm dầu, nước (nước sông,
nước giếng và nước máy). Kết quả: 3,46% P. aeruginosa phân lập từ đất đề
kháng với 5 loại kháng sinh. Trong bệnh phẩm, 7,69% đề kháng 6 loại kháng
sinh, 30,77% đề kháng 7 loại kháng sinh, 23,1% đề kháng với 8 loại kháng
sinh (ampicillin, chloramphenicol, cloxacillin, erythromycin, penicillin,
tetracycline, streptomycin, gentamicin). Trong dược phẩm, loại vi khuẩn này
cũng có hiện tượng đề kháng đa kháng sinh từ 2, 4 đến 8 loại kháng sinh khác
nhau (augmentin, amoxycillin, tetracycline, cotrimoxazole, nalidixic acid,
ofloxacin, nitrofurantoin). Trong nước, 6,7% P. aeruginosa kháng lại 4 loại
kháng sinh, 8,5% kháng với 5 loại kháng sinh (augmentin, amoxycillin,
tetracycline, cloxacillin, cotrimoxazole) (Lateef A. và cs, 2005) [28].
Ngoài ra, một số nghiên cứu khác trên bệnh phẩm cũng cho thấy khả năng
đề kháng kháng sinh của P. aeruginosa khá cao. Gales A. C. (1997-1999),
6631 chủng P. aeruginosa được phân lập chủ yếu trên bệnh nhân viêm đường
hô hấp tại 3 vùng khác nhau (Châu Âu, Cannada, Châu Mỹ Latin). Trong đó

218 mẫu P. aeruginosa đa kháng thuốc – đề kháng với nhiều loại kháng sinh
thông dụng (piperacillin, ceftazidime, imipenem, and gentamicin), với tỉ lệ
8,2% ở Châu Mỹ Latin, 0,9% ở Cannada (Gales A. C. và cs, 2001) [23].
Oguntibeju O. O. và Nwobu R. A. U. (2004), nghiên cứu P. aeruginosa
trên những bệnh nhân bị nhiễm trùng vết thương thấy rằng: tỉ lệ P. aeruginosa
xâm nhiễm vào phụ nữ cao hơn đàn ông (tỉ lệ 3 : 2) và tìm thấy nhiều hơn trên
các bệnh nhân là trẻ em và người già. Khảo sát tính nhạy cảm kháng sinh của
20 chủng P. aeruginosa phân lập được cho thấy tính nhạy cảm của vi khuẩn


9
này với một số kháng sinh, tỉ lệ là colistin (100%), gentamicin (75%),
streptomycin (30%), và tetracycline (10%) (Oguntibeju O. O. và cs, 2004)
[34]. Theo nhiều tác giả, fosfomycin là một kháng sinh rất hữu hiệu trong
điều trị các nhiễm trùng do P. aeruginosa gây ra. Đặc biệt, fosfomycin có
hiệu quả khi kết hợp với các kháng sinh như oxfloxacin (Mirakhur A. và cs,
2003) [31].
Theo Hirulkar N. B. và Soni B. (2011), nghiên cứu phân lập P. aeruginosa
trong nước uống. Trong số 22 mẫu được phát hiện nhiễm P. aeruginosa khi
được phân lập cho thấy kháng 55% là Ciprofloxacin, tiếp theo là Gentamicin
(51%), Nitrofurantoin (51%), Erythromycin (50%), Cotrimoxazole (50%),
Ofloxacin (50%), tetracycline (46%), tfloxacin (46%), Cefalexin (46%),
Metronidazole (46%), Ampicillin (41%), Penicillin (41%) và Amoxycillin
(41%) (Hirulkar N. B. và cs, 2011) [25].
Theo nghiên cứu của Joseph N. M. và cộng sự (2013), từ 112 mẫu P.
aeruginosa phân lập được từ bệnh nhân điều trị năm 2012. Kết quả tỷ lệ kháng
Gentamicine (59,6%), Piperacillin (36,8%) và Ciprofloxaxin (33,3%) (Joseph N.
M. và cs, 2013) [26].
2.2.2. Tình hình kháng thuốc của Pseudomonas aeruginosa trong nước
Các nghiên cứu trong nước về tình hình nhiễm P. aeruginosa trong nước

uống chưa được nghiên cứu. Hầu hết khả năng gậy bệnh và tính đề kháng
kháng sinh của loại vi khuẩn này chủ yếu được phân lập trên bệnh phẩm. Quá
trình theo dõi mức độ đề kháng trong năm 1997 của Võ Thị Chi Mai và cộng
sự trên các tác nhân trong nhiễm khuẩn máu, nhiễm khuẩn đường hô hấp và
nhiễm khuẩn đường tiết niệu thì P. aeruginosa là nguyên nhân chính. Hơn thế
nữa, hầu hết 374 dòng trực trùng mủ xanh phân lập từ máu (16), nước tiểu
(47) và đờm (311) kháng nhiều loại kháng sinh. Ðối với cephalosporins thế hệ
3, đến 62,5% kháng cefotaxime và 38,9% kháng ceftazidime. Các vi khuẩn


10
này kháng amikacin 10,8% và tobramycin 59%. Trên fluoroquinolones, tỉ lệ
kháng ofloxacin là 58,3%, kháng norfloxacin 55,2% và kháng ciprofloxacin
43,8% (Võ Thị Chi Mai và cs, 1997) [11].
Nghiên cứu về tình trạng nhiễm khuẩn bệnh viện tại Bệnh viện Đa khoa
(BVĐK) tỉnh Quảng Ngãi và Bệnh viện Đa khoa khu vực Bồng Sơn từ năm
2003-2004 cho thấy P. aeruginosa đứng hàng thứ 3 với tỷ lệ 18,8%, gặp chủ
yếu ở bệnh phẩm mủ, chỉ nhạy với amikacin, axepim, ceftazidin, ceftriaxon.
Kết quả kiểm tra mẫu nước y tế tại 2 bệnh viện cho thấy: năm 2003 mẫu nước
tại BVĐK khu vực Bồng Sơn không có vi khuẩn gây bệnh, năm 2004 các
mẫu nước ngâm dây máy hút, rửa tay, nước tắm bé lấy từ sô đựng nước của
cả 2 bệnh viện (nước cất dùng làm ẩm bình ôxy, ngâm dây thở, hút đàm) đều
bị nhiễm P. aeruginosa và Pseudomonas sp. Hai loại vi khuẩn gây bệnh trong
mẫu nước chủ yếu là P. aeruginosa (71,4%) và trực khuẩn đường ruột gram
âm (28,6%) (Hồ Việt Mỹ và cs, 2004) [12].
Trong một nghiên cứu của Lê Bảo Huy và cộng sự (2005), tác nhân gây
bệnh viêm phổi bệnh viện chủ yếu là vi khuẩn Gram âm chiếm 86,15% trong
đó P. aeruginosa chiếm 41,15%. Vi khuẩn này đã đề kháng cao đối với những
kháng sinh chuyên trị và hay dùng ở Việt Nam (nhất là các khoa ICU: khoa
điều trị tích cực): imipenem (66,7%), ticarcillin/a.clavulanic (45%), ceftazidime

(74,1%), cefepime (77,8%), ciprofloxacin (96,3%) (Lê Bảo Huy và cs, 2005) [9].
Theo nghiên cứu của Hoàng Doãn Cảnh và cộng sự (2014), trong tổng số 28
chủng P. aeruginosa phân lập được từ các mẫu bệnh phẩm ở Viện Pasteur, TP Hồ
Chí Minh. P. aeruginosa có mức độ kháng với các kháng sinh: CS(10,7%), FOS
(24%), ATM(36%), AN (42,9%), CIP(48,2%), FEP (45,8%), IPM (46,2%), GM
(55,6%), CFP(54,2%), TCC (54,2%), TM(54,2%), PIP(60,7%), CFS (62,5%),
SSS(64%). Tỉ lệ này thể hiện sự đa kháng thuốc của P. aeruginosa và mức độ


11
kháng kháng sinh của P. aeruginosa là khá cao (trên 40%) (Hoàng Doãn Cảnh và
cs, 2014) [2].
2.3. Cơ chế kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn
2.3.1. Cơ chế enzyme khử hoạt tính của thuốc kháng sinh
Vi khuẩn sản xuất enzyme có thể thay đổi hoặc làm giảm tác dụng của
kháng sinh, bằng cách này chúng phá hủy hoạt tính của kháng sinh. Cơ chế
này được biết đến nhiều nhất và sớm nhất với penicillinase phá hủy vòng βlactam, biến penicillin thành penicilloic acid, làm mất tác dụng của thuốc
(Guardabassi L. và cs, 2006) [24]. Sau đó hàng loạt các enzyme β -lactamase
có khả năng ức chế hoặc phân hủy các kháng sinh mạnh như cephalosporin và
carbapenem được phát hiện.
Hiện nay đã xác định được hơn 890 loại enzyme kháng kháng sinh của vi
khuẩn, nhiều hơn số lượng các loại kháng sinh đã được sản xuất và phần lớn
các gene mã hóa các enzyme này nằm trên các plasmid có thể truyền dễ dàng
trong quần thể vi khuẩn cùng và khác loài (Anton Y. P. và cs, 2010) [17];
(Bush K. và cs, 2010) [19]. β –lactamase phổ rộng, gọi là carbapenemases có
khả năng làm giảm tác dụng của kháng sinh carbapenem và có thể chịu trách
nhiệm kháng với imipenem và meropenem, loại enzyme này có trong P.
aeruginosa và trực khuẩn gram âm khác (Mulvey M. R. và cs, 2009) [32].
2.3.2. Cơ chế thay đổi đích của thuốc kháng sinh
Mỗi chất kháng sinh có đích tác động, điểm gắn kết khác nhau ở vi

khuẩn. Các đích cho kháng sinh có thể bị thay đổi hoặc được bảo vệ bởi sự
gắn kết của một protein, do đó thuốc không thể gắn vào và tác động đến vi
khuẩn. Cơ chế đề kháng này xảy ra với hầu hết kháng sinh. Kháng sinh nhóm
β-lactam tác động bằng cách gắn vào cấu trúc trên thành tế bào vi khuẩn gọi
là penicillin binding protein (PBP) (Mulvey M. R. và cs, 2009) [32].


12
2.3.3. Cơ chế ngăn sự xâm nhập của kháng sinh vào trong tế bào
Làm giảm mức độ thấm của kháng sinh qua thành tế bào vi khuẩn trong
trường hợp kháng tetracycline hoặc làm mất hệ thống vận chuyển qua màng
trong trường hợp kháng kháng sinh nhóm aminoglycosid. Việc thâm nhập của
các kháng sinh nhóm beta-lactam được thực hiện qua các kênh vận chuyển
(porin), vi khuẩn biến đổi làm mất các kênh vận chuyển và làm hạn chế sự tác
động của nhóm kháng sinh này (Anton Y. P. và cs, 2010) [17].
Vách tế bào của vi khuẩn Gram âm bao gồm màng bên trong và bên
ngoài, hoạt động như một rào cản chống thấm. Để vận chuyển các chất cần
thiết thông qua màng ngoài, các tế bào vi khuẩn sản xuất ra protein ngoài
màng (porins). Protein ngoài màng này cho phép khuếch tán các phân tử (bao
gồm cả thuốc kháng sinh vào trong tế bào. Các đột biến làm thay đổi cấu trúc
của protein ngoài màng tạo ra một rào cản làm cho các kháng sinh không thể
khuếch tán vào trong tế bào. Cơ chế này có ở P. aeruginosa và các trực khuẩn
Gram âm khác có thể kháng thuốc kháng sinh thuộc nhóm β-lactam
(Livermore D. M. và cs, 2001) [29].
Cơ chế bơm thuốc ra (efflux pumps): hệ thống bơm thoát dòng có tác
dụng chuyển kháng sinh ra ngoài, làm giảm nồng độ thuốc trong tế bào của vi
khuẩn. Trước đây, cơ chế này được biết đến như là một trong những cơ chế
chính của vi khuẩn đề kháng với kháng sinh nhóm tetracycline (tetracycline,
minocycline, doxycyc-line) mã hóa bởi gene Tet (Tet-pump). Hiện nay, cơ
chế này được đề cập đến như là một cơ chế đề kháng nhiều nhóm kháng sinh

(đa đề kháng) với các bơm được mã hóa bởi các gene MefA/E (đề kháng
nhóm macrolides), AmrAB-OprA, MexXY-OprM và AcrD (đề kháng nhóm
aminoglycosides), MexAB-OprM (đề

kháng

nhóm

β-lactam), AcrAB-

TolC và Mex (đề kháng nhóm flouroquinolones) (McGowan JE Jr., 1983)
[30].


13
2.3.4. Cơ chế kháng thuốc kháng sinh của Pseudomonas aeruginosa
2.3.4.1. Cơ chế enzyme khử hoạt tính của kháng sinh
Theo Daniel J. W. và cộng sự (2013) enzyme khử hoạt tính của kháng
sinh nhóm β-lactam được chia ra thành các nhóm (Daniel J. W. và cs, 2013)
[21]:
Nhóm AmpC cephalosporinase: Các AmpC của P. aeruginosa là một
enzyme cảm ứng tự nhiên. Sự gia tăng AmpC của P. aeruginosa có thể gây ra
sự đề kháng với hầu như tất cả các kháng sinh nhóm β-lactam.
Nhóm AmpC cephalosporinase phổ rộng: các enzyme này có thể biểu
hiện tăng hoạt động thủy phân để chống lại các cephalosporin và imipenem.
Nhóm β-lactamase: bao gồm các emzyme plasmid mã hóa TEM-1, TEM2, và SHV-1. Nhóm β-lactamases dễ dàng thủy phân penicillin và cephalosporin.
Nhóm β-lactamase phổ rộng (ESBL): là biến thể của nhóm β-lactamase.
Có thể thủy phân penicillin, cephalosporin, oxyimino-cephalosporin
(ceftazidime và cefotaxime) và các monobactam aztreonam.
Nhóm Penicillinases: được xác định trong P. aeruginosa bao gồm PSE-1,

PSE-3, PSE-4, PSE-5, CARB-3, và CARB-4. Các enzyme này bị ức chế bởi
clavulanate. Tuy nhiên, chúng thủy phân hiệu quả ticarcillin và chúng cung
cấp cho P. aeruginosa khả năng kháng với ticarcillin-clavulanate
Nhóm OXA-type Penicillinases: bị ức chế bởi clavulanate và tazobactam.
Có tác dụng thủy phân hiệu quả với loxacillin và oxacillin.
Nhóm OXA-type β-lactamase phổ rộng: có khả năng thủy phân
oxyimino-cephalosporin và aztreonam và tăng khả năng kháng thuốc cho P.
aeruginosa.
Nhóm OXA-type Carbapenemases: các OXA-type carbapenemases có ái
lực cao với carbapenems, chúng thủy phân không hiệu quả các chất và khó để
đánh giá ý nghĩa lâm sàng của chúng.


14
Nhóm Carbapenemases: Có khả năng thủy phân các penicillin, cephalosporin
và aztreonam nhưng chúng bị ức chế bởi tazobactam và clavulanic acid.
Nhóm Metallo β-lactamase: cung cấp sức đề kháng đối với penicillin, ức
chế sự kết hợp giữa penicillin và carbapenems.
2.3.4.2. Cơ chế ngăn sự xâm nhập của kháng sinh vào trong tế bào
Các OprD porin của P. aeruginosa là một porin chất nền cụ thể tạo điều
kiện cho sự khuếch tán các amino acid cơ bản các peptide nhỏ và
carbapenems vào trong tế bào. Khi các OprD giảm xuống hoặc bị mất đi tính
nhạy cảm của P. aeruginosa đối với carbapenems cũng giảm (Daniel J. W. và
cs, 2013) [21].
β-lactam tự do khuếch tán vào tế bào P. aeruginosa. Tuy nhiên enzyme βlactamase gặp phải trở ngại lớn trong quá trình xâm nhập vào trong tế bào P.
aeruginosa do sự bơm đẩy ra khỏi tế bào. Có 3 cơ chế bơm đẩy β-lactam cụ
thể là: MexAB-OprM, MexCD-OprJ và MexXY (Daniel J. W. và cs, 2013)
[21].
2.4. Các phƣơng pháp phát hiện Pseudomonas aeruginosa kháng thuốc
2.4.1. Kỹ thuật khoanh giấy kháng sinh khuếch tán trên đĩa thạch

- Nguyên lý: Kháng sinh trong khoang giấy sẽ được khuếch tán vào
môi trường thạch Mueller Hinton (MH) đã cấy các chủng P. aeruginosa
thử nghiệm. Mức độ nhạy cảm của P. aeruginosa với kháng sinh được biểu
hiện bằng đường kính các vòng vô khuẩn xung quanh khoanh giấy kháng
sinh (CLSI, 2010) [20].
- Ưu điểm: Đây là kỹ thuật đơn giản, giá thành rẻ, được sử dụng phổ
biến để điều trị và giám sát dịch tễ học.
- Hạn chế: kỹ thuật này chỉ phát hiện được mức độ nhạy cảm nồng độ
kháng sinh cho biết trước.


15
2.4.2. Kỹ thuật xác định nồng độ tối thiểu của kháng sinh (MIC)
- Nguyên lý: Các chủng vi khuẩn thử nghiệm được nuôi cấy trên các đĩa
thạch Mueller Hinton (MH) hoặc canh thang có chứa nồng độ kháng sinh
khác nhau. Nồng độ kháng sinh tối thiểu có tác dụng ức chế vi khuẩn được
xác định khi mật độ khuẩn lạc ≤ 3.
- Ưu điểm: Đây là kỹ thuật chuẩn thức được áp dụng nhằm xác định
nồng độ kháng sinh nhỏ nhất ức chế sự phát triển của vi khuẩn, kết quả giúp
các bác sỹ lựa chọn và tính toán liều kháng sinh cho bệnh nhân (CLSI, 2010)
[20].
- Hạn chế: Kỹ thuật này có giá thành cao, phức tạp, đầy đủ trang thiết bị
và cán bộ có kinh nghiệm để thực hiện.
2.4.3. Kỹ thuật PCR
- Nguyên lý: Kỹ thuật này dựa trên nguyên lý tổng hợp DNA trong tế
bào được nhân lên theo cơ chế bán bảo tồn. Quá trình tổng hợp DNA được
bắt đầu theo chu trình: hai sợi DNA làm khuôn mẫu bị tách ra dưới tác dụng
của nhiệt độ. Hai đoạn mồi oligonucleotide từ 20 - 40 nucleotide sẽ gắn vào
các vị trí bổ sung trên đoạn DNA mẫu. Trong điều kiện của PCR, hai mồi sẽ
được kéo dài về hai phía, tạo ra đoạn DNA mới bổ sung với đoạn khuôn mẫu.

- Ưu điểm: Với một cặp mồi đặc hiệu một đoạn DNA nào đó sẽ được
tổng hợp sau mỗi chu kỳ nhiệt của PCR. Hàng triệu bản sao sẽ được tổng hợp
trong thời gian ngắn và chúng ta có thể phát hiện được các đoạn gene đặc hiệu
cần khuếch đại trên thạch điện di. Kỹ thuật PCR hiện đang được sử dụng rộng
rãi trong nhiều lĩnh vực như Y học, sinh học và nông nghiệp với nhiều mục
đích khác nhau như phát hiện các căn nguyên gây bệnh do vi khuẩn hay phát
hiện các gene kháng kháng sinh (Kumarasamy K. K. và cs, 2010) [27].
- Hạn chế: Cần phải có DNA mồi đặc trưng cho DNA cần khuếch đại.
Để có đoạn mồi này ít nhất phải biết trước trình tự nucleotide cần khuếch đại.


16
Kích thước DNA cần khuếch đại không vượt quá 3kb. Khả năng ngoại nhiễm
lớn (do thao tác nhiều lần).


17
Phần 3
ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu
3.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Các chủng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa kháng thuốc phân lập từ
bệnh nhân điều trị tại bệnh viện Đa khoa Trung Ương Thái Nguyên từ tháng
12 năm 2014 đến tháng 5 năm 2015.
3.1.2. Phạm vi nghiên cứu
Các chủng Pseudomonas aeruginosa kháng thuốc thu thập được từ người
bệnh điều trị tại bệnh viện Đa khoa Trung Ương Thái Nguyên từ từ tháng 12
năm 2014 đến tháng 5 năm 2015.
3.2. Địa điểm và thời gian tiến hành
3.2.1. Địa điểm nghiên cứu

- Khoa vi sinh vật, Bệnh viện đa khoa Trung Ương Thái Nguyên
- Phòng thí nghiệm Khoa Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm Trường Đại học Nông Lâm - Đại học Thái Nguyên.
3.2.2. Thời gian nghiên cứu
Từ 12/2014 – 05/2015
3.3. Vật liệu nghiên cứu
3.3.1. Các cặp mồi sử dụng trong đề tài
Đề tài nghiên cứu này sử dụng 3 cặp mồi bao gồm: cặp mồi OPRLFOPRLR sử dụng để định danh vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa, cặp mồi
blaIMPF-blaIMPR đặc hiệu cho gene kháng metallo β-lactamase họ IMP và
cặp mồi blaVIMF-blaVIMR đặc hiệu cho gene kháng metallo β-lactamase họ
VIM. Tất cả các cặp mồi trên được sử dụng dựa theo công bố của Aghamiri


18
năm 2014 (Aghamiri S. và cs, 2014) [16]. Trình tự mồi được đặt sản xuất tại
công ty Intergrated DNA Technologies của Mỹ (www.IDTDNA.com).
Trình tự các cặp mồi sử dụng trong đề tài nghiên cứu này được trình bày
trong bảng 3.1.
Bảng 3.1: Các cặp mồi sử dụng trong đề tài nghiên cứu
Tên mồi

o

Trình tự nucleotide (5’→3’)

Tm ( C)

OPRLF ATGGAAATGCTGAAATTCGG
OPRLR CTTCTTCAGCTCGACGCGAC
blaIMPF GTTTGAAGAAGTTAACGGGTGG
blaIMPR ATAATTTGGCGGACTTTGGC

blaVIMF TGGTGTTTGGTCGCATATCG
blaVIMR GAGCAAGTCTAGACCGCCCG
3.3.2. Hóa chất sử dụng trong đề tài

60
66
63
62
64
68

Kích thƣớc
sản phẩm
PCR (bp)
483
459
595

Bảng 3.2: Các hóa chất sử dụng trong đề tài nghiên cứu
STT
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

11
12
13

Tên hóa chất
CTAB
Chloroform
Isoamyl ahcohol
Isopropanol
CH3COONa 3M (pH= 5,5)
Ethanol
Dung dịch đệm TE (pH= 8)
Agarose
Ethidium bromide
PCR buffer
dNTPs (dATP, dGTP, dCTP, dTTP)
Taq DNA polymerase
Primer

Hãng sản xuất
Sigma, Đức
Sigma, Đức
Sigma, Đức
Sigma, Đức
Sigma, Đức
Sigma, Đức
Sigma, Đức
Sigma, Đức
Sigma, Đức
Fermentas, Đức

Fermentas, Đức
Fermentas, Đức
Fermentas, Đức