Bài Tập Nhóm Các Phương Pháp Xác Định Lượng Dư Thuốc Kháng Sinh Trong Tôm

CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH LƯỢNG DƯ
THUỐC KHÁNG SINH TRONG TÔM
DH11HH
SINH VIÊN THỰC HIỆN:
Huỳnh Thị Kim Chi
Lê Thị Nguyên Nhung
Phạm Thị Minh Thư
Lý Thị Huyền Trang
Trần Xuân Quyền

11139001
11139011
11139017
11139143
11139166


Nội dung báo cáo tiểu luận

I. ĐẶT VẤN ĐỀ
II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
1.Đối tượng nghiên cứu
2.Các phương pháp phân tích
3.Giới thiệu về Chloramphenicol

III. HÀM LƯỢNG CHLORAMPHENICOL TRONG TÔM. PHƯƠNG
PHÁP PHÂN TÍCH BẰNG KÍT ELISA VÀ PHÂN TÍCH SẮC KÝ LCMS/MS.
4.Nguyên tắc
5.Dụng cụ và thiết bị
6.Hoá chất
7.Dụng cụ chuẩn

8.Chuẩn bị mẫu thử


I. ĐẶT VẤN ĐỀ.
Dư lượng kháng sinh trong thực phẩm hiện là
vấn đề quan ngại của hầu hết các cơ quan kiểm
soát thực phẩm trên thế giới. Một số loại kháng
sinh bản thân nó (chloramphenicol, malachite
green ...) có thể gây ra tác động có hại cho sức
khoẻ người tiêu dùng, một số loại khác như các
kháng sinh nhóm nitrofurans qua quá trình
trao đổi chất trong cơ thể động vật có thể sinh
ra những hợp chất có độc tính cao đối với cơ
thể sống.


Chính vì vậy những kháng sinh này đã bị cấm sử dụng hoàn
toàn trong nuôi trồng và bảo quản thực phẩm.Vì vậy các
phương pháp phân tích kháng sinh có trong thực phẩm càng
được chú trọng nghiên cứu và hoàn thiện.


II. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Phân tích Chloramphenicol có trong tôm.


1. Các phương pháp phân tích chloramphenicol hiện nay

 Phân tích bằng sắc kí lỏng hiệu
năng cao.

+ Pha tĩnh được sử dụng là pha tĩnh
không phân cực C8 hoặc C18
+ Dung môi động có tính phân cực cao
như:Hỗn hợp H2O/Acetonitril
(75/25,v/v) hay hỗn hợp axit axetic 1%
trong methanol/H2O (55/45,v/v). Tốc
độ pha động 1ml/phút
+ Detectơ thường được sử dụng là UVVIS ở buớc sóng 278nm hay detectơ MS


Ngoài ra còn sử dụng thêm:
+ cột chiết pha rắn với ống cacbon đa vách
làm chất hấp phụ trước khi mẫu được chạy
qua cột sắc ký lỏng kết hợp detectơ khối phổ
+ dụng hệ sắc ký lỏng hiệu năng cao để tách
chloramphenicol và nhóm các dẫn xuất của nó
sử dụng detectơ điện hóa thay vì detectơ UV
thông thường


Ngoài ra còn sử dụng:
+cột chiết pha rắn với ống
cacbon đa vách làm chất hấp
phụ trước khi mẫu được chạy
qua cột sắc ký lỏng kết hợp
detectơ khối phổ
+ hệ sắc ký lỏng hiệu năng
cao để tách chloramphenicol
và nhóm các dẫn xuất của nó
sử dụng detectơ điện hóa

thay vì detectơ UV thông
thường

Hệ thống sắc kí lỏng hiệu
năng cao


 Phân tích bằng sắc ký
khí
+ Pha tĩnh polysiloxan có
độ phân cực từ thấp đến
trung bình với tỷ lệ phenyl
từ 5-50% (metyl 95-50%)
+ Pha động là khí N2, Tốc
độ pha động: 1mL/phút
+ Detectơ thường được sử
dụng là ECD hay MS

Máy sắc kí khí


Khi phân tích bằng sắc ký khí, để tăng độ
nhạy cho phép phân tích, chloramphenicol
thường được dẫn xuất hóa thành
trimetylsilyl-cloramphenicol (TMS-CAP).
GC/MS, với kỹ thuật NICI, các mũi m/z đặc
trưng cho TMS-CAP là 466, 468, 470,376,
378. GC/MS/MS, với kỹ thuật NICI cho các
mũi đặc trưng 304, 322, 358, 394, 430

 Phân tích bằng phương pháp quang

Nguyên tắc chung của phương pháp quang này là
khử nhóm nitro của chloramphenicol thành nhóm
amino để tạo thành hợp chất có màu. Các nhóm
nghiên cứu khác nhau có thể sử dụng các chất
khác nhau để làm tác nhân khử
Ta có thể khử nhóm nitro ở gốc hydrocacbon thơm
bằng hỗn hợp Zn và Ca/HCl, cho sản phẩm tác
dụng với trisodium pentacyanoaminoferrat đế tạo
thành sản phẩm có màu đỏ tía có độ hấp thụ cực
đại giữa 480 – 540 nm


Ngoài ra, ta có thể dùng phương
pháp khử cloramphenicol bằng
TiCl3, trong dung dịch axit axetic
băng ở nhiệt độ phòng trong vòng
10 phút. Sản phẩm khử được gia
nhiệt với pdimetylaminobenzaldehit trong
20 phút, sản phẩm tạo thành có
màu vàng tươi, hấp thụ mạnh
ánh sáng ở vùng khả kiến và tuân
theo định luật Beer ở 440nm
Máy quang phổ UV-VIS


 Phương pháp
ELISA

Kít thử Elisa: Kit thử của các
hãng R-Biopharm và TAPB.
Qui trình chuẩn bị mẫu: Dư
lượng CAP trong 3g mẫu đuợc
ly trích bằng 6ml ethyl acetate.
Dịch chiết đuợc cô đến khô ở
50oC dưới dòng nitơ. Cặn khô
được hoà tan trong 1ml đệm
và làm sạch bằng 1ml hexan.
Hàm luợng CAP trong dịch
chiết đuợc phân tích với kit
thử ELISA


Qui trình thử nghiệm với ELISA: qui
trình xác định hàm lượng CAP trong dịch
chiết trên Elisa tuân thủ theo đúng hướng
dẫn của nhà sản xuất. Mỗi loạt thử
nghiệm đều có kèm theo mẫu chứng âm
và chứng dương để kiểm soát chất lượng
kết quả thử nghiệm.
Giới hạn phát hiện: 0,1ppb


2. Giới thiệu về Chloramphenicol
Chloramphenicol (CAP) là một kháng
sinh kìm khuẩn đã được phân lập từ
Streptomyces venezuelae vào năm 1947 và
được tổng hợp vào năm 1949. Nó được coi

là một nguyên mẫu kháng sinh phổ rộng ,
cùng với tetracycline , và vì nó là cả hai giá
rẻ và dễ dàng để sản xuất một loại kháng
sinh thường xuyên của sự lựa chọn ở các
nước đang phát triển.


Chloramphenicol hiện nay có 18 dạngchuyểnhóa.
Côngthứccấu tạo:2,2-diclo-N-)-2-hydroxyl-1(hydroxylmethyl)-2-(4-nitrophenyl)ethyl]acetamide


Tính chất hóa lí:
+Tinh thể hình kim hoặc tấm kéo dài.
+ Mắt thường ở dạng bột mịn màu trắng xám,
trắng hoặc vàng trắng.
+Nhiệt độ nóng chảy vào khoảng 150,5oC đến
151.5oC. Thăng hoa trong chân không cao và nhạy
cảm với ánh sáng. Các nhóm nitro là dễ dàng khử
thành các nhóm amino.
+Trong 4 chất đồng phân lập thể, chỉ có dạng αR,
βR (hay còn gọi là dạng D) là có hoạt tính
(IARC 1990).




- Tác dụng:chữa thương
hàn, viêm não,viêm mắt…

- Sự hấp thu và

bài tiết:CAP được
hấp thu qua hệ
tiêu hóa và khi
tiêm chích được
phân phối đi các
mô.CAP được bài
tiết chủ yếu qua
thận ở dạng este
của acid
glucurosamid và
arylamin


Độc tính:
+Gây các bệnh thiếu máu bất sản,ức chế tủy
xương,bệnh bạch cầu ở trẻ em,hội chứng
xám bé.
+Tương tác với AND và ARN gây sai lệch di
truyền,ngoài ra còn gây bệnh ung
thư…
+ Giới hạn Chloramphenicol có trong tôm:
EU và Mỹ:0.3ppb
Nhật Bản:0.5ppb


III. PHÂN TÍCH CHLORAMPHENICOL CÓ TRONG
TÔM.
1. Dư lượng Chloramphenicol trong tôm bằng kít Elisa
và sắc ký khối phổ LC-MS/MS

Giới thiệu:Các phương pháp sắc ký ghép khối phổ
như GC-MS,GC-MS/MS,LC-MS,LC-MS/MS đều được
chấp nhận dùng để xác định hàm lượng các chất
kháng sinh trong thực phẩm tuy nhiên chi phí về
thiết bị,chi phí vận hành,kỹ năng và trình độ của kĩ
thuật viên vì vậy phương pháp Elisa đã được đưa
vào sử dụng để sang lọc ra các mẫu dương tính
với Chloramphenicol trước khi phân tích bằng các
phương pháp sắc ký trên


Nguyên tắc của phương pháp ELISA
ELISA ( Enzyme-Linked ImmunoSorbent
Assay_ Xét nghiệm hấp thu miễn dịch liên
kết với enzyme) dựa trên sự kết hợp giữa
kháng nguyên và kháng thể đặc hiệu, phản
ứng tạo sản phẩm có màu hay phát sáng.
Trong đó tính chất họat hóa của enzyme và
độ đặc hiệu của kháng thể là không đổi.


Nguyên tắc:Sử dụng KT đơn dòng
(Mabs) phủ bề mặt những đĩa giếng.
Nếu có sự hiện diện của KN trong
mẫu,KN sẽ tạo phức hợp với KT cố định
trên giếng và KT tự do có gắn enzyme
tạo thành một phức hợp
kép(sandwich).Khi bổ sung cơ chất đặc
hiệu của enzyme vào giếng,enzyme xúc
tác phản ứng thủy phân cơ chất để tạo

ra các sản phẩm có màu hay phát sáng.


Phương pháp tiến hành

Có 2 phương pháp xét nghiệm ELISA:
 Phương pháp ELISA gián tiếp(indirect
ELISA): dùng để phát hiện kháng thể
chuyên biệt trong huyết thanh
 Phương pháp ELISA trực tiếp( direct
ELISA): dùng để phát hiện kháng nguyên
trong mẫu xét nghiệm.