Khảo sát quá trình lên men acid lactic bởi Lactobacillus drebrueckii

Header Page 1 of 133.

Đồ án tốt nghiệp

GVHD: TS.Nguyễn Thúy Hương

CHƯƠNG 1. MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Hiện nay kỹ thuật cố định tế bào đang được đề cập và quan tâm nhiều đặc biệt
trong các lĩnh vực lên men sản xuất các sản phẩm trao đổi chất. Tế bào cố đọnh có
nhiều ưu điểm hơn tế bào tự do như: Enzyme của tế bào ổn định hơn enzyme ở dạng
tự do khi tế bào được gắn trên chất mang polymer tự nhiên, cố định tế bào vi sinh vật
không đồi hỏi khâu tách chiết và tinh sạch sản phẩm. Tế bào vi sinh vật cố định
không bị lẫn vào sản phẩm và có thể chủ động ngừng phản ứng theo ý muốn. Có thể
được sử dụng nhiều lần theo chu kỳ hoặc liên tục.
Acid lactic là sản phẩm của quá trình lên men lactic bởi vi khuẩn lactic. Có
ứng dụng rất nhiều trong công nghiệp, thực phẩm, y dược. Trong công nghiệp nhẹ,
acid lactic là dung môi cho công nghiệp sản xuất sơn, vecni, nhuộm và thuộc da…,
trong công nghệ thực phẩm ứng dụng để làm chua quả, sản xuất dưa chua, các sản
phẩm lên men từ sữa,sản xuất các loại sữa và bột giàu canxi … Trong y học, người ta
sử dụng vật liệu có tên là purasorb ( là một hợp chất cao phân tử được sản xuất từ
acid lactic) Purasorb được sử dụng như những đinh gim, gắn phần xương lại với
nhau. Ngoài ra các nhà khoa học đang nghiên cứu tạo ra những vật liệu sinh học
dùng trong y học bằng các copolyme của acid lactic, chất dẻo mới thay thế cho chất
dẻo cũ khó phân hủy… Tuy acid lactic được ứng dụng rất nhiều nhưng chưa có
nhiều phương nghiên cứu ứng dụng các phương pháp khác vào quá trình lên men
nhằm làm tăng hiệu suất lên men thu nhận acid lactic.
Trên cơ sở vấn đề đặt ra, việc áp dụng phương pháp cố định tế bào trong sản
xuất lên men acid lactic là một hướng nghiên cứu trong việc tìm kiếm các phương
pháp lên men nhằm làm tăng hiệu suất lên men acid lactic.
1.2. Mục tiêu đề tài

Với mục tiêu đề tài là sử dụng chế phẩm Lactobacillus delbrueckii cố định để
lên men liên tục thu nhận acid lactic. Đề tài được tiến hành với các thí nhiệm sau:
_Khảo sát các quá trình ảnh hưởng đến lên men acid lactic ( lên men theo
mẻ): Độ Brix, pH, thời gian lên men.
_ Xác định tốc độ pha loãng tối ưu của hệ thống lên men liên tục
_Kiểm tra tính ổn định của hệ thống lên men liên tục.
SVTH: Trần Thị Thu Giang

Footer Page 1 of 133.

1


Header Page 2 of 133.

Đồ án tốt nghiệp

GVHD: TS.Nguyễn Thúy Hương

CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu về lên men acid lactic
2.1.1. Đặc điểm của acid lactic
Acid lactic là chất hữu cơ không màu, mùi nhẹ, tan trong nước và cồn. Công
thức hóa học của acid lactic là CH3CHOHCOOH. Khối lượng phân tử của acid lactic
là 98,08. Nhiệt độ sôi là 122oC, điểm tan 17oC
Acid lactic còn có tên gọi khác là 1-hydroxyethanol cacboxylic hay acid 2hydroxypropanoic. Trong cấu tạo phân tử của chúng có một cacbon bất đối xứng nên
chúng có 2 đồng phân quang học: D-acid lactic và L-acid lactic. Hai đồng phân
quang học này có tính chất hoá lý giống nhau, nhưng chỉ khác là khả năng làm quay
mặt phẳng phân cực của ánh sáng. Do đó tính chất sinh học của chúng hoàn toàn
khác nhau.

Loại L-acid lactic ở dạng tinh thể, tan trong nước, cồn etylic, eter, không tan
trong CHCl3. Nhiệt độ nóng chảy là 28oC, góc quay cực ở 15oC là 2,67 o.
Loại D-acid lactic ở dạng tinh thể, tan trong nước, cồn. Nhiệt độ nóng chảy là
28 oC, nhiệt độ sôi 103 oC, góc quay cực ở 15 oC là -2,26 o.
Nếu D-acid lactic và L-acid lactic có trong một hỗn hợp theo tỷ lệ 50/50
người ta gọi là hỗn hợp Raxemic. Hỗn hợp này được ký hiệu là D1 acid lactic. Trong
quá trình lên men không khi nào có một hỗn hợp có tỷ lệ lý tưởng này mà chỉ có
được hỗn hợp này khi tiến hành tổng hợp hữu cơ. DL-acid lactic là dịch lỏng dạng
siro, có khả năng tan trong nước, trong cồn, không tan trong CHCl3. Nhiệt độ nóng
chảy của chúng là 16,7 oC, nhiệt độ sôi là 122 oC. [6]
2.1.2. Lên men lactic
Lên men lactic là quá trình chuyển hoá đường thành acid lactic nhờ vi sinh vật,
điển hình là vi khuẩn lactic. Lên men lactic là một trong những loại hình lên men
phát triển nhất trong thiên nhiên.
Lên men lactic là một quá trình trao đổi năng lượng. Các phân tử ATP được
hình thành trong quá trình chuyển hoá cơ chất (lactose) sẽ được vi khuẩn giữ lại
trong tế bào để phục vụ cho quá trình trao đổi và sinh trưởng của vi sinh vật. Ngược
lại các sản phẩm như acid lactic, ethanol, CO2 được vi khuẩn thải vào môi trường lên

SVTH: Trần Thị Thu Giang

Footer Page 2 of 133.

2


Header Page 3 of 133.

Đồ án tốt nghiệp

GVHD: TS.Nguyễn Thúy Hương

men. Kết quả là hàm lượng acid lactic tích lũy trong môi trường lên men ngày càng
tăng, làm giảm pH môi trường và kéo theo những biến đổi lý hoá khác.
Trong quá trình lên men lactic, ngoài sản phẩm là acid lactic, acid acetic,
ethanol, CO2 trong dịch lên men còn xuất hiện cả trăm hợp chất hoá học mới khác.
Chúng là sản phẩm trung gian hoặc sản phẩm phụ của quá trình lên men. Hàm lượng
của chúng trong dịch lên men thường rất thấp ( vài ppm hoặc ít hơn ). Một số hợp
chất trong nhóm trên rất dễ bay hơi. Chúng đóng vai trò quan trọng trong việc góp
phần hình thành nên mùi vị đặc trưng cho những sản phẩm lên men lactic.
Khi nồng độ của acid lactic đạt 2 – 3% sẽ ức chế hoạt động của các vi sinh vật
khác, kể cả E.coli. Chính vì thế nên lên men lactic được ứng dụng để sản xuất nhiều
sản phẩm khác nhau như: sữa chua, bơ, dưa chua…
Phương trình tóm tắt của quá trình lên men lactic:
C6H12O6→2C3H6O3 + 136Kj (32,4 Kcal)
Lên men lactic gồm có lên men đồng hình và lên men dị hình
Lên men đồng hình: Lượng acid lactic tạo thành chiếm hơn 90%, chỉ một
lượng nhỏ pyruvat bị khử carbon chuyển thành acid acetic, ethanol, CO2, và acetoin.
Lượng sản phẩm phụ tạo ra phụ thuộc sự có mặt của oxy.
Các chủng vi sinh vật được sử dụng trong lên men đồng hình như:
Lactobacterium casei, Lactobacterium cremoris, Lactobacterium bulgaricus,
Lactobacterium delbruckii…
Phương trình tổng quát trong quá trình lên men đồng hình:
C6H12O6 + 2ADP + 2Pi → 2CH3CHOHCOOH + 2ATP
Trong một số trường hợp, Lên men đồng hình có thể được chuyển sang dạng
dị hình khi điều kiện lên men thay đổi.
Lên men dị hình: Chỉ có 50% lượng đường tạo thành acid lactic, ngoài ra còn
có các sản phẩm phụ tương tác với nhau tạo thành ester có mùi thơm.
Phương trình tổng quát trong quá trình lên men dị hình:
C6H12O6 → CH3CHOHCOOH + CH3COOH + C2H5OH

Lượng sản phẩm phụ tạo thành hoàn toàn phụ thuộc vào giống vi sinh vật,
môi trường dinh dưỡng và điều kiện ngoại cảnh. Acid lactic thường chiếm 40%

SVTH: Trần Thị Thu Giang

Footer Page 3 of 133.

3


Header Page 4 of 133.

Đồ án tốt nghiệp

GVHD: TS.Nguyễn Thúy Hương

lượng đường đã được phân huỷ, acid suecinic 20%, rượu etylic 10%, acid acetic 10%,
và các loại khí gần 20% .[6]
2.1.3. Vi khuẩn lên men lactic
2.1.3.1. Đặc điểm chung
Vi khuẩn lactic thuộc Lactobacilliaceae. Acid lactic được phát hiện vào năm
1780 nhờ nhà hoá học Sheele người Thụy Điển, ở sữa chua, acid lactic được thừa
nhận là sản phẩm của quá trình lên men vào năm 1847.
Vi khuẩn lactic thuộc vi khuẩn Gram (+), không di động, không có khả năng
tạo bào tử ( tuy nhiên hiện nay người ta đã tìm thấy một số giống thuộc họ vi khuẩn
lactic có khả năng tạo bào tử).
Vi khuẩn lactic thuộc vi khuẩn hiếu khí tuỳ tiện, không chứa cytochrom và
enzyme catalase, có khả năng sinh tổng hợp enzyme peroxydase rất mạnh. Chúng
phân giải H2O2 để tạo ra H2O và O2 để phát triển.
Theo khóa phân loại của Bergay, họ Lactobacilliaceae chia làm 2 họ:

Streptococeae và Lactobacieae
Streptococeae lại chia ra Streptococcus và Leuconostoc.
Lactobacileae chỉ có 1 loài là Lactobacillus
Vi khuẩn lactic có nhiều trong thiên nhiên. Chúng tồn tại nhiều ở cỏ, nhất là
cỏ khô, trong cơ thể người và động vật, trong miệng, ruột. Một số loài trong họ vi
khuẩn lactic như Streptococcus có khả năng gây bệnh. Nhóm vi khuẩn lactic rất đa
dạng gồm nhiều giống rất khác nhau, tế bào của chúng có thể là hình cầu, hình
que...Phân biệt chúng về khả năng lên men đồng hình hay dị hình. Khả năng tổng
hợp nhiều hợp chất cần cho sự sống của những vi khuẩn này rất yếu.[7]
Các loài vi khuẩn lactic khác nhau tạo thành acid lactic trong môi trường và
như vậy sức chịu acid cũng khác nhau. Đa số các trực khuẩn lactic đồng hình tạo
thành acid cao hơn ( khoảng 2-3,5%), liên cầu khuẩn (khoảng 1%). Các trực khuẩn
này có thể phát triển ở pH: 3.8 – 4, cầu khuẩn không thể phát triển ở môi trường này.
Hoạt lực lên men tốt nhất ở vùng pH: 5.5 – 6.0 .
Đa số vi khuẩn lactic, đặc biệt là trực khuẩn đồng hình rất kén chọn thành
phần dinh dưỡng trong môi trường và chỉ phát triển được trong môi trường có tương
đối đầy đủ các acid amin hoặc các hợp chất nitơ phức tạp. Ngoài ta chúng còn nhu
SVTH: Trần Thị Thu Giang

Footer Page 4 of 133.

4


Header Page 5 of 133.

Đồ án tốt nghiệp

GVHD: TS.Nguyễn Thúy Hương

cầu về vitamin (B1, B2, B6, PP), các acid pantotenic và folic. Bởi vậy, môi trường
nuôi vi khuẩn lactic có thành phần khá phức tạp. [1]
Vi khuẩn lactic chịu được ở trạng thái khô hạn, bền vững với CO2 và cồn etylic,
nhiều loài vẫn sống được trong môi trường có 10 – 15% cồn hoặc cao hơn, một số
trực khuẩn bền với NaCl (tới 7 – 10%).
Các vi khuẩn lactic ưa lạnh phát triển ở nhiệt độ tương đối thấp (5 oC hoặc
thấp hơn), các loài ưa ấm có nhiệt độ sinh trưởng tối thích là 25 - 35 oC, các loài ưa
nhiệt có nhiệt độ tối thích là 40 – 45 oC. Khi gia nhiệt tới 60 – 80 oC hầu hết chúng bị
chết sau 10 – 30 phút. Sự phát triển của nó cần có sự có mặt của peptone, acid amin
hay muối amôn. Chúng có yêu cầu đặc biệt về chất dinh dưỡng là giàu vitamin, acid
amin và khoáng chất. Quá trình lên men xảy ra tốt nhất trong môi trường acid pH từ
5.5 – 6, khi pH nhỏ hơn 5.5 quá trình lên men bị dừng lại.
Vi khuẩn lactic có hoạt tính proteaza: phân huỷ protein của sữa thành các
peptid và acid amin. Hoạt tính này ở các loài là khác nhau, thường là trực khuẩn cao
hơn. Vi khuẩn lactic lên men được đa số disacarit.
Chúng có khả năng lên men nhiều loại đường đơn và đường đôi nhưng không
có khả năng lên men các loại glucid phức tạp và tinh bột, chỉ có loài L.delbrueckii là
đồng hoá được tinh bột. Một số vi khuẩn lên men lactic dị hình sử dụng được
pentoza và acid citric.
Một số loài có khả năng tạo thành màng nhầy. Một số khác có khả năng đối
kháng với thể hoại sinh và các vi sinh vật gây bệnh hoặc làm thối rửa thực phẩm.
Như vậy, ngoài khả năng tạo thành acid lactic, các loài này còn có khả năng
sinh ra các hợp chất có hoạt tính kháng sinh ( người ta gọi các hợp chất này là
bacteriocin). Những chất kháng sinh này không dùng trong y học mà chỉ được dùng
trong bảo quản thực phẩm có hiệu quả khả quan. Các vi khuẩn lactic ngoài việc tạo
thành acid còn có 1 số loài tạo được chất thơm ( diacetyl, acetoin, acid bay hơi...)
như Streptococcus diacetylactic.
Vi khuẩn Lactobacillus có thể làm giảm hội chứng nhạy cảm đường ruột. Các
vi khuẩn này có nhiệm vụ biến đổi chất xơ thực phẩm, thức ăn chưa tiêu hoá hết ở
ruột non thành acid lactic, acetic, butyric, hàng loạt vitamin, acid amin, men, hocmon

và các chất dinh dưỡng quan trọng khác, sinh ra các khí như NH3, CO2, H2S...
SVTH: Trần Thị Thu Giang

Footer Page 5 of 133.

5


Header Page 6 of 133.

Đồ án tốt nghiệp

GVHD: TS.Nguyễn Thúy Hương

2.1.3.2. Các chủng vi sinh vật được sử dụng trong lên men lactic
Lactobacillus
Lactobacillus là tên một giống vi khuẩn, giống này có nhiều loài như Lactobacillus
acidophilus, Lactobacillus sporogenes, Lactobacillus kefir...
Trong đường ruột luôn có nhiều loại vi khuẩn ký sinh, trong đó có cả những
loại có ích và có hại cho sức khỏe con người. Sự tồn tại của vi khuẩn lactic tạo thành
sự cân bằng vi khuẩn trong đường ruột. Vi khuẩn Lactobacillus có thể làm giảm hội
chứng nhạy cảm đường ruột.[6]
Các vi khuẩn này có nhiệm vụ biến đổi chất xơ thực phẩm, thức ăn chưa tiêu
hoá hết ở ruột non thành acid lactic, acetic, butyric, hàng loạt vitamin, acid amin,
men, hocmon và các chất dinh dưỡng quan trọng khác. Nó cũng sinh ra các khí như
NH3, CO2, H2S... Quá trình biến đổi đó gọi chung là quá trình lên men, mà nhờ nó,
thức ăn được tiêu hoá hoàn toàn.
Trong môi trường hoạt động của đại tràng, các vi khuẩn có ích có khả năng lấn áp, đè
bẹp và tiêu diệt rất nhiều loại vi trùng gây bệnh.
Lactobacillus cũng giúp tiêu hoá đường lactose trong sữa một cách dễ dàng

hơn. Loại vi khuẩn có ích này cũng đem lại hiệu quả cao cho những người bị đau
bụng tiêu chảy vì loạn khuẩn đường ruột do hậu quả của việc dùng quá nhiều kháng
sinh khiến các vi khuẩn có ích bị tiêu diệt.
Một nghiên cứu gần đây cho thấy, vi khuẩn Lactobacillus còn có tác dụng
chữa bệnh chàm ở trẻ em.
Một số chủng Lactobacillus thường dùng trong lên men lactic như:
Lactobacillus bulgaricus: Lên men đồng hình, là trực khuẩn tròn, đôi khi ở
dạng hạt, thường kết thành chuỗi dài, Gram (+), không có khả năng di động.Chúng
có khả năng lên men được các loại đường glucose, lactose, galactose, không lên men
được sacaroza, xylose, arabinose, sorbose, dulcitol, mannitol, dextrin, inulin. Chúng
không có khả năng tạo ra nitrit từ nitrate. Đây là giống ưa nhiệt, nhiệt độ tối thích
cho phát triển là 40 – 45 oC, tối thiểu là 15 – 20 oC.

SVTH: Trần Thị Thu Giang

Footer Page 6 of 133.

6


Header Page 7 of 133.

Đồ án tốt nghiệp

GVHD: TS.Nguyễn Thúy Hương

Hình 2.1 : Vi khuẩn Lactobacillus bulgaricus [10]
Lactobacillus casei: Lên men lactic đồng hình, trực khuẩn nhỏ, Gram (+),
thường gặp ở dạng chuỗi dài hoặc ngắn, tích tụ tới 1,5% acid. Chúng không có khả
năng chuyển động. Có khả năng lên men được các loại đường glucose, fructose,

mannose, galactose, maltose, lactose, salicin. Trong quá trình lên men chúng tạo ra
D-acid lactic. Nhiệt độ tối thích cho phát triển là 38 – 40 oC, nhờ có hoạt tính
proteaza nên có thể phân hủy protein trong sữa thành acid amin.

Hình 2.2 : Vi khuẩn Lactobacillus casei [10]
Lactobacillus lycopersici: lên men lactic dị hình, là trực khuẩn Gram (+), sinh
hơi, trong thiên nhiên chúng tồn tại thành từng đôi một, có khả năng tạo bào tử.
Trong quá trình lên men đường, chúng tạo ra cồn, acid lactic, acid acetic và CO2 .
Ngày nay chúng được coi như các biến chủng của Lactobacillus brevis.[6]
Lactobacillus pasteurianus: là trực khuẩn Gram (+), có kích thước rộng: 0.5 –
1.0µm, dài: 7.0 - 35µm. Trong thiên nhiên chúng tồn tại riêng lẻ, không di động.
Chúng có khả năng lên men được arabinose, glucose, fructose, galactose, maltose,
SVTH: Trần Thị Thu Giang

Footer Page 7 of 133.

7


Header Page 8 of 133.

Đồ án tốt nghiệp

GVHD: TS.Nguyễn Thúy Hương

tạo ra một loạt các sản phẩm như: CO2, alcohol, acid lactic, acid acetic, acid formic.
Nhiệt độ thích hợp từ 29 – 33 oC.
Lactobacillus bifidus: trực khuẩn rất nhỏ, thuộc loại Gram (+). Chúng không
có khả năng di động, có khả năng lên men được các loại đường glucose, fructose,
galactose, saccharose, inulin, dextrin. Nhiệt độ phát triển tốt nhất của vi khuẩn này là

37 oC.
Lactobacillus causaciccus: Trực khuẩn Gram (+) ngắn, không có khả năng
chuyển động, có khả năng lên men các loại đường glucose, fructose, mannose,
galactose, maltose, lactose, mannitol. Nhiệt độ phát triển tối ưu là 48 – 50 oC.
Latobacillus brevis: lên men lactic dị hình, là loại trực khuẩn Gram (+), không
có khả năng di động, có kích thước rộng: 0.7 – 1.0µm, dài: 2.0 – 4.0µm, tìm thấy chủ
yếu trong muối chua bắp cải. Trong thiên nhiên chúng thường lêi kết với nhau thành
chuỗi. Trong quá trình phát triển chúng có thể sử dụng lactate canxi như nguồn cung
cấp carbon. Chúng có khả năng lên men các loại đường arbinose, xylose, gluxose,
fructose, galactose, maltose. Trong lên men ngoài acid lactic (1,2%), nó còn tạo
thành acid acetic, rượu etylic (2,4%), CO2, nó còn tạo hương làm cho sản phẩm có
hương vị dễ chịu. Nhiệt độ phát triển tối đa là 30 oC, vi khuẩn này có nhiều trong sữa,
kefia, dưa chua…

Hình 2.3 Vi khuẩn Latobacillus brevis [10]
Lactobacillus leichmannii: trực khuẩn Gram (+). Trong tự nhiên chúng có khả
năng tạo thành chuỗi ngắn, kích thước tế bào từ 0.6 – 2.0µm. Chúng có khả năng lên
men glucose, fructose, maltose, saccharose, trehalose và không có khả năng lên men
lactose, galactose, raffinose, arabinose, rhamnose, dextrin, inulin. Trong quá trình lên
SVTH: Trần Thị Thu Giang

Footer Page 8 of 133.

8


Header Page 9 of 133.

Đồ án tốt nghiệp

GVHD: TS.Nguyễn Thúy Hương

men, chúng tạo ra L-acid lactic, không có khả năng tạo nitrit từ nitrat. Nhiệt độ phát
triển tối ưu là 36 oC.
Lactobacillus helveticcus: trực khuẩn, có kích thước rộng: 0.7 – 0.9µm, dài:
2.0 – 6.0µm. Trong thiên nhiên chúng có thể tồn tại riêng lẻ từng tế bào, cũng có thể
tạo thành chuỗi tế bào. Chúng có khả năng lên men các loại đường glucose, fructose,
galactose, mannose, maltose, lactose. Nhiệt độ phát triển từ 40 – 42 oC. Vi khuẩn này
được sử dụng nhiều trong sản xuất sữa chua và phomai cứng.
Lactobacillus thermophilus: là trực khuẩn Gram (+), kích thước tế bào 0.5 –
3.0µm, không có khả năng di động. Nhiệt độ phát triển tối ưu là 30 oC, có thể chịu
được nhiệt độ 65 – 75 oC. Vi khuẩn này được sử dụng nhiều trong sản xuất sữa chua
và phomai.
Lactobacillus plantarum: trực khuẩn Gram (+), kích thước tế bào rộng: 0.7 – 1µm,
dài 3 – 8µm. Nhiệt độ phát triển tối ưu là 30 oC, có khả năng chịu được nồng độ
NaCl 5,5%. Vi khuẩn này được dùng nhiều trong chế biến sữa.[6]

Hình 2.4 Vi khuẩn Lactobacillus plantarum [9]
Leuconostoc
Leuconostoc gồm những liên cầu khuẩn lên men lactic đồng dạng, lên men
đường sinh acid lactic và 1 lượng lớn acid acetic, cồn etylic, và khí CO2. Khả năng
của 2 loài Leuconostoc dextranicium và Leuconostoc citrovorum lên men acid citric
của sữa với sự sản sinh chất có mùi thơm diacetyl và khả năng kích thích liên cầu
khuẩn lactic làm cho chúng được đem dùng vào giai đoạn đầu của chế biến bơ và
phomai.
Một số đặc trưng của giống Leuconostoc cho nó vị trí quan trọng trong thực
phẩm như: Sản sinh diacetyl, sự chịu đựng của những nồng độ muối cao làm cho
SVTH: Trần Thị Thu Giang

Footer Page 9 of 133.

9


Header Page 10 of 133.

Đồ án tốt nghiệp

GVHD: TS.Nguyễn Thúy Hương

Leuconostoc mesenteriodes được đem dùng ở giai đoạn đầu của sự lên men lactic. Sự
chịu đựng được ở những nồng độ đường cao đến 55 – 60% (đối với Leuconostoc
mesenteriodes) làm cho vi khuẩn có thể phát triển trong xiro bán lỏng và kem đá…
sản sinh ra nhiều thán khí từ đường làm hư hỏng 1 số loại phomai, xiro.

Hình 2.5 Vi sinh vật thuộc nhóm Leuconostoc [9]
Streptococcus
Streptococcus là cầu khuẩn hoặc trực khuẩn rất ngắn, chủ yếu lên men lactic
đồng hình, kết song đôi hoặc thành chuỗi ngắn. Giống ưa ấm, nhiệt độ phát triển tối
thiểu là 10 oC, tối đa là 40 – 45 oC và phát triển tốt ở 30 – 35 oC. Trong môi trường nó
tích tụ được 0.8 – 1% acid. Một số chủng tạo thành bacteriocin.
Một số dạng Streptococcus thường dùng để lên men lactic như:
Streptococcus lactis: là liên cầu khuẩn Gram (+). Nhiệt độ phát triển từ 10 –
45 oC, có thể chịu được nồng độ NaCl 4%. Khi lên men đường glucose, maltose,
lactose, xylose, arabinose, saccharose, trehalose, monnitol, tạo ra acid lactic, CO2,
acid acetic, diacetyl. Chúng có khả năng lên men được raffinose, inulin, glycerol,
sorbitol. Chúng được sử dụng rộng rãi trong chế biến các sản phẩm như sữa chua,
cream – bơ chua, phomai. Streptococcus lactic có khả năng lên men 30 oC đối với
sữa, đường glucose, mantose, lactose, galactose.

SVTH: Trần Thị Thu Giang

Footer Page 10 of 133.

10


Header Page 11 of 133.

Đồ án tốt nghiệp

GVHD: TS.Nguyễn Thúy Hương

Hình 2.6 Vi khuẩn Streptococcus lactis [10]
Streptococcus cremoris : là tế bào hình cầu và kết thành chuỗi dài, ưa ấm và
tạo ít acid trong môi trường. Nhiệt độ thích hợp cho phát triển là 25 oC, tối thiểu là 10
o

C, và tối đa là 36 – 38 oC.
Streptococcus thermophilus : có dạng hình cầu, kết thành chuỗi dài, phát triển

tốt nhất ở nhiệt độ 40 – 45 oC, tích tụ khoảng 1% acid. Thường dùng phối hợp với
trực khuẩn lactic để chế biến sữa chua và các loại đặc biệt, sữa chua nấu chín và
phomai.

Hình 2.7 Vi khuẩn Streptococcus thermophilus [10]

Streptococcus falcalis : là tế bào Gram (+), chúng thường tạo thành chuỗi tế
bào hình cầu, có khả năng chịu được nồng độ NaCl 5%, có khả năng lên men đường
glucose, maltose, lactose, trehalose, silicin, sorbitol.[6]

Gần đây, người ta nghiên cứu sản xuất phomai từ sữa dừa dưới tác dụng của vi
khuẩn Streptococcus diacetylactis. Giống được bảo quản trong môi trường sữa và
giữ trong tủ đông. Nhiệt độ nuôi cấy sinh trưởng và lên men mạnh nhất khi nuôi cấy
SVTH: Trần Thị Thu Giang

Footer Page 11 of 133.

11


Header Page 12 of 133.

Đồ án tốt nghiệp

GVHD: TS.Nguyễn Thúy Hương

ở 28 oC, phát triển khá ở 35 oC và thấp nhất ở 20 oC. Sau nhiều thử nghiệm cho thấy
môi trường tốt nhất là môi trường sữa bột gầy bổ sung glucose và nước chiết nấm
men.
Streptococcus diacetylactis còn được gọi là Pneumococci, là cầu khuẩn Gram
(+), xếp từng đôi hay thành chuỗi, có vỏ bằng polysaccharide. Pneumococci dễ bị ly
giải bởi những chất hoạt động bề mặt như muối mật. Thường trú ở đường hô hấp trên
của người và có thể gây viêm phổi, viêm xoang, viêm phế quản, nhiễm khuẩn máu,
viêm màng não... Ở bệnh phẩm đàm hay mủ, vi khuẩn đứng riêng lẻ hay xếp thành
chuỗi. Khi trở nên già thì biến thành Gram (-) và dễ tự ly giải.
2.1.4. Đặc điểm chung của Lactobacillus delbrueckii
Lactobacillus delbrueckii thuộc:
Giới: Bacteria
Ngành: Fermicutes
Lớp: Bacilli

Bộ: Lactobacillilales
Họ: Lactobacillaceae
Giống: Lactobacillus
Loài: Lactobacillus delbrueckii
Trực khuẩn dài, kích thước 0,5- 0,8µm,2,0- 9,0 mm,không di động, Gram (+)
Có khả năng lên men được các loại đường glucose, fructose, galactose,
maltose và dexrin.Không có khả năng lên men xylose, arabinose, mannitol, inulin,
rhamnose, lactose, raffinose, trehalose. Ngoài ra chúng có thể đồng hóa được tinh bột.
Thường gặp trên hạt đại mạch, trên bề mặt của thực vật và xác cây đang phân
giải, đây là trực khuẩn lớn. Trong quá trình phát triển của mình chúng có khả năng
tạo thành sợi. Nhiệt độ tối ưu cho chúng phát triển từ 45 ÷ 50oC,pH là 4.5 – 6.8,
khác với các loài khác chúng không có khả năng lên men đường lactose vì vậy chúng
không được dùng trong chế biến sữa.
Thông thường có khả năng lên men đường thành acid lactic trong điều kiện kỵ
khí.

SVTH: Trần Thị Thu Giang

Footer Page 12 of 133.

12


Header Page 13 of 133.

Đồ án tốt nghiệp

GVHD: TS.Nguyễn Thúy Hương

2.1.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn lactic.

2.1.5.1. Ảnh hưởng của pH
pH là số đo hoạt tính của ion hydrogen trong môi trường. Thang pH thay đổi
từ 0-14, pH có ảnh hưởng rất lớn đến sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật. Mỗi
sinh vật điều có một phạm vi pH nhất định và pH sinh trưởng tốt nhất. Vi sinh vật ưa
acid có pH phát triển tốt nhất khoảng 0-5.5, vi sinh vật trung tính từ 5.5-8, vi sinh vật
ưa kiềm từ 8.5-11.5, vi sinh vật ưa kiềm cực đoan sinh truởng tối ưu ở pH 10 và lớn
hơn. Mặc dù mỗi nhóm vi sinh vật có khoảng pH khá rộng nhưng mức chịu đựng của
chúng có giới hạn nhất định. Khi pH của tế bào có sự biến đổi đột ngột sẽ phá vỡ
màng sinh chất, ức chế hoạt tính của enzyme hay protein chuyển màng.[ 11]
Khi pH môi trường thay đổi tương đối lớn, vi sinh vật vẫn có phương pháp
thích nghi ở một giới hạn cho phép. Phần lớn pH nội bào của vi sinh vật vẫn giữ
trung tính, nguyên nhân là do tính thấm H+ qua màng sinh chất tương đối thấp. Vi
sinh vật trung tính thông qua hệ thống vận chuyển đã sử dụng K+ thay cho H+. Vi
sinh vật ưa kiềm cực đoan dung Na+ thay cho H+ từ môi trường bên ngoài. Ngoài ra
hệ thống chất đệm nội bào cũng có tác dụng ổn định pH nội bào. Trong quá trình trao
đổi chất của vi sinh vật sinh ra các chất có tính acid hoặc bazơ giúp trung hòa pH
môi trường. Chẳng hạn, Thiobacillus có thể oxy hóa các hợp chất chứa lưu huỳnh
tạo acid sulfuric, một số vi khuẩn phân giải acid amin tạo NH3 làm kiềm hóa môi
trường.[11]
Vi khuẩn lactic nói chung và Lactobacillus delbrueckii nói riêng có thể phát
triển được trong môi trường acid, khoảng pH của chúng có thể từ 4.5 – 8.5. Trong
quá trình lên men, vi khuẩn sẽ sinh ra acid lactic, khi pH thấp hơn 4 một mặt nó sẽ
ứu chế các vi khuẩn tạp nhiễm, tuy nhiên nó cũng ức chế sự phát triển của
Lactobacillus delbrueckii, do đó cần phải theo dõi suốt quá trình lên men, dùng bazơ
để điều chỉnh pH về thích hợp.
2.1.5.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Cũng giống như các sinh vật khác, nhiệt độ môi trường cũng ảnh hưởng rất
lớn đối với vi sinh vật. Trên thực tế, do vi sinh vật thường là các vi sinh vật đơn bào
cho nên chúng rất mẫn cảm với sự biến hóa của nhiệt đô, và thường bị biến hóa cùng
với sự biến hóa về nhiệt độ của môi trường xung quanh. Chính vì vậy, nhiệt độ của tế

SVTH: Trần Thị Thu Giang

Footer Page 13 of 133.

13


Header Page 14 of 133.

Đồ án tốt nghiệp

GVHD: TS.Nguyễn Thúy Hương

bào vi sinh vật cũng phản ánh trực tiếp nhiệt độ của môi trường xung quanh. Một
nhân tố quyết định ảnh hưởng của nhiệt độ đối với sự sinh trưởng của vi sinh vật đó
là tính mẫn cảm với nhiệt độ của các phản ứng xúc tác nhờ enzyme. Trong phạm vi
nhiệt độ thấp, khi nhiệt độ tăng lên sẽ làm tăng tốc độ sinh trưởng của vi sinh vật, vì
phản ứng xúc tác nhờ enzyme cũng giống như các phản ứng hóa học nói chung, khi
nhiệt độ tăng lên 10 oC tốc độ phản ứng sẽ tăng gấp đôi. Vì các phản ứng trong tế bào
đều tăng cho nên toàn bộ hoạt động trao đổi chất sẽ tăng lên khi nhiệt độ cao hơn, và
vi sinh vật sẽ sinh trưởng nhanh hơn. Lúc nhiệt độ tăng lên đến một lúc nhất định thì
nhiệt độ càng tăng, tốc d 9ộ sinh trưởng càng giảm. Khi nhiệt độ tăng quá cao, vi
sinh vật sẽ chết. Khi nhiệt độ quá cao sẽ gây ra sự biến tính của enzyme, của cá cthể
vận chuyển ( transport carryers) và các protein khác. Màng sinh chất sẽ bị tổn thương
vì 2 lớp lippit sẽ bị hòa tan. Do đó mặc dầu ở nhiệt độ cao các phản ứng xúc tác tiến
hành càng nhanh, nhưng do các nguyên nhân nói trên mà tế bào bị tổn thương đến
mức khó hồi phục và dẫn đến việc ức chế sinh trưởng. Tại điều kiện nhiệt độ rất thấp
màng sinh chất bị kết đông lại, enzyme cũng ngừng hoạt động. Nói chung, nếu vựt
quá nhiệt độ tốt nhất đối với vi sinh vật, chức năng và kết cấu tế bào điều bị ảnh
hưởng. Nếu nhiệt độ rất thấp, tuy chức năng chịu ảnh hưởng nhưng thành phần hóa

học và kết cấu không nhất thiết bị ảnh hưởng.[11] Vi khuẩn lactic trong cơ thể phát
triển tốt nhất ở nhiệt độ từ 36 – 38 oC, ngược lại trong cơ thể động vật thì cao hơn từ
41 – 43 oC và có thể đạt đến 46.5 oC. Nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của
Lactobacillus từ 30 – 40 oC. Lactobacillus delbrueckii phát triển trong khoảng nhiệt
độ 10 – 50 oC (Buchta, 1983)
2.1.5.3. Ảnh hưởng của oxy
Các vi sinh vật sinh trưởng trong điều kiện có oxygen được gọi là vi sinh vật
hiếu khí (aerobe), còn các vi sinh vật sinh trưởng trong điều kiện không có oxygen
được gọi là các vi sinh vật kỵ khí (anaerobe). Hầu hết các cơ thể đa bào đều phải cần
sinh trưởng trong điều kiện có oxygen, chúng là các hiếu khí bắt buộc (obligate
aerobes). Oxygen là chất nhận điện tử cuối cùng trong chuỗi vận chuyển điện tử khi
hô hấp hiếu khí. Ngoài ra các vi sinh vật nhân thực (eucaryotes) hiếu khí còn dùng
oxygen để tổng hợp sterol và các acid béo không bão hòa. Các vi sinh vật kỵ khí
không bắt buộc ( facultative anaerobes ) không cần oxygen để sinh trưởng nhưng khi
SVTH: Trần Thị Thu Giang

Footer Page 14 of 133.

14


Header Page 15 of 133.

Đồ án tốt nghiệp

GVHD: TS.Nguyễn Thúy Hương

có oxygen thì sinh trưởng tốt hơn. Khi có oxygen chúng sử dụng phương thức hô hấp
hiếu khí. Các vi sinh vật kỵ khí tùy nghi (aerotolerant anaerobes ) như vi khuẩn
Enterrococcus faecalis có thể sinh trưởng như nhau trong điều kiện có hay không có

oxygen. Ngược lại vi khuẩn Bacteroides, Fusobacterrium, Clostridiun pasteurianum,
Methanococcus…. Sẽ bị chết khi có oxygen.[11]
L. delbrueckii là vi khuẩn hiếu khí tùy tiện.Trong điều kiện hiếu khí sinh khối
của vi khuẩn sẽ phát triển nhanh hơn so với điều kiện kỵ khí. Trong điều kiện hiếu
khí, từ 1 phân tử glucose sẽ bị oxy hóa hoàn toàn thành CO2 và H2O và tổng hợp các
enzyme, từ 1 phân tử glucose tạo ra 36 hoặc 38 ATP, trong điều kiện kỵ khí từ 1
phân tử glucose tạo ra 2ATP do đó lượng cơ chất bị phân hủy rất nhanh và tổng hợp
một số chất kháng khuẩn.
2.1.6. Công nghệ sản xuất acid lactic:
2.1.6.1. Phương pháp sản xuất truyền thống:
Theo phương pháp truyền thống, công nghệ sản xuất acid lactic phải trải qua 3
giai đoạn chính:
Chuẩn bị môi trường lên men
Người ta thường sử dụng nguồn mật rỉ vì rẻ và dễ kiếm. Trước tiên mật rỉ cần
được xử lý để tẩy màu và tách các chất keo có trong mật rỉ. Để xử lý màu, người ta
thường dùng than hoạt tính. Trước tiên mật rỉ cần phải được làm loãng theo tỉ lệ 1:3,
sau đó cho chảy qua cột than hoạt tính.Than hoạt tính sẽ hấp phụ các chất màu.
Sau đó làm loãng mật rỉ đến nồng độ chất khô 15% và dùng H2SO4 5% theo
khối lượng dịch để acid hóa môi trường.H2SO4 có ý nghĩa rất quan trọng trong quá
trình xử lý mật rỉ: H2SO4 như một chất chuyển hóa đường saccharose thành đường
nghịch đảo giúp quá trình lên men sau này tốt hơn. Trong giai đọan này người ta đun
dung dịch 90 – 95 oC trong 6 giờ.
Tiếp tục pha loãng dung dịch đường xuống còn 5 – 10% đường và điều chỉnh
pH ngược lại đến 6,3 – 6,5. Làm nguội dung dịch đường xuống 50 oC và bơm chúng
vào thùng lên men để tiến hành quá trình lên men. [5]
Giai đoạn lên men
Vi khuẩn lactic được nuôi cấy riêng ở phân xưởng nhân giống,khi lượng
giống đảm bảo về số lượng tế bào (khỏang.106 tế bào/ml) người ta chuyển giống vào
SVTH: Trần Thị Thu Giang

Footer Page 15 of 133.

15


Header Page 16 of 133.

Đồ án tốt nghiệp

GVHD: TS.Nguyễn Thúy Hương

thùng lên men với tỉ lệ giống là 2,5 – 3%. Trong quá trình lên men, người ta sử dụng
vôi mịn để trung hòa lượng acid tạo thành nhằm tránh hiện tượng acid hóa dung dịch
lên men và tạo ra lactate canxi.Số lượng CaCO3 cho vào tùy thuộc vào lượng acid
lactic tạo thành.Duy trì pH trong dịch lên men ở mức 5 – 6.
Trong quá trình lên men, người ta tiến hành khuấy trộn liên tục môi trường.
Giai đoạn tạo lactate canxi và thu nhận acid lactic
Sau khi lên men xong,dung dịch lên men được đun nóng đến 80 – 90
o

C.Người ta dùng CaCO3 để điều chỉnh dịch đến pH 10 – 11 để yên từ 3 – 5 giờ.Sau

đó loại bỏ chất lắng,lọc dịch bằng máy lọc khung bản ở nhiệt độ 70 – 80 oC.
Sau khi lọc xong, toàn bộ dịch lên men được chuyển sang thiết bị kết tủa
lactate canxi. Quá trình tạo kết tủa lactate canxi phải mất 10 – 16 giờ.Kết thúc quá
trình, người ta đem lọc bằng máy lọc khung bản.
Để riêng kết tủa và dịch lọc.Dịch lọc được đem đi cô đặc lại và tiến hành kết
tủa lại 1 lần nữa để thu hồi toàn bộ lượng acid lactic có trong dịch lên men. Phần kết
tủa này được trộn chung với phần trước và đem sang thiết bị thu nhận acid lactic.Để
thu nhận acid lactic người ta cho H2SO4 vào phần tủa.Phản ứng sẽ xảy ra và tạo

thành CaSO4 kết tủa và dung dịch chứa acid lactic ( C3H6O3).
Dung dịch acid lactic được đem đi khử màu bằng than hoạt tính và đem cô
đặc chân không để thu nhận acid lactic tinh khiết. [5]
2.1.6.2. Phương pháp sản xuất hiện đại:
Phương pháp thẩm tích điện và trao đổi ion
Phương pháp này khác với phương pháp truyền thống ở 2 nội dung:
 Thay đổi giống và môi trường lên men.
 Thay đổi phương pháp thu nhận acid lactic.
Giống và môi trường lên men:
Giống dùng trong quá trình lên men là Lactobacillus acidophilus. Lượng
giống cho vào để lên men là 5% so với dung dịch lên men.
Dung dịch chứa đường: 40 – 100 đường trong 1000ml
1% dầu bắp thô
1 – 4% nước chiết bắp
Người ta bổ sung khá nhiều khoáng vi lượng vào môi trường lên men.
SVTH: Trần Thị Thu Giang

Footer Page 16 of 133.

16


Header Page 17 of 133.

Đồ án tốt nghiệp

GVHD: TS.Nguyễn Thúy Hương

Nhiệt độ lên men 40 – 50 oC
Điều chỉnh pH trong suốt quá trình lên men là 4,8 – 5,7 bằng NaOH [5]

Phương pháp thu nhận acid lactic
Sau khi lên men người ta dùng CaCO3 đưa pH dung dịch lên men đến pH 6,5
và thực hiện các điều kiện cho việc tạo thành lactic canxi như phương pháp truyền
thống.
Toàn bộ dung dịch, cả phần lactate và sinh khối được đưa vào thiết bị thẩm
tích điện (eletro dialysis) để thu nhận lactate canxi ở dạng lỏng và sinh khối vi sinh
vật. Sinh khối vi sinh vật có khả năng lên men sẽ được chuyển ngược lại để lên men
mẻ kế tiếp. Lactat canxi được cô đặc chân không và chuyển sang máy thẩm tích điện
trích ly (water spiltting eletrodialysis ) để thu nhận acid lactic. Dung dịch acid lactic
sẽ được đưa qua cột trao đổi ion để tách các ion Ca+ và các cation khác. Acid lactic
sau khi thu được sẽ có độ tinh thiết 99%. [5]
2.1.6.3.Phương pháp thu nhận acid lactic
Phương pháp thu nhận acid lactic ở pH > pKa
Đầu tiên người ta cho dung dịch lên men tiếp xúc với chất hấp thụ alamin 336
(tricaprylylamin hòa tan trong methyl iso butylketone).
Tiếp đến, chất hấp phụ sẽ tiếp xúc với ammoniac và trialkylamin phân tử thấp
là trimethylamin (TMA). TMA sẽ được tạo thành trimethylamonium (TMAm), sau
đó TMA và hơi nước sẽ được tái sử dụng, còn acid lactic sẽ được thu nhận.
Phương pháp tách pha
Acid lactic được chuyển thành lactat canxi ở dung dịch lên men. Dung dịch
này được chuyển qua thiết bị lọc. Phần sinh khối được tái sử dụng. Phần lactat hòa
tan được cô đặc đến khoảng 40 – 70% khối lượng ban đầu. ( Người ta điều chỉnh pH
bằng NaCO3 đến pH 6,0 – 6,5 để tạo ra lactate natri).
Lactat natri được đưa vào thiết bị chứa trialkylamin và khí CO2 ở áp suất
75pSi. Lúc này dung dịch sẽ tạo thành hai pha:
* Pha hữu cơ gồm chất hấp phụ acid lactic.
* Pha hòa tan gồm muối carbonate natri và acid carbonic.
Người ta thu hồi acid lactic từ pha hữu cơ bằng phương pháp chưng cất chân không
với áp suất 2 – 10mmHg, ở nhiệt độ 80 – 240 oC. [5]
SVTH: Trần Thị Thu Giang

Footer Page 17 of 133.

17


Header Page 18 of 133.

Đồ án tốt nghiệp

GVHD: TS.Nguyễn Thúy Hương

2.2. Giới thiệu về rỉ đường mía.
2.2.1. Thành phần cấu tạo
Rỉ đường mía là phần còn lại của dung dịch đường sau khi đã tách phần
đường kính kết tinh. Số lượng và chất lượng của rỉ đường phụ thuộc vào giống mía,
điều kiện trồng trọt, hoàn cảnh địa lý và trình độ kỹ thuật chế biến của nhà máy
đường. Thông thường rỉ đường mía thu được bằng 3 ÷ 4% trọng lượng mía đưa vào
chế biến. Thành phần chính của rỉ đường là đường, các chất phi đường và nước. Rỉ
đường mía có khoảng 20% nước, 62% đường và 10% chất phi đường hoặc cao hơn
một chút.
Đường trong rỉ đường bao gồm 25 – 40% saccaroza. 15 – 25% đường khử
( glucoza và fructoza ) và 3 – 5% đường không lên men được tạo nên trong quá trình
chế biến đường. Ở đây do nhiều lần pha loãng và cô đặc một lượng nhất định
saccaroza bị biến thành hợp chất tương tự dextrin do tác dụng của nhiệt. Chất này có
tính khử nhưng không lên men được và không có khả năng kết tinh. [2]
Ngoài saccaroza, glucoza và fructoza rỉ đường mía còn có một lượng nhỏ các
loại đường khác như rafinoza, lactoza, mantoza và xyloza. [3]
Các chất phi đường gồm phi đường hữu cơ và phi đường vô cơ. Phi đường
hữu cơ chứa nitơ của rỉ đường mía chủ yếu là các acid amin cùng với một lượng rất

nhỏ protein và sản phẩm phân giải của nó. Các acid amin từ nước mía dễ dàng đi vào
rỉ đường vì phần lớn chúng rất dễ hòa tan trong nước trừ tiroxin và xixtin.. Nitơ tổng
số trong rỉ đường mía của Mỹ xê dịch trong khoảng 0.4 ÷ 1.5% trung bình là 0.7%
trọng lượng của rỉ đường Hợp chất phi đường không chứa nitơ bao gồm pectin,
araban, galactan hoặc các sản phẩm thủy phân của chúng là arabinoza và galatoza,
chất nhầy, chất màu và chất thơm. Pectin bị kết tủa trong quá trình chế biến đường
nhưng các chất vừa nói không kết tủa và gần như toàn vẹn đi vào rỉ đường (1.22 –
1.56%).
Matubara. K. và Kinoshita, S. đã phân tích định tính các loại acid hữu cơ và
cho biết các acid sau đây có trong rỉ đường mía của các nước Đông Nam Á : acid
aconitic, lactic, malic, xucxinic, glycolic, xitric và lượng nhỏ fumaric, oxalic và
gluconic. Riêng acod aconitric có nồng độ khá cao, xấp xỉ 1.0 – 1.5%. Sự có mặt của
acid này càng nhiều thì sản lượng đường càng thấp. Đặc biệt các loại mía có vị chua
SVTH: Trần Thị Thu Giang

Footer Page 18 of 133.

18


Header Page 19 of 133.

Đồ án tốt nghiệp

GVHD: TS.Nguyễn Thúy Hương

không thể đưa vào sản xuất được. Mía trồng ở những vùng quá nóng như Louisiana
và Florida phát triển rất nhanh nên nồng độ aconitic trong mía là 0.1 – 0.2% và trong
rỉ đường là 3 – 7%. Do vậy người ta đã tiến hành thu hồi loại acid này làm phụ phẩm
của nhà máy đường trước khi đem rỉ đường đi chế biến.

Các chất màu của rỉ đường bao gồm các chất caramen, melanoit, melanin và
phức phenol-Fe+2. Cường độ màu tăng ba lần khi nhiệt độ tăng thêm 10 oC. Có thể
chia các hợp chất màu thành nhiều nhóm:
_ Chất caramen: Xuất hiện nhờ quá trình nhiệt phân sacharoza kèm theo lọai
trừ nước và không chứa một chút nitơ nào. Khi pH không đổi, tốc độ tạo chất
caramen tỉ lệ thuận với nhiệt độ phản ứng.
_ Phức chất polyphenol -Fe+2: là Fe+2- brenzcatechin có màu vàng xanh không
thể loại hết ở giai đoạn làm sạch nước mía và đi vào rỉ đường.
_ Melanoidin: Đây là sản phẩm ngưng tụ của đường khử và acid amin mà chủ
yếu là acid aspactic. Sản phẩm ngưng tụ quen biết nhất là acid fuscazinic đóng vai
trò quan trọng làm tăng độ màu của rỉ đường.
_ Melanin: Được hình thành nhờ phản ứng oxy hóa khử các acid amin thơm
nhờ xúc tác của enzyme polyphenol-oxydaza khi có mặt của O2 và Cu+2. Các acid
amin thơm thường bị oxy hóa là tiroxin và brenzocatechin. Các melanin thường bị
loại hết ở giai đoạn làm sạch nước đường nên chỉ tìm thấy lượng rất nhỏ trong rỉ
đường.
_ Humin: Được trùng hợp từ 66 – 68 các đơn vị cấu tạo của acid amin. Từ đó
phân tích ra khoảng 52 – 53 gốc acid aspactic, 5 gốc acid amino-β-butyric, 2 gốc acid
glutamic, 2 gốc β- amino propionic và 1 gốc acid p- butyric, 2 gốc acid -p- aminoizovaleric.
_ Ngoài ra rỉ đường còn chứa hợp chất màu nâu có công thức cấu tạo C1718H26-27O10N.

[3]

_ Chất keo: Có trong rỉ đường chủ yếu là pectin, chất sáp và chất nhầy. Các
chất này ảnh hưởng rất nhiều đến sự phát triển của vi sinh vật tạo thành màng bao
bọc quanh tế bào ngăn cản quá trình hấp thụ các chất dinh dưỡng và thải các sản
phẩm trao đổi chất của tế bào ra ngoài môi trường. Ngoài ra các chất keo là nguyên

SVTH: Trần Thị Thu Giang

Footer Page 19 of 133.

19


Header Page 20 of 133.

Đồ án tốt nghiệp

GVHD: TS.Nguyễn Thúy Hương

nhân chính tạo ra một lượng bọt lớn trong nuôi cấy vi sinh vật, giảm hiệu suất sử
dụng thiết bị.
_ Các chất phi đường vô cơ chủ yếu là các loại muối tìm thấy trong thành
phần tro của rỉ đường. Độ tro của rỉ đường mía thấp hơn độ tro của rỉ đường củ cải
đường. Muối Kali có khá nhiều trong rỉ đường tiếp đến là canxi và dư lượng SO2.
Điều này dễ hiểu vì muối Kali được dùng để bón cho mía còn muối canxi và gốc
sunfat được thêm vào ở giai đoạn xử lý nước mía và tinh luyện đường.
Bảng 2.1 Thành phần tro trong chất khô của rỉ đường mía và rỉ đường củ cải
(%) [2]
Thành phần

Rỉ đường củ cải

Rỉ đường mía

K2 O

3.9

3.5

CaO

0.26

1.5

SiO2

0.10

0.5

P2O5

0.06

0.2

MgO

0.16

0.1

Na2O

1.30

Al2O3

0.07

Fe2O3

0.02

Dư lượng CO2

3.50

-

Dư lượng SO2

0.55

1.6

Cl-

1.60

0.4

Tổng số

11.52

8.0

0.2

2.2.2. Thành phần các chất sinh trưởng
Ngoài các nguyên tố kim loại và các á kim kể trên, rỉ đường mía còn chứa
nhiều các nguyên tố khác với lượng cực kỳ nhỏ chỉ có thể tính bằng mg/kg rỉ đường
như: Fe 115 mg, Zn 34 mg, Mn 18 mg, Cu 4.9 mg, B3.0 mg, Co 0.59 mg và Mo 0.2
mg.
Rỉ đường mía rất giàu các chất sinh trưởng như acid pantotenic, nicotinic,
folic, B1, B2 và đặc biệt là biotin. Rỉ đường mía Mĩ không thua kém cao ngô là loại

SVTH: Trần Thị Thu Giang

Footer Page 20 of 133.

20


Header Page 21 of 133.

Đồ án tốt nghiệp

GVHD: TS.Nguyễn Thúy Hương

vẫn thường dùng làm nguồn cung cấp chất sinh trưởng cho một số loại môi trường
nuôi cấy vi sinh vật.
Bảng 2.2 Thành phần một số chất sinh trưởng của rỉ đường mía và cao ngô
(µ/100gam) [3]
Loại

chất

sinh Rỉ đường mía

Cao ngô

trưởng

Mexico

Cuba

Mĩ

B1

140

-

830

640

B2

-

-

250

510

B6

700

-

650

910

Acid nicotinic

-

-

2100

8900

Acid pantotenic

12000

-

2140

510

Acid folic

-

-

3.8

12

Biotin

65

10.8

120

49

2.2.3. Vi sinh vật trong rỉ đường mía:
Có rất nhiều vi sinh vật trong rỉ đường mía. Đa số chúng từ nguyên liệu, một
số nhỏ từ không khí, và đất vào dịch đường. Loại nào chịu được tác dụng nhiệt hay
tác dụng của hóa chất thì tồn tại. Có thể phân chúng thành 3 loại: Vi khuẩn, nấm men
và nấm mốc. Trong đó lọai đầu là nguy hiểm hơn cả vì nó gồm nhiều giống có khả

năng sinh bào tử. Người ta chia rỉ đường làm 3 loại tùy theo số lượng vi sinh vật tạp
nhiễm ( Bảng 2.3):
Bảng 2.3 Phân loại rỉ đường theo số lượng vi sinh vật tạp nhiễm[3]
Loại rỉ đường

Số lượng vi sinh vật Đánh giá và xử lý
trong 1 gram rỉ đường

I

100,000

Rất tốt, không cần xử lý

II

100,000 – 1,000,000

Trung bình, cần thanh trùng.

III

1,000,000 – 5,000,000

Nhiễm nặng, cần xử lý nghiêm
ngặt bằng hóa chất và tác dụng
nhiệt.

SVTH: Trần Thị Thu Giang

Footer Page 21 of 133.

21


Header Page 22 of 133.

Đồ án tốt nghiệp

GVHD: TS.Nguyễn Thúy Hương

2.2.4. Lực đệm của rỉ đường mía
Lực đệm là loại lực có sức tự cản sự biến đổi phản ứng của rỉ đường khi bổ
sung kiềm hoặc axít. Rỉ đường mía có tính đệm đặc trưng. Bình thường pH của rỉ
đường mía nằm trong khỏang 5.3 – 6.0 . Trong quá trình bảo quản pH có thể bị giảm
do hoạt động của vi sinh vật tạp nhiễm tạo ra các acid hữu cơ. Khi thêm HCl hay
H2SO4 vào rỉ đường, acid sẽ tác dụng với các muối kiềm của các acid hữu cơ tự do,
qua đó pH của rỉ đường bị thay đổi rất ít khi tiếp tục thêm acid HCl hay H2SO4. Lực
đệm của rỉ đường biểu hiện mạnh nhất ờ pH 3.0 – 5.0, trung bình ở pH5.0 – 6.0 và
rất ít ở pH 6.0 – 7.07.
Mía đường là thế mạnh của Việt Nam, vào năm 2000 đạt năng suất
triệu tấn/năm. Do đó khả năng tận dụng nguồn rỉ đường là rất lớn. Hiện nay rỉ đường
chủ yếu được ứng dụng sản xuất acid lactic và ethanol. Nghiên cứu của Arti
Dumbrepatil, Mukund Adsul, Shivani Chaudhari, Jayant Khire, and Digambar
Gokhale tại Ấn Độ, sử dụng nguồn rỉ đường để lên men sản xuất acid lactic, tác giả
đã sử dụng nguồn đường trong rỉ đường cung cấp nguồn carbon cho vi khuẩn
Lactobacillus delbrueckii subsp, do trong rỉ đường hàm lượng protein rất thấp do đó
cần bổ sung cao nấm men cung cấp nitơ cho vi khuẩn. Kết quả khảo sát hàm lượng
cao nấm men 0.5g/l cho hàm lượng acid lactic đạt nồng độ tối ưu là 166g/l.[8]
2.3. Cố định tế bào vi sinh vật:

2.3.1. Định nghĩa:
Sự cố định tế bào vi sinh vật được xác định như là quá trình gắn tế bào vi sinh
vật vào phase riêng biệt tách khỏi phase tự do của dung dịch nhưng vẫn có khả năng
trao đổi chất với các phân tử cơ chất có mặt trong phase tự do nói trên. Phase chứa tế
bào thong thường không tan trong nước và là polymer cao phân tử có tính ưa nước.
Tế bào sau khi cố định có thể sử dụng nhiều lần, không lẫn vào sản phẩm và có thể
chủ động ngừng phản ứng nếu mong muốn.
2.3.2. Ưu điểm và nhược điểm của tế bào vi sinh vật cố định:
Ưu điểm:
Enzyme của tế bào ổn định hơn enzyme ở dạng tự do khi tế bào được gắn trên
chất mang polymer tự nhiên, cố định tế bào vi sinh vật không đòi hỏi khâu tách chiết
và tinh sạch enzyme, tế bào vi sinh vật cố định có khả năng thực hiện các quá trình
SVTH: Trần Thị Thu Giang

Footer Page 22 of 133.

22


Header Page 23 of 133.

Đồ án tốt nghiệp

GVHD: TS.Nguyễn Thúy Hương

gồm nhiều phản ứng enzyme kế tiếp nhau và có thể được sử dụng nhiều lần theo chu
kỳ hoặc liên tục, trong tế bào vi sinh vật cố định ,song song với quá trình trao đổi
chất còn diễn ra quá trình tái tạo cofactor.
Nhược điểm:
Protease có mặt trong tế bào vi sinh vật có thể gây hiện tượng thủy giải đối

với enzyme mà ta quan tâm, trong tế bào vi sinh vật cố định có thể xảy ra các phản
ứng phụ không đặc hiệu, tế bào vi sinh vật cố định gây cản trở khuếch tán bổ sung
đối với quá trình vận chuyển cơ chất và sự cản trở này rất khó đánh giá về mặt định
lượng, enzyme đặc hiệu của tế bào vi sinh vật cố định có thể giảm hoạt độ riêng.[5]
2.3.3. Các yêu cầu đòi tế bào vi sinh vật cố định:
Sự mất hoạt tính enzyme trong quá trình cố định tế bào phải ở mức độ thấp,
các tế bào phải có khả năng chiếm thể tích riêng của thiết bị phản ứng nhiều nhất
nhằm làm tăng năng suất thể tích.
Cơ chất và sản phẩm tạo ra phải có khả năng khắc phục được hàng rào cản trở
khuếch tán, chất xúc tác (tế bào gắn vào chất mang ) phải dễ dàng khuấy trộn được
và bền về mặt cơ học.
Chất xúc tác phải ổn định trong khoảng nhiệt độ họat động của quy trình công
nghệ cũng như phải bền đối với hóa chất và pH sử dụng trong quy trình công nghệ,
phải thực hiện được việc tái sinh chất xúc tác dựa vào họat động của quá trình trao
đổi chất đặc thù với từng cơ thể vi sinh vật. [5]
2.3.4. Giới thiệu về chất mang Cellulose vi khuẩn ( Bacterial Cellulose –
BC )
Cellulose là một lọai polymer sinh học phong phú nhất trên trái đất, không
những được xem như thành phần chính của sinh khối thực vật, mà còn là đại diện
polymer ngọai bào của vi sinh vật. BC phụ thuộc vào những sản phẩm đặc trưng của
quá trình trao đổi chất nguyên thủy và chủ yếu là màng bảo vệ, trong khi cellulose
thực vật đóng vai trò cấu trúc tế bào.
Cellulose được tổng hợp bởi vi khuẩn thuộc giống Acetobacter, Rhizobium,
Agrobacterium, và Sarcina (Jonas và Farah, 1998). Các sinh vật tổng hợp Cellulose
hiệu quả nhất là vi khuẩn sinh acid acetic, Gram (-) Acetobacter xylinum (phân loại
như Gluconacetobacter xylinus, Yamada và cộng sự, 1997; Yamada,2000), loại vi
SVTH: Trần Thị Thu Giang

Footer Page 23 of 133.

23


Header Page 24 of 133.

Đồ án tốt nghiệp

GVHD: TS.Nguyễn Thúy Hương

khuẩn được sử dụng làm vi sinh vật mẫu dùng trong những nghiên cứu ứng dụng và
nghiên cứu cơ bản trên cellulose.
Một trong những đặc điểm quan trọng nhất của BC là độ tinh sạch hóa học.
Đây là đặc điểm phân biệt cellulose vi khuẩn với cellulose thực vật, loại cellulose
thường liên kết với hemicellulose và lignin.
Do những đặc tính duy nhất được tạo ra từ cấu trúc hạt cực mịn, BC có nhiều
ứng dụng trong ngành giấy, dệt sợi và công nghệ thực phẩm; được xem như vật liệu
sinh học trong nghành mỹ phẩm và y khoa (Ring và cộng sự, 1986). Ứng dụng rộng
hơn của loại polysaccharide này phụ thuộc vào quy mô sản xuất và chi phí của nó.Vì
vậy,các nghiên cứu cơ bản được tiến hành cùng những nghiên cứu chuyên sâu về
lĩnh vực cải tiến giống và phát triển quá trình sản xuất.
Hình thái đại thể của BC phụ thuộc nghiêm ngặt vào những điều kiện nuôi cấy
( Watanabe và cộng sự,1998,a; Yamanaka và cộng sự,2000). Trong các điều kiện
tĩnh, vi khuẩn tích lũy các mãng (BC-S) cellulose trên bề mặt môi trường nước luộc
thịch chứa dinh dưỡng ở mặt phân giới ( phân cắt phase) khí-lỏng giàu oxy. Các sợi
phụ cellulose nhô ra từ các lỗ sắp theo thứ tự đường thẳng ở bề mặt của tế bào vi
khuẩn, kết tinh thành các vi sợi và ép sâu hơn vào môi trường tăng trưởng.Vì thế,
màng mỏng giống như da, nâng đỡ quần thể tế bào A.xylinum bao gồm các dãi
cellulose chồng lên nhau và xoắn vào nhau tạo thành các mặt phẳng song song và vô
tổ chức (Jonas và Farah,1998). Các sợi BC-S liền kề nhau thường ích phân nhánh và
nối liền nhau hơn các sợi của BC được tạo trong môi trường cấy lắc (BC-A), ở dạng

những thể hạt không đều nhau, những dãi hình sao và hình sợi, phân tán đều trong
nuôi cấy lỏng ( Vandamme và cộng sự, 1998)
Tính chất
BC là dạng polymer có độ tinh sạch cao hơn so với các dạng cellulose khác,
không chứa lignin và hemicellulose. BC có thể bị phân hủy hoàn toàn.
Trọng lượng nhẹ, kích thước ổn định, sức căng và độ bền sinh học cao
Khả năng nổi bật của cellulose vi khuẩn là giữ nước tốt. Trong điều kiện ngập
nước, nước có thể vận chuyển vào các sợi cellulose.
Khả năng kết sợi tạo tinh thể tốt.
Tính bền cơ học tốt, khả năng chịu nhiệt tốt.
SVTH: Trần Thị Thu Giang

Footer Page 24 of 133.

24


Header Page 25 of 133.

Đồ án tốt nghiệp

GVHD: TS.Nguyễn Thúy Hương

Lớp màng cellulose được tổng hợp trực tiếp, vì vậy việc sản xuất các sản
phẩm mong muốn không cần qua bước trung gian. Chẳng hạn như sản xuất giấy
không cần qua bước phân hủy, còn vải thì không cần bước se chỉ. Đặc biệt là vi
khuẩn có thể tổng hợp được các loại màng mỏng và sợi cực nhỏ. Trong cấu trúc BC
thu được trong điều kiện là nuôi cấy tĩnh có các trục đơn giúp cho cấu trúc lớp màng
tạo nên chặc chẽ hơn. [5]
Vi sinh vật tổng hợp BC

BC được tổng hợp bởi một vài giống vi khuẩn, trong đóa chủng Acetobacter
phổ biến nhất Các giống vi sinh vật tổng hợp BC được giới thiệu trong bản sau:
Bảng 2.4 Các chủng vi sinh vật tạo màng cellulose [5]
Chủng vi sinh vật
Acetobacter

Cấu trúc cellulose
Màng mỏng, ngọai bào bao
gồm các dải hẹp tạo thành

Achromobacter

Sợi nhỏ

Aerobacter

Sợi nhỏ

Agrobacterium

Sợi nhỏ, ngắn

Alcaligenses

Sợi nhỏ

Pseudomonas

Sợi nhỏ đan vào nhau

Rhizobium

Sợi nhỏ, ngắn

Sarcina

Cellulose vô định hình

Zoogloea

Không xác định

A. xylinum ( tương tự A. aceti spp. Xylinum, A. xylinus) là chủng tổng hợp BC
hiệu quả nhất. Hiện nay, chủng này được tái phân lập và được xếp thuộc giống
Gluconacetobacter như G. xylinus ( Yamada và cộng sự, 1998,2000) cùng với các
loài khác ( G. Hansensii, G. Europaeus, G. Oboediens và G. Intermedius).
Chức năng sinh lý học
Trong môi trường sống tự nhiên, phần lớn vi khuẩn tổng hợp polysaccharide
ngoại bào. Các tế bào vi khuẩn tổng hợp cellulose được bẫy trong mạng lưới polymer,
mà mạng này thường xuyên nâng đỡ khuẩn lạc ở mặt phân giới lỏng-khí. Vì thế, các
chủng tạo thành BC có thể sống trong nước thải. Chất nền polymer tham gia trong sự
SVTH: Trần Thị Thu Giang

Footer Page 25 of 133.

25