Bước đầu nghiên cứu chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ glyphosate vào cây đậu tương nhờ vi khuẩn agrobacterium tumefaciens

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

NGUYỄN THỊ LIỄU

“BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN KHÁNG THUỐC
TRỪ CỎ GLYPHOSATE VÀO CÂY ĐẬU TƢƠNG NHỜ
VI KHUẨN AGROBACTERIUM TUMEFACIENS”

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – Năm 2014


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

NGUYỄN THỊ LIỄU

“Bƣớc đầu nghiên cứu chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ
glyphosate vào cây đậu tƣơng nhờ vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens”
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60 42 0114

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. PGS.TS. Đặng Trọng Lương

(Viện Di truyền Nông nghiệp Việt Nam)
2. GS.TS. Phan Tuấn Nghĩa
(Đại học Khoa học Tự nhiên-ĐHQGHN)

Hà Nội – Năm 2014


I. MỞ ĐẦU
Đậu tương (Glycine max (L.) Merr) là cây trồng quan trọng trên thế giới có giá trị sử
dụng toàn diện do hàm lượng protein cao nhất trong các loại hạt thực vật (38-47%), lipid (12,525,0%), glucid (10-15%). Đây là nguồn cung cấp protein và dầu thực vật chủ lực cho toàn thế
giới. Hạt đậu tương chứa gần như đầy đủ các axit amin cơ bản như isoleucin, leucin,
methyonin, phenylalanin, tryptophan, valin.
Mặc dù đã bắt đầu tiến hành sản xuất trên quy mô công nghiệp từ năm 2011 nhưng Việt
Nam vẫn tiếp tục phải nhập khẩu phần lớn lượng bột đậu tương. Năm 2013, Việt Nam đã nhập
khẩu khoảng 2,97 triệu tấn khô đậu tương. Trước tình hình đó Bộ Nông nghiệp và Phát triển
nông thôn đặt ra yêu cầu tăng năng suất và diện tích trồng đậu tương trên cả nước.
Ngày nay, công nghệ gen sử dụng các phương pháp hiện đại đã khắc phục được rất
nhiều hạn chế của phương pháp chọn giống truyền thống. Công nghệ gen cho phép các nhà di
truyền và chọn giống thực vật xác định, thiết kế các gen đặc hiệu cho các mục tiêu mong muốn
rồi chuyển các gen này vào các giống đang sử dụng nhằm tăng tính chống chịu, tăng năng suất
chất lượng cây trồng.
Có nhiều phương pháp chuyển gen được sử dụng đã thành công trong đó phương pháp
chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens đang được các phòng thí nghiệm trên thế
giới cũng như ở Việt Nam sử dụng nhiều nhất. Với ưu điểm là tần số biến nạp khá cao, các cây
chuyển gen thu được tương đối dễ và ít tốn kém, phương pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn A.
tumefaciens đã đạt được kết quả trên nhiều đối tượng như thuốc lá, hoa cúc, đậu xanh, lúa và
nhiều giống cây trồng khác.
Xuất phát từ những yêu cầu thực tiễn trên chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Bước
đầu nghiên cứu chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ glyphosate vào cây đậu tương nhờ vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens’’.

CHƢƠNG I - TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu chung về đậu tƣơng
1.1.1. Nguồn gốc
1


Dựa vào sự đa dạng về hình thái, Fukuda (1993) và về sau nhiều nhà khoa học khác đã
thống nhất rằng, đậu tương có nguồn gốc từ Mãn Châu (Trung Quốc). Từ Trung Quốc, đậu
tương đã lan truyền đi khắp thế giới. Theo các nhà nghiên cứu Nhật Bản, vào khoảng 200
năm trước công nguyên, đậu tương đã được đưa vào Triều Tiên và sau đó được chuyển sang
Nhật. Đến giữa thế kỷ 17, đậu tương mới được nhà thực vật người Đức Engelbert Caemfer
đưa về Châu Âu và đến năm 1954 mới du nhập vào Mỹ. Một số tài liệu cho rằng cây đậu
tương được đưa vào trồng ở nước ta từ thời vua Hùng, cây đậu tương được trồng trước cây
đậu xanh và cây đậu đen.
1.1.2. Phân loại
Đậu tương hay đỗ tương, đậu nành có tên khoa học là Glycine max (L.) Merr. Theo khóa
phân loại của Hymowitz T., C.A. Newell và căn cứ vào đặc điểm hình thái, sự phân bố địa lý
và số lượng nhiễm sắc thể, cây đậu tương thuộc bộ đậu (Fabales), họ đậu (Fabaceae), phân họ
Leguminosae, chi Glycine. Đậu tương trồng có số lượng nhiễm sắc thể 2n = 40 là loại cây trồng
mang lại giá trị kinh tế cũng như giá trị dinh dưỡng cao.
1.1.3. Vai trò của đậu tương
Cây đậu tương mang lại những giá trị rất toàn diện. Theo thống kê, trên toàn thế giới có
khoảng 1,2 vạn sản phẩm làm từ đậu tương. Các sản phẩm được tiêu thụ trên thị trường gồm
bột đậu nành đóng gói, đậu phụ, sữa đậu nành, sữa chua đậu nành,… Trong công nghiệp, đậu
tương được sử dụng để chế biến cao su nhân tạo, sơn, mực in, xà phòng, chất dẻo, tơ nhân tạo,
chất đốt lỏng, dầu bôi trơn trong ngành hàng không, nhưng chủ yếu đậu tương dùng để ép dầu.
Đậu tương là cây có khả năng cố định đạm nên được sử dụng làm cây luân canh cải tạo đất
trong hệ thống nông nghiệp. Thân lá đậu tương dùng bón ruộng thay phân hữu cơ rất tốt bởi
hàm lượng nitơ trong thân chiếm 0,05%, trong lá chiếm 0,19%. Ngoài ra đậu tương còn là
nguồn thức ăn tốt cho gia súc, 1kg hạt đậu tương tương đương với 1,38 đơn vị thức ăn chăn

nuôi. Các bộ phận của cây đậu tương (thân, lá, rễ, quả, hạt) có hàm lượng đạm khá cao cho nên
các sản phẩm phụ như thân lá tươi có thể nghiền khô làm thức ăn tổng hợp của gia súc.
1.2. Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens và quá trình chuyển gen thực vật
1.2.1. Khái quát chung về vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
Agrobacterium tumefaciens là vi khuẩn gây bệnh sống trong đất, có khả năng xâm nhiễm
thực vật, kích thích tạo khối u ngay tại các vết thương của cây chủ. Trong tự nhiên,
2


Agrobacterium tumefaciens chủ yếu tấn công cây hai lá mầm, đặc biệt là nhóm thực vật có hoa.
Hoàn toàn khác với mô tế bào thực vật bình thường, khối u do Agrobacterium tumefaciens sinh
ra phát triển mạnh ngay trong điều kiện thiếu hoocmon sinh trưởng (auxin và cytokinin). Đó là
do Agrobacterium tumefaciens đã chuyển một đoạn T-DNA (transfer DNA) sang tế bào thực
vật và T-DNA điều khiển quá trình sinh tổng hợp các chất đó. Ngoài ra, các khối u cũng sinh
tổng hợp các opine là các axit amin, đặc biệt là các dẫn xuất của đường. Opine được vi khuẩn sử
dụng thay cho nguồn cacbon và nitơ nhờ hoạt động của gen chuyển hóa opine trên plasmid gây khối
u thực vật. Dạng opine được tổng hợp có thể là nopanin, octopin, agrocinopin, mannozapin và
agropin, phụ thuộc vào từng chủng Agrobacterium tumefaciens. Trong đó, octopin và nopalin là hai
dạng opine phổ biến.
1.2.2. Ti-plasmid
Ti-plasmid là một phân tử DNA mạch vòng, kích thước khoảng 200kb, phân tử lượng của
nó sấp xỉ 1,2.108. Trong tế bào thực vật chúng tồn tại như một đơn vị sao chép độc lập. Tiplasmid ở các chủng Agrobacterium khác nhau đều có bốn vùng tương đồng: vùng có liên quan
đến sự tái bản, vùng liên quan đến sự tiếp hợp, vùng gây độc hay còn gọi là vùng vir (virulent
region), vùng T-DNA. Quá trình gây tạo khối u có liên quan trực tiếp đến vùng T-DNA và
vùng vir.
Vùng T-DNA
Vùng T-DNA là vùng được chuyển vào tế bào thực vật và gây nên các khối u thực vật. Có
hai hệ gen tồn tại trên T-DNA:
- Hệ gen thứ nhất quy định quá trình sinh tổng hợp các chất kích thích sinh trưởng thực vật
là auxin và cytokinin. Khi các gen này hoạt động sẽ dẫn đến sự phân chia các tế bào một cách

liên tục gây ra khối u.
- Hệ gen thứ hai quy định lên quá trình sinh tổng hợp các opine. Đây là các axit amin lạ có
nguồn gốc từ arginine và không bao giờ xuất hiện trong tế bào bình thường.
T-DNA được giới hạn bởi hai bờ phải (right border) và bờ trái (left border). Hai bờ có
cấu trúc lặp lại gồm 24 cặp bazơ nitơ chỉ những đoạn DNA nằm giữa hai bờ được chuyển vào
tế bào thực vật. Bờ phải và bờ trái là những yếu tố cần thiết cho sự chuyển DNA. Tuy nhiên,
quá trình chuyển T-DNA lại do vùng gây độc quy định.
Vùng gen vir
3


Vùng vir dài 35kb mang các gen gây độc. Vùng này bao gồm gen virA, virB, virC, virD,
virE, virG (một số chủng còn có virF). Trong đó gen virA, virB, virD, virG cần thiết cho tạo
độc tính. Hoạt động của gen vir giúp T-DNA này tách ra khỏi vi khuẩn, xâm nhập vào tế bào
thực vật.
Sự biểu hiện của các gen vùng vir là một quá trình sinh hoá phức tạp mà các tác nhân đầu
tiên tác động đến nó là hợp chất phenolic. Với những đặc tính này A.tumafaciens được sử dụng
như một vectơ để chuyển gen vào cây.
1.2.3. Quá trình chuyển gen thực vật thông qua Agrobacterium tumefaciens
Chuyển gen là kỹ thuật đưa một hay nhiều gen lạ đã được thiết kế ở dạng DNA tái tổ
hợp vào tế bào chủ của cây trồng nói riêng và của các sinh vật nói chung (vi sinh vật, động
vật,...) làm cho gen lạ có thể tồn tại ở dạng plasmid tái tổ hợp hoặc gắn vào bộ gen tế bào chủ.
Trong tế bào chủ, các gen này hoạt động tổng hợp nên các protein đặc trưng dẫn tới việc xuất
hiện các đặc tính mới của cơ thể chuyển gen. Các bước chính để tạo một thực vật chuyển gen
gồm có: chọn lọc và phân lập gen, chuyển gen vào tế bào thực vật, nuôi tế bào thực vật mang
gen lạ thành cây hoàn chỉnh.
Hiện nay, có rất nhiều các phương pháp chuyển gen vào thực vật khác nhau như sử dụng
súng bắn gen, dùng xung điện tế bào và mô thực vật, dùng vi tiêm, chuyển gen thông qua con
đường ống phấn,… Tuy nhiên, phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn A. tumefaciens
là phương pháp được sử dụng phổ biến hiện nay. Chuyển gen vào thực vật thông qua

Agrobacterium tumefaciens được xem là phương pháp có nhiều ưu điểm (nhất là đối với cây
hai lá mầm) dựa vào khả năng chuyển gen tự nhiên của loài vi khuẩn đất Agrobacterium .
1.2.4. Hệ thống vector chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
Các Ti-plasmid chứa các gen tổng hợp hoocmon sinh trưởng thực vật và opine không
cần thiết gây khối u cho cây bị xâm nhiễm nên không được dùng trực tiếp làm vector. Các
enzym giới hạn có thể cắt DNA của plasmid ở nhiều chỗ khác nhau, trong khi đó công nghệ
gen lại cần có những vị trí cắt duy nhất cho hoạt động của một số enzym giới hạn. Ngoài ra,
các gen one được dùng làm chỉ thị chọc lọc có tính trội, nhưng chúng lại làm cản trở quá trình
tái sinh bình thường ở thực vật. Với những lí do này, Ti-plasmid đã được nghiên cứu cải biến
như cắt bỏ các gen không quan trọng, lắp thêm các gen cần thiết vào vùng tạo dòng đa năng
MCS (multicloning site- trình tự tạo dòng) tạo hai hệ thống vector chuyển gen hiệu quả: vectơ
4


liên hợp, vectơ nhị phân. Nhờ vậy, cây trồng được biến nạp Ti-plasmid cải biến vừa mang gen
quan tâm, vừa có khả năng tái sinh và phát triển bình thường.
Vectơ liên hợp (co-integrative vector)
Hệ thống vector liên hợp (co-integrative vector) là kết quả của sự liên hợp hai loại
plasmid: Ti-plasmid đã loại trừ vùng gen gây khối u và gen tạo các hợp chất opine nhưng vẫn
giữ lại vùng vir và vùng bờ trái, bờ phải. Thay vào những gen bị cắt bỏ là đoạn tương đồng với
một đoạn trên plasmid thứ hai (plasmid trung gian) để phục vụ cho việc liên hợp hai loại
plasmid. Plasmid trung gian là một plasmid tách dòng từ vi khuẩn E. coli và có thể tái sinh
được ở Agrobacterium. Plasmid này có chứa vùng gắn gen cần chuyển nạp, các gen chỉ thị
phục vụ việc chọn lọc và có đoạn tương đồng. Khi cho tương tác hai loại plasmid này với nhau
chúng sẽ liên hợp qua sự trao đổi chéo giữa hai đoạn tương đồng và hình thành nên vector liên
hợp. Vector liên hợp này nằm trong vi khuẩn A. tumefaciens và hoạt động theo cơ chế chuyển
gen thông thường của vi khuẩn đất. Do tần số đưa plasmid trung gian từ E. coli sang
Agrobacterium rất thấp nên vector này ít được sử dụng.
Vectơ nhị phân (binary vector)
Hệ thống vector nhị phân khác với vector liên hợp là chúng có hai vector (plasmid) cùng

có mặt và hoạt động trong Agrobacterium. (1) Vector chuyển gen: là Ti-plasmid nhỏ có khả
năng tự sao chép và có phổ vật chủ rộng với đoạn T-DNA được cắt bỏ hết các gen không cần
thiết ở giữa hai trình tự bờ trái và bờ phải, gắn thêm các đơn vị sao chép để DNA plasmid có
thể vừa tự nhân trong cả E. coli và Agrobacterium, các gen chọn lọc, gen chỉ thị, vùng có chứa
nhiều điểm cắt của các enzym giới hạn (vùng tạo ra dòng đa năng) nằm ở giữa hai trình tự bờ
trái và bờ phải để chèn gen mong muốn. (2) Vector bổ trợ: với vùng T-DNA và bờ phải, bờ trái
cắt bỏ hoàn toàn, giữ lại vùng vir. Khi các gen trên vector bổ trợ hoạt động thì các sản phẩm
của nó sẽ tác động tới đoạn T-DNA trên vector chuyển gen dẫn đến sự chuyển đoạn T-DNA
sang tế bào thực vật.
Thực tế cho thấy, plasmid với hai đơn vị sao chép có thể không bền vững trong E. coli
khi cả hai vùng này cùng hoạt động. Tuy nhiên, vector nhị phân có ưu điểm như: không xảy ra
quá trình tái tổ hợp giữa các plasmid, kích thước vector khá nhỏ. Nhờ vậy, hiệu quả quá trình
chuyển gen từ E. coli sang A. tumefaciens đã tăng lên. Hiện nay, vector nhị phân được sử dụng
rộng rãi với rất nhiều loại được thiết kế phù hợp với yêu cầu của quá trình chuyển gen.
5


Hệ thống vector pCAMBIA
Vector pCAMBIA là vector nhị phân có nguồn gốc là vector pPZP. Đặc điểm chung của
pCAMBIA: số lượng bản copy trong E. coli cao, đơn vị sao chép pVS1 bền vững trong
Agrobacterium, kích thước nhỏ (từ 7-12kb) phụ thuộc vào từng loại plasmid, chọn lọc vi khuẩn
bằng chloramphenicol hoặc kanamycin, chọn lọc thực vật bằng hygromycin B hoặc kanamycin,
gen chỉ thị là gen gus.
Hiện nay hệ thống pCAMBIA đã đã thiết kế các vector khác nhau mang các gen thích
hợp với từng đối tượng thực vật, từng chủng A .tumefaciens và từng mục đích sử dụng khác
nhau. Gồm có: p2300, p2201, p1300, p1301, p1302, p1303, p1304, p1305.1, p1305.2.
1.2.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả biến nạp thông qua A.tumefaciens
Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả biến nạp thông qua A.tumefaciens:
Ảnh hưởng của kiểu gen: hiệu quả chuyển gen rất khác nhau giữa các kiểu gen của cùng một
loài. Nhiều báo cáo, tài liệu về chuyển gen đã đề cập đến ảnh hưởng của kiểu gen đến khả năng

chuyển T-ADN hay phản ứng nuôi cấy in vitro.
Ảnh hưởng của dạng mẫu mô đích: hiệu quả biến nạp ở các mô khác nhau biểu hiện sự
tiếp nhận gen ngoại lai cũng khác nhau (các mô đang phân sinh dễ biến nạp hơn). Ở cây cà
chua (giống seeda) các mô lá mầm cho hiệu quả biến nạp cao hơn gấp 6 lần mô lá. Các dạng
mô được sử dụng làm mô đích để biến nạp là mô sẹo phôi hóa, phôi non của hạt hay huyền phù
tế bào. Mẫu quá non hay quá già đều ảnh hưởng đến khả năng biến nạp. Nếu mẫu non, sức
sống kém dẫn đến tỷ lệ mẫu sống thấp, còn nếu mẫu quá già lúc này hệ gen thực vật ổn định
dẫn đến việc tiếp nhận gen ngoại lai trở nên khó khăn hơn.
Ảnh hưởng của chủng Agrobacterium và plasmid: các nghiên cứu chuyển gen thành
công thông qua A. tumefaciens cho thấy các chủng vi khuẩn được sử dụng hiệu quả ở các loài
cây một lá mầm đó là LBA4404, C58 đã bị bất hoạt, EHA101 và các chủng cải biên (EHA105
từ EHA101, AGL0 và AGL1 từ EHA101) [33]. Dạng Ti-plasmid của Agrobacterium cũng có
vai trò trong quá trình chuyển T-ADN vào tế bào thực vật. Các nghiên cứu cho thấy, Tiplasmid dạng nopalin có hiệu quả hơn trong việc lây nhiễm Agrobacterium vào ngô so với Tiplasmid dạng octopin.
Nhiệt độ: ảnh hưởng của nhiệt độ trong quá trình đồng nuôi cấy đến hiệu quả chuyển TADN đã được phát hiện ở các loài cây hai lá mầm. Nhiệt độ thích hợp cho quá trình chuyển T6


ADN có thể thay đổi đối với mỗi dạng mẫu mô biến nạp nhất định. Nhiệt độ thích hợp cho
chuyển gen bền vững cũng cần phải được đánh giá với mỗi dạng mẫu mô đích và với mỗi
chủng Agrobacterium biến nạp. Ở các loài cây một lá mầm nhiệt đồng nuôi cấy thường là 24250C, một số trường hợp là 280C. Ảnh hưởng của nhiệt độ thấp (dưới 230C) đến khả năng
chuyển T-ADN và chuyển gen bền vững đã được đánh giá. Biểu hiện gen bền vững gen trong
chuyển gen vào mô sẹo cây tỏi đạt được cao nhất ở 220C. Tần số chuyển gen cao hơn đã nhận
được ở phôi ngô non sau biến nạp được đồng nuôi cấy ở 200C so với 230C.
Ảnh hưởng của thành phần môi trường lây nhiễm và đồng nuôi cấy: sự lây nhiễm
Agrobacterium có thể được cải tiến bằng cách thêm các chất cảm ứng như acetosyringone vào
môi trường nuôi cấy. Khi nghiên cứu sự ảnh hưởng của acetosyringone đến hiệu quả chuyển
gen ở giống lúa DT10 cho thấy ở nồng độ 400μM thì hiệu quả biến nạp cao nhất (45,1%) còn ở
nồng độ 500μM chỉ đạt 16%, thấp nhất (Trần Bích Lan và cs, 1998). Gần đây, việc sử dụng LCys bổ sung vào môi trường đồng nuôi cấy đã cải thiện hiệu suất chuyển gen ở cây ngô.
Ảnh hưởng của các chất kháng sinh để loại bỏ Agrobacterium: các chất kháng sinh như:
cefotaxim, car, timentin thường được sử dụng loại bỏ vi khuẩn sau khi đồng nuôi cấy trong các
nghiên cứu chuyển gen thông qua Agrobacterium . Hiện nay, Car đang được sử dụng chủ yếu

trong các thí nghiệm chuyển gen thông qua Agrobacterium vào ngô và lúa ở nồng độ 100 mg/l.
Và đối với đậu tương là cefotaxim 200mg/l, car 250mg/l .
Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn: mật độ vi khuẩn Agrobacterium cao thường gây chết tế
bào thực vật giảm khả năng tái sinh của các tế bào sau khi biến nạp, dẫn tới giảm tần số chuyển
gen bền vững. Tuy nhiên, mật độ vi khuẩn lây nhiễm cao là cần thiết đối với chuyển gen vào
các loài, các mẫu mô khó, tần số chuyển gen có thể được cải thiện bằng cách lây nhiễm ở mật
độ vi khuẩn cao sau đó rửa mẫu hoặc bổ sung các chất kìm hãm vi khuẩn vào môi trường đồng
nuôi cấy.
1.3. Nghiên cứu chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ glyphosate trên cây đậu tƣơng
1.3.1 Cơ chế kháng glyphosate
Để sản xuất cây chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ, người ta cần những gen kháng mã hóa
cho protein, những protein này hoặc làm bất hoạt thuốc diệt cỏ, hoặc thay đổi vị trí tác động
7


của thuốc trong tế bào, làm thuốc không còn gây hại.
Thuốc diệt cỏ glyphosate ức chế đặc hiệu enzyme 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphatesynthase (EPSP-synthase). Đây là enzyme cần thiết trong thực vật để tổng hợp amino acid
thơm (phenylalanin, tryptophan và tyrosin), một số vitamin và các hợp chất có nguồn gốc thứ
cấp. Enzyme này không có ở người và động vật, vì vậy glyphosate không độc đối với người.
Glyphosate được phân giải trong đất nhờ vi sinh vật và không để lại sản phẩm độc hại nào.
Kháng glyphosate có thể do những cơ chế khác nhau:
+ Thứ nhất trong cây có sự biểu hiện mạnh mẽ của enzyme của EPSP-synthase dưới sự
điều khiển của promoter CaMV-35S và đồng thời tạo nên một enzyme oxidoreductase của vi
khuẩn. Nhờ enzyme oxidoreductase mà thuốc bị bất hoạt và với một lượng lớn EPSP-synthase
được tạo nên thì lượng thuốc còn lại không thể gây hại ở cây biến đổi gen. Ở đây 2 gen cần
thiết, trong đó gen oxidoreductase là không có trong thực vật.
+ Một khả năng thứ hai là sử dụng EPSP-synthase của vi khuẩn. Từ vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens (loài CP4), EPSP-synthase vi khuẩn được phân lập và do sự thay
đổi trình tự amino acid nên enzyme này không còn mẫn cảm với glyphosate và vì vậy được sử
dụng trong nhiều cây trồng thương mại.

+ Thứ ba là xuất hiện một dạng đột biến EPSP-synthase của cây trồng có khả năng
kháng glyphosate.
Sự kết hợp của glyphosate vào enzyme EPSP-synthase ở loại hình bình thường đã làm
mất hoạt tính xúc tác và hạn chế sự di chuyển của enzyme này vào lục lạp. Dạng EPSP*synthase (mã hóa bởi shkG*- dạng đột biến) có hoạt tính thấp với glyphosate và vẫn thể hiện
hoạt tính khi có mặt của thuốc diệt cỏ này.
1.6.2. Đậu tương chuyển gen kháng glyphosate
Hiện nay, các cây trồng chuyển gen kháng glyphosate thường mang 1 hoặc vài gen dưới
đây:
- Gen EPSPS phân lập từ vi khuẩn Agrobacterium chủng CP4 mã hoá cho một dạng của
enzym 5-enolpyruvyshikimate-3-phosphate synthase (EPSPS) có khả năng kháng thuốc diệt cỏ
glyphosate.
- Gen EPSPS cải biên phân lập từ ngô mã hoá cho enzym EPSPS
8


- Gen phân lập từ vi khuẩn đất Achromobacter chủng LBAA mã hoá cho enzym oxy
hoá khử glyphosate (GOX).
Ở cây đậu tương, người ta đã đưa một số gen kháng thuốc diệt cỏ, tuy nhiên khi
chuyển gen EPSPS phân lập từ vi khuẩn Agrobacterium chủng CP4 biểu hiện tính
kháng thuốc diệt cỏ rất hiệu quả. Giống đậu tương chuyển gen kháng glyphosate mang
gen này hiện đang được trồng phổ biến tại nhiều quốc gia trên thế giới dưới tên thương
mại là đậu tương Roundup ready. Đây là giống đậu tương chuyển gen kháng thuốc trừ
cỏ Roundup chứa hoạt chất glyphosate phổ biến nhất. Hiện nay, các nhà khoa học cũng
như các tập đoàn giống cây trồng vẫn đang nỗ lực nghiên cứu nhằm phát triển thêm
các giống đậu tương mang gen kháng thuốc trừ cỏ khác ngoài gen EPSPS nhưng
những nỗ lực này hầu hết mới chỉ dừng lại ở việc tạo ra các dòng cây chuyển gen triển
vọng chứ chưa thể tạo ra những sản phẩm thương mại hoá khác thay thế cho các giống
Roundup ready mang gen EPSPS.
CHƢƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu

Vật liệu thực vật là hai giống đậu tương DT2008 và giống ĐT26.
Các chủng vi khuẩn GV3101, C58C1, LBA4404được lưu giữ tại Viện Di truyền Nông
nghiệp. Các chủng này chứa vector pCAMBIA2300
2.2 Hóa chất thiết bị
2.2.1. Hóa chất và môi trường
Các hóa chất được sử dụng trong thí nghiệm: H2O2, BAP, IAA, các muối đa lượng, vi
lượng, vitamin thuộc môi trường MS (Murashige & Skoog, 1962) và B5 (Gambor, 1968). Các
chất kháng sinh, chất dẫn dụ acetosyringone (AS)...
2.2.2. Các thiết bị thí nghiệm
Các máy móc và thiết bị thí nghiệm chính dùng cho nghiên cứu bao gồm: máy khuấy từ,
máy ly tâm, máy khuấy trộn vortex, máy quang phổ, máy soi chụp ảnh gel, pipetman các loại,
máy ly tâm lạnh, bộ điện di DNA, và một số trang thiết bị khác.
2.3. Nội dung nghiên cứu
9


Nội dung 1: Xây dựng quy trình tái sinh giống đậu tương DT2008 và ĐT26
Nội dung 2: Bước đầu xây dựng quy trình chuyển gen CP4-EPSPS kháng thuốc trừ cỏ
vào hai giống đậu tương DT2008, ĐT26 nhờ Agrobacterium tumefaciens.
Nội dung 3: Đánh giá xác định sự biểu hiện của gen chuyển.
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
 Phương pháp nuôi cấy mô tế bào để xây dựng hệ thống tái sinh cây





Phương pháp lây nhiễm chủng vi khuẩn vào mẫu thực vật
Phương pháp tách chiết DNA
Phương pháp PCR

Phương pháp điện di trên gel agarose

CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Xây dựng quy trình tái sinh hai giống đậu tƣơng DT2008 và ĐT26
3.1.1. Ảnh hưởng của H2O2 đến khả năng khử trùng hạt
Khử trùng mẫu là công đoạn đầu tiên có ý nghĩa quyết định đến kết quả của quá trình nuôi
cấy mô và tế bào thực vật.
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của H2O2 đến khả năng khử trùng của hạt giống đậu tương DT2008 và
giống ĐT26
Giống ĐT26

Giống DT2008
Tỷ lệ

Tỷ lệ

Tỷ lệ

Tỷ lệ

Tỷ lệ

Tỷ lệ

mẫu

mẫu

mẫu

mẫu

mẫu

mẫu

nhiễm

chết

sống

nhiễm

chết

sống

(%)

(%)

(%)

(%)

(%)

(%)

8

94

0

6

98

0

2

10

8

0

92

10

0

90

12

2

34

64

5

40

55

8

35

20

45

40

23

37

10

2

40

58

5

46

49

12

0

75

25

0

78

22

Nồng độ

Thời gian

H2O2 (%)

(phút)

15

20

Qua bảng số liệu cho thấy sử dụng dung dịch H2O2ở nồng độ 15% trong thời gian 10 phút
10


thích hợp cho việc khử trùng hạt đậu tương giống DT2008 và ĐT26, cho tỷ lệ mẫu sống cao: Với
giống DT2008 tỷ lệ mẫu sống đạt 92% và giống ĐT26 tỷ lệ mẫu sống đạt 90%.
3.1.2. Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và IBA đến khả năng tạo chồi từ lá mầm và nốt lá mầm
của các giống đậu tương nghiên cứu
BAP là một cytokinnin tổng hợp nhân tạo, có tác dụng kích thích sự phân bào và tái sinh
chồi mạnh mẽ từ mô nuôi cấy. Sau 9 tuần nuôi cấy với 2 lần cấy chuyển chúng tôi quan sát và
ghi nhận được kết quả ở bảng 3.2.
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của BAP và IBA lên khả năng tạo cụm chồi từ lá mầm
Công thức

Giống ĐT26

Giống DT2008
Tỉ lệ tạo

Chất

Tỉ lệ tạo

lƣợng

cụm

chồi

chồi

1

++

0

1

++

68

3,4

++

71

3,52

++

0,1

83

4,89

+++

86

4,88

+++

2

0,1

100

6,22

+++

100

6,46

++

2,5

0,1

100

5,45

+

100

5,72

+

1

0,2

60

3,13

+++

62

3,26

+++

1,5

0,2

76

4,36

+++

80

4,67

+++

2

0,2

100

5,2

++

100

5,31

++

2,5

0,2

100

4,93

++

100

4,98

++

BAP

IBA

(mg/l)

(mg/l)

0

0

0

1

0,1

1,5

cụm
chồi

Số
chồi/cụm

Số
chồi/cụm

Chất
lƣợng
chồi

+: chồi trung bình, lá biến dạng
++: chồi khỏe, lá có màu xanh
+++: chồi to khỏe, bản lá rộng, lá có màu xanh đậm
Kết quả ở bảng 3.2 cho thấy khi kết hợp BAP với IBA thì khả năng tạo cụm chồi và số
chồi/mẫu của cả 2 giống đều cao hơn công thức đối chứng (không bổ sung BAP và IBA).
Trong thí nghiệm này chúng tôi chọn ra được công thức có bổ sung kết hợp 0,1 mg/l IBA với 2
mg/l BAP là công thức tốt nhất để tạo cụm chồi cho hai giống đậu tương DT2008 và ĐT26.
3.1.3. Ảnh hưởng của GA3 đến khả năng kéo dài chồi của các giống đậu tương nghiên cứu

11


Bảng 3.3. Khả năng kéo dài chồi của hai giống đậu tương DT2008 và ĐT26

Công

Nồng độ GA3

Nồng độ

(mg/l)

IAA (mg/l)

thức

Giống DT2008

Giống ĐT26

Chiều cao chồi

Chiều cao chồi

(cm)

(cm)

1

0,1

0,1

3.2

3.8

2

0,5

0,1

6,2

7,4

3

1

0,1

5,8

6,6

Kết quả cho thấy, khả năng kéo dài chồi của hai giống đậu tương nghiên cứu trên môi

trường bổ sung GA3 có sự khác biệt rõ rệt. Chiều cao chồi dao động từ 3,2 cm đến 7,4 cm. Khả
năng kéo dài chồi của hai giống DT2008 và ĐT26 thích hợp hơn ở nồng độ GA3 là 0,5 mg/l
(chiều cao chồi giống DT2008 đạt 6,2 và ĐT26 đạt 7,4 cm). Trong đó, giống ĐT26 có khả
năng kéo dài chồi tốt hơn giống DT2008. Ở tất cả các công thức khi so sánh chiều cao chồi của
2giống DT2008 và ĐT26 đều cho thấy ĐT26 có khả năng kéo dài chồi tốt hơn (chiều cao chồi
ở giống DT2008 lần lượt là 3,2; 6,2; 5,8; còn ở giống ĐT26 tương ứng là 3,8; 7,4; 6,6). Điều
này chứng tỏ, việc kéo dài chồi ngoài yếu tố GA3 còn do đặc điểm của từng giống quyết định.
Như vậy, từ kết quả thí nghiệm chúng tôi chọn ra được công thức 2 có bổ sung 0,5 mg/l
GA3 và 0,1 mg/l IAA là công thức tối ưu để kéo dài chồi của hai giống đậu tương nghiên cứu.
3.1.4. Ảnh hưởng của α-NAA đến khả năng hình thành rễ của các giống đậu tương nghiên
cứu
α-NAA có tác dụng làm tăng hô hấp của tế bào và mô nuôi cấy, tăng hoạt tính enzym và
ảnh hưởng mạnh đến trao đổi chất của nitơ, tăng khả năng tiếp nhận và sử dụng đường trong
môi trường nuôi cấy.
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của α-NAA đến khả năng ra rễ giống đậu tương DT2008

Giống

Nồng độ

Tỷ lệ

α-NAA

ra rễ

(mg/l)

(%)

Số rễ
TB/cây

Chiều

Chất

dài rễ

lƣợng

(cm)

rễ

12

Đặc điểm hình thái
cây con


0,1

47

1,26

2,05

Xấu

Thân cây nhỏ, khoẻ,
có 2-3 lá xanh đậm
Thân cây mập,

DT2008

0,5

100

4,15

7,12

Tốt

khoẻ, có 2-3 lá xanh
đậm

1

90

3,22

4,30

Xấu

0,1

45

1,50

2,82

Xấu

Thân cây nhỏ, có 2-3
lá xanh nhạt.
Thân cây nhỏ, có 3-4
lá xanh nhạt
Thân cây mập,

ĐT26

0,5

98

4,36

7,65

Tốt

khoẻ, có 3-4 lá xanh
đậm

1

86

3,45

5,20

Xấu

Thân cây nhỏ, có 3-4
lá xanh đậm

Chất lượng rễ: - Rễ tốt: rễ nhiều, to, có màu trắng, khỏe
- Rễ xấu: rễ nhỏ, có màu vàng
Từ kết quả trên cho thấy, hầu hết các giống đều có khả năng phát sinh rễ khi được nuôi
cấy trên môi trường có bổ sung α-NAA. Tỷ lệ phát sinh rễ tương đối cao ở nồng độ α-NAA 0,5
mg/l tùy thuộc từng giống, với giống DT2008 đạt 100%, giống ĐT26 đạt 98%. Kết quả này
phù hợp với kết quả nghiên cứu của Zhanyuan Zhang và cộng sự (1999).
Qua kết quả các thí nghiệm khử trùng, tạo chồi, kéo dài chồi và ra rễ đậu tương ở trên
chúng tôi tiến hành xây dựng quy trình tái sinh như sau:
QUY TRÌNH TÁI SINH HAI GIỐNG ĐẬU TƢƠNG DT2008 VÀ ĐT26

13


Hạt đậu tƣơng
DT2008, ĐT26
Khử trùng bằng

H2O215% trong 10
phút

MS-B5+ 0,1 mg/l IBA + 2 mg/1BAP
+ 100 ml/l nước dừa
Tạo cụm chồi
MS-B5 + 0,5 mg/l GA3 + 0,1
mg/l IAA

Kéo dài chồi
MS-B5 + 0,5 mg/l α-NAA

Ra rễ
Hình 3.5. Sơ đồ quy trình tái sinh hai giống đậu tương DT2008 và ĐT26
3.2. Bƣớc đầu xây dựng quy trình chuyển gen CP4-EPSPS kháng thuốc trừ cỏ vào hai
giống đậu tƣơng DT2008 và ĐT26 thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens.
3.2.1. Xác định chủng vi khuẩn Agrobacterrium tumefaciens phù hợp để chuyển gen CP4EPSPS vào giống đậu tương DT2008, ĐT26
Trong thí nghiệm này, ba chủng vi khuẩn được thử nghiệm là LBA4404, C58C1 và
GV3101. Hiệu quả chuyển gen của từng chủng vi khuẩn được xác định dựa vào tần số biểu
hiện tạm thời của gen gus, kết quả thu được như sau:

Bảng 3.5. Biểu hiện tạm thời của gen gus khi lây nhiễm các chủng Agrobacterium khác nhau
với nốt lá mầm giống đậu tương DT2008 và ĐT26
Giống ĐT26

Giống DT2008
CT

Chủng

Tổng

Số mẫu

Tần số

Tổng

Số mẫu

Tần số biểu

khuẩn

số

biểu

biểu hiện

số

biểu hiện

hiện tạm

mẫu

hiện gus

tạm thời

mẫu

gus

thời (%)

14


(%)
1

GV3101

101

4

3,96

100

5

5,0

2

LBA4404

115

20

17,4

110

18

16,4

3

C58C1

110

21

19,1

110

20

18,2

Kết quả thí nghiệm ở bảng 3.5 cho thấy, trong số 3 chủng vi khuẩn sử dụng trong thí
nghiệm thì chủng vi khuẩn C58C1 tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus ở giống DT2008 và
ĐT26 đạt cao nhất (19,1% và 18,2%).
Như vậy, trong thí nghiệm này chúng tôi chọn được các chủng C58C1 để lây nhiễm với
giống đậu tương DT2008 và ĐT26 cho hiệu quả biến nạp tương đối cao.
3.2.2. Ảnh hưởng của mật độ dung dịch vi khuẩn (OD600) đến hiệu quả chuyển gen vào
giống DT2008 và ĐT26
Bảng 3.6. Kết quả thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của mật độ dung dịch vi khuẩn
(OD600) đến khả năng biểu hiện gen gus của DT2008 và ĐT26
Giống ĐT26

Giống DT2008
Tỷ lệ

Tỷ lệ

sống

chết

(%)

(%)

0,0

86,5

13,5

0,2

84,5

0,4

Tần số

Tỷ lệ

Tỷ lệ

Tần số biểu

sống

chết

hiện tạm thời

(%)

(%)

(%)

0,0

85,3

14,7

0,0

15,5

1,65

82,5

17,5

1,64

84,2

15,8

3,5

84,0

16,0

3,2

0,6

83,4

16,6

18,2

84,6

15,4

17,4

0,8

84,5

15,5

18,9

84,3

15,7

18,6

1,0

81,7

18,3

17,4

82,7

17,3

17,2

1,2

65,3

34,7

4,5

66,4

33,6

4,7

1,4

60,4

39,6

2,2

61,6

38,4

2,1

OD

biểu hiện
tạm thời
(%)

Như vậy, từ kết quả thí nghiệm trên ta hoàn toàn có thể sử dụng giá trị OD = 0,8 khi
biến nạp vi khuẩn với giống đậu tương DT2008 và ĐT26.
15


3.2.3. Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm vi khuẩn A. tumefaciens đến hiệu quả chuyển gen
trên giống đậu tương DT2008, ĐT26
Bảng 3.7. Hiệu suất biến nạp vào đậu tương theo thời gian biến nạp đối với giống đậu tương
DT2008, ĐT26
ĐT26

Giống DT2008
Thời

Tỉ lệ

gian

sống
(%)

Tỉ lệ
chết
(%)

Tần số biểu

Tỉ lệ

hiện tạm

sống

thời (%)

(%)

Tỉ lệ
chết
(%)

Tần số biểu
hiện tam
thời (%)

0

87,5

12,5

0

86,5

13,5

0

30

85

15

5,5

83,7

16,3

5,0

45

83,5

16,5

7,5

82,5

17,5

6,5

60

81,5

18,5

18,7

80

20,0

18,2

90

65,5

34,5

10,5

64,6

35,4

10,5

Quan sát kết quả bảng 3.7 ta thấy thời gian biến nạp thích hợp nhất với chủng C58C1
dòng đậu tương DT2008 và ĐT26 là 60 phút, tần số biểu hiện tạm thời tốt nhất lần lượt
là18,7% và 18,2%.
3.2.4. Ảnh hưởng của thời gian đ ồng nuôi cấy đế n hi ệu quả chuyển gen vào DT2008 và
ĐT26
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến biểu hiện tạm thời của gen gus
Công thức

Tần số biểu hiện gen tạm thời (%)

Thời gian đồng nuôi
cấy (ngày)

Giống DT2008

Giống ĐT26

1

0

0

0

2

3

10,0

8,5

3

4

12,8

11,4

4

5

18,5

18,1

5

6

16,1

15,8

16


6

7

14,2

13,8

Như vậy, trong thí nghiệm này thì thời gian đồng nuôi cấy thích hợp nhất là 5 ngày, cho
tỉ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus đạt 18,5% ở giống đậu tương DT2008 và 18,1% ở giống
đậu tương ĐT26.
3.2.5. Ảnh hưởng của tổ hợp kháng sinh cefotaxim và vancomycin đến hiệu quả ức chế vi
khuẩn
Trong một quy trình chuyển gen nhờ vi khuẩn A .tumefaciens điển hình, sau khi vi khuẩn A.
tumefaciens được sử dụng để chuyển gen ngoại lai vào mô hay tế bào thực vật, vật liệu chuyển gen cần
được xử lý với các loại kháng sinh thích hợp để loại bỏ vi khuẩn. Việc sử dụng kết hợp cefotaxim và
vancomycin giúp cải thiện đáng kể hiệu quả ức chế vi khuẩn. Vì vậy, trong thí nghiệm chúng
tôi sử dụng vancomycin ở nồng độ 250 mg/l kết hợp với cefotaxim ở các nồng độ khác nhau
nhằm cải thiện hiệu quả ức chế vi khuẩn. Kết quả thí nghiệm thể hiện ở bảng 3.9.
Bảng 3.9. Hiệu quả ức chế vi khuẩn A. tumefaciens và ảnh hưởng của tổ hợp kháng sinh
cefotaxim và vancomycin đến khả năng tái sinh của hai giống
ĐT26 và DT2008
Nồng độ kháng sinh

Vancomycin

Cefotaxim

Giống ĐT26

Giống DT2008

(mg/l)
Tỉ lệ

Tỉ lệ

Số chồi

Tỉ lệ

mẫu

mẫu

tái sinh

mẫu

sạch

tái sinh

(chồi/

sạch

(%)

(%)

mẫu)

(%)

Tỉ lệ
mẫu
tái
sinh
(%)

Số chồi
tái sinh
(chồi/
mẫu)

0

0

0

11

1,17

0

9

1,17

250

150

45

41

1,32

38

40

1,32

250

200

62

46

1,32

60

44

1,32

250

250

72

49

1,35

71

39

1,35

250

300

81

39

1

78

32

1

17


Kết quả nghiên cứu thu được tương đương với kết quả nghiên cứu của Wiebke và cs
(2006). Như vậy, dựa trên tất cả các chỉ tiêu theo dõi có thể kết luận công thức thí nghiệm sử
dụng 250 mg/l cefotaxim và 250 mg/l vancomycin cho hiệu quả ức chế vi khuẩn tốt nhất.
3.2.6. Ảnh hưởng của nồng độ kanamycin đến sức sống và khả năng tái sinh của mẫu lá
mầm giống DT2008 và ĐT26
Nồng độ kanamycin được sử dụng cho nghiên cứu chọn lọc mô tế bào mang gen thường
dao động từ 50-500 mg/l tùy thuộc vào loài thực vật và loại mô tế bào sử dụng trong thí
nghiệm. Với cây đậu tương non, Zhang và cs (2006) sử dụng nồng độ kanamycin cao 400 mg/l
để chọn lọc cá thể chuyển gen. Cũng trên cây đậu tương nhưng với vật liệu lá mầm Muhammad
và cs (2010) lại sử dụng nồng độkanamycin thấp trong khoảng từ 20-50 mg/l trong quá trình
tiến hành chọn lọc. Nhằm xác định liều lượng kanamycin thích hợp giúp ức chế hoàn toàn sự
tái sinh của các mô tế bào đậu tương không mang gen kháng, chúng tôi bố trí thí nghiệm bổ
sung kanamycin ở các nồng độ khác nhau vào môi trường tái sinh của giống DT2008 và ĐT26.
Dưới đây là kết quả thí nghiệm chúng tôi thu được sau 40 ngày thí nghiệm.

Bảng 3.10. Ảnh hưởng của kháng sinh kanamycin đến khả năng tái sinh của mẫu lá mầm giống
đậu tương DT2008 và ĐT26
Giống ĐT26

Giống DT2008
Công

Tỉ lệ

thức

mẫu chết
(%)

Tỉ lệ mẫu
tái sinh (%)

Số chồi
trung bình
(chồi/mẫu)

Tỉ lệ mẫu

Tỉ lệ mẫu

chết (%)

tái sinh (%)

Số chồi

trung bình
(chồi/mẫu)

1

0

90

2,22

0

94

2,27

2

60

40

1,15

56

44

1,14

3

96

4

1

92

8

1,13

4

100

0

0

100

0

0

Kết quả nghiên cứu ở bảng 3.10 cho thấy, ngưỡng nồng độ kanamycin thích hợp để ức

chế sự phát triển của mô không mang gen ngoại lai của cả hai giống đậu tương thí nghiệm là
50-75 mg/l. Qua các thí nghiệm đã tiến hành, chúng tôi xác minh được nồng độ kháng sinh
kanamycin thích hợp để chọn lọc mô mang gen là 50-75 mg/l. Ở khoảng nồng độ này, 96100% mẫu lá mầm của giống đậu tương ĐT26 và 92-100% mẫu lá mầm của giống đậu tương
18


DT2008 không mang gen kháng mất khả năng tái sinh.

Từ các kết quả đạt đƣợc chúng tôi đƣa ra quy trình chuyển gen nhƣ sau:
Khử trùng hạt

Chủng vi khuẩn C58C1

Cho hạt nảy mầm
Nuôi lỏng tạo huyền
phù

Làm tổn thương nốt lá
mầm của hạt

Cho mẫu đậu tương tiếp xúc với dịch khuẩn với
OD600 = 0,8 (lây nhiễm trong 60 phút)
Đồng nuôi cấy trên môi trường A2 (trong 5 ngày)
Khử khuẩn bằng cefotaxim (250 mg/l) và
vancomycim (250 mg/l)
Chọn lọc bằng Kanamycin (50 mg/l)

Tạo chồi trên môi trường MS-B5 + 0,1mg/l IBA +
2mg/l BAP (trong 9 tuần)
Kéo dài chồi trên môi trường MS-B5 +0,5 mg/l

α-NAA(trong 4 tuần)
Ra rễ trên môi trường MS-B5 +0,5 mg/l αNAA(trong 4 tuần)
19

Hình 3.12.


Sơ đồ quy trình quy trình chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ CP4-EPSPS vào hai giống đậu tương
DT2008 và ĐT26
3.3. Kiểm tra sự có mặt của gen CP4-EPSPS ở các mẫu đậu tƣơng DT2008 và ĐT26 đã
biến nạp
3.3.1 Kiểm tra sự có mặt của gen CP4-EPSPS ở các mẫu đậu tương DT2008 đã biến nạp

Hình 3.14. Sản phẩm điện di phản ứng PCR nhân gen CP4-EPSPS từ mẫu DNA genome của
các cây đậu tương DT2008 đã biến nạp
Sau khi kiểm tra thì có 5 mẫu có sự xuất hiện của băng có kích thước xấp xỉ 1,5 kb
tương đương với đối chứng dương (mẫu ADN của plasmid pCAMBIA2300.1). Còn lại 20 mẫu
không có sự xuất hiện của băng kích thước này và không có sự khuếch đại sản phẩm PCR. Kết
quả này chứng tỏ 5 cây đậu tương DT2008 tái sinh này nhiều khả năng mang gen CP4-EPSPS
và 20 mẫu ADN không thể nhân băng sản phẩm, đồng nghĩa với việc cá thể có mẫu ADN này
không mang gen kháng thuốc trừ cỏ glyphosate (hình 3.14).

3.3.2. Kiểm tra sự có mặt của gen CP4-EPSPS ở các mẫu đậu tương ĐT26 đã biến nạp

20


Hình 3.15. Sản phẩm điện di phản ứng PCR nhân gen CP4-EPSPS từ mẫu DNA genome của
các cây đậu tương ĐT26 đã biến nạp
Kết quả điện di sản phẩm PCR cho thấy trong tổng số 25 mẫu đậu tương ĐT26 đã biến nạp

sống sót trên môi trường chọn lọc thì có 4 mẫu có sự xuất hiện của băng kích thước xấp xỉ 1,5 kb,
giống như băng kích thước của mẫu DNA plasmid pCAMBIA2300.1 mang gen CP4-EPSPS đã
khuếch đại (mẫu đối chứng dương tính). Trong khi 21 mẫu giống đậu tương ĐT26 đã biến nạp còn lại
thì không thấy xuất hiện băng kích thước nào, có nghĩa là không có sự khuếch đại gen CP4-EPSPS,
tương tự như mẫu đối chứng âm tính (cây đậu tương không chuyển gen) (hình 3.15).

21


CHƢƠNG IV - KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
Kết luận
Dựa trên kết quả thu được từ thí nghiệm, chúng tôi rút ra những kết luận sau:
1. Đã xây dựng được quy trình tái sinh cây đậu tương giống DT2008 và ĐT26: sử dụng
H2O2 15% trong thời gian 10 phút để khử trùng mẫu, tạo cụm chồi đậu tương trên môi trường
MS-B5 có bổ sung 0,1mg/l IBA, 2 mg/l BAP, kéo dài chồi trên môi trường MS-B5 có bổ sung
0,1mg/l IAA, 0,5 mg/l GA3. Các chồi đậu tương đạt tiêu chuẩn chuyển sang môi trường ra rễ là
môi trường MS-B5 có bổ sung 0,5 mg/l α-NAA.
2. Đã xây dựng được quy trình chuyển gen CP4-EPSPS vào 2 giống đậu tương DT2008
và ĐT26 bằng cách sử dụng chủng C58C1 có OD = 0,8 lây nhiễm trên nốt lá mầm với thời gian
lây nhiễm là 60 phút, sau lây nhiễm đồng nuôi cấy trong 5 ngày. Mẫu đậu tương được khử
khuẩn bằng cefotaxim (250 mg/l) và vancomycin (250 mg/l), sau đó cho tái sinh theo quy trình
như trên để thu được cây chuyển gen.
3. Bằng kĩ thuật PCR đã xác định được 5 mẫu giống DT2008 (trong tổng số 25 mẫu thu
được sau biến nạp) và 4 mẫu đậu tương ĐT26 (trong tổng số 25 mẫu thu được sau biến nạp)
mang gen CP4-EPSPS, với kích thước xấp xỉ 1,5 kB.
Đề nghị
1.Tiếp tục tiến hành các thí nghiệm bổ sung để xác minh sự tồn tại của gen kháng thuốc
trừ cỏ trong các cây chuyển gen, đồng thời thực hiện tự thụ và chọn lọc để thu được các cây
chuyển gen đồng hợp tử làm vật liệu ổn định cho các thí nghiệm lai tạo giống kháng thuốc trừ
cỏ glyphosate tiếp theo.

2. Sau khi thu được vật liệu chuyển gen cần tiếp tục đánh khả năng kháng thuốc trừ cỏ
của cây chuyển gen ngoài đồng ruộng và theo dõi tính ổn định của gen chuyển trong cây đậu
tương đã được chuyển gen CP4-EPSPS.

22