6
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
NGUYỄN THỊ HƯƠNG
NGHIÊN CỨU CỐ ĐỊNH TẾ BÀO VÀ ỨNG DỤNG TRONG LÊN
MEN ETANOL TỪ RỈ ĐƯỜNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP LIÊN TỤC
LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
Hà Nội - 2014
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
NGUYỄN THỊ HƯƠNG
NGHIÊN CỨU CỐ ĐỊNH TẾ BÀO VÀ ỨNG DỤNG TRONG LÊN
MEN ETANOL TỪ RỈ ĐƯỜNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP LIÊN TỤC
Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm
Mã số:
62540101
LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. GS. TS. Hoàng Đình Hòa
2.
TS. Đặng Hồng Ánh
Hà Nội – 2014
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Những kết quả trình bày trong luận án
này chưa được một tác giả nào khác công bố
Nghiên cứu sinh
Nguyễn Thị Hương
LỜI CẢM ƠN
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới các Thầy, Cô giáo hướng dẫn khoa học là GS. Hoàng
Đình Hòa và TS. Đặng Hồng Ánh đã tận tình chỉ dẫn, giúp đỡ và động viên em trong suốt
thời gian học tập và thực hiện luận án để có kết quả học tập như ngày hôm nay.
Em cũng xin chân thành cảm ơn tới Quý Thầy, Cô giáo trong Bộ môn Công nghệ sinh học của
Viện Công nghệ sinh học và Thực phẩm – Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội đã hết sức giúp
đỡ và hướng dẫn, chỉ bảo và tạo điều kiện cho em trong quá trình học tập và nghiên cứu.
Em cũng xin cảm ơn Bộ môn Công nghệ đồ uống, Bộ môn Vi sinh – của Viện Công nghiệp
thực phẩm – 301 Nguyễn Trãi, Thanh Xuân, Hà Nội nơi đã cho em niềm vinh dự là một trong
các thành viên tham gia đề tài mã số ĐT. 03.10/NLSH thuộc Đề án phát triển nhiên liệu sinh
học đến năm 2015, tầm nhìn đến 2025 của Bộ công thương và có cơ hội quý báu được nâng
cao kiến thức chuyên môn và thực hiện luận án để có kết quả như ngày hôm nay.
Em cũng xin cảm ơn Ban lãnh đạo và các Anh Chị, Em trong Phòng Đào tạo Đại học của
Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội đã luôn ủng hộ tinh thần, tạo điều kiện và giúp đỡ trong
công việc tại Phòng để em có thể hoàn thành luận án đúng hạn.
Em cũng xin chân thành cảm ơn những người thân trong gia đình, những người bạn đã động
viên và khích lệ cho em có được sự chuyên tâm và động lực phấn đấu thực hiện lụân án này.
Việc hoàn thành luận án và được trở thành một tiến sĩ, đó không chỉ là mơ ước của cá nhân
em mà nó còn là sự mong chờ, là niềm tự hào to lớn của dòng họ em.
Nghiên cứu sinh
Nguyễn Thị Hương
MỤC LỤC
NỘI DUNG
Trang
Lời cam đoan
Lời cảm ơn
Danh mục các chữ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các hình
MỞ ĐẦU
1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
4
1.1. Một số nét cơ bản về ethanol
4
1.1.1. Định nghĩa
4
1.1.2.Sơ đồ quy trình sản xuất ethanol từ rỉ đường
4
1.1.3.Yêu cầu chất lượng và các vấn đề về nấm men trong sản xuất ethanol
5
1.1.4. Rỉ đường dùng để sản xuất ethanol
7
1.2. Tình hình sản xuất và tiêu thụ ethanol trên thế giới và Việt Nam
11
1.3. Vấn đề cố định nấm men trên giá thể và các phương pháp cố định
13
1.3.1. Định nghĩa về cố định tế bào
13
1.3.2. Các phương pháp cố định tế bào nấm men
13
1.3.3. Các kỹ thuật cố định tế bào
17
1.3.4. Chất mang alginate
19
1.3.5. Một số chất mang khác
26
1.4. Các phương pháp lên men và một số yếu tố ảnh hưởng đến qúa trình lên
30
men
1.4.1. Phương pháp lên men gián đoạn
30
1.4.2. Phương pháp lên men bán liên tục
30
1.4.3. Phương pháp lên men liên tục
30
1.5. Tình hình nghiên cứu về công nghệ sản xuất ethanol trên thế giới và ở
33
Việt nam
1.5.1.Tình hình nghiên cứu về công nghệ sản xuất ethanol trên thế giới
33
1.5.2. Tình hình nghiên cứu về công nghệ sản xuất ethanol ở Việt nam
36
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
38
2.1. Vật liệu
38
2.1.1. Chủng vi sinh vật
38
2.1.2. Rỉ đường
38
2.1.3. Hóa chất
38
2.1.4. Môi trường nuôi cấy
2.2.Thiết bị và phương pháp nghiên cứu
38
39
2.2.1. Thiết bị
39
2.2.2. Phương pháp nghiên cứu
39
2.2.3. Phân tích
42
2.2.3.1. Quan sát trạng thái nấm men
42
2.2.3.2. Xác định tế bào nấm men nhờ buồng đếm Thomas
42
2.2.3.3. Xác định lượng tế bào sống
42
2.2.3.4. Xác định số lượng tế bào sống, chết
43
2.2.3.5. Xác định pH, hàm lượng chất khô
43
2.2.3.6. Xác định ni tơ tổng số, đường tổng số, độ thuần khiết
43
2.2.3.7. Xác định nồng độ ethanol
43
2.2.3.8. Xác định mật độ tế bào nấm men bằng máy so màu
44
2.2.3.9. Xác định lượng vi khuẩn hiếu khí có trong dịch lên men
44
2.2.3.10. Phân tích đường khử theo phương pháp Graxianop
44
2.2.3.11. Xác định đường khử theo Nelson-Somogi
44
2.2.3.12. Phương pháp xác định tổng lượng chất keo trong rỉ đường
44
2.2.3.13. Phương pháp xác định lực đệm của rỉ đường
44
2.2.3.14. Phương pháp xử lý rỉ đường
44
2.2.3.15. Tính hiệu suất lên men
44
2.2.3.16. Tính tốc độ pha loãng và năng suất ethanol
44
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
46
3.1. Nghiên cứu tuyển chọn chủng nấm men có khả năng lên men bằng
46
phương pháp cố định tế bào trên môi trường rỉ đường để đạt hiệu suất lên
men cao
3.1.1. Nghiên cứu lựa chọn nguồn nguyên liệu rỉ đường
46
3.1.2. Nghiên cứu tuyển chọn chủng nấm men có khả năng lên men trên môi
47
trường rỉ đường
3.1.3. Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy tối ưu để thu sinh khối nấm men cho việc
50
cố định tế bào
3. 2. Nghiên cứu quy trình công nghệ cố định tế bào
57
3.2.1. Nghiên cứu lựa chọn loại chất mang
57
3.2.2. Nghiên cứu thông số công nghệ cố định tế bào
57
3.3. Nghiên cứu công nghệ lên men ethanol nhờ tế bào cố định trên môi
66
trường rỉ đường
3.3.1. Lựa chọn nồng độ cơ chất ban đầu
66
3.3.2. Lựa chọn tỷ lệ giữa hạt tế bào cố định và dịch lên men thích hợp cho quá
66
trình lên men
3.3.3. Xác định các điều kiện lên men nhờ tế bào cố định
69
3.3.4. Đánh giá hoạt lực lên men của tế bào cố định theo thời gian lên men
71
3.4. Xây dựng quy trình lên men ethanol từ rỉ đường theo phương pháp lên
73
men liên tục nhờ tế bào cố định
3.4.1. Lựa chọn phương pháp lên men liên tục
73
3.4.2. Xác định tốc độ pha loãng của quá trình lên men liên tục
77
3.4.3. Nghiên cứu ổn định các thông số động học của quá quá trình lên men liên
79
3.5. Nghiên cứu xử lý hạt tế bào nấm men để giữ hoạt lực lên men cho quá
81
tục
trình lên men liên tục
3.5 1. Xác định thời điểm cần hoạt hóa
81
3.5.2. Nghiên cứu dung dịch rửa hạt tế bào nấm men
82
3.5.3. Nghiên cứu bổ sung một số cơ chất dinh dưỡng vào dịch hoạt hóa nấm
84
men
3.5.4. Nghiên cứu phương pháp hoạt hóa hạt tế bào
3.6. Xây dựng mô hình và sản xuất thử nghiệm ethanol ở qui mô pilot
3.6.1. Nghiên cứu thiết kế mô hình hệ thống thiết bị lên men liên tục nhờ tế bào
92
93
93
cố định thích hợp cho quy mô sản xuất 500lit ethanol/ngày
3.6.2. Xây dựng mô hình và sản xuất thực nghiệm ethanol bằng phương pháp
95
lên men liên tục nhờ cố định tế bào trên mô hình thiết bị
3.6.3. Đánh giá hiệu quả kinh tế
101
3.6.4. Quy trình công nghệ lên men ethanol từ rỉ đường bằng phương pháp cố
103
định tế bào trong hệ thống lên men liên tục
Kết luận
106
Kiến nghị
108
Danh mục các công trình đã công bố
109
Tài liệu tham khảo
110
Phụ lục
119
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
1.
0
Bx: Độ Brix
2. EDTA: Ethylen diamin tetraacetic acid
3. SEM: Scanning electron microscope: Kính hiển vi điện tử quét
4. M/G: Tỷ lệ D-manuronic acid/L-guluronic acid của chế phẩm alginate
DANH MỤC CÁC BẢNG
NỘI DUNG
Trang
Bảng 1.1. Sản xuất ethanol trên thế giới
12
Bảng 1.2. Tiêu thụ ethanol cho nhiên liệu của thế giới
12
Bảng 1.3. ứng dụng của nấm men cố định
18
Bảng 1.4. Năng suất sinh ethanol trong quá trình lên men dịch nho
35
Bảng 2.1. Môi trường nhân giống sinh khối, lên men, môi trường hoạt hoá tế bào
38
cố định trong hạt gel
Bảng 3.1. Thành phần hoá học và mức độ nhiễm tạp vi sinh vật của 4 loại rỉ
47
đường
Bảng 3.2. Khả năng lên men của các chủng nấm men
48
Bảng 3.3. Năng lực lên men của các chủng nấm men trong điều kiện cố định tế
49
bào.
Bảng 3.4. Sự sinh trưởng của chủng CNTP 7028 trên các nguồn ni tơ khác nhau
51
Bảng 3.5. ảnh hưởng của các loại chất mang đến quá trình lên men
57
Bảng 3.6. ảnh hưởng của chất mang đến khả năng lên men
58
Bảng 3.7. ảnh hưởng của nồng độ Na- Alginate đến quá trình lên men
59
Bảng 3.8. ảnh hưởng của nồng độ Na- Alginate đến các chỉ tiêu của dịch sau lên
59
men
Bảng 3.9. ảnh hưởng của nồng độ dung dịch tạo gel đến quá trình lên men
60
Bảng 3.10. ảnh hưởng của nồng độ dung dịch tạo gel đến các chỉ tiêu dịch sau lên
61
men
Bảng 3.11. ảnh hưởng của tỷ lệ giống nấm men đến quá trình lên men
62
Bảng 3.12. ảnh hưởng của tỷ lệ giống nấm men đưa vào dung dịch chất mang đến
62
chỉ tiêu của dịch sau lên men
Bảng 3.13. ảnh hưởng của tốc độ dòng chảy tạo hạt tế bào cố định đến quá trình
63
lên men
Bảng 3.14. ảnh hưởng của tốc độ dòng chảy tạo hạt tế bào cố định đến chỉ tiêu
64
của dịch sau lên men
Bảng 3.15. ảnh hưởng của kích thứoc hạt đến quá trình lên men
64
Bảng 3.16. ảnh hưởng của kích thước hạt đến thành phần dịch sau lên men
65
Bảng 3.17. ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến quá trình lên men
66
Bảng 3.18. ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến chỉ tiêu của dịch sau lên men
67
Bảng 3.19. ảnh hưởng của tỷ lệ hạt tế bào cố định so với dịch khi lên men
68
Bảng 3.20. ảnh hưởng của tỷ lệ hạt tế bào cố định đến chỉ tiêu của dịch sau lên
68
men.
Bảng 3.21. ảnh hưởng của pH đến quá trình lên men
69
Bảng 3.22. ảnh hưởng của ph đến chỉ tiêu của dịch sau lên men
69
Bảng 3.23. ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình lên men
70
Bảng 3.24. ảnh hưởng của nhiệt độ đến chỉ tiêu của dịch sau lên men
71
Bảng 3.25. Lượng CO2 tạo thành theo các lần tái sử dụng tế bào nấm men cố
72
định
Bảng 3.26. Các chỉ tiêu dịch sau lên men theo các lần tái sử dụng hạt tế bào nấm
72
men cố định.
Bảng 3.27. Khả năng lên men của tế bào cố định trong quá trình lên men liên tục
74
(tỷ lệ giữa hạt tế bào cố định: thể tích dịch lên men là 30% w/v)
Bảng 3.28. Khả năng lên men của tế bào cố định trong quá trình lên men liên tục
74
(tỷ lệ giữa hạt tế bào cố định: thể tích dịch lên men là 40% w/v)
Bảng 3.29. Khả năng lên men của tế bào cố định trong quá trình lên men liên tục
75
(tỷ lệ giữa hạt tế bào cố định: thể tích dịch lên men là 50% w/v)
Bảng 3.30. Khả năng lên men của tế bào nấm men cố định trong quá trình lên
76
men liên tục
Bảng 3.31. Khả năng lên men của tế bào nấm men cố định trong quá trình lên
78
men liên tục
Bảng 3.32. ảnh hưởng của thời điểm hoạt hoá đến khả năng lên men của hạt tế
82
bào nấm men cố định
Bảng 3.33. ảnh hưởng của dung dịch rửa hạt đến quá trình lên men trong hệ thống
83
lên men liên tục
Bảng 3.34. ảnh hưởng của nguồn ni tơ trong dịch hoạt hoá đến khả năng lên men
84
của hạt tế bào nấm men cố định.
Bảng 3.35. ảnh hưởng của nguồn ni tơ bổ sung vào dịch hoạt hoá đển tốc độ sinh
86
CO2 trong bình engol của hạt tế bào nấm men cố định
Bảng 3.36. ảnh hưởng của nồng độ ure đến khả năng lên men của hạt tế bào nấm
86
men cố định
Bảng 3.37. ảnh hưởng của nồng độ ure trong dịch hoạt hoá đến khả năng lên men
87
Bảng 3.38. ảnh hưởng của nguồn photpho trong dịch hoạt hoá đến khả năng lên
88
men của hạt tế bào nấm men
Bảng 3.39. ảnh hưởng của nguồn photpho bổ sung vào dịch hoạt hoá đến tốc độ
sinh CO2 trong bình engol của hạt tế bào nấm men
90
Bảng 3.40. ảnh hưởng của nồng độ KH2PO4 đến khả năng lên men của hạt tế bào
89
nấm men cố định
Bảng 3.41. ảnh hưởng của nồng độ KH2PO4 đến tốc độ sinh CO2 trong bình engol
90
của hạt tế bào nấm men cố định
Bảng 3.42. ảnh hưởng của phương pháp hoạt hoá tới tốc độ sinh CO2 trong bình
91
engol của hạt tế bào nấm men cố định
Bảng 3.43. ảnh hưởng của phương pháp hoạt hoá tới quá trình lên men của hạt tế
92
bào nấm men cố định
Bảng 3.44. Danh mục thiết bị trong mô hình thiết bị lên men liên tục qui mô 500
94
lit ethanol/ngày
Bảng 3.45. Kết quả theo dõi quá trình lên men liên tục trong hệ thống thiết bị
96
1200 lít (mẻ 1)
Bảng 3.46. Kết quả theo dõi quá trình lên men liên tục trong hệ thống thiết bị
97
1200 lít (mẻ 2)
Bảng 3.47. Kết quả theo dõi quá trình lên men liên tục trong hệ thống thiết bị
98
1200 lít (mẻ 3)
Bảng 3.48. Kết quả phân tích một số thành phần của ethanol được sản xuất từ rỉ
100
đường theo quy trình công nghệ lên men liên tục nhờ cố định tế bào
Bảng 3.49. Đánh giá hiệu quả kinh tế của hai phương pháp lên men
101
DANH MỤC CÁC HÌNH
NỘI DUNG
Trang
Hình 1.1.Quy trình sản xuất ethanol từ rỉ đường
4
Hình 1.2. Hình ảnh nấm men Saccharomyces cerevisiae
5,6
Hình 1.3. Hình ảnh rỉ đường mía
9
Hình 1.4. Các kỹ thuật cố định tế bào vi sinh vật
17
Hình 1.5. Cơ chế tạo gel của alginate
19
Hình 1.6: Cấu trúc của alginate
21
Hình 1.7. Mô hình tạo gel dạng vi trứng của alginate canxi
23
Hình 1.8. Sự liên kết của ion Ca2+ với các gốc guluronic
23
Hình 1.9. Quy trình tạo hạt gel ca-alginate
25
Hình 1.10: Cấu trúc của xanthan gum
27
Hình 1.11: Cấu trúc của carrageenan
28
Hình 2.1. Sơ đồ tạo hạt tế bào cố định
40
Hình 2.2. Sơ đồ bố trí hệ thống lên men liên tục
41
Hình 2.3. Bộ cất ethanol ở phòng thí nghiệm
43
Hình 3.1. ảnh hưởng của nồng độ glucoza tới khả năng tạo sinh khối của
50
chủng CNTP7028
Hình 3.2. ảnh hưởng của nồng độ (NH4)2SO4 đến khả năng tạo sinh khối của
51
chủng CNTP 7028
Hình 3.3. ảnh hưởng của nồng độ MgSO4 .7H2O đến khả năng tạo sinh khối
52
của chủng CNTP 7028
Hình 3.4. ảnh hưởng của nồng độ cao nấm men tới sự sinh trưởng của chủng
53
CNTP7028
Hình 3.5. ảnh hưởng của nồng độ K2HPO4 tới khả năng tạo sinh khối của
54
chủng CNTP 7028
Hình 3.6. ảnh hưởng của tốc độ lắc đến khả năng tạo sinh khối của chủng
54
CNTP7028
Hình 3.7. Động học của quá trình sinh trưởng của chủng CNTP 7028
55
Hình 3.8. ảnh hưởng của tốc độ ly tâm đến khối lượng sinh khối thu được
56
Hình 3.9. ảnh hưởng của số lần rửa tới mức độ sạch của sinh khối
56
Hình 3.10. ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến khả năng tạo ethanol và hiệu
77
suất lên men của tế bào cố định trong hệ thống lên men liên tục
Hình 3.11. ảnh hưởng của tốc độ pha loãng đến sản lượng ethanol thu được
78
trong hệ thống lên men liên tục
Hình 3.12. Nồng độ ethanol thu đựoc trong hệ thống lên men liên tục theo
79
thời gian lên men
80
Hình 3.13. Hình ảnh hạt gel canxi alginate trong một chu kỳ lên men
Hình 3.14. Sự phát triển của tế bào nấm men Sacchromyces cerevisiae CNTP
81
7028 trong hạt gel đựơc chụp trên kính hiển vi điện tử quét
Hình 3.15. Thời gian sinh CO2 đẩy hết 5ml dịch trong bình engol sau khi
84
dùng dung dịch rửa hạt tế bào nấm men cố định
Hình 3.16. Động học của quá trình lên men liên tục trên hệ thống lên men
99
liên tục 1200 lít
Hình 3.17. Qúa trình lên men ethanol từ rỉ đường bằng phương pháp lên men
liên tục nhờ cố định tế bào trong gel ca-alginate
103
MỞ ĐẦU
Ethanol là sản phẩm lên men được loài người sử dụng lâu đời nhất và hiện nay cũng là
thứ đồ uống được phổ biến rộng rãi ở mọi nước trên toàn thế giới. Nó chiếm một vị trí khá
quan trọng trong công nghiệp thực phẩm nói riêng và các ngành kinh tế nói chung. Ngoài
công dụng làm đồ uống, ethanol còn được dùng làm nguyên liệu cho một số ngành công
nghiệp khác như: làm dung môi hữu cơ, nhiên liệu, dùng trong y tế, trong mỹ phẩm pha nước
hoa, trong dược phẩm để trích ly các hoạt chất sinh học, sản xuất axit axetic và dấm ăn, sản
xuất các loại este có mùi thơm, trong cao su tổng hợp và nhiều hợp chất khác v.v… Đặc biệt
trong bối cảnh nguồn nhiên liệu hóa thạch đang ngày càng cạn kiệt thì ethanol được coi như
nguồn nhiên liệu sinh học thay thế đầy hứa hẹn.
Việt Nam nằm ở vùng khí hậu nhiệt đới, thích hợp cho việc trồng mía tạo thuận lợi
cho công nghiệp mía đường phát triển. Cùng với sản phẩm chính là đường kính, hàng năm các
nhà máy đường thải ra khoảng 600.000 - 700.000 tấn rỉ đường [17]. Đây là nguồn nguyên liệu
dồi dào để cung cấp cho ngành công nghiệp lên men, đặc biệt là công nghiệp sản xuất rượu
cồn. Theo báo cáo công tác tháng 9 năm 2013 của Bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn
ngày 04/10/2013 số 3580/BC-BNN-VP thì tổng diện tích cây công nghiệp ngắn ngày tính đến
trung tuần tháng 9 đạt 565,5 ngàn ha, bằng 97,3% so với cùng kỳ năm trước và trong đó mía
đạt gần 174,3 ngàn ha, tăng 2,8% [1].
Tại Việt Nam việc sản xuất ethanol chủ yếu tập trung ở một số nhà máy lớn như Công
ty cổ phần cồn rượu Hà Nội, công ty cổ phần rượu Bình Tây, công ty cổ phần rượu Đồng
Xuân...mà đi từ nguồn nguyên liệu là tinh bột. Công nghệ áp dụng vẫn chủ yếu là công nghệ
lên men gián đoạn hoặc bán liên tục, sản phẩm tạo ra chủ yếu mới chỉ đáp ứng được nhu cầu
của thị trường đồ uống. Ngoài ra còn có một số nhà máy sản xuất cồn của các công ty Mía
Đường như công ty Mía Đường Lam Sơn... đã tận dụng nguyên liệu mật rỉ để sản xuất cồn.
Một trong các chiến lược cải tiến quá trình lên men ethanol là áp dụng kỹ thuật cố
định tế bào để thu được quá trình lên men có năng suất và hiệu suất cao. Trong số các chất
mang trong kỹ thuật cố định tế bào ứng dụng trong lên men ethanol thì ca-alginate được sử
dụng rộng rãi nhất do gel có độ xốp cao cho phép cơ chất và sản phẩm lên men đi vào, đi ra
được dễ dàng tạo thuận lợi cho việc trao đổi chất. Sự khuếch tán của glucoza và ethanol vào
và ra khỏi mạng lưới gel rất cao và do tính tương thích sinh học rất tốt cho phép các tế bào
sống duy trì hoạt động sống của mình khi cố định trên mạng lưới gel, không độc, không gây
ức chế hoạt động sống của tế bào. Theo Nedovic và cộng sự (2005) cho rằng có hơn 80% các
nghiên cứu trên thế giới về cố định tế bào đã sử dụng chất mang alginate [97].
1
Đã có rất nhiều công trình nghiên cứu đề cập đến việc sử dụng các tế bào cố định để lên
men sản xuất các loại đồ uống nói chung và ethanol nói riêng [9], [10], [21]. Tuy nhiên ở Việt Nam
hiện nay việc áp dụng công nghệ cố định tế bào mới chủ yếu ở mức độ phòng thí nghiệm mang tính
khảo sát ban đầu và thực hiện trên các sản phẩm lên men khác như bia, rượu vang.... Việc kết hợp
giữa cố định tế bào và quá trình lên men liên tục trong sản xuất ethanol từ rỉ đường phù hợp với điều
kiện Việt Nam và có nhiều triển vọng ứng dụng vào thực tiễn. Với những ý nghĩa đó chúng tôi
đã thực hiện đề tài nghiên cứu: “Nghiên cứu cố định tế bào và ứng dụng trong lên men
etanol từ rỉ đường bằng phương pháp liên tục”.
Mục tiêu cần đạt của đề tài là:
1. Xác định được công nghệ thích hợp tạo giá thể để cố định tế bào nấm men và các điều
kiện thích hợp lên men dịch rỉ đường bằng nấm men cố định.
2.
Xác định được các thông số công nghệ cơ bản của quá trình lên men liên tục, sử dụng
nấm men cố định.
3.
Xây dựng mô hình và sản xuất thử nghiệm ethanol bằng phương pháp lên men liên
tục nhờ tế bào cố định trên mô hình thiết bị.
Để đạt được các mục tiêu trên, đề tài cần nghiên cứu các nội dung:
1. Nghiên cứu tuyển chọn chủng nấm men có khả năng lên men bằng phương pháp cố
định tế bào trên môi trường rỉ đường để đạt hiệu suất lên men cao
- Tuyển chọn chủng nấm men có khả năng lên men tốt trên môi trường rỉ đường từ các
chủng nấm men có trong sưu tập giống công nghiệp của Viện CNTP.
- Tuyển chọn chủng nấm men có khả năng lên men tốt trong điều kiện cố định trong
lớp chất mang từ các chủng đã được chọn ở trên.
- Lựa chọn nguồn nguyên liệu rỉ đường.
2. Nghiên cứu quy trình công nghệ cố định tế bào
- Khảo sát ảnh hưởng của một số loại chất mang đến quá trình cố định tế bào.
- Nghiên cứu phối hợp sử dụng các chất mang khác nhau để đạt hiệu quả cố định và
lên men tốt.
- Lựa chọn nồng độ chất mang.
- Nồng độ dung dịch tạo gel cho độ bền cơ học của hạt tế bào cố định cao.
- Lựa chọn tỷ lệ giống thích hợp trong chất mang cho khả năng giữ tế bào và độ bền
cơ học cao nhất.
- Lựa chọn tốc độ dòng chảy tạo hạt tế bào cố định .
3. Nghiên cứu công nghệ lên men ethanol nhờ tế bào cố định trên môi trường rỉ đường
- Xác định nồng độ cơ chất ban đầu và nồng độ các chất vi lượng bổ sung.
2
- Nghiên cứu lựa chọn tỷ lệ hạt tế bào cố định và dịch lên men thích hợp cho quá trình
lên men.
- Xác định các điều kiện lên men nhờ tế bào cố định cho nồng độ ethanol cao ( nhiệt
độ, pH, ...)
- Đánh giá hoạt lực lên men của tế bào cố định theo thời gian lên men.
- Xác định thời điểm cần hoạt hoá để kéo dài hoạt lực của tế bào cố định.
- Nghiên cứu bổ sung một số cơ chất để nâng cao khả năng sống và duy trì hoạt tính
lên men của tế bào cố định.
- Nghiên cứu bổ sung oxy hoà tan để nâng cao khả năng sống và duy trì hoạt tính lên
men của các tế bào cố định.
4. Xây dựng quy trình lên men ethanol từ rỉ đường theo phương pháp lên men liên tục nhờ
tế bào cố định
- Lựa chọn phương pháp lên men thích hợp.
- Xác định tốc độ pha loãng của quá trình lên men liên tục.
- Nghiên cứu độ ổn định các thông số động học của quá trình lên men liên tục theo thời
gian lên men.
5. Nghiên cứu xử lý hạt tế bào nấm men để giữ hoạt lực lên men cho quá trình lên men
liên tục
- Xác định thời điểm cần hoạt hoá.
- Nghiên cứu dung dịch rửa hạt tế bào nấm men.
- Nghiên cứu bổ sung một số cơ chất dinh dưỡng vào dịch hoạt hoá nấm men.
6. Xây dựng mô hình và sản xuất thử nghiệm ethanol ở qui mô pilot
- Nghiên cứu mô hình hệ thống thiết bị lên men liên tục nhờ tế bào cố định thích hợp
cho quy mô sản xuất 500 lít ethanol/ngày.
- Thử nghiệm lên men liên tục ở qui mô pilot .
- Đánh giá hiệu quả kinh tế.
3
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Một số nét cơ bản về ethanol
1.1.1. Định nghĩa ethanol
Ethanol là chất lỏng trong suốt, có công thức phân tử là C2H5OH, phân tử gam
46,07g/mol, khối lượng riêng (0,789g/cm3 ), điểm sôi (78.40C), điểm bắt lửa ( 130C),
nhiệt độ tự cháy (4250C) [17]. Ethanol tan vô hạn trong nước, tan trong ete và
clorofom, hút ẩm, dễ cháy, khi cháy không có khói và ngọn lửa màu xanh da trời.
1.1.2. Sơ đồ quy trình sản xuất cồn etylic từ rỉ đường
Rỉ đường (chất khô :80-85%)
chs
Pha loãng (đến chất khô 53-54%)
Axit hóa hoặc gia nhiệt
Xử lý rỉ đường (loại bỏ chất keo, diệt vi sinh vật)
Tách cặn
Cặn
Rỉ đường sạch cặn
Pha loãng đến nồng độ nhân men giống
(12-15% chất khô)
Pha loãng đến nồng độ lên men (24-25% chất
khô)
Nhân men giống
Lên men
Bổ sung các chất
dinh dưỡng
Chưng cất
Bã rượu
Cồn thô (26-28%v)
Xử lý cồn thô
Tinh luyện cồn thô
Cồn etylic>=96%v
Hình 1.1. Quy trình sản xuất ethanol từ rỉ đường
4
Tách aldehyd, tách dầu khét
(rượu bậc cao +ester)
1.1.3. Yêu cầu chất lượng và các vấn đề về nấm men trong sản xuất cồn etylic
- Chủng nấm men thường dùng trong sản xuất rượu ethanol là Saccharomyces
cerevisiae thuộc họ Endomycetacea hay Ascomyces.
- Nấm men có nhiều hình dáng khác nhau: oval, tròn, hình quả chanh, hình chuỳ, hình
cầu, hình trứng….. Hình dáng tế bào có thể thay đổi tuỳ loài, điều kiện nuôi cấy và tuổi của
nấm men..
Hình 1.2. a.
Hình 1.2.b
5
Hình 1.2.c
Hình 1.2.d
Hình 1.2. Hình ảnh nấm men (Saccharomyces cerevisiae)
6
- Tế bào nấm men được cấu tạo chủ yếu từ thành tế bào, màng nguyên sinh chất, nhân
và các cơ quan con khác. Nhân được bao bọc bởi màng nhân, ngoài ra nó thuộc tế bào
eucaryote ( Hình 1.2.b) nên tính ổn định đặc tính di truyền trong thời gian dài thực hiện lên
men liên tục bằng có định tế bào hiệu quả hơn. Kích thước tế bào nấm men cũng khác nhau và
phụ thuộc vào điều kiện nuôi cấy, dao động trong khoảng 2,5-10 m chiều rộng và 5-50 m
chiều dài. Tế bào có hình dạng hình oval là chủ yếu ( Hình 1.2.a) nên đễ cố định trong chất
mang. Nấm men có thể sinh sản chủ yếu bằng phương pháp nẩy chồi. Tế bào trưởng thành
mọc ra một chồi nhỏ, một phần nhân chuyển sang chồi cùng với sự lớn của chồi thành một
nhân mới. Chồi lớn có vách ngăn với tế bào mẹ, rồi tách riêng thành tế bào mới, tạo ra những
vết sẹo ( Hình 1.2.c và 1.2.d ).
- Có hoạt tính tạo cồn cao.
- Nấm men dùng trong sản xuất ethanol ngoài khả năng biến đường thành ethanol và khí
CO2 , càng triệt để càng tốt. Chịu được sự biến đổi của môi trường trong điều kiện nhiệt độ,
pH, nồng độ đường, đặc biệt chịu được nồng độ ethanol cao.
* Đặc điểm của quá trình lên men ethanol: Dịch đường lên men đục. Nhiều cặn lơ lửng - ảnh
hưởng đến chất lượng sản phẩm. Lên men ở nhiệt độ cao. Sau một chu kỳ lên men thì nấm
men ít kết lắng, tỷ lệ tế bào chết nhiều, dẫn đến tốc độ thoái hoá nhanh, dịch huyền phù có
nấm men kết lắng cũng không sạch. Vì vậy trong sản xuất ethanol không thể tái sử dụng nấm
men của mẻ trước cho lên men mẻ sau. Lên men mẻ nào thì phải nhân giống cho các mẻ đấy,
không tái sử dụng được – đó chính là sự bất lợi của lên men cổ điển. Nó có nhiều rủi ro:
-
Nếu mẻ lên men nào bị nhiễm khuẩn - cả dây chuyền bị nhiễm
-
Hiệu quả thấp, tiêu tốn nhiên liệu và nhân công lao động
-
Quy trình công nghệ sản xuất cồn ethanol phức tạp thêm (vì dịch nhân giống có
nồng độ bao giờ cũng thấp hơn dịch đường lên men ethanol)
Chính vì vậy đi đến giải pháp cố định nấm men và nó các ưu điểm:
-
Chịu được áp suất thẩm thấu, tăng tốc độ sử dụng cơ chất, rút ngắn thời gian lên
men.
-
Tăng hiệu suất thu hồi và giảm chi phí tinh sạch.
-
Có khả năng tái sử dụng.
1.1.4. Rỉ đường dùng sản xuất ethanol
1.1.4.1. Thành phần hóa học của rỉ đường
Thành phần rỉ đường phụ thuộc vào giống mía, đất đai trồng trọt và điều kiện canh tác
cũng như công nghệ sản xuất đường. Bình thường lượng chất khô trong mật rỉ chiếm 80 đến
7
85%, nước chiếm 15 đến 20%. Có nhà máy rửa nhiều nước sau ly tâm đường nên lượng chất
khô giảm còn 70 – 75% [6].
Trong số các chất khô thì đường chiếm tới 60%, gồm 35 - 40% là saccaroza và 20 – 25%
là đường khử, ngoài ra còn chứa một lượng đường không lên men ( 3-5%) như rafinoza (0,010,3%), lactoza, manoza và xyloza [6]; [11], [17].
Số chất khô còn lại gọi chung là chất phi đường và gồm 30 – 32% là hợp chất hữu cơ và 8
– 10% là chất vô cơ.
Hợp chất hữu cơ gồm các chất chứa nitơ, cacbon, oxy và hydro. Hợp chất hữu cơ chứa
nitơ phần lớn là ở dạng amin như glutamic, lơxin, alanin v.v…Lượng nitơ trong rỉ đường mía
chỉ khoảng 0,5 đến 1%, ít hơn so với rỉ đường củ cải (1,2 – 2,2%) [11], [17].
Chất hữu cơ không chứa ni tơ gồm có pectin, chất nhầy furfurol và oxymetyl furfurol, axit
v.v…Ngoài ra còn chứa các chất khử nhưng không lên men được như caramen, chất màu…
+ Các hợp chất màu: rỉ đường thường có mầu nâu sẫm hay nâu đen, chủ yếu là do hỗn
hợp các chất mầu tạo thành.
+ Hợp chất caramen: tạo thành do sự mất nước của đường saccaroza dưới tác dụng
của nhiệt độ. Khi pH không đổi thì cường độ mầu tỉ lệ thuận với nhiệt độ và thời gian
đun nóng.
+ Phức chất phenol-Fe+2: có mầu vàng xanh và không thể loại hết ở giai đoạn làm
sạch nước mía và đi vào rỉ đường.
+ Melannoidin: là sản phẩm ngưng tụ của đường khử với axit amin là chủ yếu là axit
asparagin.
+ Mêlanin: là sản phẩm oxi hoá khử các axitamin ở dạng vòng có trong rỉ đường dưới
sự xúc tác của enzim polyphenoloxydaza khi có mặt của oxy và Cu2+, chủ yếu là
tyrozin.
+ Chất keo: chủ yếu là các chất pectin, chất sáp, chất nhờn. Các chất này có ảnh
hưởng xấu tới nấm men vì nó tạo màng nhầy bao bọc quanh tế bào ngăn cản quá trình
hấp thụ chất dinh dưỡng, làm giảm hoạt tính sinh học, ức chế quá trình lên men, hạn
chế tạo sinh khối. Ngoài ra còn là nguyên nhân chính tạo bọt trong quá trình nuôi cấy
vi sinh vật.
Các hợp chất vô cơ: chủ yếu là các loại muối tìm thấy trong thành phần tro của rỉ đường
như muối kali, natri, canxi.
Trong rỉ đường mía khá giàu biotin (vitamin H) và hàm lượng vitamin gồm : B1, B2, B3,
B6, PP [19].
8
Hình 1.3. Hình ảnh rỉ đường mía
Như vậy có thể thấy rằng trong thành phần của rỉ đường có đầy đủ các loại đường có thể lên
men và các yếu tố vi lượng, chất khoáng cần thiết cho quá trình lên men ethanol. Ngoài ra
nguồn ni tơ có trong rỉ đường thấp thì trong quá trình nuôi cấy ta sẽ phải bổ sung thêm nguồn
nitơ để thúc đẩy quá trình sinh trưởng và phát triển [38], [39], [55].
1.1.4.2. Các phương pháp xử lý rỉ đường
a. Phương pháp hoá học (phương pháp axit hoá)
Người ta thường sử dụng axit sunfuric 0,40,6% để kết tủa các chất keo có trong rỉ
đường, đồng thời axit H2SO4 còn liên kết với các muối, đẩy các axít hữu cơ ra, tạo pH thích
hợp cho lên men ethanol. Lượng axit H2SO4 cho vào phụ thuộc vào phương pháp xử lý có gia
nhiệt hay không gia nhiệt và phụ thuộc pH của rỉ đường. Khi bổ sung axit H2SO4 vào dưới tác
dụng của nhiệt thì một số axit bay hơi thoát ra làm một vài chất độc đối với nấm men cũng bị
oxi hoá [12], [17].
Ví dụ:
CaSO3 + H2SO4 CaSO4 + H2O + SO2
KNO3 + H2SO4 K2SO4 + HNO3
Không những thế H2SO4 còn có tác dụng thuỷ phân một phần saccaroza thành glucoza
và fructoza. Đồng thời độ thuần khiết của rỉ đường sau khi axit hoá tăng lên, giảm từ 20-30%
9
các chất phi đường, 40-60% hàm lượng chất keo, giảm bớt chất tro và tạp trùng như vi khuẩn
lactic, butyric, acetic...
Xử lý với axit không gia nhiệt:
Phương pháp này chỉ áp dụng khi rỉ đường bị nhiễm tạp không nhiều.
Tiến hành: cho rỉ đường và nước vào thiết bị làm trong theo tỷ lệ 1:1 đồng thời cho cánh
khuấy hoạt động và cho từ 2 6 lít H2SO4 đậm đặc (d=1,84)/1 tấn rỉ đường tới pH=4,5. Sau
đó bổ sung amoni sunphat và supe photphat khuấy đều trong 30 phút và để lắng từ 6-12 giờ
cho tới khi rỉ đường trong hoàn toàn. Tách cặn lấy phần trong đem pha loãng tới nồng độ gây
men và lên men.
Xử lý với axit gia nhiệt:
Tiến hành: rỉ đường được pha loãng giống phương pháp xử lý bằng axit không gia nhiệt
và chỉnh tới pH = 4,5. Sau đó dùng hơi nước sục trực tiếp vào tới nhiệt độ 85-90OC giữ trong
0,5-1h sau đó để lắng từ 2-4h rồi tách cặn và đem pha loãng tới nồng độ gây men và lên men
[17].
b. Phương pháp xử lý rỉ đường bằng hợp chất polyme
Các chất rắn trong rỉ đường tồn tại ở trạng thái keo nên chúng nằm lơ lửng trong dịch
đường. Để kết lắng được các hạt keo này thì phải phá vỡ trạng thái ổn định của hệ bằng cách
phá vỡ lớp điện tích bảo vệ hạt keo. Khi đó các hạt keo sẽ tự kết hợp lại với nhau đến khi khối
lượng tăng dần và lắng xuống.
Bản chất hoá học của polyme kết lắng là các copolin của acrylamit, được chúng chia
làm 3 nhóm điện tích: cationic, anionic và nonionic
Hiện nay có rất nhiều loại polyme nhưng chỉ có polyme mang diện tích dương mới có
khả năng kết lắng các tạp chất trong rỉ đường. Polyme mang diện tích dương thấp có khả năng
kết lắng rỉ đường triệt để, thời gian kết lắng nhanh, dễ lắng cặn, không qua thiết bị lọc. Ở Việt
Nam hiện nay thường dùng hai loại polyme mang diện tích dương thấp là C510H và C300 của
hãng ARON Nhật bản trong hai loại này thì C510H có khả năng kết lắng tốt hơn.
c. Phương xử lý rỉ đường bằng cơ học
Dùng phương pháp li tâm để loại bớt chất bẩn và chất keo. Làm trong bằng phương pháp
này rút ngắn thời gian xử lí rỉ đường, không tốn axit, không ăn mòn thiết bị, đảm bảo quá
trình pha chế môi trường nhanh, liên tục nhưng độ trong không bền và tạo thành cặn trong
thiết bị lên men. Li tâm với tốc độ từ nhỏ đến lớn để đảm bảo tách hết cặn lớn nhỏ. Tuỳ theo
mục đích sử dụng và chất lượng rỉ đường người ta có thể kết hợp hoặc không kết hợp với tác
dụng nhiệt. Tuy nhiên có nhược điểm là năng suất máy li tâm thường là rất thấp, giá thành
cao, tốn nhiều năng lượng điện nên ít được sử dụng trong sản xuất lớn [12], [17].
10
1.2. Tình hình sản xuất và tiêu thụ ethanol trên thế giới và Việt Nam
1.2.1.Tình hình sản xuất và tiêu thụ ethanol trên thế giới
Trên thế giới, việc nghiên cứu sử dụng ethanol để thay thế chất phụ gia metyl-butyl ete
trong xăng dầu đã được tiến hành trong nhiều năm qua. Theo “ Dự án Biomass” của Bộ năng
lượng Hoa Kỳ thì chính phủ công bố cấm sử dụng metyl-butyl ete vào đầu năm 2003, do
nhiều công trình nghiên cứu đã khẳng định sự ô nhiễm nguồn nước, môi trường không khí,
sức khỏe con người của việc sử dụng metyl-butyl ete [3]. Chương trình ethanol nhiên liệu
được nhiều nước quan tâm, đầu tư xây dựng chiến lược phát triển các nhà máy sản xuất
ethanol từ các loại ngũ cốc như: ngô, sắn, mía đường… nhằm đáp ứng nhu cầu cung cấp
nhiên liệu tái tạo trong tương lai [29], [45], [45]. Năm 2003 toàn thế giới đã sản xuất được
38,5 tỷ lít ethanol (châu Mỹ chiếm khoảng 70%, châu Á 17%, châu Âu 10%), trong đó 70%
được dùng làm nhiên liệu, 30% được sử dụng trong công nghiệp thực phẩm, y tế, hoá chất.
Đến năm 2007, lượng ethanol sản xuất đã tăng lên 56 tỷ lít, trong đó tỷ lệ sử dụng làm nhiên
liệu tăng lên 75%. Năm 2009, sản lượng ethanol trên thế giới đạt khoảng 66 tỷ lít [7]. Theo
Pilgrim C. (2009) và Carlos A., Cardona, O. J. S (2007) thì dự báo đến năm 2021, sản lượng
ethanol thế giới sẽ tăng lên 180,402 tỷ lít và tỷ lệ sử dụng làm nhiên liệu tăng lên tới 86% (
bảng 1.1 và bảng 1.2) [31], [82], [83], [92], [104], [107], [108], [109], [110],.
Trên thế giới, Brazin, Mỹ và Trung Quốc là 3 quốc gia đứng đầu về sản xuất và sử
dụng ethanol nhiên liệu. Trong khu vực Đông Nam Á, Thái Lan là quốc gia phát triển rất
nhanh về sản xuất và sử dụng xăng pha ethanol sản xuất từ phế phẩm của sắn, hạt ngô, cây
ngô, đường, bã mía [7], [66].
Mỹ là quốc gia tiêu thụ hàng năm 25% năng lượng trên thế giới. Năm 2004, Mỹ đã
sản xuất trên 13 tỷ lít ethanol. Do lệnh cấm sử dụng metyl-butyl ete đã làm tăng mạnh nhu
cầu đối ethanol nhiên liệu ở Mỹ. Mỹ đã vượt Braxin và là nước sản xuất ethanol lớn nhất trên
thế giới hiện nay. Năm 2009, sản lượng ethanol lên tới 25,9 tỷ lít [7], [29], [66], [82].
Trung Quốc là quốc gia sản xuất và sử dụng ethanol nhiên liệu lớn thứ 3 sau Braxin và
Mỹ. Năm 2004, nước này đã đưa vào hoạt động nhà máy sản xuất ethanol lớn nhất thế giới
với công suất 600.000 tấn/năm tại Cát Lâm (mỗi năm tiêu thụ 1,9 triệu tấn ngô làm nguyên
liệu), tăng lượng cồn ethanol cả nước trên 3,5 tỷ lít. Gần nước ta nhất là Thái Lan, một nước
đã có chính sách sản xuất nhiên liệu sinh học từ 10 năm nay. Từ năm 2002, Thái Lan đã xây
dựng thêm 4 nhà máy sản xuất ethanol nhằm giảm chi phí nhập khẩu xăng dầu. Năm 2004,
Thái Lan đã sản xuất trên 280.000 m3 ethanol, đầu tư thêm 20 nhà máy để năm 2015 có trên
2,5 tỷ lít ethanol dùng làm nhiên liệu [7], [99], [100], [105].
11
Bảng 1.1 Sản xuất ethanol trên thế giới (tr.lít)
Nước/Khu vực
2009-2011
2012
Mỹ
47.167
82.610
Braxin
25.331
51.305
Trung Quốc
8.094
10.008
EU
6.424
15.747
Ấn Độ
1.796
4.194
Thái Lan
777
2.102
Việt Nam
209
493
Nguồn: OECD/FAO Agriculture Outlook, 2012
Bảng 1.2 Tiêu thụ ethanol cho nhiên liệu của Thế giới (tr.lít)
Nội dung
2009-2011
2012
Sản xuất ra
98.210
180.402
Tiêu thụ nội địa
97.220
179.919
Tiêu thụ cho nhiên liệu
77.178
155.964
Nguồn: OECD/FAO Agriculture Outlook, 2012
1.2.2. Tình hình sản xuất và tiêu thụ ethanol ở Việt Nam
Theo vietbao.vn/kinh tế thì thống kê năm 2007 ở Việt Nam có khoảng 328 cơ sở sản
xuất rượu lớn với sản lượng 360 triệu lít/năm, 320 cơ sở sản xuất nhỏ với sản lượng dưới 1
triệu lít/năm, hộ gia đình tự sản xuất ước tính khoảng 250 triệu lít/năm [111].
Theo khảo sát của Bộ Công Thương, hết quý I-2009, rượu tăng 16% so với cùng kỳ
năm 2008. Cho đến năm 2010 chính phủ vẫn định hướng chỉ đạo việc tiếp tục gia tăng sản
lượng rượu bia do nhiều thành phần kinh tế tham gia sản xuất, chỉ hạn chế dần lượng rượu
dân tự nấu [2].
Mỗi năm tổng công suất sản xuất ethanol trên cả nước đều tăng tập trung ở 3 nhà máy
lớn có công suất từ 15.000 - 30.000 lít/ngày là nhà máy Hiệp Hoà, Lam Sơn, nhà máy Bình
Tây và hàng trăm cơ sở sản xuất có quy mô nhỏ lẻ với công suất từ 3.000 - 5.000 lít/ngày. Sản
lượng ethanol Việt Nam hiện nay còn rất nhỏ, công suất sản xuất của mỗi nhà máy cũng nhỏ,
các đơn vị sản xuất ethanol đang gặp nhiều khó khăn do nguồn nguyên liệu không ổn định.
12